JPH0358904A - 新規なバシラス・スリンギエンシス分離体 - Google Patents
新規なバシラス・スリンギエンシス分離体Info
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なバシラス・スリンギエンシス分離体に関
する。
する。
バシラス・スリンギエンシス(Bacillus th
rin−giensis. B.t.)は、δ一エンド
トキシンと呼ばれる昆虫毒素をつくる。毒素はe.t.
抱子形成細胞によって合成される。毒素が感受性のある
昆虫の幼虫に結晶型で摂取されると、昆虫の腸液ブロテ
アーゼにより、毒素は生物学的活性部分に転化される。
rin−giensis. B.t.)は、δ一エンド
トキシンと呼ばれる昆虫毒素をつくる。毒素はe.t.
抱子形成細胞によって合成される。毒素が感受性のある
昆虫の幼虫に結晶型で摂取されると、昆虫の腸液ブロテ
アーゼにより、毒素は生物学的活性部分に転化される。
主要目標は昆虫の腸上皮細胞であり、これが急速に破壊
される。
される。
8.t.の報告された活性スペクトルは、鱗翅目と鞘翅
目内の昆虫種を包含し、その多くは農林業の主要害虫で
ある。活性スペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅目(
旧ptera)の昆虫を包含している。
目内の昆虫種を包含し、その多くは農林業の主要害虫で
ある。活性スペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅目(
旧ptera)の昆虫を包含している。
コウチ・ティー・エル(Couch, T.L.)(1
980年)「バシラス・スリンギエンシス◆バラエティ
・イスラエレンシス(B.thurin3iensis
var. israelensis)の蚊病原性」工
業微生物学の発展22巻61−76頁:ビーグル●シー
・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「
農業生態系における昆虫体内w菌の使用」工業微生物学
の発展20巻97−104頁を参照のこと。
980年)「バシラス・スリンギエンシス◆バラエティ
・イスラエレンシス(B.thurin3iensis
var. israelensis)の蚊病原性」工
業微生物学の発展22巻61−76頁:ビーグル●シー
・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「
農業生態系における昆虫体内w菌の使用」工業微生物学
の発展20巻97−104頁を参照のこと。
本発明は、双翅目害虫に対して活性をもった新規なバシ
ラス・スリンギエンシス(B.t.)分離体に関する。
ラス・スリンギエンシス(B.t.)分離体に関する。
例えば、本明細書でバシラス・スリンギエンシス●バラ
エティーモリソニPS71M3 ( B.t.PS71
M3)及びバシラス・スリンキエンシス・バラエティ●
イスラエレンシスPS123DI ( B.t.PS1
230+)として知られる新規なB.t.分離体は、試
験ざれたすべての蚊に対して活性であることが示された
。
エティーモリソニPS71M3 ( B.t.PS71
M3)及びバシラス・スリンキエンシス・バラエティ●
イスラエレンシスPS123DI ( B.t.PS1
230+)として知られる新規なB.t.分離体は、試
験ざれたすべての蚊に対して活性であることが示された
。
本発明はまた、親微生物と実質的に同し殺虫性状をもつ
新規な分離体の無胞子性( spo−)変式種も包含す
る。これらの変異種はバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・モリソニPS71M3−69 (B.t.P
s71M3−69)及びバシラス・スリンキエンシス◆
バラエティ●イスラエレンシスPS123DI−45
( B.t.Ps123DI−45)と指定されている
。本発明の新規な変異種は溶菌マイナスであり、すなわ
ち容易に溶菌しない。変異種をつくる手1頻は、本明!
4書に明らかにされている。
新規な分離体の無胞子性( spo−)変式種も包含す
る。これらの変異種はバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・モリソニPS71M3−69 (B.t.P
s71M3−69)及びバシラス・スリンキエンシス◆
バラエティ●イスラエレンシスPS123DI−45
( B.t.Ps123DI−45)と指定されている
。本発明の新規な変異種は溶菌マイナスであり、すなわ
ち容易に溶菌しない。変異種をつくる手1頻は、本明!
4書に明らかにされている。
更に、本発明は実質的に無傷の細胞を目標害虫環境に施
用する時に殺虫活性を持続させろために、実質的に無傷
のB.t.細胞を処理することを包含する。このような
処理は、手法が殺虫剤の性状に悪影響しない限り、又は
殺虫剤を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的
又は物理的手段、又は化学・物理的手段の矧み合わせで
ありうる。処理されたR.t.細胞は、殺虫剤毒素に刻
する保護被覆としての役目を果たす。毒素は、目標害虫
による摂取時に、その場で作用するように利用できる。
用する時に殺虫活性を持続させろために、実質的に無傷
のB.t.細胞を処理することを包含する。このような
処理は、手法が殺虫剤の性状に悪影響しない限り、又は
殺虫剤を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的
又は物理的手段、又は化学・物理的手段の矧み合わせで
ありうる。処理されたR.t.細胞は、殺虫剤毒素に刻
する保護被覆としての役目を果たす。毒素は、目標害虫
による摂取時に、その場で作用するように利用できる。
本発明の変異種細胞は延長された発酵間間中に無傷のま
までいるから、細胞は上の手順によって容易に処理でき
る。更に、変異種微生物に胞子がないため、胞子汚染に
よって環境に脅威を与えることなく、より安全な殺虫剤
が提供される。
までいるから、細胞は上の手順によって容易に処理でき
る。更に、変異種微生物に胞子がないため、胞子汚染に
よって環境に脅威を与えることなく、より安全な殺虫剤
が提供される。
本発明の新規なハシラス・スリンギエンシス分離体は以
下の性状をもっている。
下の性状をもっている。
集落で、表面はく
すんでいる。
増殖共月の細胞
形態
鞭毛の血清型
B,t.に典型的
8a8h,
モリソニ
同じ
l4、イスラエ
レンシス
細胞内封入体
無定形
無定形
〜130,000 G7,00067,0
00 27.00027,000 spo一変異種は親培養基について上に列挙されたもの
と同じ特性をもつている。
00 27.00027,000 spo一変異種は親培養基について上に列挙されたもの
と同じ特性をもつている。
両分離体とその無胞子性変異種は、試験されたすべての
蚊を殺虫する。生物検定は、ネッタイシマ力(Aede
s aegyptt)、アエデス・ドルサリス(Ae−
des dorsalis)、アノフエレス・アルボマ
ニス( An−opheles albomanis)
、クレツクス●ビビエンスくCulex pipien
s)、クレックス・キンケフ7シアツス(Culexq
uinquefasciatus)、及びクレックス◆
タルサリス(Culex tarsalis)に対して
行なわれた。
蚊を殺虫する。生物検定は、ネッタイシマ力(Aede
s aegyptt)、アエデス・ドルサリス(Ae−
des dorsalis)、アノフエレス・アルボマ
ニス( An−opheles albomanis)
、クレツクス●ビビエンスくCulex pipien
s)、クレックス・キンケフ7シアツス(Culexq
uinquefasciatus)、及びクレックス◆
タルサリス(Culex tarsalis)に対して
行なわれた。
生物検定手III! : 胞子及び結晶懸濁液の希釈
液を小さなカップ中の水に加える。第4齢幼虫を加える
。致死率を48時間後に読取る。
液を小さなカップ中の水に加える。第4齢幼虫を加える
。致死率を48時間後に読取る。
本発明出願で明らかにざれた培養基は、61604合衆
国イリノイ州ビオリア、ノース・ユニバーシティ・スト
リート1815番地、北部研究センター農業研究サービ
ス特許培養基保存施設(NRRL)に寄託された。
国イリノイ州ビオリア、ノース・ユニバーシティ・スト
リート1815番地、北部研究センター農業研究サービ
ス特許培養基保存施設(NRRL)に寄託された。
培養基二B.スリンギエン シス・バラエテ受託番号:
寄託間日:
培養基:
ィ・モリソニPS71M3−69
NRRL B−18515
!989年6月29日
バシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ◆イスラエレンシスPS12
301−45
受託番号: NRRL B−18514寄託期日:
1989年6月29日 本培養基は、37 CFRI.+4及び35 1Jsc
122の下でを特許庁長官に権限があると認められた
者は、本特許出願の対応米国出願の係属中に、培養基を
人手できることを保証されているという条件の下で寄託
された。また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提
出されている国々の外国特許法で要求されるとおりに、
寄託物は人手できる。しかし、寄託物が入手できるから
といって、行政行為によって付与された特許権を損わし
めて本発明を実施する権利を構成するものではないこと
を理解すべきてある. 更に、本培養基寄託物は、ブタベスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に利用可能とされる
。すなわち、寄託物の試料提洪に対する最も最近の請求
後少なくとも5年間、かつどんな場合も、寄託期日から
少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発酵され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能て汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託li1
!設が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合
には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への人手可能性に閏するすべ
ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久
に取り除かれる。
1989年6月29日 本培養基は、37 CFRI.+4及び35 1Jsc
122の下でを特許庁長官に権限があると認められた
者は、本特許出願の対応米国出願の係属中に、培養基を
人手できることを保証されているという条件の下で寄託
された。また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提
出されている国々の外国特許法で要求されるとおりに、
寄託物は人手できる。しかし、寄託物が入手できるから
といって、行政行為によって付与された特許権を損わし
めて本発明を実施する権利を構成するものではないこと
を理解すべきてある. 更に、本培養基寄託物は、ブタベスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に利用可能とされる
。すなわち、寄託物の試料提洪に対する最も最近の請求
後少なくとも5年間、かつどんな場合も、寄託期日から
少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発酵され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能て汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託li1
!設が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合
には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への人手可能性に閏するすべ
ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久
に取り除かれる。
本出願のB.t.培養基は、標準的な培地及び発酵技術
を用いて培養できる。発酵周期の終了後、この技術で周
知の手段で、まずB.t.胞子と結晶を発酵液から分離
することにより、細菌を取り入れることができる。
を用いて培養できる。発酵周期の終了後、この技術で周
知の手段で、まずB.t.胞子と結晶を発酵液から分離
することにより、細菌を取り入れることができる。
本出願のspo一変異種は、胞子を分離するための追加
段階なしに培養し、取り入れることができて有利である
。
段階なしに培養し、取り入れることができて有利である
。
!I抱を目標害虫環境に施用する時に殺虫活性を持続さ
せるために、B.t.細胞を処方に先立って、実質的に
無傷のまま処理できる。このような処理は、手法が殺虫
剤の性状に悪影響しない限り、又は殺虫剤を保護する細
胞能力を消滅させない限り、化学的又は物理的手段、又
は化学・物理的手段の組み合わせでありうる。化学試薬
の例はハロゲン化剤、特に原子番号I7−80のハロゲ
ン類である。
せるために、B.t.細胞を処方に先立って、実質的に
無傷のまま処理できる。このような処理は、手法が殺虫
剤の性状に悪影響しない限り、又は殺虫剤を保護する細
胞能力を消滅させない限り、化学的又は物理的手段、又
は化学・物理的手段の組み合わせでありうる。化学試薬
の例はハロゲン化剤、特に原子番号I7−80のハロゲ
ン類である。
更に詳しくは、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を
達成するのに十分な時間に使用できる。他の適当な手法
は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなア
ルデヒト類;塩化ゼフィランと塩化セチルビリジニウム
のような抗感染薬;イソブロビルアルコールとエタノー
ルのようなアルコール類;アアン固定液やヘリ一固定液
のような種々の絹織学的固定液(フマソン、グレッチェ
ン●エル(Humason,Gretchen L.)
r動物紹織の手法」ダアリュー◆エッチ・フリーマン社
、1967年);又は目標害虫環境に細胞を施用する時
に細胞内につくられる毒素の活性を持続さ仕るような物
理的手段(加熱〉及び化学的薬剤の組み合わせによる処
理を包含する。物理的手段の例は、ガンマ線とX線のよ
うな短波長の放射線、凍結、Uv照射、凍結乾燥等であ
る。微生物細胞の処理手順については、合衆国特許第4
,695,462号を参煕のこと。この特許の方法は、
参照により、本明細書に取入れられている. 本発明のB.t.細胞を種々の方法で処方できる。
達成するのに十分な時間に使用できる。他の適当な手法
は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなア
ルデヒト類;塩化ゼフィランと塩化セチルビリジニウム
のような抗感染薬;イソブロビルアルコールとエタノー
ルのようなアルコール類;アアン固定液やヘリ一固定液
のような種々の絹織学的固定液(フマソン、グレッチェ
ン●エル(Humason,Gretchen L.)
r動物紹織の手法」ダアリュー◆エッチ・フリーマン社
、1967年);又は目標害虫環境に細胞を施用する時
に細胞内につくられる毒素の活性を持続さ仕るような物
理的手段(加熱〉及び化学的薬剤の組み合わせによる処
理を包含する。物理的手段の例は、ガンマ線とX線のよ
うな短波長の放射線、凍結、Uv照射、凍結乾燥等であ
る。微生物細胞の処理手順については、合衆国特許第4
,695,462号を参煕のこと。この特許の方法は、
参照により、本明細書に取入れられている. 本発明のB.t.細胞を種々の方法で処方できる。
種々の不活性材料、例えば無機鉱物(フィロ珪酸塩、炭
酸塩、硫酸塩、燐酸塩等〉や植物材料(粉末トウモロコ
シ穂軸、もみ殻、くるみ殻等)と混合することにより、
水和剤、粒剤、又は粉剤として使用できる。処方剤は展
粘着助剤、安定剤、その他の殺虫剤添加物、又は表面活
性剤を包含できる.液体処方剤は水性基盤又は非水性で
あり、フォーム、ゲル、懸濁液、濃厚乳剤等として使用
できる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又
は重合体を包含できる. 殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使用
ざれるかによって、広範囲にわたる.殺虫剤は少なくと
もli量Xで存在し、100重量2でありうる.乾燥処
方剤は約1−95重ftzの殺虫剤をもつが、液体処方
剤は一般に約1・60重量2の固形分を液相中にもつで
あろう。処方剤は概してWIg当たり約102ないし約
10’個の細胞をもつであろう.これらの処方剤はへク
タール当たり約50 B(液体又は乾燥)ないし1 k
g以上の率で投与されよう。
酸塩、硫酸塩、燐酸塩等〉や植物材料(粉末トウモロコ
シ穂軸、もみ殻、くるみ殻等)と混合することにより、
水和剤、粒剤、又は粉剤として使用できる。処方剤は展
粘着助剤、安定剤、その他の殺虫剤添加物、又は表面活
性剤を包含できる.液体処方剤は水性基盤又は非水性で
あり、フォーム、ゲル、懸濁液、濃厚乳剤等として使用
できる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又
は重合体を包含できる. 殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使用
ざれるかによって、広範囲にわたる.殺虫剤は少なくと
もli量Xで存在し、100重量2でありうる.乾燥処
方剤は約1−95重ftzの殺虫剤をもつが、液体処方
剤は一般に約1・60重量2の固形分を液相中にもつで
あろう。処方剤は概してWIg当たり約102ないし約
10’個の細胞をもつであろう.これらの処方剤はへク
タール当たり約50 B(液体又は乾燥)ないし1 k
g以上の率で投与されよう。
処方剤は双翅目害虫環境、例えは植物、土壌、又は水に
噴霧、散布、散水等によって施用できる。
噴霧、散布、散水等によって施用できる。
以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した
実施例である。これらの例は限定的に労えられてはなら
ない。他に注意がなければ、百分率はすべて11溶媒混
合物割合はすべて容量による. 実施例I B.t.PS71M3及ひB.t.PS1
23DIの培養B.t.PS71M3及びB.t.PS
123[11の二次培養基又は出発培養基を使用して、
LBブロスとして知られる次の培地に接種した。
実施例である。これらの例は限定的に労えられてはなら
ない。他に注意がなければ、百分率はすべて11溶媒混
合物割合はすべて容量による. 実施例I B.t.PS71M3及ひB.t.PS1
23DIの培養B.t.PS71M3及びB.t.PS
123[11の二次培養基又は出発培養基を使用して、
LBブロスとして知られる次の培地に接種した。
トリブトン to g
酵母エキス 58
NaCI 5 g
5N NaO}1 0.6 ml水
1000.0
ml標準的な微生物学手法に従って、上の培地は接種
に先立って滅菌され、接種は無菌手順を用いて行なわれ
る。
1000.0
ml標準的な微生物学手法に従って、上の培地は接種
に先立って滅菌され、接種は無菌手順を用いて行なわれ
る。
詳細な手111ロは以下のとおのである。
無菌のPl,IYE培地(水1リットル中ベブトン5%
、酵母エキス0.1%、N a l.” I O .
5%; p++ 7.5に調整)を含有する一連の15
0 ml三角フラスコに、B.t.PS71M3及びR
. t. PS123Dlのベトリ皿培養基から接種す
る。フラスコを回転振どう機( 200 rpm)上で
一夜30゛Cで培責ずろ。この出発培養基から、7.5
m1の出発培養基を用いて、2リットルフラスコ中のし
Rブロス300 mlに接種する。LBアロスのフラス
コを出発培養基と同し条件下に培養するが、2〜3時間
後に取り入れろ。600 nmての光学密度は1.0で
ある。
、酵母エキス0.1%、N a l.” I O .
5%; p++ 7.5に調整)を含有する一連の15
0 ml三角フラスコに、B.t.PS71M3及びR
. t. PS123Dlのベトリ皿培養基から接種す
る。フラスコを回転振どう機( 200 rpm)上で
一夜30゛Cで培責ずろ。この出発培養基から、7.5
m1の出発培養基を用いて、2リットルフラスコ中のし
Rブロス300 mlに接種する。LBアロスのフラス
コを出発培養基と同し条件下に培養するが、2〜3時間
後に取り入れろ。600 nmての光学密度は1.0で
ある。
上の手順は、この技術で周知の手順により、大発酵装置
まで容易に規模拡大できる。
まで容易に規模拡大できる。
上の発酵で得られるFl.t.m胞は、この技術で周チ
ロの手順により単離てきる。しばしば用いられる手11
屓は、取り入れた発#液を分離手+ll(i,例えば遠
心分離にかけることである。その代わりに、B.t.細
胞を既述のように取り入れずに、発酵容器中で処理でき
る。
ロの手順により単離てきる。しばしば用いられる手11
屓は、取り入れた発#液を分離手+ll(i,例えば遠
心分離にかけることである。その代わりに、B.t.細
胞を既述のように取り入れずに、発酵容器中で処理でき
る。
実施例2 s.t.バラエティ・モリソニ(PS71
M3−69)及ひR.t.バラエティ●イスラエレンシ
ス(PS123f)l−45)と指定される無胞子性の
溶菌マイナス変X 14の調製 本発明の新規な無胞子性の請菌マイナス変異種は、次の
ように調製された。
M3−69)及ひR.t.バラエティ●イスラエレンシ
ス(PS123f)l−45)と指定される無胞子性の
溶菌マイナス変X 14の調製 本発明の新規な無胞子性の請菌マイナス変異種は、次の
ように調製された。
l. 野性型B.t.バラエティ・モリソニPS7+1
−13及U B.t. イスラZ レン’y 7. P
S123rllを冷凍(一85℃)アンプルから直接に
栄養寒天培地へ線状接種した。
−13及U B.t. イスラZ レン’y 7. P
S123rllを冷凍(一85℃)アンプルから直接に
栄養寒天培地へ線状接種した。
接種はプレー}IQ枚に行なった。
2. 次にプレートを30゜Cて72時間培養した。
3. 滅菌の0.05M Pt)4緩衝液(pH 7.
0)(各プレートに7 it)によって胞子を取り入れ
た。
0)(各プレートに7 it)によって胞子を取り入れ
た。
4. 次に懸濁液を各IQ m15回のアリコートで分
離した。
離した。
5. 増殖間の細胞を殺菌するために、5アリコートを
70℃の温浴にかけた。
70℃の温浴にかけた。
6. これらの処理試料に、エチルメタンスルホネー}
(EMS)(シグマ・ケミカル社から人手)を添加し
た。添加量は0.15 ml; 0.25 n3 0.
35 ml;0.50 mlであった。
(EMS)(シグマ・ケミカル社から人手)を添加し
た。添加量は0.15 ml; 0.25 n3 0.
35 ml;0.50 mlであった。
?. EMSの添加後、試料を30℃、350 rp
m (回転振とう機)で18時間培養した。
m (回転振とう機)で18時間培養した。
8. 次に処理培養基を無菌蒸留水10 mlで2回洗
い、8,000 rpmで5分の遠心分離にかけた.殺
虫率を決定するために、プレートカウントを行なった。
い、8,000 rpmで5分の遠心分離にかけた.殺
虫率を決定するために、プレートカウントを行なった。
9。 次に、最終ベレットを無菌食塩水10 mlと4
0%無菌グリセロール10 ifに再懸濁し、−85℃
で保存した。
0%無菌グリセロール10 ifに再懸濁し、−85℃
で保存した。
10. 振どうフラスコの培地中で無胞子性変異種を選
別し、発酵の終期に泄傷で毒素結晶を含有する変異種を
選択することによって、溶菌マイナス菌株を確認できる
。
別し、発酵の終期に泄傷で毒素結晶を含有する変異種を
選択することによって、溶菌マイナス菌株を確認できる
。
範囲: EMS: 0.15 ml0.50 m
l殺虫$ : 98−99.999% EMSa用時間+ 15−18時間 温浴適用温度: To−80℃ バシラス・スリンギエンシスの無胞子性mVJマイナス
変′A種を得るためのその他の手段としては、ニトロソ
グアニジン、Uv照削、亜硝酸、部位特異的変異誘発な
どがある。
l殺虫$ : 98−99.999% EMSa用時間+ 15−18時間 温浴適用温度: To−80℃ バシラス・スリンギエンシスの無胞子性mVJマイナス
変′A種を得るためのその他の手段としては、ニトロソ
グアニジン、Uv照削、亜硝酸、部位特異的変異誘発な
どがある。
実施例3 変異菌株B. t.Ps71M3−69及び
B.t.PS123DI−45からの、それぞれの親菌
株[1.t.PS71M3及びB.t.PS1231J
Iの調製低温殺菌のような応力条件下に、変異種から親
菌株を得ることができる。下記の条件下に、次の復帰頻
度が確定された。
B.t.PS123DI−45からの、それぞれの親菌
株[1.t.PS71M3及びB.t.PS1231J
Iの調製低温殺菌のような応力条件下に、変異種から親
菌株を得ることができる。下記の条件下に、次の復帰頻
度が確定された。
PS123DI−45 7.92 x 1
0−■PS71M3−69 1.63 x
10−”統計的に、これはI x !O”個の細胞の
うち1個が復帰細胞であることを示す。低温殺菌後に発
見された胞子形成体く復帰!!I抱)の成長から生ずる
タンパクのゲル走査分析は、両菌株とも?Jl!sll
i!と同じであった。手;116は次のとおりである。
0−■PS71M3−69 1.63 x
10−”統計的に、これはI x !O”個の細胞の
うち1個が復帰細胞であることを示す。低温殺菌後に発
見された胞子形成体く復帰!!I抱)の成長から生ずる
タンパクのゲル走査分析は、両菌株とも?Jl!sll
i!と同じであった。手;116は次のとおりである。
l. 希釈培地(Lブロス)1リットル中で変異種培養
基( B.t.PS71M3−69又は[+.t.PS
123DI−45)を回転振とう機上で24時間生育さ
せる。
基( B.t.PS71M3−69又は[+.t.PS
123DI−45)を回転振とう機上で24時間生育さ
せる。
2. 細胞懸濁液を取入れ、無菌の遠心分離びんに移し
、8,000 rpmで10分間遠沈させろ。
、8,000 rpmで10分間遠沈させろ。
3. 上澄み液を除き、ベレットを容量50 mにする
量の無菌脱イオン水中に再悲濁させる。
量の無菌脱イオン水中に再悲濁させる。
4. ベレットを再懸濁し、無菌フラスコに移す。この
未処理材科から7レートカウントを行なう。
未処理材科から7レートカウントを行なう。
5. フラスコを80℃の温浴中に入れて、200rp
mで15分振どうする。
mで15分振どうする。
6. フラスコを取り出し、懸濁液を栄養寒天上にプレ
ートする(50mlでプレート50枚)。
ートする(50mlでプレート50枚)。
7. プレートを30℃で48時間培養し、現われる集
落を顕微鏡観察する。
落を顕微鏡観察する。
8. 栄養寒天上Lこ胞子形成体を二次培養し、72時
間培養する.復帰頻度は、胞子形成体の数を全処理細胞
数で割ることによって算出ざれる。
間培養する.復帰頻度は、胞子形成体の数を全処理細胞
数で割ることによって算出ざれる。
例: (8.9xlO’ cfu/ml)x50 m
l == 4.45X10”処理細胞 3胞子形成体が見つかる。
l == 4.45X10”処理細胞 3胞子形成体が見つかる。
3/4.45xl011= 0.74xlO−129.
胞子形成体の身元を決定するために、「復帰体」を液
体発酵培地中て親菌株と平行して生育させる。
胞子形成体の身元を決定するために、「復帰体」を液
体発酵培地中て親菌株と平行して生育させる。
10. 生ずるタンパクを、親から生ずるものと比較分
析する。「復帰体」と親菌株は同一帯域移動パターンを
もつはずである。
析する。「復帰体」と親菌株は同一帯域移動パターンを
もつはずである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・モリソ
ニPS71M3;バシラス・スリンギエンシス・バラエ
ティ・イスラエレンシスPS123D1;寄託番号NR
RLB−18515の確認特性をもったバシラス・スリ
ンギエンシス・バラエティ・モリソニPS71M3−6
9;及び寄託番号NRRLB・18514の確認特性を
もったバシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イス
ラエレンシスPS123D1−45からなる群から選ば
れる微生物の昆虫防除有効量に害虫を接触させることを
含めてなる、昆虫の防除法。 2、微生物がバシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・モリソニPS71M3である、特許請求の範囲第1項
に記載の方法。 3、微生物がバシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・イスラエレンシスPS123D1である、特許請求の
範囲第1項に記載の方法。 4、微生物がバシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・モリソニPS71M3−69である、特許請求の範囲
第1項に記載の方法。 5、微生物がバシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・イスラエレンシスPS123D1−45である、特許
請求の範囲第1項に記載の方法。 6、上記の害虫が双翅目に属している、特許請求の範囲
第1項に記載の方法。 7、上記の害虫が蚊である、特許請求の範囲第1項に記
載の方法。 8、上記の蚊がネッタイシマカ(Aedes aegy
pti)、アエデス・ドルサリス(Aedes dor
salis)、アノフエレス・アルボマニス(Anop
heles albomanis)、クレックス・ピピ
エンス(Culex pipiens)、クレックス・
キンケフアシアツス(Culex quinquefa
s−ciatus)、及びクレックス・タルサリス(C
ulex ta−rsalis)からなる群から選ばれ
る、特許請求の範囲第7項に記載の方法。 9、寄託番号HRRLB−18515の確認特性をもっ
たバシラス・スリンギエンシス・バラエティ・モリソニ
PS71M3−69;及び寄託番号NRRLB−185
14の確認特性をもったバシラス・スリンギエンシス・
バラエティ・イスラエレンシスPS123D1−45か
らなる群から選ばれる安定なlysis^−spo^−
cry^+バシラス・スリンギエンシスの昆虫防除有効
量に、上記の害虫を接触させることを含めてなる、感受
性をもった害虫の防除法。 10、上記の害虫が双翅目に属している、特許請求の範
囲第9項に記載の方法。 11、上記の害虫が蚊である、特許請求の範囲第10項
に記載の方法。 12、上記の蚊がネッタイシマカ(アエデス・アエギプ
チ)、アエデス・ドルサリス、アノフェレス・アルボマ
ニス、クレックス・ピピエンス、クレックス・キンケフ
アシアツス、及びクレックス・タルサリスからなる群か
ら選ばれる、特許請求の範囲第11項に記載の方法。 13、殺虫剤担体と組み合わせた、寄託番号NRRLB
−18515の確認特性をもったバシラス・スリンギエ
ンシス・バラエティ・モリソニPS71M3−69;及
び寄託番号NRRLB−18514の確認特性をもつた
バシラス・スリンギエンシス・バラエテイ・イスラエレ
ンシスPS123D1−45からなる群から選ばれる安
定なlysis^−spo^−cry^+バシラス・ス
リンギエンシスを含めてなる、物質の組成物。 14、上記の安定なlysis^−spo^−cry^
+バシラス・スリンギエンシスがバシラス・スリンギエ
ンシス・バラエティ・モリソニPS71M3−69であ
る、特許請求の範囲第13項に記載の物質の組成物。 15、上記の安定なlysis^−spo^−cry^
+バシラス・スリンギエンシスがバシラス・スリンギエ
ンシス・バラエティ・イスラエレンシスPS123D1
−45である、特許請求の範囲第13項に記載の物質の
組成物。 16、殺虫剤担体と組み合わせたバシラス・スリンギエ
ンシス・バラエティ・モリソニPS71M3とバシラス
・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシスP
S123D1からなる群から選ばれるバシラス・スリン
ギエンシスを含めてなる、物質の組成物。 17、上記のバシラス・スリンギエンシスがバシラス・
スリンギエンシス・バラエティ・モリソニPS71M3
である、特許請求の範囲第16項に記載の物質の組成物
。 18、上記のバシラス・スリンギエンシスが、バシラス
・スリンギエンシス・バラエテイ・イスラエレンシスP
S123D1である、特許請求の範囲第16項に記載の
物質の組成物。 19、目標害虫環境に施用されると持続的な殺虫活性と
摂食帯域でより大きな持続性をもった実質的に無傷の処
理細胞を含めてなる殺虫剤組成物であつて、上記の殺虫
剤が双翅目昆虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり
、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・モリソニ
PS71M3;バシラス・スリンギエンシス・バラエテ
イ・イスラエレンシスPS123D1;寄託番号NRR
LB−18515の確認特性をもったバシラス・スリン
ギエンシス・バラエティ・モリソニPS71M3−69
;及び寄託番号NRRLB−18514の確認特性をも
ったバシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラ
エレンシスPS123D1−45からなる群から選ばれ
る微生物によってつくられる場合の殺虫剤組成物。 20、上記の処理細胞が、環境中で殺虫活性を持続させ
るために、化学的又は物理的手段によって処理される、
特許請求の範囲第19項に記載の殺虫剤組成物。 21、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・モリソニPS71M3である、特許請求の範
囲第20項に記載の殺虫剤組成物。 22、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスPS123D1である、特
許請求の範囲第20項に記載の殺虫剤組成物。 23、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・モリソニPS71M3−69である、特許請
求の範囲第20項に記載の殺虫剤組成物。 24、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエテイ・イスラエレンシスPS123D1−45であ
る、特許請求の範囲第20項に記載の殺虫剤組成物。 25、目標害虫環境に施用されると持続的な殺虫活性を
もった実質的に無傷の処理細胞を含めてなる殺虫剤組成
物の昆虫防除有効量に害虫を接触させることを含めてな
る害虫防除法であって、上記の殺虫剤が双翅目昆虫に有
毒なポリペプチドで、細胞内にあり、バシラス・スリン
ギエンシス・バラエティ・モリソニPS71M3;バシ
ラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシ
スPS123D1;寄託番号NRRLB−18515の
確認特性をもったバシラス・スリンギエンシス・バラエ
ティ・モリソニPS71M3−69;及び寄託番号NR
RLB−18514の確認特性をもったバシラス・スリ
ンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシスPS12
3D1−45からなる群から選ばれる微生物によってつ
くられる場合の害虫防除法。 26、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・モリソニPS71M3である、特許請求の範
囲第25項に記載の方法。 27、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスPS123D1である、特
許請求の範囲第25項に記載の方法。 28、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエテイ・モリソニPS71M3−69である、特許請
求の範囲第25項に記載の方法。 29、上記の微生物がバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスPS123D1−45であ
る、特許請求の範囲第25項に記載の方法。 30、上記の昆虫が蚊である、特許請求の範囲第25項
に記載の方法。 31、上記の蚊がネツタイシマカ(Aedes aeg
yp−ti)、アエデス・ドルサリス(Aedes d
orsalis)、アノフエレス・アルボマニス(An
opheles alboma−nis)、クレックス
・ピピエンス(Culex pipiens)、クレッ
クス・キンケフアシアツス(Culex quinqu
e−fasciatus)、及びクレックス・タルサリ
ス(Culextarsalis)からなる群から選ば
れる、特許請求の範囲第30項に記載の方法。
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