JPH05501955A - デルタエンドトキシンを高収率で産生するバシラスツリンゲンシスの突然変異株又は変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 デルタ　エンドトキシンを高収率で 産生ずるハシラス　ツリンゲンシス の突然変異株又は変異株 発明の背景 ハシラス　ツリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の 商業上の製剤は、害虫の生物学的制御用として広く用いられている。これらの細 菌殺虫剤の利点は、非常に制限された範囲の標的混生に対し極めて選択的であり かつ性分解性であるということである。

ハシラス　ツリンゲンシスの商業製剤は、副作用を有さすに収穫の直前に使用で きる。

ハシラス　ツリンゲンシスは、棒状の嫌気性の胞子形成細菌であり、これはスロ ゾイト形成過程中、１個又はそれ以上の封入体（副芽胞結晶と呼ばれる）の産生 を特徴とする。これらの結晶は、高分子量の蛋白質（デルタ　エンドトキシンと 呼ばれる）から構成される。デルタ−エンドトキシンは、ハシラス　ツリンゲン シスの商業的に入手できる製剤中の有効成分である。

種々の害虫宿主スペクトルを有する多（のＢ、ツリンゲンシスは、同定されてき ている。それらは、鞭毛状の抗原に基づき種々の亜種に分類される。特に興味あ るものは、蝶蛾類鱗翅目の害虫に用いられるハシラス　ツリンゲンシス亜種カル スタキおよび亜種アイザワイ、双翅目害虫の駆除ムご用いられるハシラス　ツリ ンゲンシス亜種イスラレンシスおよび甲虫類の害虫の駆除のために用いられるハ シラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスである。

甲虫毒性ハシラス　ツリンゲンシスの最初の単離は、１９８３年に報告された（ Ｋ、クリーク等、Ｚ、ａｎｄ、Ｅｎｔ。

９６．５００〜５０８、ヨーロンパ特許公開０１４９１．６２）。

単離物（これは、ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと呼ばれる）は 、受託番号ＤＳＭ２８０３をもってジャーマン　コレンイション　オブ　バイオ オーガニズムに寄託された。ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスは、 コメノゴミムシダマシおよびチャイロコメノゴミムシダマシの幼虫、−ネブリオ 　モ’　ト（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｒｉｔｏｒ）　（テネブリオニデ、コレオ ブテラ）の蝋の死体から１９８２年に単離された。菌株は各細胞内に１種の胞子 および１種以上の殺虫性態芽胞結晶を産生し、この結晶は平らな板状形であり、 約０゜８μｍ〜１５μｍの婦長を有する。これはハシラス　ツリンゲンシスの血 清型Ｈ８ａ、８ｂおよび病理型Ｃに属する（クリーク等、５ｙｓｔｅ１１．　Ａ ｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９．　１３８〜１４１゜１９８７、米国特許４ ．７６６、２０３）これは、成る種の食葉甲虫の幼虫に対しのみ毒性があるが、 青虫（レビドプテラ）、蚊（ジブテラ）又は他の混生に対して有効でない。ハシ ラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオンニスからの結晶および胞子又は単離した 結晶を取込んだ後、コロラドポテト甲虫（レプチノタルザ　デセミレネアタ）の 幼虫および一定の成虫の給餌を止める。幼生期段階のＬＬ−Ｌ３は、１〜３日以 内に死亡する（シェネテル等、ｒ　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ａｐｐｌ ｉｅｃｊ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　：ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｐａｔｈｏｌｏ ｇｙ　ＪＲ，Ａ、サムサン等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ 　Ｉｎｔ、　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈ ｏｌｏｇｙ、５５５頁、１９８６年）。

近年、以下の内容が明らかにされた。すなわち、甲虫活性の結晶に加えてハシラ ス　ッリンゲンシス亜種テネブリオニスは、紡鐘形、スベロイダル（ｓｐｅｒｏ ｉｄａｌ）　、又は板状の他の副芽胞結晶を生成する（Ａ、Ｍ、ツーゲルおよび Ａ、クリーク、Ｊ、Ａ、ｐｐｌ、Ｅｎｔ、１０８，４９０〜４９７．１９８９） 。第二の結晶の活性は未だ知られていない。

ハシラス　ツリンゲンシス亜種の４種の商業製品は、甲虫の駆除に開発されてい る。ノボ　ノルディスク社製造のノボドール（ＮＯＶＯＤＯＲ（登録商標））、 サンド社のトリデフ）　（ＴＲＩＤＥＮＴ　（登録商標））、およびアボット　 ラボラトリ−社のジテラ（ＤｆＴｅｒｒａ（登録商標））、およびエコゲン社の フォイル（Ｆｏｉｌ）（登録商標））である。

他の甲虫毒バシラス　ッリンゲンシス菌株の単離は、１９８６年に報告された（ ベルンスタント等、８ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

４巻、３０５〜３０８．１９８６、米国特許４，７６４，３７２　、　１９８８ 年）「ハシラス　ッリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」と称されるこの菌株、Ｍ、 は、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９３９をもってノーザン　レージョ゛ナル　リ サーチ　ラボラトリ−（Ｕ　Ｓ　Ａ、　）に寄託された。「ハシラス　ッリンゲ ンシス亜種サン　ジエゴ」に基づく商業製品は、マイコーゲン社により開発され た。

バシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、ＤＳＭ２８０３および植物細胞 の表現型特徴を含む「バシラス　ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴＪ、ＮＲＲＬ −Ｂ　１５９３９の比較研究、毒性側芽胞結晶の特徴およびプラスミドＤＮＡの 分析は、しかし、「バシラス　ツリンゲンシス亜種すンジエゴ」が先に単離され た株ＤＳＭ２８０３、バシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスと明らかに 同一であることを示しティる（クリーゲ等、Ｊ、Ａｐｐ　Ｉｎ、Ｅｎｔ、１０４ ．４１７〜４２４．１９８７））。更にバシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリ オニスおよび「バシラス　ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」由来の甲虫活性デ ルタ　エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列 は同一である。

同一の培養条件下で前記の第二のタイプの結晶は又、「バシラス　ツリンゲンシ ス亜種サン　ジエゴ」により合成される（Ａ、　Ｍ、ツーゲル　アンド　Ａ、ク リーク、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｔ、１０８，４９０〜４９７．１９８９）。

・バジ＋７りおよびＥ、フラツフ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ　３５　（２）　。

２３３〜２４．０．１９９０）によれば、「サン　ジエゴ」単離物は、「テネフ ゛リオニス」（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）に類イ以しており、更にそれを異なる 亜種として正当に見なみことはできない。

甲虫の害虫を駆除するためのバシラス　ツリンゲンシスの有用性は、甲虫活性毒 素の有効性およびその経済的生産性および生産物の効力に依存する。一方、これ は害虫活性バシラス　ツリンゲンシス株の発酵によって産生されるデルタ　エン ドトキシンの量に依存する。

Ｂ、ツリンゲンシスは、殺虫剤の製造に対し多年用いられてきたが、デルタ−エ ンドトキシンの増加を伴う突然変異株は有利であろう。しかし、そのような変異 株はこれまで記載されていない。

高収率でデルタ−エンドトキシンを産生する突然変異株は、Ｂ、ツリンゲンシス 毒素のより有効でかつ経済的産生並びに同等のコストでより強力なり、ツリンゲ ンシスの生産に対する可能性を与えるであろう。一方、これは利用者に対しては 有利であろう。何故ならより少ない量の殺虫剤が保存され、更に一定の面積に対 して取扱われるからである。加えて、使用者はより少ない容器材料で処理でき、 これにより環境への影響を少なくすることができる。

突然変異を通じてのバシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスによるデルタ 　エンドトキシンの生産性の改良は、これまでに報告されていない。

甲虫の幼虫を駆除することにおける特にＢ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス の使用に関する二つの問題は、処理されるべき領域に対し相当に多量の製剤を必 要とする製剤の能力又は強度が相当に低いということである。例えば殆ど他のＢ 、ツリンゲンシス製品および殆ど他の殺虫剤は１〜２１／ｈａであるのに比較し 、５〜１０１７ｈａ必要である。

従って改良された強度を有する製品に対する必要性が存在する。

この問題を解決する一つの方法は、製剤の濃度を高めることであろう。しかし、 これは保存および輸送において得られる節約に比較して相当に生産コストが高く なるであろう。

はるかによりすばらしい解決法は、細胞光たり実質的により多量のデルタ　エン ドトキシンを生産し得るＢ、ツリンゲンシス株の突然変異体を造ることであろう 。

発明の要約 従って本発明は、−の面において、それらの親株よりも実質的により多量の毒素 を生産し得る突然変異もしくは変異バシラス　ツリンゲンシス株に関する。

他の面において、本発明は、亜種テネブリオニスに属するＢ、ツリンゲンシス株 の高生産性突然変異株もしくは変異株に関する。

本発明の更に他の面は、殺虫製品の製造のためのそのような突然変異もしくは変 異バシラス　ツリンゲンシス株の使用、並びに有効成分として本発明の突然変異 又は変異バシラスツリンゲンシス株によって産生されるデルタ−エンドトキシン を含んでなるそのような殺虫組成物にも関する。

また、本発明は、その一つの面において問題となっているデルタ−エンドトキシ ンの活性に感度性の害虫が駆除されるべきである領域に、本発明に係る組成物を 適用することにより害虫を駆除する方法に関する。

更に別の面において、本発明はそれらの親株よりも実質的により多量のデルタ　 エンドトキシンを産生し得るそのような変異された又は突然変異されたＢ、ツリ ンゲンシス株を得るために選択し、もしくは突然変異させ次いで選択する方法に 関する。

微生物の寄託 本発明を詳細に記載する目的のため、高量のデルタ−エン突然変異株を、ドイツ チェ　ザンムルク　フォノ　マイクロオルガニネメン　ラント　ツエルグルツレ ン　ＧｍｂＨｌ（マツシエローデルベルクｌｂ、Ｄ−３３００ブラウシバイク、 ドイツ共和国）に、下記に示す日に特許手続の目的のため寄託した。ＤＳＭはブ ダペスト条約に基づく国際機関であり、条約の規則９に従って寄託の不変性を付 与する。

寄託日　１９８９年１０月１０日 寄託者の参照番号　ＮＮＢ１７６− １ＤＳの受託番号　ＤＳＭ５４８０ 突然変異株ＤＳＭ５４８０は、バシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、 菌株ＤＳＭ５５２６　（これは又下記に示すようにブダペスト条約に基づき寄託 された）を突然変異させることにより得られた。

寄託日　１９８９年９月１４日 寄託者の参照番号　ＮＮＢ１２ ５ＤＳの受託番号　ＤＳＭ５５２６ 発明の開示 本発明は、その一般的な面において、その親株に比較して高量の活性デルタ−エ ンドトキシンを産生するバシラス　ッリンゲンシスの突然変異株又は変異株に関 する。

本明細書中、表現の「高貴」は好ましくは少なくとも２倍又はそれ以上を意味す る。

本発明のこの面において更に以下に示す本発明のより特異的面の双方において、 Ｂ、ツリンゲンシス突然変異株によって産生されるデルタ−エンドトキシンは、 その親Ｂ、ツリンゲンシスと同様の害虫、例えば鱗翅目害虫（これに対してはＢ 、ツリンゲンシス亜種カルスタキおよび亜種アイザワの突然変異株）、双翅目害 虫（これに対してはＢ、ツリンゲンシス亜種イスラレンシスからの突然変異株） 又は甲虫類の害虫（これに対してはＢ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの突 然変異株）に対して企図される活性を有するであろう。

本発明の−の特定の態様において、Ｂ、ツリンゲンシスは亜種テネブリオニスに 属し、産生されたデルタ−エンドトキシンは甲虫に対して活性である。

この面のもと本発明の好ましい態様において、Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリ オニスの突然変異株又は変異株は、菌株ＤｓＭ２８０３の３倍以上のデルタ　エ ンドトキシンを産生することができる。

本発明の別の態様は、Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの突然変異株又は 変異株を含んでなり、これらは平均婦長２μｍ又はそれ以上の副芽胞結晶を産生 じ得る。

本発明の更に別の態様は、親株、又は株ＤＳＭ２８０３のスポロゾイト形成頻度 よりもより少ないスポロゾイト形成頻度１０〜１００又は１０６回を示す。突然 変異されたもしくは変異されたＢ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株を含ん でなる。

更により好ましい態様は、寄託された変異株Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリオ ニス、０３Ｍ５４８０を含んでなる。

本発明の研究過程において、その親株（０３Ｍ５５２６）と比較して２倍以上の デルタ−エンドトキシン産生を示すＢ。

ツリンゲンシス亜種テネブリオニス（０３Ｍ５４８０）の突然変異株が単離され た。この突然変異株の位相差検鏡法および走査型電子検鏡法および伝導電子検鏡 法では、以下の内容が明らかに示される。すなわち、この突然変異株の高生産性 は、スポロゾイト形成に関するデルタ　エンドトキシン産生の調整における変化 に帰因し、これは存在する甲虫活性バシラス　ツリンゲンシス株により産生され る結晶よりも５倍以上大きい蛋白質結晶の生産をもたらす。結晶形成とスポロゾ イト形成間の密接な相互関係は、離されておるようでありそして変異株は、スポ ロゾイト形成前に高量のデルタ　エンドトキシンを産生ずる。

本発明の一つの面において、本発明は殺虫性のＢ、ツリンゲンシス生産物の製造 方法において本発明の突然変異株もしくは変異株の使用に関し、該方法において Ｂ、ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、および当業者に公 知の他の成分を含む適当な培地中で適当な時間培養し、次いでデルタ　エンドト キシンを回収する。

本発明の別の面において、上記で得られたＢ、ツリンゲンシス　デルタ　エンド トキシン生産物は、殺虫剤組成物中の有効成分として用いられる。

本発明は又、本発明のＢ、ツリンゲンシス　デルタ　エンドトキシンおよび農業 的に許容できる希釈剤又は担体を含んでなる殺虫剤組成物又は製剤に関する。

本発明は又、Ｂ、ツリンゲンシス　デルタ　エンドトキシン生産物を含む殺虫剤 組成物又は製剤に関し、液体形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少 なくとも３％Ｗ／Ｗに相当する、少なくとも１５．　０００ＢＴＴＵ／ｇの強度 を有するか、又は乾燥形の該殺虫剤組成物は、甲虫殺虫性結晶蛋白質の少な（と も１０％ｗ　／　ｗに相当する、少なくとも５０゜０００　ＢＴＴＵ／　ｇの強 度を有する。

特定の態様において、本発明はＤＳＭ２８０３又は他の甲虫活性Ｂｔｔ株から産 生される殺虫組成物の少なくとも２倍の強度を有する０３Ｍ５６８０から産生さ れる殺虫組成物に関する。

本発明の組成物は、農業化学品の製剤化に対して公知の方法での形態を採ること ができ、例えば懸濁液、水性エマルション、粉剤、分散粉末、乳化性コンセント レート又は顆粒である。更に、該組成物は直接適用に対する適当な形態でよく、 あるいは又コンセントレートとして、又は主組成物でよ（、これは適用前に適当 量の水又は他の希釈剤で希釈する必要がある。

本発明組成物の殺虫的に有効なり、ツリンゲンシス　デルタ　エンドトキシンの 濃度は、植物に適用の際、単独又は他の殺虫剤と組合せた場合、好ましくは約０ ．５〜２５重量％、特に１〜１５重量％である。

更に別の面で本発明は、害虫の駆除方法に関し、ここにおいて、先の殺虫剤組成 物を害虫で浸された領域に適用する。

特定の態様において、駆除されるべき害虫は、蝶！＠類鱗翅目、双翅目および甲 虫に属する群、特に甲虫、例えばコロラドじゃがいも甲虫である。

特定の態様において、害虫は液体殺虫剤組成物１ニーカー当たり１クオートの適 用により、又は乾燥殺虫剤組成物１ニーカー当たり０．５ボンドの適用により駆 除できる。

本発明の活性Ｂ、ツリンゲンシス製剤又は組成物は、例えばスプレー法又はダス チングにより害虫が植物に現われ始めた時に植物に直接適用できる。適用の好ま しい態様は、スプレー法である。一般に、幼虫成育の初期の段階において害虫の 良好な駆除を得ることが必要である。何故なら、このときが植物が最も少ない損 害を受ける時だからである。

バシラス　ツリンゲンシス株を突然変異させ次いで親株よりも実質的により多量 のデルタ　エンドトキシンを産生できるそのような株を選択する一つの方法にお いて、親株をｉ）変異原で処理し、 ｉｉ）このように処理された突然変異株を無胞子および／又はオリゴ胞子株の選 択に対して適当な培地上で増殖させ、街）半透明ココニーを選択し次いで加熱に より流動しない培地中で増殖させ、次いで ｉｖ）真に無脂子株をコロニーを熱処理に委ねることにより除外する。

この方法の好ましい態様によれば、このように選ばれたコロニーを通常の製造培 地中で増殖させ、次いでデルタ　エンドトキシン生産を増加し得る株に対する最 終選択を行う。

上記方法の工程（ｉ）において、変異原は、適当な通常の化学源、例えばＮ−メ チル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネート であってよく、あるいは親株を電磁放射線、例えばＴ−、Ｘ線−又はＵＶ−放射 線で処理する。

工程（ｉｉ　）において、適当な培地はジョンソン等（’５ｐｏｒｅｓ　Ｖ［に Ｐ、ゲルトアルド等編集、２４８〜２５４頁、１９７５年）によって記載される 如くホスフェートを含む変性栄養胞子形成培地（ＮＳＭＰ培地）であってよい。

本発明方法の工程（ｉｖ）において、適当な培地はＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚおよびゲル ライト（Ｋｅｌｃｏ）を補ったＮＳＭＰ培地であってよい。

本発明の高生産性変異株又は突然変異株を得る他の方法は、例えば液体、培地中 で親株を増殖させ次いで無胞子および／又はオリゴ胞子変異株の選択に対し適当 な寒天培地上に培養ブロスを散布した後自発的突然変異株又は変異株を選択する ことにより企図される。

本発明の高生産性変異株又は突然変異株をスクリーニングする他の方法は、例え ば遠心分離により又は集団の他の分離手段により、これらの集団を用いて行うこ とができる。

例１ ２倍のデルタ−エンドトキシン生産能を有するＢ、ツリンゲンシス亜種テネブリ オニスの突然変異株を単離した。この変異株の位相差顕鏡法、走査型電子顕鏡法 および伝達電子顕鏡法により以下の内容が説明する。すなわち、この変異株の高 生産性は、スポロゾイト形成に関してデルタ　エンドトキシン生産の調整の変化 に基づくものであり、これは存在する甲虫活性ハシラス　ツリンゲンシス株によ り生産される結晶よりも５倍以上までも大きい蛋白質結晶の生産をもたらす。

結晶形成とスポロゾイト形成間の密接な双互関係は除かれたと思われ、そして変 異株はスポロゾイト形成前に高量のデルタ−エンドトキシンを生産する。

高収率突然変異株の生産 Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの胞子、株ＤＳＭ５５２６を７　ｋＧｙ の放射線量を得るためにγ照射した。照射した胞子をＮＳＭＰ寒天プレート（サ ンセン等（ｒｓｐｏｒｅｓ　■」、Ｐ、プルハルト等編集、２４８〜２５４頁、 １９７５年）により記載されるホスフェートを含む変性栄養胞子形成培地）上に 散布した。なお、前記培地は、無胞子および／又はオリゴ胞子変異株の選択に対 し適当である。

ＮＳＭＰ−寒天プレートを３０°Ｃで２〜３日間インキュベートした。半透明コ ロニーを取り出し次いで、ＮＳＭＰゲライトプレート（ＭｇＣ１ｚ　（０，５７ ｇ／ｌ）およびゲライト（Ｇｅｒｉｔｅ、Ｋｅｌｃｏ）（２０ｇ／ｌ）を補った ＮＳＭＰ培地に移した。

ＮＳＭＰゲライトプレートを、９０°Ｃで１時間インキュベートし、更に３０° Ｃで１〜２日間インキュベートした。

ＮＳＭＰゲライトプレート上で良好に増殖した突然変異株を選択した。このよう にして全ての無胞子突然変異株は、それらが熱処理後増殖しないので除いた。

選択した突然変異株を商業培地を含有する振とうフラスコ内で増殖させた。生産 されたデルタ−エンドトキシンの量を、以下に記載の免疫学的方法により測定し た。

親株よりも著るしい量のデルタ−エンドトキシンの生産する突然変異株のみを選 んだ。

土壌培地上および液体培地内で選択された突然変異株の形態を位相差検鏡法（Ｘ ２５００）および走査型および伝達電子検鏡法により調べた。胞子および結晶の 数を数えそして蛋白質結晶の大きさを決定した。

得られた突然変異株の内、デルタ−エンドトキシンを産生ずるその顕著な能力に 対し一つ（ＤＳＭ５４８０）を選択した。

突然変異株ＤＳＭ５４８０によって産生されたデルタ　エンドトキシンの量を、 ＤＳＭ２８０３、すなわちバシラスツリンゲンシス亜種テネブリオニスの原単離 物、バシラスツリンゲンシス亜種テネブリオニス、Ｎ０ＶＯＤＯＲ（登録商標） の生産に対して用いられる菌株ＤＳＭ５５２６、ハシラス　ツリンゲンシス亜種 テネブリオニス株ＮＢ　１７８、サントス社から単離され１９８９年からハシラ ス　ツリンゲンシス　テネブリオニス製品ＴＲＩ　ＤＥＮＴ　（登録商標、株Ｎ Ｂ１９８、サントス社から単離され１９９０年よりＢ、ツリンゲンシス亜種テネ ブリオニス製品ＴＲＩ　ＤＥＮＴ　（登録商標）、「ハシラス　ツリンゲンシス 亜種サン　ジエゴ」、株ＮＲＲＬ−Ｂ−１５９３９、およびマイコサンから単離 された株ＮＢ１９７．１９９０年からｒＢ、ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」 製品Ｍ−ＯＮＥ　（登録商標）の各々のデルタエンドトキシン量と比較した。例 ２の表１に示すように、本発明の改良された突然変異株は今は入手できるハシラ ス　ツリンゲンシスの甲虫活性株のデルタ　エンドトキシンの２〜３．５倍を産 生ずる。

例２ この例において、ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネプリオニス突然変異株ＤＳ Ｍ５４８０のデルタ　エンドトキシン収率を、通常の培地におけるハシラス　ツ リンゲンシス亜種テネブリオニス株ＤＳＭ２８０３　（ハシラス　ツリンゲンシ ス亜種の原単離吻）、ＤＳＭ５５２６　（ノボ　ノルディスク社の生産株）およ びＮＢ１７８およびＮＢ１９Ｂ（サントスの生産株）、およびハシラス　ツリン ゲンシス亜種サン　ジエゴ、株ＮＲＲＬ−Ｂ　１５９３９およびＮＢ１９７（マ イコサンの生産株）のデルタ　エンドトキシン収率と比較した。

各棟を、以下の組成の寒天斜面上で３０°Ｃで１７時間増殖させた。前記組成は 蒸留水１１当たりのｇ数で表われ次の組成からなる。

ペプトン（ディフコ）　５ｇ 牛肉エキス（ディフコ＞　３ｇ 寒天（ディフコ）　２０ｇ ｐＨ７，０ 各株からの細胞懸濁液５翔１を、５００１のバッフル底型エレンマイヤーフラス コ内の生産培地１００ｍ１に移した。生産培地は、以下の量（水道水１１当たり のｇ数で表現）の成分からなる。

大豆ミル　５０ｇ 氷解デンプン　４０ｇ ＫＨ２ＰＯ４１，７７ｇ Ｋ、ＨＰｏ、　４．５３ｇ ｐ）！　７．０ インキユベートされるフラスコを、振とうしながら（２５Ｑｒｐｍ　）　３０　 ’Ｃでインキュベートした。９６時間インキュベーション後、培養ブロスを免疫 学的方法によりデルタ　エンドトキシン収率に対し分析した。

個々の株によって産生されたデルタ　エンドトキシンの量は、ロケット電気永動 法（ＲＩＥ）および測光イムノアッセイ（ＰｒＡ）により、ハシラス　ツリンゲ ンシス亜種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたらされた抗体を用 いて測定した。

４００＋＋ｇの各培養ブロスを秤量した。７ＩＩ＋１の燐酸三ナトリウム緩衝液 （０，１２５Ｍ、ｐＨ１２）を各サンプルに添加した。

懸濁液を１時間振とうしてデルタ　エンドトキシン蛋白質を得た。

次いでサンプルを３．５０Ｏｒｐｍで１５分間遠心し次いで上澄みを、Ｂ、ツリ ンゲンシス亜種テネブリオニスからの精製蛋白質結晶に対してもたらされる抗血 清に対するロケット免疫電気泳動によりデルタ−エンドトキシンに対して試験し た。デルタ　エンドトキシンの量を、結晶蛋白質の公知量を有する標準に対し比 較して測定した。

結晶蛋白質の濃度も又、測光イムノアッセイにより測定した。結晶蛍白質をアル カリ溶液中に溶解した。溶解蛍白質をそれらの抗体により沈でんさせた。この反 応速度を濁り測定法で決定した。デルタ−エンドトキシンの量を公知量の結晶蛋 白質を有する標準に対して相対的に測定した。

分析で用いた抗体の生産に対する結晶抗原は、Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリ オニスから単離された結晶から得られた。

多クローン性抗体は、０．２５ｍｇの結晶抗原を毎２周間家兎に注射することに よりもたらされた。

得られた結果を次の表１ａおよび表１ｂに示す。デルタエンドトキシン収率をＢ ＴＴｔｌ／ｇ　（培養ブロスｇ当たりの単位、ロケット免疫電気永動（ＲＩＥ） により決定、又は測光免疫イムノアッセイ（ＰＩＡ）により決定）として表わす 。純粋なり、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス蛋白質結晶に対して用いられる 値は、５００．　０００ＢＴＴＵ／ｇである。以下の表１ａに示される値は、６ 〜７個の独立発酵物の平均であり、表ｒｂ内の値は、３個の独立発酵物の平均で ある。

表１ａ 振とうフラスコ中、ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株により産生 されるデルタ　エンドトキシンデルタ　エンドトキシン収率 ＲＩＥ　ＰＩＡ 株　ＢＴＴＵ／ｇ　、　ＢＴＴＵ／ｇ ＤＳＭ　２８０３　６７６　１２９３ ＮＲＲＬ−Ｂ　１５９３９　７４７　１１２６ＮＢ　１７８　９８６　１７２８ ＤＳＭ　５５２６　１０９７　１８６０ＤＳＭ　５４８０　２３８２　４１６９ 表１ｂ 振とうフラスコ中、ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネフ゛リオニス株により産 生されるデルタ　エンドトキシンデルタ　エンドトキシン収率 ＹＥ 株　ＢＴＴＵ／ｇ ＮＢ　１９７　１１０３ ＮＢ　１９８　１２３７ ＤＳＭ　５４８０　２８６７ 表１ａおよび表１ｂから以下の内容が、明らかである。すなわち、０３Ｍ５４８ は、ハシラス　ツリンゲンシス亜種テネブリオニスの原株、ＤＳＭ２８０３およ び「ハシラス　ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」、株ＮＲＲＬ−Ｂ　１５９３ ９よりも３倍以上多いデルタ　エンドトキシンを生産し、更にハシラス　ツリン ゲンシス亜種テネブリオニスの商業製品の生産に今日用いられている株の２倍以 上の量のデルタエンドトキシンを生産する。

ハシラス　ツリンゲンシス亜種、突然変異株ＤＳＭ５４８０の位相差検鏡法、走 査型電子検鏡法および伝達電子検鏡法により以下の内容が明らかになった。すな わち、この突然変異株により生産される蛋白質結晶は、ハシラス　ツリンゲンシ ス亜種テネプリオニス、株ＤＳＭ２８０３．ＤＳＭ５５２６、ＮＢ１７８および ＮＢ１９８並びに「ハシラス　ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」、株ＮＲＲＬ −Ｂ　１５９３９およびＮＢ　１９７により生産される相当する蛋白質結晶より もはるかにより大きい。

例３ この例において、Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネプリオニス、株ＤＳＭ２８０３． ＤＳＭ５５２６．ＮＢ１７８およびＮＢ１９８、および突然変異株ＤＳＭ５４８ ０並びｒＢ、ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」、株ＮＲＲＬ−Ｂ　１５９３９ およびＮＢ　１９７におけるスポロゾイト形成および副芽胞結晶形成を、固体培 地および液体培地について比較した。

各棟を、以下の組成を有する寒天斜面上３０°Ｃで２日間増殖させた。組成は、 蒸留水１１当たりのｇ数で表わされる。

ペプトン（ディフコ）　５ｇ 牛肉エキス（ディフコ）　３ｇ 寒天（ディフコ）　２０ｇ ｐＨ７，０ 各々の株を液体培地中でも増殖させた。全ての株を寒天斜面上３０°Ｃで１７時 間増殖させた。各棟からの細胞の懸濁液５ｍｌを、各々１００ｍ１の培地を有す る、複数個の５００ｍ１バツフル低型工ルレンマイヤフラスコに移した。

培地は以下に示される量（水道水１１当りのｇ数で表わされる）の成分から成る 。

液体培地： 酵母エキス　５ｇ ＫＨｚＰＯ４０，８ｇ 、＋Ｈ７，０ インキュベートされるフラスコを振とうしながら（２５０ｒｐ道）３０°Ｃで９ ６時間振とうした。

Ｂ、ツリンゲンシス亜種テネブリオニス、株ＤＳＭ２８０３、ＤＳＭ５５２６． ＮＢ１７８およびＮＢ１９８、および「Ｂ、ツリンゲンシス亜種サン　ジエゴ」 、株ＮＲＲＬ−Ｂ１５９３９およびＮＢ　１９７は、全て両方の培地上で良好に スポロゾイト形成した。細胞溶解前には、細胞は胞子および副芽胞結晶を含有し ていた。結晶の大きさは、細胞熔解のときまでは長さ０．４μｍから０．９〜１ ．１μｍであった。蛋白質の平均大きさは０．６〜０．７μｍ長であった。

突然変異株ＤＳＭ５４８０ば、固体培地および明定した液体培地中受ない胞子（ １ｍｌ当たり１０ｈ個よりも少ない胞子）を生産した。細胞溶解前、大抵の細胞 は、巨大蛋白質結晶を有し、胞子は有していなかった。蛋白質結晶の寸法は、０ ．４〜０．７μｍから５．０μｍであり、蛋白質結晶の平均寸法は２゜２〜２． ３μｍ長であった。

伝達電子検鏡法によるこれらの培地からの超微細構造分析により以下の内容が明 らかにされた。すなわち、突然変異株におけるスポロゾイト形成プロセスは、開 始されているが、細胞溶解前までには完了していなかった。スポロゾイト形成プ ロセスは、種々の細胞内で種々の段階に達していた。スポロゾイト形成が、段階 ■（前胞子隔膜形成）にのみ達していた細胞においては、蛋白質結晶は全ての細 胞を満たしていた。

生産培地（例２）において、突然変異株はより多数の胞子（１０７〜１０８個の 胞子／ｌａ　ｌ　）を生産した。この培地において突然変異株のスポロゾイト形 成頻度は、親株におけるよりも１０〜１００倍低かった。

従って、突然変異株は、通常の胞子を生産する能力を保持している。しかし、突 然変異株のスポロゾイト形成頻度は、培地に強く依存するように思われる。

個々の株によって生産される蛋白質結晶の寸法を表Ｉ！ａおよびｎｂに示す。

表Ｉ［ａ 今日入手できる甲虫活性Ｂ、ツリンゲンシスにより生産される蛋白質の寸法 蛋白質結晶の長さくμｍ） 株　最小値　最大値　平均値 ＤＳＭ　２８０３　０．４　０．９　０．７ＮＲＲＬ−Ｂ−１５９３９Ｃｉ、４ 　０．９　０．７ＮＢ１７８　０．５　０．９　０．７ ０５Ｍ　５５２６　０．４　０．９　０．７ＤＳＭ５４８Ｑ　Ｏ，７５，０２， ３ 表ｎｂ 今日入手できる甲虫活性Ｂ、ツリンゲンシス株により生産される蛋白質の寸法 蛋白質結晶の長さくμｍ） 株　最小値　最大値　平均値 ＮＢ１９７　０．４　０．７　０．６ ＮＢ１９８　”　０．４　１．１　０．７ＤＳＭ　５４８０　０．４　４．２　 ２．０表Ｉｒａおよび表ｎｂから、突然変異株ＤＳＭ５４８０は、今日入手でき る甲虫活性Ｂ、ｔ、株のいずれよりもはるかに大きい蛋白質結晶を生産すること が明らかである。

得られたデータから、スポロゾイト形成に関しデルタ　エンドトキシン生産の範 囲が突然変異株において変化したことは明白である。

突然変異株は、胞子発育前に蛋白質結晶を生産するようであり、これによりデル タ　エンドトキシン生産のためのより長期間を細胞に与え、これは親株における よりも細胞溶解の時までにはるかにより大きな蛋白質結晶の生産をもたらす。

入手できる栄養源並びにスポロゾイト形成の時までの細胞内の蛋白質結晶の寸法 に依存して、通常の胞子は、細胞溶解の時までに発育するであろう。

例４ この例においては、高生産性Ｂｔｔ突然変異株ＤＳＭ５４８０を、コロラドポテ ト甲虫の幼虫駆除のための強力生産品を得るために用いた。

ＤＳＭ５４８０を、通気撹拌した生産発酵タンク内の例２に記載した生産発酵培 地上で発酵させた。９６時間後、連続遠心分離機で遠心により回収した。

活性蛋白質結晶を含有する濃厚クリームを、微生物保存剤を添加して殺菌し、ｐ ｏを５．０に調節した。

濃厚クリームの１部を、噴霧乾燥し、水和剤の処方用に後に用いた。濃厚クリー ムの残りは、２種の水性流動性コンセントレート（ＦＣ）の処方用に直接用いた 。

水和剤は、表■に記載の如く処方した。２種のＦＣの処方は表■に示される。

表■　ノボドール（ＮＯＶＯＤＯＲ）　（登録商標）水和剤処方成　分　重量％ ＢｔｔＯ噴霧乾燥濃厚クリーム　４０ 洗剤　９ 凝結防止剤　１ 不活性充てん剤　５０ 表ＩＶ／ボドー）Ｌ、　（ＮＯＶＯＤＯＲ）　（登録商標）ＦＣ処方Ｂｔｔ濃厚 クリーム　８８　５５ 保存剤　４ 凍結防止剤　９．１　１９ 洗剤　２．５　２．５ ｐＨ調節剤　２．８５　２．８５ 水　１．５５　１６．６５ １００、０　１００．０ 純粋な結晶蛋白質の５００．　ＯＯ０ＢＴＴ［Ｉ／ｇの値を用いると、処方中の 活性結晶蛋白質の濃度は次の通りである。

／Ｈ−ｎ　（ＮＯＶＯＤＯＲ）　（登録商標）ＷＰ　７０．８　ＫＢＴＴＵ／ｇ 　１４．１６／ｆＦ−１（ＮＯＶＯＤＯＲ）　（登録商標）ＦＣＩ　２４．７Ｋ ＢＴＴＵ／ｇ　４．９４／ＩＦ−４（ＮＯＶＯＤＯＲ）　（登録商標）ＦＣ２１ ４，２ＫＢＴＴＵ／ｇ　２．８４洗剤は、殺虫剤製品中で通常用いられる懸濁助 剤および水和剤内から広幅く選んだ。

凝結防止剤は、親水性シリカであり、不活性充てん剤は、不活性充てん剤、例え ばベントナイト、無機塩又は粘土から用いられる。

ＦＣ中で用いられる保存剤は、食物および化粧保存剤の群から選ばれた。ｐｌ（ 調節剤は無機酸である。

例５ 圃場試験を行ない、主な目標害虫、コロラドじゃがいも甲虫の幼虫に対する高生 産性Ｂｔｔ突然変異株ＤＳＭ５４８０の微生物学的効果を証明した。２種の商業 製品トリプント（Ｔｒｉｄｅｎｔ）（登録商標）およびエムーオネ（Ｍ−。

ｎｅ）（登録商標）について比較した。作物はじゃがいもであった。

作物に３回、６月２０日、６月２７日および８月３日（第２世代幼虫）に散布し た。

用いた製品および用量は次の通りであった：１．５クォート／ニーｔｊ−１４， ２２，８４２，５りオート／ニーカー　１４．２　２．８４３．０りオート／ニ ーカー　１４．２　２．８４未処理対照に比較したＣＰＢ幼虫の駆除平均％を表 Ｖに示す。コロラドじゃがいも甲虫淘汰圧は未処理コントロールにおいて非常に 重かった二８月１日に２０本の作物に対し３７０匹の幼虫および８月８日に２０ 本の作物に対し９０４匹の幼虫 表Ｖ コントロール（％） 処　理　８月１日　８月８日 ノネ“トル（登録商標）ＦＣ２１，５クオート　９５　１００ノネドール（登録 商標）ＦＣ２２，５クオート　９８　９９ノ亀Ｆ−ル（登録商標汗Ｃ２３フォー ）　１００　１００これらの結果は、明らかに高生産性突然変異株ＤＳＭ５４８ ０を用いて生産した製品は、圃場におけるコロラドじゃがいも甲虫の幼虫駆除に 有効であった。高生産株によって生産れる結晶蛋白質は、十分に活性であり、１ ．５クオートのノボドールＦＣは、４クオートのトリプントと同長の結果を与え 更に２クオートのエムーオネと同様の結果を与える。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年５月１３日

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．親株と比較して高量の殺虫性デルターエンドトキシンを生産し得るバシラス 　シリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の突然変 異株又は変異株。
2. ２．Ｂ．ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株が、親株と比較して２倍又は２ 倍以上の殺虫性デルターエンドトキシンを生産する能力を有する、請求の範囲第 １項記載の突然変異株又は変異株。
3. ３．Ｂ．ツリンゲンシス突然変異株又は変異株が、Ｂ．ツリンゲンシスの病原型 に属する、請求の範囲第２又は３項に記載の突然変異株又は変異株。
4. ４．Ｂ．ツリンゲンシスの突然変異株又は変異株が、その親のＢ．ツリンゲンシ スデルターエンドトキシンと同様に、同様の害虫、例えば蝶蛾類鱗翅目（Ｂ．ツ リンゲンシス亜種クルスタキおよび／又は亜種アイザワイからの突然変異株）、 双翅目害虫（Ｂ．ツリンゲンシス亜種イスラレンシス又は甲虫類の害虫（Ｂ．ツ リンゲンシス亜種テネプリオニスからの突然変異株）に対して企図された活性を 有する、請求の範囲第１，２、又は３項のいずれかに記載の突然変異株又は変異 株。
5. ５．Ｂ．ツリンゲンシスが、亜種テネブリオニスに属し更に生産されるデルター エンドトキシンが甲虫に対し活性である、請求の範囲第１，２，３又は４項のい ずれかに記載の突然変異株又は変異株。
6. ６．Ｂ．ツリンゲンシス亜種テネプリオニスが、株ＤＳＭ２８０３のデルタエン ドトキシンの３倍以上生産することができる、請求の範囲第５項記載の突然変異 株又は変異株。
7. ７．突然変異された、又は変異されたＢ．ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株 が、その親株の副芽胞結晶の平均端長の長さの少なくとも２倍の長さの平均端長 を有する副芽胞結晶を生産できる、請求の範囲第５又は第６項記載の突然変異株 又は変異株。
8. ８．突然変異された又は変異されたＢ．ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株が 、２μｍ以上の平均端長を有する副芽胞結晶を生産できる、請求の範囲第７項記 載の突然変異株又は変異株。
9. ９．突然変異された又は変異されたＢ．ツリンゲンシス亜種テネブリオニスが、 親株のスポロゾイト形成頻度よりも１０〜１００又は１０６回より低いスポロゾ イト形成頻度を示す、請求の範囲第４〜８項のいづれかに記載の突然変異株又は 変異株。
10. １０．突然変異されたＢ．ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株が、株ＤＳＭ２ ８０３のスポロゾイト形成頻度よりも１０〜１００又は１０６回より低いスポロ ゾイト形成頻度を示す、請求の範囲第９項記載の突然変異株又は変異株。
11. １１．突然変異株が、寄託された突然変異株Ｂ．ツリンゲンシス亜種テネプリオ ニスＤＳＭ５４８０である、請求の範囲第１項記載の突然変異株。
12. １２．殺虫性のＢ．ツリンゲンシス生産物の製造するための請求の範囲第１〜１ １項のいずれかに記載の突然変異株もしくは変異株の使用であって、Ｂ．ツリン ゲンシスの突然変異株又は変異株を、炭素、窒素、および他の成分を含む適当な 培地中で適当な時間培養し、次いでデルタエンドトキシンを回収し、しかる後デ ルタエンドトキシンを含んでなる殺虫生産物を培地より単独又は細胞および／又 は胞子と共に回収し、次いでこの生産物を所望により農業的に許容できる賦形剤 と混合する、前記使用。
13. １３．有効成分として、請求の範囲第１２項記載に従って得られたＢ．ツリンゲ ンシスデルタエンドトキシンを含んでなる殺虫剤組成物。
14. １４．デルタエンドトキシンを単独で又は他の生物学的に活性な生産物と組合わ せて利用する、請求の範囲第１３項記載の組成物。
15. １５．農業的に許容できる希釈剤又は担体と混合されたＢ．ツリンゲンシスデル タエンドトキシン生産物を含んでなる請求の範囲第１３又は１４項記載の殺虫剤 組成物又は製剤。
16. １６．親株により生産された殺虫剤組成物の強度よりも２倍以上の強度を有する 請求の範囲第１３〜１５項のいずれかに記載の組成物。
17. １７．少なくとも３％ｗ／ｗの甲虫殺虫性結晶蛋白質に相当する、少なくとも１ ５，０００ＢＴＴＵ／ｇの強度を有する液体殺虫剤組成物。
18. １８．少なくとも１０％ｗ／ｗ甲虫殺虫性結晶蛋白質に相当する、少なくとも５ ０，０００ＢＴＴＵ／ｇの強度を有する乾燥殺虫剤組成物。
19. １９．ＤＳＭ２８０３又は他の甲虫活性Ｂｔｔ株から生産された殺虫剤組成物の 強度の少なくとも２倍を有するＤＳＭ５４８０から生産された殺虫剤組成物。
20. ２０．組成物中の希釈剤又は担体が、固体、又は所望により表面活性剤を組合せ た液体である、請求の範囲第１３〜２０項のいずれかに記載の方法。
21. ２１．請求の範囲第１３〜２０項のいずれかに記載の組成物を、害虫に感染され た領域に適用する、害虫の駆除方法。
22. ２２．害虫．が、蝶蛾類鱗翅目、双翅目および甲虫の群に属する、請求の範囲第 ２１項記載の方法。
23. ２３．害虫が、甲虫、特にコロラドじゃがいも甲虫である、請求の範囲第２２項 記載の方法。
24. ２４．液体殺虫剤組成物を１エーカー当たり１クオートを適用することにより害 虫を駆除する請求の範囲第２２又は２３項記載の方法。
25. ２５．乾燥殺虫組成物を１エーカー当たり０．５ポンド適用することにより害虫 を駆除する、請求の範囲第２２又は２３項記載の方法。
26. ２６．バシラスツリンゲンシス株を突然変異させ次いで親株よりも実質的により 多量のデルタエンドトキシンを産生できるそのような株を選択する方法であって 、親株をｉ）変異原で処理し、 ｉｉ）このように処理された突然変異株を無胞子および／又はオリゴ胞子株の選 択に対して適当な培地中で増殖させ、ｉｉｉ）半透明コロニーを選択し次いで加 熱により流動しない培地中で増殖させ、次いで ｉｖ）コロニーを熱処理に委ねることにより真に無胞子株を除外する、前記方法 。
27. ２７．選ばれたコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデルタエンドト キシン生産を増加し得る株に対する最終選択を行う、請求の範囲第２６項記載の 方法。
28. ２８．工程（ｉ）において、変異原が、適当な通常の化学源、例えばＮ−メチル −Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、又はエチルメタンスルホネートであ る請求の範囲第２６又は２７項記載の方法。
29. ２９．工程（ｉ）における親株を電磁放射線、例えばγ−，Ｘ線−又はＵＶ−放 射線で処理する、請求の範囲第２６又は２７項に記載の方法。
30. ３０．工程（ｉｉ）において、適当な培地がホスフェートを含む変性栄養胞子形 成培地（ＮＳＭＰ培地）である、請求の範囲第２６〜３０項のいずれかに記載の 方法。
31. ３１．工程（ｉｖ）において、適当な培地がＭｇＣｌ２およびゲルライト（Ｋｅ １ｃｏ）を捕ったＮＳＭＰ培地である請求の範囲第２６〜３０項のいずれかに記 載の方法。
32. ３２．親株が、Ｂ．ツリンゲンシス亜種クルスタキ、Ｂ．ツリンゲンシス亜種ア イザワイ、Ｂ．ツリンゲンシス亜種イスラエンシンスおよびＢ．ツリンゲンシス 亜種テネプリオニスから成る群に属する、請求の範囲第２６〜３１項のいずれか に記載の方法。
33. ３３．親株が、Ｂ．ツリンゲンシス亜種テネプリオニス株である、請求の範囲第 ３２項記載の方法。
34. ３４．親株が、Ｂ．ツリンゲンシス亜種テネブリオニス株ＤＳＭ５５２６である 、請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．親株よりも実質的により多量のデルタエンドトキシンを産生できるバシラ スツリンゲンシス株の突然変異株又は変異株を選択する方法であって、該親株を ｉ）適当な栄養培地中で培養し、 ｉｉ）工程（ｉ）から培養プロスを無胞子および／又はオリゴ胞子株の選択に対 して適当な培地上に散布し、ｉｉｉ）半透明コロニーを選択し次いで加熱により 流動しない培地中で増殖させ、次いで ｉｖ）真に無胞子株をコロニーを熱処理に委ねることにより除外する、前記方法 。
36. ３６．選ばれたコロニーを通常の製造培地中で増殖させ、次いでデルタエンドト キシン生産を増加し得る株に対する最終選択を行う、請求の範囲第３５項記載の 方法。
37. ３７．工程（ｉｉ）において、適当な培地がホスフェートを含む変性栄養胞子形 成培地（ＮＳＭＰ培地）である、請求の範囲第３５又は３６項に記載の方法。
38. ３８．工程（ｉｖ）において、適当な培地がＭｇＣ１２およびゲルライト（Ｋｅ Ｉｃｏ）を補ったＮＳＭＰ培地である請求の範囲第３５〜３８項のいずれかに記 載の方法。
39. ３９．親株が、Ｂ．ツリンゲンシス亜種クルスタキ、Ｂ．ツリンゲンシス亜種ア イザワイ、Ｂ．ツリンゲンシス亜種イスラエンシンスおよびＢ．ツリンゲンシス 亜種テネブリオニスから成る群に属する、請求の範囲第３５〜３８項のいずれか に記載の方法。