JP2950614B2 - デルタエンドトキシンを高収率で産生するバシラスツリンゲンシスの突然変異株又は変異株 - Google Patents
デルタエンドトキシンを高収率で産生するバシラスツリンゲンシスの突然変異株又は変異株Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 バシラス ツリンゲンシス（Bacillus thringiensi
s）の商業上の製剤は、害虫の生物学的制御用として広
く用いられている。これらの細菌殺虫剤の利点は、非常
に制限された範囲の標的混虫に対し極めて選択的であり
かつ生分解性であるということである。
s）の商業上の製剤は、害虫の生物学的制御用として広
く用いられている。これらの細菌殺虫剤の利点は、非常
に制限された範囲の標的混虫に対し極めて選択的であり
かつ生分解性であるということである。
バシラス ツリンゲンシスの商業製剤は、副作用を有
さずに収穫の直前に使用できる。
さずに収穫の直前に使用できる。
バシラス ツリンゲンシスは、棒状の嫌気性の胞子形
成細菌であり、これはスロゾイト形成過程中、１個又は
それ以上の封入体（副芽胞結晶と呼ばれる）の産生を特
徴とする。これらの結晶は、高分子量の蛋白質（デルタ
エンドトキシンと呼ばれる）から構成される。デルタ
−エンドトキシンは、バシラス ツリンゲンシスの商業
的に入手できる製剤中の有効成分である。
成細菌であり、これはスロゾイト形成過程中、１個又は
それ以上の封入体（副芽胞結晶と呼ばれる）の産生を特
徴とする。これらの結晶は、高分子量の蛋白質（デルタ
エンドトキシンと呼ばれる）から構成される。デルタ
−エンドトキシンは、バシラス ツリンゲンシスの商業
的に入手できる製剤中の有効成分である。
種々の害虫宿主スペクトルを有する多くのB.ツリンゲ
ンシスは、同定されてきている。それらは、鞭毛状の抗
原に基づき種々の亜種に分類される。特に興味あるもの
は、蝶蛾類鱗翅目の害虫に用いられるバシラス ツリン
ゲンシス亜種カルスタキおよび亜種アイザワイ、双翅目
害虫の駆除に用いられるバシラス ツリンゲンシス亜種
イスラレンシスおよび甲虫類の害虫の駆除のために用い
られるバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスで
ある。
ンシスは、同定されてきている。それらは、鞭毛状の抗
原に基づき種々の亜種に分類される。特に興味あるもの
は、蝶蛾類鱗翅目の害虫に用いられるバシラス ツリン
ゲンシス亜種カルスタキおよび亜種アイザワイ、双翅目
害虫の駆除に用いられるバシラス ツリンゲンシス亜種
イスラレンシスおよび甲虫類の害虫の駆除のために用い
られるバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスで
ある。
甲虫毒性バシラス ツリンゲンシスの最初の単離は、
1983年に報告された（K.クリーン等、Z.and.End.96,500
〜508、ヨーロッパ特許公開0149162）。
1983年に報告された（K.クリーン等、Z.and.End.96,500
〜508、ヨーロッパ特許公開0149162）。
単離物（これは、バシラス ツリンゲンシス亜種テネ
ブリオニスと呼ばれる）は、受託番号DSM2803をもって
ジャーマン コレッイション オブ バイオオーガニズ
ムに寄託された。バシラス ツリンゲンシス亜種テネブ
リオニスは、コメノゴミムシダマンおよびチャイロコメ
ノゴミムシダマシの幼虫、テネブリオ モリト（Tenebr
io moritor）（テネブリオニデ、コレオプテラ）の蛹の
死体から1982年に単離された。菌株は各細胞内に１種の
胞子および１種以上の殺虫性副芽胞結晶を産生し、この
結晶は平らな板状形であり、約0.8μｍ〜15μｍの端長
を有する。これはバシリス ツリンゲンシスの血清型H8
a,8bおよび病理型Ｃに属する（クリーク等、System.App
l.Microbiol.9,138〜141,1978、米国特許4,766,203） これは、或る種の食葉甲虫の幼虫に対しのみ毒性があ
るが、青虫（レピドプテラ）、蚊（ジプテラ）又は他の
混虫に対して有効でない。バシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオンニスからの結晶および胞子又は単離した
結晶を取込んだ後、コロラドポテト甲虫（レプチノタル
サ デセミレネアタ）の幼虫および一定の成虫の給餌を
止める。幼生期段階のL1−L3は、１〜３日以内に死亡す
る（シエネテル等、「Fundamental and applied aspect
s of invertebrate pathologys」R.A.サムサン等、Proc
eedingo of the 4th Int.Colloquim of Invertebrate P
athology,555頁、1986年）。
ブリオニスと呼ばれる）は、受託番号DSM2803をもって
ジャーマン コレッイション オブ バイオオーガニズ
ムに寄託された。バシラス ツリンゲンシス亜種テネブ
リオニスは、コメノゴミムシダマンおよびチャイロコメ
ノゴミムシダマシの幼虫、テネブリオ モリト（Tenebr
io moritor）（テネブリオニデ、コレオプテラ）の蛹の
死体から1982年に単離された。菌株は各細胞内に１種の
胞子および１種以上の殺虫性副芽胞結晶を産生し、この
結晶は平らな板状形であり、約0.8μｍ〜15μｍの端長
を有する。これはバシリス ツリンゲンシスの血清型H8
a,8bおよび病理型Ｃに属する（クリーク等、System.App
l.Microbiol.9,138〜141,1978、米国特許4,766,203） これは、或る種の食葉甲虫の幼虫に対しのみ毒性があ
るが、青虫（レピドプテラ）、蚊（ジプテラ）又は他の
混虫に対して有効でない。バシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオンニスからの結晶および胞子又は単離した
結晶を取込んだ後、コロラドポテト甲虫（レプチノタル
サ デセミレネアタ）の幼虫および一定の成虫の給餌を
止める。幼生期段階のL1−L3は、１〜３日以内に死亡す
る（シエネテル等、「Fundamental and applied aspect
s of invertebrate pathologys」R.A.サムサン等、Proc
eedingo of the 4th Int.Colloquim of Invertebrate P
athology,555頁、1986年）。
近年、以下の内容が明らかにされた。すなわち、甲虫
活性の結晶に加えてバシラス ツリンゲンシス亜種テネ
ブリオニスは、紡鐘形、スペロイダル（speroidol）、
又は板状の他の副芽胞結晶を生成する（A.M.フーゲルお
よびA.クリーク、J.Appl.Ent.108,490〜497,1989）。第
二の結晶の活性は未だ知られていない。
活性の結晶に加えてバシラス ツリンゲンシス亜種テネ
ブリオニスは、紡鐘形、スペロイダル（speroidol）、
又は板状の他の副芽胞結晶を生成する（A.M.フーゲルお
よびA.クリーク、J.Appl.Ent.108,490〜497,1989）。第
二の結晶の活性は未だ知られていない。
バシラス ツリンゲンシス亜種の４種の商業製品は、
甲虫の駆除に開発されている。ノボ ノルディスク社製
造のノボドール（NOVODOR（登録商標））、サンド社の
トリデント（TRIDENT（登録商標））、およびアボット
ラボラトリー社のジテラ（DiTerra（登録商標））、
およびエコゲン社のフォイル（Foil）（登録商標））で
ある。
甲虫の駆除に開発されている。ノボ ノルディスク社製
造のノボドール（NOVODOR（登録商標））、サンド社の
トリデント（TRIDENT（登録商標））、およびアボット
ラボラトリー社のジテラ（DiTerra（登録商標））、
およびエコゲン社のフォイル（Foil）（登録商標））で
ある。
他の甲虫毒バシラス ツリンゲンシス菌株の単離は、
1986年に報告された（ヘルンスタット等、Bio/Technolo
gy,4巻、305〜308,1986、米国特許4,764,372,1988年）
「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」と称さ
れるこの菌株、M7は、寄託番号NRRL Ｂ−15939をもっ
てノーザン レージョナル リサーチ ラボラトリー
（USA）に寄託された。「バシラス ツリンゲンシス亜
種サン ジエゴ」に基づく商業製品は、マイコーゲン社
により開発された。
1986年に報告された（ヘルンスタット等、Bio/Technolo
gy,4巻、305〜308,1986、米国特許4,764,372,1988年）
「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」と称さ
れるこの菌株、M7は、寄託番号NRRL Ｂ−15939をもっ
てノーザン レージョナル リサーチ ラボラトリー
（USA）に寄託された。「バシラス ツリンゲンシス亜
種サン ジエゴ」に基づく商業製品は、マイコーゲン社
により開発された。
バシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、DSM2
803および植物細胞の表現型特徴を含む「バシラス ツ
リンゲンシス亜種サン ジエゴ」、NRRL−Ｂ 15939の
比較研究、毒性副芽胞結晶の特徴およびプラスミドDNA
の分析は、しかし、「バシラス ツリンゲンシス亜種サ
ン ジエゴ」が先に単離された株DSM2803、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと明らかに同一であ
ることを示している（クリーゲ等、J.Appln.Ent.104,41
7〜424,1987））。更にバシラス ツリンゲンシス亜種
テネブリオニスおよび「バシラス ツリンゲンシス亜種
サン ジエゴ」由来の甲虫活性デルタ エンドトキシン
遺伝子のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配
列は同一である。
803および植物細胞の表現型特徴を含む「バシラス ツ
リンゲンシス亜種サン ジエゴ」、NRRL−Ｂ 15939の
比較研究、毒性副芽胞結晶の特徴およびプラスミドDNA
の分析は、しかし、「バシラス ツリンゲンシス亜種サ
ン ジエゴ」が先に単離された株DSM2803、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと明らかに同一であ
ることを示している（クリーゲ等、J.Appln.Ent.104,41
7〜424,1987））。更にバシラス ツリンゲンシス亜種
テネブリオニスおよび「バシラス ツリンゲンシス亜種
サン ジエゴ」由来の甲虫活性デルタ エンドトキシン
遺伝子のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配
列は同一である。
同一の培養条件下で前記の第二のタイプの結晶は又、
「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」により
合成される（A.M.フーゲル アンド A.クリーク、J.Ap
pl.Ent,108,490〜497,1989）。
「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」により
合成される（A.M.フーゲル アンド A.クリーク、J.Ap
pl.Ent,108,490〜497,1989）。
バジャックおよびE.フラコン（Entomophaga 35
（２）,233〜240,1990）によれば、「サン ジエゴ」単
離物は、「テネブリオニス」（tenebrionis）に類似し
ており、更にそれを異なる亜種として正当に見なみこと
はできない。
（２）,233〜240,1990）によれば、「サン ジエゴ」単
離物は、「テネブリオニス」（tenebrionis）に類似し
ており、更にそれを異なる亜種として正当に見なみこと
はできない。
甲虫の害虫を駆除するためのバシシス ツリンゲンシ
スの有用性は、甲虫活性毒素の有効性およびその経済的
生産性および生産物の効力に依存する。一方、これは害
虫活性バシラス ツリンゲンシス株の発酵によって産生
されるデルタ エンドトキシンの量に依存する。
スの有用性は、甲虫活性毒素の有効性およびその経済的
生産性および生産物の効力に依存する。一方、これは害
虫活性バシラス ツリンゲンシス株の発酵によって産生
されるデルタ エンドトキシンの量に依存する。
B.ツリンゲンシスは、殺虫剤の製造に対し多年用いら
れてきたが、デルタ−エンドトキシンの増加を伴う突然
変異株は有利であろう。しかし、そのような変異株はこ
れまで記載されていない。
れてきたが、デルタ−エンドトキシンの増加を伴う突然
変異株は有利であろう。しかし、そのような変異株はこ
れまで記載されていない。
高収率でデルタ−エンドトキシンを産生する突然変異
株は、B.ツリンゲンシス毒素のより有効でかつ経済的産
生並びに同等のコストでより強力なB.ツリンゲンシスの
生産に対する可能性を与えるであろう。一方、これは利
用者に対しては有利であろう。何故ならより少ない量の
殺虫剤が保存され、更に一定の面積に対して取扱われる
からである。加えて、使用者はより少ない容器材料で処
理でき、これにより環境への影響を少なくすることがで
きる。
株は、B.ツリンゲンシス毒素のより有効でかつ経済的産
生並びに同等のコストでより強力なB.ツリンゲンシスの
生産に対する可能性を与えるであろう。一方、これは利
用者に対しては有利であろう。何故ならより少ない量の
殺虫剤が保存され、更に一定の面積に対して取扱われる
からである。加えて、使用者はより少ない容器材料で処
理でき、これにより環境への影響を少なくすることがで
きる。
突然変異を通じてのバシラス ツリンゲンシス亜種テ
ネブリオニスによるデルタ エンドトキシンの生産性の
改良は、これまでに報告されていない。
ネブリオニスによるデルタ エンドトキシンの生産性の
改良は、これまでに報告されていない。
甲虫の幼虫を駆除することにおける特にB.ツリンゲン
シス亜種テネブリオニスの使用に関する一つの問題は、
処理されるべき領域に対し相当に多量の製剤を必要とす
る製剤の能力又は強度が相当に低いということである。
例えば殆ど他のB.ツリンゲンシス製品および殆ど他の殺
虫剤は１〜21/haであるのに比較し、５〜101/ha必要で
ある。
シス亜種テネブリオニスの使用に関する一つの問題は、
処理されるべき領域に対し相当に多量の製剤を必要とす
る製剤の能力又は強度が相当に低いということである。
例えば殆ど他のB.ツリンゲンシス製品および殆ど他の殺
虫剤は１〜21/haであるのに比較し、５〜101/ha必要で
ある。
従って改良された強度を有する製品に対する必要性が
存在する。
存在する。
この問題を解決する一つの方法は、製剤の濃度を高め
ることであろう。しかし、これは保存および輸送におい
て得られる節約に比較して相当に生産コストが高くなる
であろう。
ることであろう。しかし、これは保存および輸送におい
て得られる節約に比較して相当に生産コストが高くなる
であろう。
はるかによりすばらしい解決法は、細胞当たり実質的
により多量のデルタ エンドトキシンを生産し得るB.ツ
リンゲンシス株の突然変異体を造ることであろう。
により多量のデルタ エンドトキシンを生産し得るB.ツ
リンゲンシス株の突然変異体を造ることであろう。
発明の要約 従って本発明は、一の面において、それらの親株より
も実質的により多量の毒素を生産し得る突然変異もしく
は変異バシラス ツリンゲンシス株に関する。
も実質的により多量の毒素を生産し得る突然変異もしく
は変異バシラス ツリンゲンシス株に関する。
他の面において、本発明は、亜種テネブリオニスに属
するB.ツリンゲンシス株の高生産性突然変異株もしくは
変異株に関する。
するB.ツリンゲンシス株の高生産性突然変異株もしくは
変異株に関する。
本発明の更に他の面は、殺虫製品の製剤のためにその
ような突然変異もしくは変異バシラス ツリンゲンシス
株の使用、並びに有効成分として本発明の突然変異又は
変異バシラス ツリンゲンシス株によって産生されるデ
ルタ−エンドトキシンを含んでなるそのような殺虫組成
物にも関する。
ような突然変異もしくは変異バシラス ツリンゲンシス
株の使用、並びに有効成分として本発明の突然変異又は
変異バシラス ツリンゲンシス株によって産生されるデ
ルタ−エンドトキシンを含んでなるそのような殺虫組成
物にも関する。
また、本発明は、その一つの面において問題となって
いるデルタ−エンドトキシンの活性に感度性の害虫が駆
除されるべきである領域に、本発明に係る組成物を適用
することにより害虫を駆除する方法に関する。
いるデルタ−エンドトキシンの活性に感度性の害虫が駆
除されるべきである領域に、本発明に係る組成物を適用
することにより害虫を駆除する方法に関する。
更に別の面において、本発明はそれらの親株よりも実
質的により多量のデルタ エンドトキシンを産生し得る
そのような変異された又は突然変異されたB.ツリンゲン
シス株を得るために選択し、もしくは突然変異させ次い
で選択する方法に関する。
質的により多量のデルタ エンドトキシンを産生し得る
そのような変異された又は突然変異されたB.ツリンゲン
シス株を得るために選択し、もしくは突然変異させ次い
で選択する方法に関する。
微生物の寄託 本発明を詳細に記載する目的のため、高量のデルタ−
エンドトキシンを産生するバシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp.ten
ebrionis）の突然変異株を、ドイツチェ ザンムルク
フォン マイクロオルガニネメン ウント ツェルクル
ツレン GmbH、（マツシエローデルベルク1b,D−3300
ブラウシバイク、ドイツ共和国）に、下記に示す日に特
許手続の目的のため寄託した。DSMはブダペスト条約に
基づく国際機関であり、条約の規則９に従って寄託の不
変性を付与する。
エンドトキシンを産生するバシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp.ten
ebrionis）の突然変異株を、ドイツチェ ザンムルク
フォン マイクロオルガニネメン ウント ツェルクル
ツレン GmbH、（マツシエローデルベルク1b,D−3300
ブラウシバイク、ドイツ共和国）に、下記に示す日に特
許手続の目的のため寄託した。DSMはブダペスト条約に
基づく国際機関であり、条約の規則９に従って寄託の不
変性を付与する。
寄託日 1989年10月10日 委託者の参照番号 NB176−１ DSMの受託番号 DSM5480 突然変異株DSM5480は、バシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオニス、菌株DSM5526（これは又下記に示す
ようにブダペスト条約に基づき寄託された）を突然変異
させることにより得られた。
種テネブリオニス、菌株DSM5526（これは又下記に示す
ようにブダペスト条約に基づき寄託された）を突然変異
させることにより得られた。
寄託日 1989年９月14日 寄託者の参照番号 NB125 DSMの受託番号 DSM5526 発明の開示 本発明は、その一般的な面において、その親株に比較
して高量の活性デルタ−エンドトキシンを産生するバシ
ラス ツリンゲンシスの突然変異株又は突然変異株に関
する。
して高量の活性デルタ−エンドトキシンを産生するバシ
ラス ツリンゲンシスの突然変異株又は突然変異株に関
する。
本明細書中、表現の「高量」は好ましくは少なくとも
２倍又はそれ以上を意味する。
２倍又はそれ以上を意味する。
本発明のこの面において更に以下に示す本発明のより
特異的面の双方において、B.ツリンゲンシス突然変異株
によって産生されるデルタ−エンドトキシンは、その親
B.ツリンゲンシスと同様の害虫、例えば鱗翅目害虫（こ
れに対してはB.ツリンゲンシス亜種カルスタキおよび亜
種アイザワの突然変異株）、双翅目害虫（これに対して
はB.ツリンゲンシス亜種イスラレンシスからの突然変異
株）又は甲虫類の害虫（これに対してはB.ツリンゲンシ
ス亜種テネブリオニスの突然変異株）に対して企図され
る活性を有するであろう。
特異的面の双方において、B.ツリンゲンシス突然変異株
によって産生されるデルタ−エンドトキシンは、その親
B.ツリンゲンシスと同様の害虫、例えば鱗翅目害虫（こ
れに対してはB.ツリンゲンシス亜種カルスタキおよび亜
種アイザワの突然変異株）、双翅目害虫（これに対して
はB.ツリンゲンシス亜種イスラレンシスからの突然変異
株）又は甲虫類の害虫（これに対してはB.ツリンゲンシ
ス亜種テネブリオニスの突然変異株）に対して企図され
る活性を有するであろう。
本発明の一の特定の態様において、B.ツリンゲンシス
は亜種テネブリオニスに属し、産生されたデルタ−エン
ドトキシンは甲虫に対して活性である。
は亜種テネブリオニスに属し、産生されたデルタ−エン
ドトキシンは甲虫に対して活性である。
この面のもと本発明の好ましい態様において、B.ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株又は変異株
は、菌株DSM2803の３倍以上のデルタ エンドトキシン
を産生することができる。
ンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株又は変異株
は、菌株DSM2803の３倍以上のデルタ エンドトキシン
を産生することができる。
本発明の別の態様は、B.ツリンゲンシス亜種テネブリ
オニスの突然変異株又は変異株を含んでなり、これらは
平均端長２μｍ又はそれ以上の副芽胞結晶を産生し得
る。
オニスの突然変異株又は変異株を含んでなり、これらは
平均端長２μｍ又はそれ以上の副芽胞結晶を産生し得
る。
本発明の更に別の態様は、親株、又は株DSM2803のス
ポロゾイト形成頻度よりもより少ないスポロゾイト形成
頻度10〜100又は106回を示す。突然変異されたもしくは
変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株を含
んでなる。
ポロゾイト形成頻度よりもより少ないスポロゾイト形成
頻度10〜100又は106回を示す。突然変異されたもしくは
変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株を含
んでなる。
更により好ましい態様は、寄託された変異株B.ツリン
ゲンシス亜種テネブリオニス、DSM5480を含んでなる。
ゲンシス亜種テネブリオニス、DSM5480を含んでなる。
本発明の研究過程において、その親株（DSM5526）と
比較して２倍以上のデルタ−エンドトキシン産生を示す
B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス（DSM5480）の突
然変異株が単離された。この突然変異株の位相差検鏡法
および走査型電子検鏡法および伝導電子検鏡法では、以
下の内容が明らかに示される。すなわち、この突然変異
株の高生産性は、スポロゾイト形成に関するデルタ エ
ンドトキシン産生の調整における変化に帰因し、これは
存在する甲虫活性バシラス ツリンゲンシス株により産
生される結晶よりも５倍以上大きい蛋白質結晶の生産を
もたらす。結晶形成とスポロゾイト形成間の密接な相互
関係は、離されておるようでありそして変異株は、スポ
ロゾイト形成前に高量のデルタ エンドトキシンを産生
する。
比較して２倍以上のデルタ−エンドトキシン産生を示す
B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス（DSM5480）の突
然変異株が単離された。この突然変異株の位相差検鏡法
および走査型電子検鏡法および伝導電子検鏡法では、以
下の内容が明らかに示される。すなわち、この突然変異
株の高生産性は、スポロゾイト形成に関するデルタ エ
ンドトキシン産生の調整における変化に帰因し、これは
存在する甲虫活性バシラス ツリンゲンシス株により産
生される結晶よりも５倍以上大きい蛋白質結晶の生産を
もたらす。結晶形成とスポロゾイト形成間の密接な相互
関係は、離されておるようでありそして変異株は、スポ
ロゾイト形成前に高量のデルタ エンドトキシンを産生
する。
本発明の一つの面において、本発明は殺虫性のB.ツリ
ンゲンシス生産物の製造方法において本発明の突然変異
株もしくは変異株の使用に関し、該方法において、B.ツ
リンゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、
および当業者に公知の他の部分を含む適当た培地中で適
当な時間培養し、次いでデルタ エンドトキシンを回収
する。
ンゲンシス生産物の製造方法において本発明の突然変異
株もしくは変異株の使用に関し、該方法において、B.ツ
リンゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、
および当業者に公知の他の部分を含む適当た培地中で適
当な時間培養し、次いでデルタ エンドトキシンを回収
する。
本発明の別の面において、上記で得られたB.ツリンゲ
ンシス デルタ エンドトキシン生産物は、殺虫剤組成
物中の有効成分として用いられる。
ンシス デルタ エンドトキシン生産物は、殺虫剤組成
物中の有効成分として用いられる。
本発明は又、本発明のB.ツリンゲンシス デルタ エ
ンドトキシンおよび農業的に許容できる希釈剤又は担体
を含んでなる殺虫剤組成物又は製剤に関する。
ンドトキシンおよび農業的に許容できる希釈剤又は担体
を含んでなる殺虫剤組成物又は製剤に関する。
本発明は又、B.ツリンゲンシス デルタ エンドトキ
シン生産物を含む殺虫剤組成物又は製剤に関し、液体形
の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少なくと
も３％w/wに相当する、少なくとも15,000BTTU/gの強度
を有するか、又は乾燥形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫
性結晶蛋白質の少なくとも10％w/wに相当する、少なく
とも50,000BTTU/gの強度を有する。
シン生産物を含む殺虫剤組成物又は製剤に関し、液体形
の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少なくと
も３％w/wに相当する、少なくとも15,000BTTU/gの強度
を有するか、又は乾燥形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫
性結晶蛋白質の少なくとも10％w/wに相当する、少なく
とも50,000BTTU/gの強度を有する。
特定の態様において、本発明はDSM2803又は他の甲虫
活性Btt株から産生される殺虫組成物の少なくとも２倍
の強度を有するDSM5680から産生される殺虫組成物に関
する。
活性Btt株から産生される殺虫組成物の少なくとも２倍
の強度を有するDSM5680から産生される殺虫組成物に関
する。
本発明の組成物は、農業化学品の製剤化に対して公知
の方法での形態を採ることができ、例えば懸濁液、水性
エマルション、粉剤、分散粉末、乳化性コンセントレー
ト又は顆粒である。更に、該組成物は直接適用に対する
適当な形態でよく、あるいは又コンセントレートとし
て、又は主組成物でよく、これは適用前に適当量の水又
は他の希釈剤で希釈する必要がある。
の方法での形態を採ることができ、例えば懸濁液、水性
エマルション、粉剤、分散粉末、乳化性コンセントレー
ト又は顆粒である。更に、該組成物は直接適用に対する
適当な形態でよく、あるいは又コンセントレートとし
て、又は主組成物でよく、これは適用前に適当量の水又
は他の希釈剤で希釈する必要がある。
本発明組成物の殺虫的に有効なB.ツリンゲンシス デ
ルタ エンドトキシンの濃度は、植物に適用の際、単独
又は他の殺虫剤と組合せた場合、好ましくは約0.5〜25
重量％、特に１〜15重量％である。
ルタ エンドトキシンの濃度は、植物に適用の際、単独
又は他の殺虫剤と組合せた場合、好ましくは約0.5〜25
重量％、特に１〜15重量％である。
更に別の面で本発明は、害虫の駆除方法に関し、ここ
において、先の殺虫剤組成物を害虫で浸された領域に適
用する。
において、先の殺虫剤組成物を害虫で浸された領域に適
用する。
特定の態様において、駆除されるべき害虫は、蝶蛾類
鱗翅目、双翅目および甲虫に属する群、特に甲虫、例え
ばコロラドじゃがいも甲虫である。
鱗翅目、双翅目および甲虫に属する群、特に甲虫、例え
ばコロラドじゃがいも甲虫である。
特定の態様において、害虫は液体殺虫剤組成物１エー
カー当たり１クオートの適用により、又は乾燥殺虫剤組
成物１エーカー当たり0.5ポンドの適用により駆除でき
る。
カー当たり１クオートの適用により、又は乾燥殺虫剤組
成物１エーカー当たり0.5ポンドの適用により駆除でき
る。
本発明の活性B.ツリンゲンシス製剤又は組成物は、例
えばスプレー法又はダスチングにより害虫が植物に現わ
れ始めた時に植物に直接適用できる。適用の好ましい態
様は、スプレー法である。一般に、幼虫成育の初期の段
階において害虫の良好な駆除を得ることが必要である。
何故なら、このときが植物が最も少ない損害を受ける時
だからである。
えばスプレー法又はダスチングにより害虫が植物に現わ
れ始めた時に植物に直接適用できる。適用の好ましい態
様は、スプレー法である。一般に、幼虫成育の初期の段
階において害虫の良好な駆除を得ることが必要である。
何故なら、このときが植物が最も少ない損害を受ける時
だからである。
バシラス ツリンゲンシス株を突然変異させ次いで親
株よりも実質的により多量のデルタ エンドトキシンを
産生できるそのような株を選択する一つの方法におい
て、親株を ｉ）変異原で処理し、 ii）このように処理された突然変異株を無胞子および／
又はオリゴ胞子株の選択に対して適当な培地上で増殖さ
せ、 iii）半透明コロニーを選択し次いで加熱により流動し
ない培地中で増殖させ、次いで iv）真に無胞子株をコロニーを熱処理に委ねることによ
り除外する。
株よりも実質的により多量のデルタ エンドトキシンを
産生できるそのような株を選択する一つの方法におい
て、親株を ｉ）変異原で処理し、 ii）このように処理された突然変異株を無胞子および／
又はオリゴ胞子株の選択に対して適当な培地上で増殖さ
せ、 iii）半透明コロニーを選択し次いで加熱により流動し
ない培地中で増殖させ、次いで iv）真に無胞子株をコロニーを熱処理に委ねることによ
り除外する。
この方法の好ましい態様によれば、このように選ばれ
たコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデル
タ エンドトキシン生産を増加し得る株に対する最終選
択を行う。
たコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデル
タ エンドトキシン生産を増加し得る株に対する最終選
択を行う。
上記方法の工程（ｉ）において、変異原は、適当な通
常の化学源、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネートであ
ってよく、あるいは親株を電磁放射線、例えばγ−,X線
−又はUV−放射線で処理する。
常の化学源、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネートであ
ってよく、あるいは親株を電磁放射線、例えばγ−,X線
−又はUV−放射線で処理する。
工程（ii）において、適当な培地はジョンソン等
（「Spores VI」;P.ゲルトアルト等編集、248〜254
頁、1975年）によって記載される如くホスフェートを含
む変性栄養胞子形成培地（NSMP培地）であってよい。
（「Spores VI」;P.ゲルトアルト等編集、248〜254
頁、1975年）によって記載される如くホスフェートを含
む変性栄養胞子形成培地（NSMP培地）であってよい。
本発明方法の工程（iv）において、適当な培地はMgCl
2およびゲルライト（Kelco）を補ったNSMP培地であって
よい。
2およびゲルライト（Kelco）を補ったNSMP培地であって
よい。
本発明の高生産性変異株又は突然変異株の得る他の方
法は、例えば液体、培地中で親株を増殖させ次いで無胞
子および／又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当な寒
天培地上の培養ブロスを散布した後自発的突然変異株又
は変異株を選択することにより企図される。
法は、例えば液体、培地中で親株を増殖させ次いで無胞
子および／又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当な寒
天培地上の培養ブロスを散布した後自発的突然変異株又
は変異株を選択することにより企図される。
本発明の高生産性変異株又は突然変異株をスクリーニ
ングする他の方法は、例えば遠心分離により又は集団の
他の分離手段により、これらの集団を用いて行うことが
できる。
ングする他の方法は、例えば遠心分離により又は集団の
他の分離手段により、これらの集団を用いて行うことが
できる。
例１ ２倍のデルタ−エンドトキシン生産能を有するB.ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株を単離し
た。この変異株の位相差顕鏡法、走査型電子顕鏡法およ
び伝達電子顕鏡法により以下の内容が説明する。すなわ
ち、この変異株の高生産性は、スポロゾイト形成に関し
てデルタ エンドトキシン生産の調整の変化に基づくも
のであり、これは存在する甲虫活性バシラス ツリンゲ
ンシス株により生産される結晶よりも５倍以上までも大
きい蛋白質結晶の生産をもたらす。結晶形成とスポロゾ
イト形成間の密接な双互関係は除かれたと思われ、そし
て変異株はスポロゾイト形成前に高量のデルタ−エンド
トキシンを生産する。
ンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株を単離し
た。この変異株の位相差顕鏡法、走査型電子顕鏡法およ
び伝達電子顕鏡法により以下の内容が説明する。すなわ
ち、この変異株の高生産性は、スポロゾイト形成に関し
てデルタ エンドトキシン生産の調整の変化に基づくも
のであり、これは存在する甲虫活性バシラス ツリンゲ
ンシス株により生産される結晶よりも５倍以上までも大
きい蛋白質結晶の生産をもたらす。結晶形成とスポロゾ
イト形成間の密接な双互関係は除かれたと思われ、そし
て変異株はスポロゾイト形成前に高量のデルタ−エンド
トキシンを生産する。
高収率突然変異株の生産 B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの胞子、株DSM5
526を7kGyの放射線量を得るためにγ照射した。照射し
た胞子をNSMP寒天プレート（ヤンセン等（「Spores VI
I」、P.ブルハルト等編集、248〜254頁、1975年）によ
り記載されるホスフェートを含む変性栄養胞子形成培
地）上に散布した。なお、前記培地は、無胞子および／
又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当である。
526を7kGyの放射線量を得るためにγ照射した。照射し
た胞子をNSMP寒天プレート（ヤンセン等（「Spores VI
I」、P.ブルハルト等編集、248〜254頁、1975年）によ
り記載されるホスフェートを含む変性栄養胞子形成培
地）上に散布した。なお、前記培地は、無胞子および／
又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当である。
NSMP−寒天プレートを30℃で２〜３日間インキュベー
トした。半透明コロニーを取り出し次いで、NSMPゲライ
トプレート（MgCl2（0.57g/l）およびゲライト（Gerit
e,Kelco）（20g/l）を補ったNSMP培地に移した。
トした。半透明コロニーを取り出し次いで、NSMPゲライ
トプレート（MgCl2（0.57g/l）およびゲライト（Gerit
e,Kelco）（20g/l）を補ったNSMP培地に移した。
NSMPゲライトプレートを、90℃で１時間インキュベー
トし、更に30℃で１〜２日間インキュベートした。
トし、更に30℃で１〜２日間インキュベートした。
NSMPゲライトプレート上で良好に増殖した突然変異株
を選択した。このようにして全ての無胞子突然変異株
は、それらが熱処理後増殖しないので除いた。
を選択した。このようにして全ての無胞子突然変異株
は、それらが熱処理後増殖しないので除いた。
選択した突然変異株を商業培地に含有する振とうフラ
スコ内で増殖させた。生産されたデルタ−エンドトキシ
ンの量を、以下に記載の免疫学的方法により測定した。
スコ内で増殖させた。生産されたデルタ−エンドトキシ
ンの量を、以下に記載の免疫学的方法により測定した。
親株よりも著るしい量のデルタ−エンドトキシンの生
産する突然変異株のみを選んだ。
産する突然変異株のみを選んだ。
土壌培地上および液体培地内で選択された突然変異株
の形態を位相差検鏡法（×2500）および走査型および伝
達電子検鏡法により調べた。胞子および結晶の数を数え
そして蛋白質結晶の大きさを決定した。
の形態を位相差検鏡法（×2500）および走査型および伝
達電子検鏡法により調べた。胞子および結晶の数を数え
そして蛋白質結晶の大きさを決定した。
得られた突然変異株の内、デルタ−エンドトキシンを
産生するその顕著な能力に対し一つ（DSM5480）を選択
した。
産生するその顕著な能力に対し一つ（DSM5480）を選択
した。
突然変異株DSM5480によって産生されたデルタ エン
ドトキシンの量を、DSM2803、すなわちバシラス ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスの原単離物、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、NOVODOR（登録商
標）の生産に対して用いられる菌株DSM5526、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株NB178、サンド
ス社から単離され1989年からバシラス ツリンゲンシス
テネブリオニス製品TRIDENT（登録商標、株NB198、サ
ンドス社から単離され1990年よりB.ツリンゲンシス亜種
テネブリオニス製品TRIDENT（登録商標）、「バシラス
ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ−15
939、およびマイコゲンから単離された株NB197、1990年
から「B.ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」製品Ｍ−ON
E（登録商標）の各々のデルタエンドトキシン量と比較
した。例２の表１に示すように、本発明の改良された突
然変異株は今は入手できるバシラス ツリンゲンシスの
甲虫活性株のデルタ エンドトキシンの２〜3.5倍を産
生する。
ドトキシンの量を、DSM2803、すなわちバシラス ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスの原単離物、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、NOVODOR（登録商
標）の生産に対して用いられる菌株DSM5526、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株NB178、サンド
ス社から単離され1989年からバシラス ツリンゲンシス
テネブリオニス製品TRIDENT（登録商標、株NB198、サ
ンドス社から単離され1990年よりB.ツリンゲンシス亜種
テネブリオニス製品TRIDENT（登録商標）、「バシラス
ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ−15
939、およびマイコゲンから単離された株NB197、1990年
から「B.ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」製品Ｍ−ON
E（登録商標）の各々のデルタエンドトキシン量と比較
した。例２の表１に示すように、本発明の改良された突
然変異株は今は入手できるバシラス ツリンゲンシスの
甲虫活性株のデルタ エンドトキシンの２〜3.5倍を産
生する。
例２ この例において、バシラス ツリンゲンシス亜種テネ
ブリオニス突然変異株DSM5480のデルタ エンドトキシ
ン収率を、通常の培地におけるバシラス ツリンゲンシ
ス亜種テネブリオニス株DSM2803（バシラス ツリンゲ
ンシス亜種の原単離物）、DSM5526（ノボ ノルディス
ク社の生産株）およびNB178およびNB198（サンドスの生
産株）、およびバシラス ツリンゲンシス亜種サン ジ
エゴ、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197（マイコゲンの生
産株）のデルタ エンドトキシン収率と比較した。各株
を、以下の組成の寒天斜面上で30℃で17時間増殖させ
た。前記組成は蒸留水11当たりのｇ数で表われ次の組成
からなる。
ブリオニス突然変異株DSM5480のデルタ エンドトキシ
ン収率を、通常の培地におけるバシラス ツリンゲンシ
ス亜種テネブリオニス株DSM2803（バシラス ツリンゲ
ンシス亜種の原単離物）、DSM5526（ノボ ノルディス
ク社の生産株）およびNB178およびNB198（サンドスの生
産株）、およびバシラス ツリンゲンシス亜種サン ジ
エゴ、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197（マイコゲンの生
産株）のデルタ エンドトキシン収率と比較した。各株
を、以下の組成の寒天斜面上で30℃で17時間増殖させ
た。前記組成は蒸留水11当たりのｇ数で表われ次の組成
からなる。
ペプトン（ディフコ） 5g 牛肉エキス（ディフコ） 3g 寒天（ディフコ） 20g pH 7.0 各株からの細胞懸濁液5mlを、500mlのバッフル底型エ
レンマイヤーフラスコ内の生産培地100mlに移した。生
産培地は、以下の量（水道水1l当たりのｇ数で表現）の
成分からなる。
レンマイヤーフラスコ内の生産培地100mlに移した。生
産培地は、以下の量（水道水1l当たりのｇ数で表現）の
成分からなる。
大豆ミル 50g 水解デンプン 40g KH2PO4 1.77g K2HPO4 4.53g pH 7.0 インキュベートされるフラスコを、振とうしながら
（250rpm）30℃でインキュベートした。96時間インキュ
ベーション後、培養ブロスを免疫学的方法によりデルタ
エンドトキシン収率に対し分析した。
（250rpm）30℃でインキュベートした。96時間インキュ
ベーション後、培養ブロスを免疫学的方法によりデルタ
エンドトキシン収率に対し分析した。
個々の株によって産生されたデルタ エンドトキシン
の量は、ロケット電気永動法（RIE）および測光イムノ
アッセイ（PIA）により、バシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたら
された抗体を用いて測定した。
の量は、ロケット電気永動法（RIE）および測光イムノ
アッセイ（PIA）により、バシラス ツリンゲンシス亜
種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたら
された抗体を用いて測定した。
400mgの各培養ブロスを秤量した。7mlの燐酸三ナトリ
ウム緩衝液（0.125M,pH12）を各サンプルに添加した。
懸濁液を１時間振とうしてデルタ エンドトキシン蛋白
質を得た。
ウム緩衝液（0.125M,pH12）を各サンプルに添加した。
懸濁液を１時間振とうしてデルタ エンドトキシン蛋白
質を得た。
次いでサンプルを3,500rpmで15分間遠心し次いで上澄
みを、B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニスからの精製
蛋白質結晶に対してもたらされる抗血清に対するロケッ
ト免疫電気泳動によりデルタ−エンドトキシンに対して
試験した。デルタ エンドトキシンの量を、結晶蛋白質
の公知量を有する標準に対して比較して測定した。
みを、B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニスからの精製
蛋白質結晶に対してもたらされる抗血清に対するロケッ
ト免疫電気泳動によりデルタ−エンドトキシンに対して
試験した。デルタ エンドトキシンの量を、結晶蛋白質
の公知量を有する標準に対して比較して測定した。
結晶蛋白質の濃度も又、測光イムノアッセイにより測
定した。結晶蛋白質をアルカリ溶液中に溶解した。溶解
蛋白質をそれらの抗体により沈でんさせた。この反応速
度を濁り測定法で決定した。デルタ−エンドトキシンの
量を公知量の結晶蛋白質を有する標準に対して相対的に
測定した。
定した。結晶蛋白質をアルカリ溶液中に溶解した。溶解
蛋白質をそれらの抗体により沈でんさせた。この反応速
度を濁り測定法で決定した。デルタ−エンドトキシンの
量を公知量の結晶蛋白質を有する標準に対して相対的に
測定した。
分析で用いた抗体の生産に対する結晶抗原は、B.ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスから単離された結晶から
得られた。
ンゲンシス亜種テネブリオニスから単離された結晶から
得られた。
多クローン性抗体は、0.25mgの結晶抗原を毎２周間家
兎に注射することによりもたらされた。
兎に注射することによりもたらされた。
得られた結果を次の表I aおよび表I bに示す。デルタ
エンドトキシン収率をBTTU/g（培養ブロスｇ当たりの
単位、ロケット免疫電気永動（RIE）により決定、又は
測光免疫イムノアッセイ（PIA）により決定）として表
わす。純粋なB.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス蛋白
質結晶に対して用いられる値は、500,000BETTU/gであ
る。以下の表I aに示される値は、６〜７個の独立発酵
物の平均であり、表I b内の値は、３個の独立発酵物の
平均である。
エンドトキシン収率をBTTU/g（培養ブロスｇ当たりの
単位、ロケット免疫電気永動（RIE）により決定、又は
測光免疫イムノアッセイ（PIA）により決定）として表
わす。純粋なB.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス蛋白
質結晶に対して用いられる値は、500,000BETTU/gであ
る。以下の表I aに示される値は、６〜７個の独立発酵
物の平均であり、表I b内の値は、３個の独立発酵物の
平均である。
表I aおよび表I bから以下の内容が、明らかである。
すなわち、DSM5480は、バシラス ツリンゲンシス亜種
テネブリオニスの原株、DSM2803および「バシラス ツ
リンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ 15939
よりも３倍以上多いデルタ エンドトキシンを生産し、
更にバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの商
業製品の生産に今日用いられている株の２倍以上の量の
デルタ エンドトキシンを生産する。
すなわち、DSM5480は、バシラス ツリンゲンシス亜種
テネブリオニスの原株、DSM2803および「バシラス ツ
リンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ 15939
よりも３倍以上多いデルタ エンドトキシンを生産し、
更にバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの商
業製品の生産に今日用いられている株の２倍以上の量の
デルタ エンドトキシンを生産する。
バシラス ツリンゲンシス亜種、突然変異株DSM5480
の位相差検鏡法、走査型電子検鏡法および伝達電子検鏡
法により以下の内容が明らかになった。すなわち、この
突然変異株により生産される蛋白質結晶は、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、株DSM2803,DSM552
6,NB178およびNB198並びに「バシラス ツリンゲンシス
亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197に
より生産される相当する蛋白質結晶よりもはるかにより
大きい。
の位相差検鏡法、走査型電子検鏡法および伝達電子検鏡
法により以下の内容が明らかになった。すなわち、この
突然変異株により生産される蛋白質結晶は、バシラス
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、株DSM2803,DSM552
6,NB178およびNB198並びに「バシラス ツリンゲンシス
亜種サン ジエゴ」、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197に
より生産される相当する蛋白質結晶よりもはるかにより
大きい。
例３ この例において、B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニ
ス、株DSM2803,DSM5526,NB178およびNB198、および突然
変異株DSM5480並び「B.ツリンゲンシス亜種サン ジエ
ゴ」、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197におけるスポロゾ
イト形成および副芽胞結晶形成を、固体培地および液体
培地について比較した。
ス、株DSM2803,DSM5526,NB178およびNB198、および突然
変異株DSM5480並び「B.ツリンゲンシス亜種サン ジエ
ゴ」、株NRRL−Ｂ 15939およびNB197におけるスポロゾ
イト形成および副芽胞結晶形成を、固体培地および液体
培地について比較した。
各株を、以下の組成を有する寒天斜面上30℃で２日間
増殖させた。組成は、蒸留水１当たりのｇ数で表わさ
れる。
増殖させた。組成は、蒸留水１当たりのｇ数で表わさ
れる。
ペプトン（ディフコ） 5g 牛肉エキス（ディフコ） 3g 寒天（ディフコ） 20g pH 7.0 各々の株を液体培地中でも増殖させた。全ての株を寒
天斜面上で30℃で17時間増殖させた。各株からの細胞の
懸濁液5mlを、各々100mlの培地を有する、複数個の500m
lバッフル低型エルレンマイヤフラスコに移した。
天斜面上で30℃で17時間増殖させた。各株からの細胞の
懸濁液5mlを、各々100mlの培地を有する、複数個の500m
lバッフル低型エルレンマイヤフラスコに移した。
培地は以下に示される量（水道水1l当たりのｇ数で表
わされる）の成分から成る。
わされる）の成分から成る。
液体培地： 酵母エキス 5g トリプトン 5g グルコース 1g KH2PO4 0.8g pH 7.0 インキュベートされるフラスコを振とうしながら（25
0rpm）で30℃で96時間振とうした。
0rpm）で30℃で96時間振とうした。
B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、株DSM2803,DS
M5526,NB178およびNB198、および「B.ツリンゲンシス亜
種サン ジエゴ」、株NRRL−B15939およびNB197は、全
て両方の培地上で良好にスポロゾイト形成した。細胞溶
解前には、細胞は胞子および副芽胞結晶を含有してい
た。結晶の大きさは、細胞溶解のときまでは長さ0.4μ
ｍから0.9〜1.1μｍであった。蛋白質の平均大きさは0.
6〜0.7μｍ長であった。
M5526,NB178およびNB198、および「B.ツリンゲンシス亜
種サン ジエゴ」、株NRRL−B15939およびNB197は、全
て両方の培地上で良好にスポロゾイト形成した。細胞溶
解前には、細胞は胞子および副芽胞結晶を含有してい
た。結晶の大きさは、細胞溶解のときまでは長さ0.4μ
ｍから0.9〜1.1μｍであった。蛋白質の平均大きさは0.
6〜0.7μｍ長であった。
突然変異株DSM5480は、固体培地および明定した液体
培地中少ない胞子（1ml当たり106個よりも少ない胞子）
を生産した。細胞溶解前、大抵の細胞は、巨大蛋白質結
晶を有し、胞子は有していなかった。蛋白質結晶の寸法
は、0.4〜0.7μｍから5.0μｍであり、蛋白質結晶の平
均寸法は2.2〜2.3μｍ長であった。
培地中少ない胞子（1ml当たり106個よりも少ない胞子）
を生産した。細胞溶解前、大抵の細胞は、巨大蛋白質結
晶を有し、胞子は有していなかった。蛋白質結晶の寸法
は、0.4〜0.7μｍから5.0μｍであり、蛋白質結晶の平
均寸法は2.2〜2.3μｍ長であった。
伝達電子検鏡法によるこれらの培地からの超微細構造
分析により以下の内容が明らかにされた。すなわち、突
然変異株におけるスポロゾイト形成プロセスは、開始さ
れているが、細胞溶解前までには完了していなかった。
スポロゾイト形成プロセスは、種々の細胞内で種々の段
階に達していた。スポロゾイト形成が、段階II（前胞子
隔膜形成）にのみ達していた細胞においては、蛋白質結
晶は全ての細胞を満たしていた。
分析により以下の内容が明らかにされた。すなわち、突
然変異株におけるスポロゾイト形成プロセスは、開始さ
れているが、細胞溶解前までには完了していなかった。
スポロゾイト形成プロセスは、種々の細胞内で種々の段
階に達していた。スポロゾイト形成が、段階II（前胞子
隔膜形成）にのみ達していた細胞においては、蛋白質結
晶は全ての細胞を満たしていた。
生産培地（例２）においては、突然変異株はより多数
の胞子（107〜108個の胞子/ml）を生産した。この培地
において突然変異株のスポロゾイト形成頻度は、親株に
おけるよりも10〜100倍低かった。
の胞子（107〜108個の胞子/ml）を生産した。この培地
において突然変異株のスポロゾイト形成頻度は、親株に
おけるよりも10〜100倍低かった。
従って、突然変異株は、通常の胞子を生産する能力を
保持している。しかし、突然変異株のスポロゾイト形成
頻度は、培地に強く依存するように思われる。
保持している。しかし、突然変異株のスポロゾイト形成
頻度は、培地に強く依存するように思われる。
個々の株によって生産される蛋白質結晶の寸法を表II
aおよびII bに示す。
aおよびII bに示す。
表II aおよび表II bから、突然変異株DSM5480は、今
日入手できる甲虫活性B.t.株のいずれよりもはるかに大
きい蛋白質結晶を生産することが明らかである。
日入手できる甲虫活性B.t.株のいずれよりもはるかに大
きい蛋白質結晶を生産することが明らかである。
得られたデータから、スポロゾイト形成に関しデルタ
エンドトキシン生産の範囲が突然変異株において変化
したことは明白である。
エンドトキシン生産の範囲が突然変異株において変化
したことは明白である。
突然変異株は、胞子発育前に蛋白質結晶を生産するよ
うであり、これによりデルタ エンドトキシン生産のた
めのより長期間を細胞に与え、これは親株におけるより
も細胞溶解の時までにはるかにより大きな蛋白質結晶の
生産をもたらす。
うであり、これによりデルタ エンドトキシン生産のた
めのより長期間を細胞に与え、これは親株におけるより
も細胞溶解の時までにはるかにより大きな蛋白質結晶の
生産をもたらす。
入手できる栄養源並びにスポロゾイト形成の時までの
細胞内の蛋白質結晶の寸法に依存して、通常の胞子は、
細胞溶解の時までに発育するであろう。
細胞内の蛋白質結晶の寸法に依存して、通常の胞子は、
細胞溶解の時までに発育するであろう。
例４ この例においては、高生産性Btt突然変異株DSM5480
を、コロラドポテト甲虫の幼虫駆除のための強力生産品
を得るために用いた。
を、コロラドポテト甲虫の幼虫駆除のための強力生産品
を得るために用いた。
DSM5480を、通気攪拌した生産発酵タンク内の例２に
記載した生産発酵培地上で発酵させた。96時間後、連続
遠心分離機で遠心により回収した。
記載した生産発酵培地上で発酵させた。96時間後、連続
遠心分離機で遠心により回収した。
活性蛋白質結晶を含有する濃厚クリームを、微生物保
存剤を添加して殺菌し、pHを5.0に調節した。
存剤を添加して殺菌し、pHを5.0に調節した。
濃厚クリームの１部を、噴霧乾燥し、水和剤の処方用
に後に用いた。濃厚クリームの残りは、２種の水性流動
性コンセントレート（FC）の処方用に直接用いた。
に後に用いた。濃厚クリームの残りは、２種の水性流動
性コンセントレート（FC）の処方用に直接用いた。
水和剤は、表IIIに記載の如く処方した。２種のFCの
処方は表IVに示される。
処方は表IVに示される。
純粋な結晶蛋白質の500,000BTTU/gの値を用いると、
処方中の活性結晶蛋白質の濃度は次の通りである。
処方中の活性結晶蛋白質の濃度は次の通りである。
洗剤は、殺虫剤製品中で通常用いられる懸濁助剤およ
び水和剤内から広幅く選んだ。
び水和剤内から広幅く選んだ。
凝結防止剤は、親水性シリカであり、不活性充てん剤
は、不活性充てん剤、例えばベントナイト、無機塩又は
粘土から用いられる。
は、不活性充てん剤、例えばベントナイト、無機塩又は
粘土から用いられる。
FC中で用いられる保存剤は、食物および化粧保存剤の
群から選ばれた。pH調節剤は無機酸である。
群から選ばれた。pH調節剤は無機酸である。
例５ 圃場試験を行ない、主な目標害虫、コロラドじゃがい
も甲虫の幼虫に対する高生産性Btt突然変異株DSM5480の
微生物学的評価を証明した。２種の商業製品トリデント
（Trident）（登録商標）およびエム−オネ（Ｍ−one）
（登録商標）について比較した。作物はじゃがいもであ
った。
も甲虫の幼虫に対する高生産性Btt突然変異株DSM5480の
微生物学的評価を証明した。２種の商業製品トリデント
（Trident）（登録商標）およびエム−オネ（Ｍ−one）
（登録商標）について比較した。作物はじゃがいもであ
った。
作物に３回、６月20日、６月27日および８月３日（第
２世代幼虫）に散布した。
２世代幼虫）に散布した。
用いた製品および用量は次の通りであった： 未処理対照に比較したCPB幼虫の駆除平均％を表Ｖに
示す。コロラドじゃがいも甲虫淘汰圧は未処理コントロ
ールにおいて非常に重かった:8月１日に20本の作物に対
し370匹の幼虫および８月８日に20本の作物に対し904匹
の幼虫 これらの結果は、明らかに高生産性突然変異株DSM548
0を用いて生産した製品は、圃場におけるコロラドじゃ
がいも甲虫の幼虫駆除に有効であった。高生産株によっ
て生産れる結晶蛋白質は、十分に活性であり、1.5クオ
ートのノボドールFCは、４クオートのトリデントと同良
の結果を与え更に２クオートのエム−オネと同様の結果
を与える。
示す。コロラドじゃがいも甲虫淘汰圧は未処理コントロ
ールにおいて非常に重かった:8月１日に20本の作物に対
し370匹の幼虫および８月８日に20本の作物に対し904匹
の幼虫 これらの結果は、明らかに高生産性突然変異株DSM548
0を用いて生産した製品は、圃場におけるコロラドじゃ
がいも甲虫の幼虫駆除に有効であった。高生産株によっ
て生産れる結晶蛋白質は、十分に活性であり、1.5クオ
ートのノボドールFCは、４クオートのトリデントと同良
の結果を与え更に２クオートのエム−オネと同様の結果
を与える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ５５２６ 前置審査 (56)参考文献 特開 昭63−216471（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−273581（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−156382（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−270804（ＪＰ，Ａ) 米国特許4766203（ＵＳ，Ａ) Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，43［６］（1982）ｐ．1498− 1500 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/00 C12N 15/00 A01N 63/00 C07K 14/325 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (24)
- 【請求項１】殺虫性デルタ−エンドトキシンを生産し得
るバシラス・ツリンゲンシス（Bacillus thuringiensi
s）亜種テネブリオニス（tenebrionis）DSM5526を親株
とする突然変異株又は変異株であって、 （１）前記親株に比較して２倍量以上の殺虫性デルタ−
エンドトキシンを生産する能力を有し； （２）親株に比べて２倍以上の平均端径を有する結晶形
の殺虫性デルタ−エンドトキシンを生産することがで
き；そして （３）胞子形成頻度が親株に比較して1/10以下である； ことを特徴とする突然変異株又は変異株。 - 【請求項２】B.ツリンゲンシス突然変異株又は変異株
が、B.ツリンゲンシスの病原型Ｃに属する、請求の範囲
第１項に記載の突然変異株又は変異株。 - 【請求項３】生産されるデルタ−エンドトキシンが鞘翅
類に対して活性である、請求の範囲第１又は２項のいず
れか１項記載の突然変異株又は変異株。 - 【請求項４】突然変異株が、寄託された突然変異株B.ツ
リンゲンシス亜種テネブリオニス（寄託番号DSM5480）
である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載
の突然変異株。 - 【請求項５】請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
突然変異株もしくは変異株の使用による、B.ツリンゲン
シス デルタ エンドトキシン含有製品の生産方法であ
って、該B.ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株を、
炭素、窒素、および他の成分を含む適当な培地中で適当
な時間培養し、しかる後デルタ エンドトキシンを含ん
でなる殺虫性生産物を培地より単独であるいは細胞およ
び／又は胞子と共に回収し、次いでこの生産物を所望に
より農業的に許容できる賦形剤と混合することを特徴と
する方法。 - 【請求項６】請求の範囲第５項に記載の方法に従って得
られるB.ツリンゲンシス デルタ エンドトキシン含有
製品。 - 【請求項７】請求項６に記載のB.ツリンゲンシス デル
タ エンドトキシン含有製品を含んで成る殺虫剤組成
物。 - 【請求項８】デルタ エンドトキシン含有製品を単独で
又は他の生物学的に活性な生産物と組合わせて含有す
る、請求の範囲第７項記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項９】農業的に許容できる希釈剤又は担体と混合
されたB.ツリンゲンシス デルタ エンドトキシン含有
製品を含んでなる請求の範囲第７又は８項記載の殺虫剤
組成物。 - 【請求項１０】親株により生産された殺虫剤組成物の殺
虫活性よりも２倍以上の殺虫活性を有する請求の範囲第
７〜９項のいずれかに記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項１１】少なくとも３％w/wの甲虫殺虫性結晶蛋
白質に相当する、少なくとも15,000BTTU/gの殺虫活性を
有し液体状である、請求項７〜10のいずれか１項に記載
の殺虫剤組成物。 - 【請求項１２】少なくとも10％w/w甲虫殺虫性結晶蛋白
質に相当する、少なくとも50,000BTTU/gの殺虫活性を有
し乾燥状である、請求項７〜10のいずれか１項に記載の
殺虫剤組成物。 - 【請求項１３】組成物中の希釈剤又は担体が、固体、又
は所望により表面活性剤を組合せた液体である、請求の
範囲第７〜12項のいずれかに記載の殺虫剤組成物。 - 【請求項１４】請求の範囲第７〜13項記載の組成物を、
害虫に感染された領域に適用する、害虫の駆除方法。 - 【請求項１５】害虫が、蝶蛾類鱗翅目、双翅目または甲
虫の群に属する、請求の範囲第14項記載の方法。 - 【請求項１６】害虫が、甲虫、特にコロラドじゃがいも
甲虫である、請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項１７】液体殺虫剤組成物を１エーカー当たり１
クオートを適用することにより害虫を駆除する請求の範
囲第14〜16項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】乾燥殺虫組成物を１エーカー当たり0.5
ポンド適用することにより害虫を駆除する、請求の範囲
第14〜16項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１９】請求の範囲第１項に記載の突然変異株又
は変異株を選択する方法であって、親株を ｉ）変異原で処理し、 ii）このように処理された突然変異株を無胞子および／
又は少胞子株の選択のために適当な培地中で増殖させ、 iii）半透明コロニーを選択し次いで加熱により流動し
ない培地中で増殖させ、次いで iv）コロニーを熱処理に委ねることにより真に無胞子株
を除外する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項２０】選ばれたコロニーを通常の製造培地中で
増殖させ、次いでデルタ エンドトキシン生産を増加し
得る株に対する最終選択を行う、請求の範囲第19項記載
の方法。 - 【請求項２１】工程（ｉ）において、変異原が、適当な
通常の化学変異源、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネー
トである請求の範囲第19又は20項記載の方法。 - 【請求項２２】工程（ｉ）における親株を電磁放射線、
例えばγ−,X線−又はUV−放射線で処理する、請求の範
囲第19又は20項に記載の方法。 - 【請求項２３】工程（ii）において、適当な培地がホス
フェートを含む改変栄養胞子形成培地（NSMP培地）であ
る、請求の範囲第19〜22項のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２４】工程（iv）において、適当な培地がMgCl
2およびゲルライト（Kelco）を補ったNSMP培地である請
求の範囲第19〜23項のいずれかに記載の方法。
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| DK5805/89 | 1989-12-12 | ||
| DK627489A DK627489D0 (da) | 1989-12-12 | 1989-12-12 | Mutant |
| DK6274/89 | 1989-12-12 |
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