JPH05501955A - デルタエンドトキシンを高収率で産生するバシラスツリンゲンシスの突然変異株又は変異株 - Google Patents
デルタエンドトキシンを高収率で産生するバシラスツリンゲンシスの突然変異株又は変異株Info
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- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
デルタ エンドトキシンを高収率で
産生ずるハシラス ツリンゲンシス
の突然変異株又は変異株
発明の背景
ハシラス ツリンゲンシス(Bacillus thringiensis)の
商業上の製剤は、害虫の生物学的制御用として広く用いられている。これらの細
菌殺虫剤の利点は、非常に制限された範囲の標的混生に対し極めて選択的であり
かつ性分解性であるということである。
ハシラス ツリンゲンシスの商業製剤は、副作用を有さすに収穫の直前に使用で
きる。
ハシラス ツリンゲンシスは、棒状の嫌気性の胞子形成細菌であり、これはスロ
ゾイト形成過程中、1個又はそれ以上の封入体(副芽胞結晶と呼ばれる)の産生
を特徴とする。これらの結晶は、高分子量の蛋白質(デルタ エンドトキシンと
呼ばれる)から構成される。デルタ−エンドトキシンは、ハシラス ツリンゲン
シスの商業的に入手できる製剤中の有効成分である。
種々の害虫宿主スペクトルを有する多(のB、ツリンゲンシスは、同定されてき
ている。それらは、鞭毛状の抗原に基づき種々の亜種に分類される。特に興味あ
るものは、蝶蛾類鱗翅目の害虫に用いられるハシラス ツリンゲンシス亜種カル
スタキおよび亜種アイザワイ、双翅目害虫の駆除ムご用いられるハシラス ツリ
ンゲンシス亜種イスラレンシスおよび甲虫類の害虫の駆除のために用いられるハ
シラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスである。
甲虫毒性ハシラス ツリンゲンシスの最初の単離は、1983年に報告された(
K、クリーク等、Z、and、Ent。
96.500〜508、ヨーロンパ特許公開01491.62)。
単離物(これは、ハシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと呼ばれる)は
、受託番号DSM2803をもってジャーマン コレンイション オブ バイオ
オーガニズムに寄託された。ハシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスは、
コメノゴミムシダマシおよびチャイロコメノゴミムシダマシの幼虫、−ネブリオ
モ’ ト(Tenebrio moritor) (テネブリオニデ、コレオ
ブテラ)の蝋の死体から1982年に単離された。菌株は各細胞内に1種の胞子
および1種以上の殺虫性態芽胞結晶を産生し、この結晶は平らな板状形であり、
約0゜8μm〜15μmの婦長を有する。これはハシラス ツリンゲンシスの血
清型H8a、8bおよび病理型Cに属する(クリーク等、5yste11. A
ppl、 Microbiol、9. 138〜141゜1987、米国特許4
.766、203)これは、成る種の食葉甲虫の幼虫に対しのみ毒性があるが、
青虫(レビドプテラ)、蚊(ジブテラ)又は他の混生に対して有効でない。ハシ
ラス ツリンゲンシス亜種テネブリオンニスからの結晶および胞子又は単離した
結晶を取込んだ後、コロラドポテト甲虫(レプチノタルザ デセミレネアタ)の
幼虫および一定の成虫の給餌を止める。幼生期段階のLL−L3は、1〜3日以
内に死亡する(シェネテル等、r Fundamental and appl
iecj aspects of :nvertebrate patholo
gy JR,A、サムサン等、Proceedingo of the 4th
Int、 CCo11oqui of Invertebrate Path
ology、555頁、1986年)。
近年、以下の内容が明らかにされた。すなわち、甲虫活性の結晶に加えてハシラ
ス ッリンゲンシス亜種テネブリオニスは、紡鐘形、スベロイダル(spero
idal) 、又は板状の他の副芽胞結晶を生成する(A、M、ツーゲルおよび
A、クリーク、J、A、ppl、Ent、108,490〜497.1989)
。第二の結晶の活性は未だ知られていない。
ハシラス ツリンゲンシス亜種の4種の商業製品は、甲虫の駆除に開発されてい
る。ノボ ノルディスク社製造のノボドール(NOVODOR(登録商標))、
サンド社のトリデフ) (TRIDENT (登録商標))、およびアボット
ラボラトリ−社のジテラ(DfTerra(登録商標))、およびエコゲン社の
フォイル(Foil)(登録商標))である。
他の甲虫毒バシラス ッリンゲンシス菌株の単離は、1986年に報告された(
ベルンスタント等、8io/Technology。
4巻、305〜308.1986、米国特許4,764,372 、 1988
年)「ハシラス ッリンゲンシス亜種サン ジエゴ」と称されるこの菌株、M、
は、寄託番号NRRL B−15939をもってノーザン レージョ゛ナル リ
サーチ ラボラトリ−(U S A、 )に寄託された。「ハシラス ッリンゲ
ンシス亜種サン ジエゴ」に基づく商業製品は、マイコーゲン社により開発され
た。
バシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、DSM2803および植物細胞
の表現型特徴を含む「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴJ、NRRL
−B 15939の比較研究、毒性側芽胞結晶の特徴およびプラスミドDNAの
分析は、しかし、「バシラス ツリンゲンシス亜種すンジエゴ」が先に単離され
た株DSM2803、バシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと明らかに
同一であることを示しティる(クリーゲ等、J、App In、Ent、104
.417〜424.1987))。更にバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリ
オニスおよび「バシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」由来の甲虫活性デ
ルタ エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列
は同一である。
同一の培養条件下で前記の第二のタイプの結晶は又、「バシラス ツリンゲンシ
ス亜種サン ジエゴ」により合成される(A、 M、ツーゲル アンド A、ク
リーク、J、Appl、Ent、108,490〜497.1989)。
・バジ+7りおよびE、フラツフ(Entomophaga 35 (2) 。
233〜24.0.1990)によれば、「サン ジエゴ」単離物は、「テネフ
゛リオニス」(tenebrionis)に類イ以しており、更にそれを異なる
亜種として正当に見なみことはできない。
甲虫の害虫を駆除するためのバシラス ツリンゲンシスの有用性は、甲虫活性毒
素の有効性およびその経済的生産性および生産物の効力に依存する。一方、これ
は害虫活性バシラス ツリンゲンシス株の発酵によって産生されるデルタ エン
ドトキシンの量に依存する。
B、ツリンゲンシスは、殺虫剤の製造に対し多年用いられてきたが、デルタ−エ
ンドトキシンの増加を伴う突然変異株は有利であろう。しかし、そのような変異
株はこれまで記載されていない。
高収率でデルタ−エンドトキシンを産生する突然変異株は、B、ツリンゲンシス
毒素のより有効でかつ経済的産生並びに同等のコストでより強力なり、ツリンゲ
ンシスの生産に対する可能性を与えるであろう。一方、これは利用者に対しては
有利であろう。何故ならより少ない量の殺虫剤が保存され、更に一定の面積に対
して取扱われるからである。加えて、使用者はより少ない容器材料で処理でき、
これにより環境への影響を少なくすることができる。
突然変異を通じてのバシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスによるデルタ
エンドトキシンの生産性の改良は、これまでに報告されていない。
甲虫の幼虫を駆除することにおける特にB、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス
の使用に関する二つの問題は、処理されるべき領域に対し相当に多量の製剤を必
要とする製剤の能力又は強度が相当に低いということである。例えば殆ど他のB
、ツリンゲンシス製品および殆ど他の殺虫剤は1〜21/haであるのに比較し
、5〜1017ha必要である。
従って改良された強度を有する製品に対する必要性が存在する。
この問題を解決する一つの方法は、製剤の濃度を高めることであろう。しかし、
これは保存および輸送において得られる節約に比較して相当に生産コストが高く
なるであろう。
はるかによりすばらしい解決法は、細胞光たり実質的により多量のデルタ エン
ドトキシンを生産し得るB、ツリンゲンシス株の突然変異体を造ることであろう
。
発明の要約
従って本発明は、−の面において、それらの親株よりも実質的により多量の毒素
を生産し得る突然変異もしくは変異バシラス ツリンゲンシス株に関する。
他の面において、本発明は、亜種テネブリオニスに属するB、ツリンゲンシス株
の高生産性突然変異株もしくは変異株に関する。
本発明の更に他の面は、殺虫製品の製造のためのそのような突然変異もしくは変
異バシラス ツリンゲンシス株の使用、並びに有効成分として本発明の突然変異
又は変異バシラスツリンゲンシス株によって産生されるデルタ−エンドトキシン
を含んでなるそのような殺虫組成物にも関する。
また、本発明は、その一つの面において問題となっているデルタ−エンドトキシ
ンの活性に感度性の害虫が駆除されるべきである領域に、本発明に係る組成物を
適用することにより害虫を駆除する方法に関する。
更に別の面において、本発明はそれらの親株よりも実質的により多量のデルタ
エンドトキシンを産生し得るそのような変異された又は突然変異されたB、ツリ
ンゲンシス株を得るために選択し、もしくは突然変異させ次いで選択する方法に
関する。
微生物の寄託
本発明を詳細に記載する目的のため、高量のデルタ−エン突然変異株を、ドイツ
チェ ザンムルク フォノ マイクロオルガニネメン ラント ツエルグルツレ
ン GmbHl(マツシエローデルベルクlb、D−3300ブラウシバイク、
ドイツ共和国)に、下記に示す日に特許手続の目的のため寄託した。DSMはブ
ダペスト条約に基づく国際機関であり、条約の規則9に従って寄託の不変性を付
与する。
寄託日 1989年10月10日
寄託者の参照番号 NNB176−
1DSの受託番号 DSM5480
突然変異株DSM5480は、バシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、
菌株DSM5526 (これは又下記に示すようにブダペスト条約に基づき寄託
された)を突然変異させることにより得られた。
寄託日 1989年9月14日
寄託者の参照番号 NNB12
5DSの受託番号 DSM5526
発明の開示
本発明は、その一般的な面において、その親株に比較して高量の活性デルタ−エ
ンドトキシンを産生するバシラス ッリンゲンシスの突然変異株又は変異株に関
する。
本明細書中、表現の「高貴」は好ましくは少なくとも2倍又はそれ以上を意味す
る。
本発明のこの面において更に以下に示す本発明のより特異的面の双方において、
B、ツリンゲンシス突然変異株によって産生されるデルタ−エンドトキシンは、
その親B、ツリンゲンシスと同様の害虫、例えば鱗翅目害虫(これに対してはB
、ツリンゲンシス亜種カルスタキおよび亜種アイザワの突然変異株)、双翅目害
虫(これに対してはB、ツリンゲンシス亜種イスラレンシスからの突然変異株)
又は甲虫類の害虫(これに対してはB、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの突
然変異株)に対して企図される活性を有するであろう。
本発明の−の特定の態様において、B、ツリンゲンシスは亜種テネブリオニスに
属し、産生されたデルタ−エンドトキシンは甲虫に対して活性である。
この面のもと本発明の好ましい態様において、B、ツリンゲンシス亜種テネブリ
オニスの突然変異株又は変異株は、菌株DsM2803の3倍以上のデルタ エ
ンドトキシンを産生することができる。
本発明の別の態様は、B、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株又は
変異株を含んでなり、これらは平均婦長2μm又はそれ以上の副芽胞結晶を産生
じ得る。
本発明の更に別の態様は、親株、又は株DSM2803のスポロゾイト形成頻度
よりもより少ないスポロゾイト形成頻度10〜100又は106回を示す。突然
変異されたもしくは変異されたB、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株を含ん
でなる。
更により好ましい態様は、寄託された変異株B、ツリンゲンシス亜種テネブリオ
ニス、03M5480を含んでなる。
本発明の研究過程において、その親株(03M5526)と比較して2倍以上の
デルタ−エンドトキシン産生を示すB。
ツリンゲンシス亜種テネブリオニス(03M5480)の突然変異株が単離され
た。この突然変異株の位相差検鏡法および走査型電子検鏡法および伝導電子検鏡
法では、以下の内容が明らかに示される。すなわち、この突然変異株の高生産性
は、スポロゾイト形成に関するデルタ エンドトキシン産生の調整における変化
に帰因し、これは存在する甲虫活性バシラス ツリンゲンシス株により産生され
る結晶よりも5倍以上大きい蛋白質結晶の生産をもたらす。結晶形成とスポロゾ
イト形成間の密接な相互関係は、離されておるようでありそして変異株は、スポ
ロゾイト形成前に高量のデルタ エンドトキシンを産生ずる。
本発明の一つの面において、本発明は殺虫性のB、ツリンゲンシス生産物の製造
方法において本発明の突然変異株もしくは変異株の使用に関し、該方法において
B、ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、および当業者に公
知の他の成分を含む適当な培地中で適当な時間培養し、次いでデルタ エンドト
キシンを回収する。
本発明の別の面において、上記で得られたB、ツリンゲンシス デルタ エンド
トキシン生産物は、殺虫剤組成物中の有効成分として用いられる。
本発明は又、本発明のB、ツリンゲンシス デルタ エンドトキシンおよび農業
的に許容できる希釈剤又は担体を含んでなる殺虫剤組成物又は製剤に関する。
本発明は又、B、ツリンゲンシス デルタ エンドトキシン生産物を含む殺虫剤
組成物又は製剤に関し、液体形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少
なくとも3%W/Wに相当する、少なくとも15. 000BTTU/gの強度
を有するか、又は乾燥形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少な(と
も10%w / wに相当する、少なくとも50゜000 BTTU/ gの強
度を有する。
特定の態様において、本発明はDSM2803又は他の甲虫活性Btt株から産
生される殺虫組成物の少なくとも2倍の強度を有する03M5680から産生さ
れる殺虫組成物に関する。
本発明の組成物は、農業化学品の製剤化に対して公知の方法での形態を採ること
ができ、例えば懸濁液、水性エマルション、粉剤、分散粉末、乳化性コンセント
レート又は顆粒である。更に、該組成物は直接適用に対する適当な形態でよく、
あるいは又コンセントレートとして、又は主組成物でよ(、これは適用前に適当
量の水又は他の希釈剤で希釈する必要がある。
本発明組成物の殺虫的に有効なり、ツリンゲンシス デルタ エンドトキシンの
濃度は、植物に適用の際、単独又は他の殺虫剤と組合せた場合、好ましくは約0
.5〜25重量%、特に1〜15重量%である。
更に別の面で本発明は、害虫の駆除方法に関し、ここにおいて、先の殺虫剤組成
物を害虫で浸された領域に適用する。
特定の態様において、駆除されるべき害虫は、蝶!@類鱗翅目、双翅目および甲
虫に属する群、特に甲虫、例えばコロラドじゃがいも甲虫である。
特定の態様において、害虫は液体殺虫剤組成物1ニーカー当たり1クオートの適
用により、又は乾燥殺虫剤組成物1ニーカー当たり0.5ボンドの適用により駆
除できる。
本発明の活性B、ツリンゲンシス製剤又は組成物は、例えばスプレー法又はダス
チングにより害虫が植物に現われ始めた時に植物に直接適用できる。適用の好ま
しい態様は、スプレー法である。一般に、幼虫成育の初期の段階において害虫の
良好な駆除を得ることが必要である。何故なら、このときが植物が最も少ない損
害を受ける時だからである。
バシラス ツリンゲンシス株を突然変異させ次いで親株よりも実質的により多量
のデルタ エンドトキシンを産生できるそのような株を選択する一つの方法にお
いて、親株をi)変異原で処理し、
ii)このように処理された突然変異株を無胞子および/又はオリゴ胞子株の選
択に対して適当な培地上で増殖させ、街)半透明ココニーを選択し次いで加熱に
より流動しない培地中で増殖させ、次いで
iv)真に無脂子株をコロニーを熱処理に委ねることにより除外する。
この方法の好ましい態様によれば、このように選ばれたコロニーを通常の製造培
地中で増殖させ、次いでデルタ エンドトキシン生産を増加し得る株に対する最
終選択を行う。
上記方法の工程(i)において、変異原は、適当な通常の化学源、例えばN−メ
チル−N′−二トローN−ニトロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネート
であってよく、あるいは親株を電磁放射線、例えばT−、X線−又はUV−放射
線で処理する。
工程(ii )において、適当な培地はジョンソン等(’5pores V[に
P、ゲルトアルド等編集、248〜254頁、1975年)によって記載される
如くホスフェートを含む変性栄養胞子形成培地(NSMP培地)であってよい。
本発明方法の工程(iv)において、適当な培地はM g Cl zおよびゲル
ライト(Kelco)を補ったNSMP培地であってよい。
本発明の高生産性変異株又は突然変異株を得る他の方法は、例えば液体、培地中
で親株を増殖させ次いで無胞子および/又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当
な寒天培地上に培養ブロスを散布した後自発的突然変異株又は変異株を選択する
ことにより企図される。
本発明の高生産性変異株又は突然変異株をスクリーニングする他の方法は、例え
ば遠心分離により又は集団の他の分離手段により、これらの集団を用いて行うこ
とができる。
例1
2倍のデルタ−エンドトキシン生産能を有するB、ツリンゲンシス亜種テネブリ
オニスの突然変異株を単離した。この変異株の位相差顕鏡法、走査型電子顕鏡法
および伝達電子顕鏡法により以下の内容が説明する。すなわち、この変異株の高
生産性は、スポロゾイト形成に関してデルタ エンドトキシン生産の調整の変化
に基づくものであり、これは存在する甲虫活性ハシラス ツリンゲンシス株によ
り生産される結晶よりも5倍以上までも大きい蛋白質結晶の生産をもたらす。
結晶形成とスポロゾイト形成間の密接な双互関係は除かれたと思われ、そして変
異株はスポロゾイト形成前に高量のデルタ−エンドトキシンを生産する。
高収率突然変異株の生産
B、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの胞子、株DSM5526を7 kGy
の放射線量を得るためにγ照射した。照射した胞子をNSMP寒天プレート(サ
ンセン等(rspores ■」、P、プルハルト等編集、248〜254頁、
1975年)により記載されるホスフェートを含む変性栄養胞子形成培地)上に
散布した。なお、前記培地は、無胞子および/又はオリゴ胞子変異株の選択に対
し適当である。
NSMP−寒天プレートを30°Cで2〜3日間インキュベートした。半透明コ
ロニーを取り出し次いで、NSMPゲライトプレート(MgC1z (0,57
g/l)およびゲライト(Gerite、Kelco)(20g/l)を補った
NSMP培地に移した。
NSMPゲライトプレートを、90°Cで1時間インキュベートし、更に30°
Cで1〜2日間インキュベートした。
NSMPゲライトプレート上で良好に増殖した突然変異株を選択した。このよう
にして全ての無胞子突然変異株は、それらが熱処理後増殖しないので除いた。
選択した突然変異株を商業培地を含有する振とうフラスコ内で増殖させた。生産
されたデルタ−エンドトキシンの量を、以下に記載の免疫学的方法により測定し
た。
親株よりも著るしい量のデルタ−エンドトキシンの生産する突然変異株のみを選
んだ。
土壌培地上および液体培地内で選択された突然変異株の形態を位相差検鏡法(X
2500)および走査型および伝達電子検鏡法により調べた。胞子および結晶の
数を数えそして蛋白質結晶の大きさを決定した。
得られた突然変異株の内、デルタ−エンドトキシンを産生ずるその顕著な能力に
対し一つ(DSM5480)を選択した。
突然変異株DSM5480によって産生されたデルタ エンドトキシンの量を、
DSM2803、すなわちバシラスツリンゲンシス亜種テネブリオニスの原単離
物、バシラスツリンゲンシス亜種テネブリオニス、N0VODOR(登録商標)
の生産に対して用いられる菌株DSM5526、ハシラス ツリンゲンシス亜種
テネブリオニス株NB 178、サントス社から単離され1989年からハシラ
ス ツリンゲンシス テネブリオニス製品TRI DENT (登録商標、株N
B198、サントス社から単離され1990年よりB、ツリンゲンシス亜種テネ
ブリオニス製品TRI DENT (登録商標)、「ハシラス ツリンゲンシス
亜種サン ジエゴ」、株NRRL−B−15939、およびマイコサンから単離
された株NB197.1990年からrB、ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」
製品M−ONE (登録商標)の各々のデルタエンドトキシン量と比較した。例
2の表1に示すように、本発明の改良された突然変異株は今は入手できるハシラ
ス ツリンゲンシスの甲虫活性株のデルタ エンドトキシンの2〜3.5倍を産
生ずる。
例2
この例において、ハシラス ツリンゲンシス亜種テネプリオニス突然変異株DS
M5480のデルタ エンドトキシン収率を、通常の培地におけるハシラス ツ
リンゲンシス亜種テネブリオニス株DSM2803 (ハシラス ツリンゲンシ
ス亜種の原単離吻)、DSM5526 (ノボ ノルディスク社の生産株)およ
びNB178およびNB19B(サントスの生産株)、およびハシラス ツリン
ゲンシス亜種サン ジエゴ、株NRRL−B 15939およびNB197(マ
イコサンの生産株)のデルタ エンドトキシン収率と比較した。
各棟を、以下の組成の寒天斜面上で30°Cで17時間増殖させた。前記組成は
蒸留水11当たりのg数で表われ次の組成からなる。
ペプトン(ディフコ) 5g
牛肉エキス(ディフコ> 3g
寒天(ディフコ) 20g
pH7,0
各株からの細胞懸濁液5翔1を、5001のバッフル底型エレンマイヤーフラス
コ内の生産培地100m1に移した。生産培地は、以下の量(水道水11当たり
のg数で表現)の成分からなる。
大豆ミル 50g
氷解デンプン 40g
KH2PO41,77g
K、HPo、 4.53g
p)! 7.0
インキユベートされるフラスコを、振とうしながら(25Qrpm ) 30
’Cでインキュベートした。96時間インキュベーション後、培養ブロスを免疫
学的方法によりデルタ エンドトキシン収率に対し分析した。
個々の株によって産生されたデルタ エンドトキシンの量は、ロケット電気永動
法(RIE)および測光イムノアッセイ(PrA)により、ハシラス ツリンゲ
ンシス亜種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたらされた抗体を用
いて測定した。
400++gの各培養ブロスを秤量した。7II+1の燐酸三ナトリウム緩衝液
(0,125M、pH12)を各サンプルに添加した。
懸濁液を1時間振とうしてデルタ エンドトキシン蛋白質を得た。
次いでサンプルを3.50Orpmで15分間遠心し次いで上澄みを、B、ツリ
ンゲンシス亜種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたらされる抗血
清に対するロケット免疫電気泳動によりデルタ−エンドトキシンに対して試験し
た。デルタ エンドトキシンの量を、結晶蛋白質の公知量を有する標準に対し比
較して測定した。
結晶蛋白質の濃度も又、測光イムノアッセイにより測定した。結晶蛍白質をアル
カリ溶液中に溶解した。溶解蛍白質をそれらの抗体により沈でんさせた。この反
応速度を濁り測定法で決定した。デルタ−エンドトキシンの量を公知量の結晶蛋
白質を有する標準に対して相対的に測定した。
分析で用いた抗体の生産に対する結晶抗原は、B、ツリンゲンシス亜種テネブリ
オニスから単離された結晶から得られた。
多クローン性抗体は、0.25mgの結晶抗原を毎2周間家兎に注射することに
よりもたらされた。
得られた結果を次の表1aおよび表1bに示す。デルタエンドトキシン収率をB
TTtl/g (培養ブロスg当たりの単位、ロケット免疫電気永動(RIE)
により決定、又は測光免疫イムノアッセイ(PIA)により決定)として表わす
。純粋なり、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス蛋白質結晶に対して用いられる
値は、500. 000BTTU/gである。以下の表1aに示される値は、6
〜7個の独立発酵物の平均であり、表rb内の値は、3個の独立発酵物の平均で
ある。
表1a
振とうフラスコ中、ハシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株により産生
されるデルタ エンドトキシンデルタ エンドトキシン収率
RIE PIA
株 BTTU/g 、 BTTU/g
DSM 2803 676 1293
NRRL−B 15939 747 1126NB 178 986 1728
DSM 5526 1097 1860DSM 5480 2382 4169
表1b
振とうフラスコ中、ハシラス ツリンゲンシス亜種テネフ゛リオニス株により産
生されるデルタ エンドトキシンデルタ エンドトキシン収率
YE
株 BTTU/g
NB 197 1103
NB 198 1237
DSM 5480 2867
表1aおよび表1bから以下の内容が、明らかである。すなわち、03M548
は、ハシラス ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの原株、DSM2803およ
び「ハシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−B 1593
9よりも3倍以上多いデルタ エンドトキシンを生産し、更にハシラス ツリン
ゲンシス亜種テネブリオニスの商業製品の生産に今日用いられている株の2倍以
上の量のデルタエンドトキシンを生産する。
ハシラス ツリンゲンシス亜種、突然変異株DSM5480の位相差検鏡法、走
査型電子検鏡法および伝達電子検鏡法により以下の内容が明らかになった。すな
わち、この突然変異株により生産される蛋白質結晶は、ハシラス ツリンゲンシ
ス亜種テネプリオニス、株DSM2803.DSM5526、NB178および
NB198並びに「ハシラス ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL
−B 15939およびNB 197により生産される相当する蛋白質結晶より
もはるかにより大きい。
例3
この例において、B、ツリンゲンシス亜種テネプリオニス、株DSM2803.
DSM5526.NB178およびNB198、および突然変異株DSM548
0並びrB、ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」、株NRRL−B 15939
およびNB 197におけるスポロゾイト形成および副芽胞結晶形成を、固体培
地および液体培地について比較した。
各棟を、以下の組成を有する寒天斜面上30°Cで2日間増殖させた。組成は、
蒸留水11当たりのg数で表わされる。
ペプトン(ディフコ) 5g
牛肉エキス(ディフコ) 3g
寒天(ディフコ) 20g
pH7,0
各々の株を液体培地中でも増殖させた。全ての株を寒天斜面上30°Cで17時
間増殖させた。各棟からの細胞の懸濁液5mlを、各々100m1の培地を有す
る、複数個の500m1バツフル低型工ルレンマイヤフラスコに移した。
培地は以下に示される量(水道水11当りのg数で表わされる)の成分から成る
。
液体培地:
酵母エキス 5g
KHzPO40,8g
、+H7,0
インキュベートされるフラスコを振とうしながら(250rp道)30°Cで9
6時間振とうした。
B、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、株DSM2803、DSM5526.
NB178およびNB198、および「B、ツリンゲンシス亜種サン ジエゴ」
、株NRRL−B15939およびNB 197は、全て両方の培地上で良好に
スポロゾイト形成した。細胞溶解前には、細胞は胞子および副芽胞結晶を含有し
ていた。結晶の大きさは、細胞熔解のときまでは長さ0.4μmから0.9〜1
.1μmであった。蛋白質の平均大きさは0.6〜0.7μm長であった。
突然変異株DSM5480ば、固体培地および明定した液体培地中受ない胞子(
1ml当たり10h個よりも少ない胞子)を生産した。細胞溶解前、大抵の細胞
は、巨大蛋白質結晶を有し、胞子は有していなかった。蛋白質結晶の寸法は、0
.4〜0.7μmから5.0μmであり、蛋白質結晶の平均寸法は2゜2〜2.
3μm長であった。
伝達電子検鏡法によるこれらの培地からの超微細構造分析により以下の内容が明
らかにされた。すなわち、突然変異株におけるスポロゾイト形成プロセスは、開
始されているが、細胞溶解前までには完了していなかった。スポロゾイト形成プ
ロセスは、種々の細胞内で種々の段階に達していた。スポロゾイト形成が、段階
■(前胞子隔膜形成)にのみ達していた細胞においては、蛋白質結晶は全ての細
胞を満たしていた。
生産培地(例2)において、突然変異株はより多数の胞子(107〜108個の
胞子/la l )を生産した。この培地において突然変異株のスポロゾイト形
成頻度は、親株におけるよりも10〜100倍低かった。
従って、突然変異株は、通常の胞子を生産する能力を保持している。しかし、突
然変異株のスポロゾイト形成頻度は、培地に強く依存するように思われる。
個々の株によって生産される蛋白質結晶の寸法を表I!aおよびnbに示す。
表I[a
今日入手できる甲虫活性B、ツリンゲンシスにより生産される蛋白質の寸法
蛋白質結晶の長さくμm)
株 最小値 最大値 平均値
DSM 2803 0.4 0.9 0.7NRRL−B−15939Ci、4
0.9 0.7NB178 0.5 0.9 0.7
05M 5526 0.4 0.9 0.7DSM548Q O,75,02,
3
表nb
今日入手できる甲虫活性B、ツリンゲンシス株により生産される蛋白質の寸法
蛋白質結晶の長さくμm)
株 最小値 最大値 平均値
NB197 0.4 0.7 0.6
NB198 ” 0.4 1.1 0.7DSM 5480 0.4 4.2
2.0表Iraおよび表nbから、突然変異株DSM5480は、今日入手でき
る甲虫活性B、t、株のいずれよりもはるかに大きい蛋白質結晶を生産すること
が明らかである。
得られたデータから、スポロゾイト形成に関しデルタ エンドトキシン生産の範
囲が突然変異株において変化したことは明白である。
突然変異株は、胞子発育前に蛋白質結晶を生産するようであり、これによりデル
タ エンドトキシン生産のためのより長期間を細胞に与え、これは親株における
よりも細胞溶解の時までにはるかにより大きな蛋白質結晶の生産をもたらす。
入手できる栄養源並びにスポロゾイト形成の時までの細胞内の蛋白質結晶の寸法
に依存して、通常の胞子は、細胞溶解の時までに発育するであろう。
例4
この例においては、高生産性Btt突然変異株DSM5480を、コロラドポテ
ト甲虫の幼虫駆除のための強力生産品を得るために用いた。
DSM5480を、通気撹拌した生産発酵タンク内の例2に記載した生産発酵培
地上で発酵させた。96時間後、連続遠心分離機で遠心により回収した。
活性蛋白質結晶を含有する濃厚クリームを、微生物保存剤を添加して殺菌し、p
oを5.0に調節した。
濃厚クリームの1部を、噴霧乾燥し、水和剤の処方用に後に用いた。濃厚クリー
ムの残りは、2種の水性流動性コンセントレート(FC)の処方用に直接用いた
。
水和剤は、表■に記載の如く処方した。2種のFCの処方は表■に示される。
表■ ノボドール(NOVODOR) (登録商標)水和剤処方成 分 重量%
BttO噴霧乾燥濃厚クリーム 40
洗剤 9
凝結防止剤 1
不活性充てん剤 50
表IV/ボドー)L、 (NOVODOR) (登録商標)FC処方Btt濃厚
クリーム 88 55
保存剤 4
凍結防止剤 9.1 19
洗剤 2.5 2.5
pH調節剤 2.85 2.85
水 1.55 16.65
100、0 100.0
純粋な結晶蛋白質の500. OO0BTT[I/gの値を用いると、処方中の
活性結晶蛋白質の濃度は次の通りである。
/H−n (NOVODOR) (登録商標)WP 70.8 KBTTU/g
14.16/fF−1(NOVODOR) (登録商標)FCI 24.7K
BTTU/g 4.94/IF−4(NOVODOR) (登録商標)FC21
4,2KBTTU/g 2.84洗剤は、殺虫剤製品中で通常用いられる懸濁助
剤および水和剤内から広幅く選んだ。
凝結防止剤は、親水性シリカであり、不活性充てん剤は、不活性充てん剤、例え
ばベントナイト、無機塩又は粘土から用いられる。
FC中で用いられる保存剤は、食物および化粧保存剤の群から選ばれた。pl(
調節剤は無機酸である。
例5
圃場試験を行ない、主な目標害虫、コロラドじゃがいも甲虫の幼虫に対する高生
産性Btt突然変異株DSM5480の微生物学的効果を証明した。2種の商業
製品トリプント(Trident)(登録商標)およびエムーオネ(M−。
ne)(登録商標)について比較した。作物はじゃがいもであった。
作物に3回、6月20日、6月27日および8月3日(第2世代幼虫)に散布し
た。
用いた製品および用量は次の通りであった:1.5クォート/ニーtj−14,
22,842,5りオート/ニーカー 14.2 2.843.0りオート/ニ
ーカー 14.2 2.84未処理対照に比較したCPB幼虫の駆除平均%を表
Vに示す。コロラドじゃがいも甲虫淘汰圧は未処理コントロールにおいて非常に
重かった二8月1日に20本の作物に対し370匹の幼虫および8月8日に20
本の作物に対し904匹の幼虫
表V
コントロール(%)
処 理 8月1日 8月8日
ノネ“トル(登録商標)FC21,5クオート 95 100ノネドール(登録
商標)FC22,5クオート 98 99ノ亀F−ル(登録商標汗C23フォー
) 100 100これらの結果は、明らかに高生産性突然変異株DSM548
0を用いて生産した製品は、圃場におけるコロラドじゃがいも甲虫の幼虫駆除に
有効であった。高生産株によって生産れる結晶蛋白質は、十分に活性であり、1
.5クオートのノボドールFCは、4クオートのトリプントと同長の結果を与え
更に2クオートのエムーオネと同様の結果を与える。
補正書の翻訳文提出書
(特許法第184条の8)
平成4年5月13日
Claims (39)
- 1.親株と比較して高量の殺虫性デルターエンドトキシンを生産し得るバシラス シリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)の突然変 異株又は変異株。
- 2.B.ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株が、親株と比較して2倍又は2 倍以上の殺虫性デルターエンドトキシンを生産する能力を有する、請求の範囲第 1項記載の突然変異株又は変異株。
- 3.B.ツリンゲンシス突然変異株又は変異株が、B.ツリンゲンシスの病原型 に属する、請求の範囲第2又は3項に記載の突然変異株又は変異株。
- 4.B.ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株が、その親のB.ツリンゲンシ スデルターエンドトキシンと同様に、同様の害虫、例えば蝶蛾類鱗翅目(B.ツ リンゲンシス亜種クルスタキおよび/又は亜種アイザワイからの突然変異株)、 双翅目害虫(B.ツリンゲンシス亜種イスラレンシス又は甲虫類の害虫(B.ツ リンゲンシス亜種テネプリオニスからの突然変異株)に対して企図された活性を 有する、請求の範囲第1,2、又は3項のいずれかに記載の突然変異株又は変異 株。
- 5.B.ツリンゲンシスが、亜種テネブリオニスに属し更に生産されるデルター エンドトキシンが甲虫に対し活性である、請求の範囲第1,2,3又は4項のい ずれかに記載の突然変異株又は変異株。
- 6.B.ツリンゲンシス亜種テネプリオニスが、株DSM2803のデルタエン ドトキシンの3倍以上生産することができる、請求の範囲第5項記載の突然変異 株又は変異株。
- 7.突然変異された、又は変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株 が、その親株の副芽胞結晶の平均端長の長さの少なくとも2倍の長さの平均端長 を有する副芽胞結晶を生産できる、請求の範囲第5又は第6項記載の突然変異株 又は変異株。
- 8.突然変異された又は変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株が 、2μm以上の平均端長を有する副芽胞結晶を生産できる、請求の範囲第7項記 載の突然変異株又は変異株。
- 9.突然変異された又は変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネブリオニスが、 親株のスポロゾイト形成頻度よりも10〜100又は106回より低いスポロゾ イト形成頻度を示す、請求の範囲第4〜8項のいづれかに記載の突然変異株又は 変異株。
- 10.突然変異されたB.ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株が、株DSM2 803のスポロゾイト形成頻度よりも10〜100又は106回より低いスポロ ゾイト形成頻度を示す、請求の範囲第9項記載の突然変異株又は変異株。
- 11.突然変異株が、寄託された突然変異株B.ツリンゲンシス亜種テネプリオ ニスDSM5480である、請求の範囲第1項記載の突然変異株。
- 12.殺虫性のB.ツリンゲンシス生産物の製造するための請求の範囲第1〜1 1項のいずれかに記載の突然変異株もしくは変異株の使用であって、B.ツリン ゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、および他の成分を含む適当な 培地中で適当な時間培養し、次いでデルタエンドトキシンを回収し、しかる後デ ルタエンドトキシンを含んでなる殺虫生産物を培地より単独又は細胞および/又 は胞子と共に回収し、次いでこの生産物を所望により農業的に許容できる賦形剤 と混合する、前記使用。
- 13.有効成分として、請求の範囲第12項記載に従って得られたB.ツリンゲ ンシスデルタエンドトキシンを含んでなる殺虫剤組成物。
- 14.デルタエンドトキシンを単独で又は他の生物学的に活性な生産物と組合わ せて利用する、請求の範囲第13項記載の組成物。
- 15.農業的に許容できる希釈剤又は担体と混合されたB.ツリンゲンシスデル タエンドトキシン生産物を含んでなる請求の範囲第13又は14項記載の殺虫剤 組成物又は製剤。
- 16.親株により生産された殺虫剤組成物の強度よりも2倍以上の強度を有する 請求の範囲第13〜15項のいずれかに記載の組成物。
- 17.少なくとも3%w/wの甲虫殺虫性結晶蛋白質に相当する、少なくとも1 5,000BTTU/gの強度を有する液体殺虫剤組成物。
- 18.少なくとも10%w/w甲虫殺虫性結晶蛋白質に相当する、少なくとも5 0,000BTTU/gの強度を有する乾燥殺虫剤組成物。
- 19.DSM2803又は他の甲虫活性Btt株から生産された殺虫剤組成物の 強度の少なくとも2倍を有するDSM5480から生産された殺虫剤組成物。
- 20.組成物中の希釈剤又は担体が、固体、又は所望により表面活性剤を組合せ た液体である、請求の範囲第13〜20項のいずれかに記載の方法。
- 21.請求の範囲第13〜20項のいずれかに記載の組成物を、害虫に感染され た領域に適用する、害虫の駆除方法。
- 22.害虫.が、蝶蛾類鱗翅目、双翅目および甲虫の群に属する、請求の範囲第 21項記載の方法。
- 23.害虫が、甲虫、特にコロラドじゃがいも甲虫である、請求の範囲第22項 記載の方法。
- 24.液体殺虫剤組成物を1エーカー当たり1クオートを適用することにより害 虫を駆除する請求の範囲第22又は23項記載の方法。
- 25.乾燥殺虫組成物を1エーカー当たり0.5ポンド適用することにより害虫 を駆除する、請求の範囲第22又は23項記載の方法。
- 26.バシラスツリンゲンシス株を突然変異させ次いで親株よりも実質的により 多量のデルタエンドトキシンを産生できるそのような株を選択する方法であって 、親株をi)変異原で処理し、 ii)このように処理された突然変異株を無胞子および/又はオリゴ胞子株の選 択に対して適当な培地中で増殖させ、iii)半透明コロニーを選択し次いで加 熱により流動しない培地中で増殖させ、次いで iv)コロニーを熱処理に委ねることにより真に無胞子株を除外する、前記方法 。
- 27.選ばれたコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデルタエンドト キシン生産を増加し得る株に対する最終選択を行う、請求の範囲第26項記載の 方法。
- 28.工程(i)において、変異原が、適当な通常の化学源、例えばN−メチル −N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネートであ る請求の範囲第26又は27項記載の方法。
- 29.工程(i)における親株を電磁放射線、例えばγ−,X線−又はUV−放 射線で処理する、請求の範囲第26又は27項に記載の方法。
- 30.工程(ii)において、適当な培地がホスフェートを含む変性栄養胞子形 成培地(NSMP培地)である、請求の範囲第26〜30項のいずれかに記載の 方法。
- 31.工程(iv)において、適当な培地がMgCl2およびゲルライト(Ke 1co)を捕ったNSMP培地である請求の範囲第26〜30項のいずれかに記 載の方法。
- 32.親株が、B.ツリンゲンシス亜種クルスタキ、B.ツリンゲンシス亜種ア イザワイ、B.ツリンゲンシス亜種イスラエンシンスおよびB.ツリンゲンシス 亜種テネプリオニスから成る群に属する、請求の範囲第26〜31項のいずれか に記載の方法。
- 33.親株が、B.ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株である、請求の範囲第 32項記載の方法。
- 34.親株が、B.ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株DSM5526である 、請求の範囲第33項記載の方法。
- 35.親株よりも実質的により多量のデルタエンドトキシンを産生できるバシラ スツリンゲンシス株の突然変異株又は変異株を選択する方法であって、該親株を i)適当な栄養培地中で培養し、 ii)工程(i)から培養プロスを無胞子および/又はオリゴ胞子株の選択に対 して適当な培地上に散布し、iii)半透明コロニーを選択し次いで加熱により 流動しない培地中で増殖させ、次いで iv)真に無胞子株をコロニーを熱処理に委ねることにより除外する、前記方法 。
- 36.選ばれたコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデルタエンドト キシン生産を増加し得る株に対する最終選択を行う、請求の範囲第35項記載の 方法。
- 37.工程(ii)において、適当な培地がホスフェートを含む変性栄養胞子形 成培地(NSMP培地)である、請求の範囲第35又は36項に記載の方法。
- 38.工程(iv)において、適当な培地がMgC12およびゲルライト(Ke Ico)を補ったNSMP培地である請求の範囲第35〜38項のいずれかに記 載の方法。
- 39.親株が、B.ツリンゲンシス亜種クルスタキ、B.ツリンゲンシス亜種ア イザワイ、B.ツリンゲンシス亜種イスラエンシンスおよびB.ツリンゲンシス 亜種テネブリオニスから成る群に属する、請求の範囲第35〜38項のいずれか に記載の方法。
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