DE69033291T2

DE69033291T2 - Mutanten oder varianten von bacillus thuringiensis die hohe ausbeuten an delta endotoxin produzieren

Info

Publication number: DE69033291T2
Application number: DE69033291T
Authority: DE
Inventors: Hanne Gurtler; Anette Petersen
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Valent BioSciences LLC
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-16
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2010-11-17
Also published as: ES2060568T3; BG96488A; DE585215T1; DE69033291D1; ES2060568T1; CA2068734C; AU647056B2; TR28902A; ATE184645T1; HU214685B; AU6736490A; EP0585215A1; RU2138950C1; CA2068734A1; WO1991007481A1; JPH05501955A; FI922205A; HUT64581A; EP0585215B1; KR927003790A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Kommerzielle Präparate von Bacillus thuringiensis werden weltweit zur biologischen Kontrolle von Insektenschädlingen. Die Vorteile dieser bakteriellen Insektizide sind, daß sie für einen sehr beschränkten Bereich von Zielinsekten hochselektiv sind, und daß sie biologisch abbaubar sind.
Kommerzielle Präpatate von Bacillus thuringiensis können bis zur Erntezeit ohne unerwünschte Wirkungen angewendet werden.
Bacillus thuringiensis ist ein stäbchenförmiges, aerobes, sporenbildendes Bakterium, das in einzigartiger Weise durch die Produktion von einem oder mehreren Einschlüssen, die als parasporale Kristalle bezeichnet werden, während des Sporulationsprozesses gekennzeichnet ist. Diese Kristalle sind aus Proteinen mit hohem Molekulargewicht zusammengesetzt, die als delta-Endotoxine bezeichnet werden. Die delta-Endotoxine sind der aktive Bestandteil in verfügbaren kommerziellen Präparaten von Bacillus thuringiensis.
Viele B. thuringiensis Stämme mit unterschiedlichen Wirtsinsektspektren wurden identifiziert. Sie werden basierend auf ihren flagellaren Antigenen in unterschiedliche Subspezies eingeordnet. Von besonderem Interesse sind Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki und subspecies aizawai, die zur Bekämpfung von Lepidoptera Insektenschädlingen verwendet werden, Bacillus thuringiensis subspecies israelensis, verwendet zur Bekämpfung von Diptera Insektenschädlingen und Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis, der zur Bekämpfung von Coleoptera Insektenschädlingen verwendet wird.
Von der ersten Isolierung eines Coleoptera toxischen Bacillus thuringiensis wurde 1983 berichtet (A. Krieg et al., Z.and.Ent. 96, 500-508, Europäische Patentoffenlegung EP 0149162 A2).
Das Isolat, das als Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis bezeichnet wurde, wurde bei der deutschen Mikroorganismushinterlegungsstelle unter der Zugriffsnummer DSM 2803 hinterlegt. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wurde 1982 aus einer toten Puppe des Mehlwurms, Tenebrio molitor (Tenebrionidae, Coleoptera) isoliert. Der Stamm produziert innerhalb jeder Zelle eine Spore und einen oder mehrere insektizide parasporale Kristalle, die eine flache, plattenartige Form besitzen, mit einer Kantenlänge von etwa 0,8 um bis 1,5 um. Es gehört zu den Serotypen H8a, 8b und Pathotyp C des Bacillus thuringiensis (Krieg et al., System.Appl.Microbiol. 9, 138-141, 1987, US Patent Nr. 4,766,203, 1988).
Er ist nur für bestimmte blattfressende Käferlarven (Chrysomelidae) giftig, jedoch unwirksam gegen Raupen (Lepidoptera), Mosquitos (Divtera) oder andere Insekten.
Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis ist nachweislich ein wirksames Bekämpfungsmittel für die Larven des Colorado Kartoffelkäfers. Nach der Aufnahme von Kristallen und Sporen von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis oder isolierten Kristallen beenden die Larven, und zu einem gewissen Ausmaß auch die ausgewachsenen Exemplare des Colorado Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata) die Nahrungsaufnahme. Die Larvenstadien L1-L3 sterben innerhalb 1-3 Tagen (Schnetter et al., in "Fundamental & applied aspects of invertebrate pathology", Herausgeber R. A. Samson et al., Proceedings of the 4th Int. colloquium of Invertebrate Pathology, Seite 555, 1986).
Es wurde kürzlich gezeigt, daß der Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis zusätzlich zu den Coleoptera aktiven Kristallen auch andere parasporale Kristalle produziert, die spindelförmig, sphäroidal oder plattenförmig sind (A. M. Huger & A. Krieg, J. Appl.Ent. 108, 490-497, 1989). Die Wirksamkeit des zweiten Kristalls ist noch nicht bekannt.
Vier kommerzielle Produkte von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wurden zur Bekämpfung von Coleopteraplagen entwickelt. NOVODOR® von Novo Nordisk A/S, TRIDENT® von Sandoz und DiTerra® von Abbott Laboratories Inc., and Foil® von Ecogen.
Von der Isolation eines weiteren für Coleoptera giftigen Bacillus thuringiensis Stammes wurde 1986 berichtet (Hernnstadt et al. Bio/Technology Band 4, 305-308, 1986, US Patent Nr. 4,764,372, 1988). Dieser Stamm, bezeichnet als "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", M7, wurde beim Northern Regional Research Laboratory, USA unter der Zugangsnummer NRRL B-15939 hinterlegt. Ein kommerzielles Produkt basierend auf "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" wurde von Mycogen Corp. entwickelt.
Vergleichende Studien von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803 und "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", NRRL-B 15939 einschließlich der phänotypischen Charakterisierung der vegetativen Zellen, der Charakterisierung des giftigen parasporalen Kristalls und die Analyse der Plasmid DNA haben jedoch gezeigt, daß "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" offensichtlich identisch ist zu dem zuvor isolierten Stamm DSM 2803 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg et al.: J. Appl.Ent. 104, 417-424, 1987). Weiterhin sind die Nukleotidsequenzen und die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Coleoptera aktiven delta Endotoxingene von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis und "Bacillus thuringiensis subsp san diego" identisch.
Unter gleichen Kulturbedingungen wird der oben genannte zweite Typ von Kristallen ebenfalls von "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" synthetisiert (A. M. Huger & A. Krieg, J. Appl.Ent. 108, 490-497, 1989).
H. de Barjac & E. Frachon (Entomophaga 35(2), 233-240, 1990) zufolge ähnelt das "san diege" Isolat dem "tenebrionis" und es ist nicht gerechtfertigt, dieses als eine unterschiedliche Subspezies anzusehen.
Die Nützlichkeit von Bacillus thuringiensis Stämmen zur Bekämpfung von Coleopteraplagen ist von der effizienten und wirtschaftlichen Produktion der coleoptera aktiven Toxine und der Wirksamkeit des produzierten Produktes abhängig. Diese ist ihrerseits von der Menge von delta-Endotoxinen abhängig, die durch die Fermentation der Coleoptera aktiven Bacillus thuringiensis Stämme erzeugt werden können.
B. thuringiensis wurde jahrelang zur Herstellung von Insektiziden verwendet, aber obwohl Mutanten von B. thuringiensis mit erhöhtem delta-Endotoxinertrag vorteilhaft wären, wurden solche Mutanten zuvor noch nie beschrieben. Mutanten, die einen höheren Ertrag an delta-Endotoxinen produzieren, würden eine effizientere und wirtschaftlichere Produktion von B. thuringiensis Toxinen ergeben und eine Möglichkeit zur Herstellung von B. thuringiensis Produkten mit erhöhter Wirksamkeit bei gleichen Kosten. Dieses wäre widerum ein Vorteil für den Anwender, da reduzierte Volumina an Pestizid- Formulierung für eine gegebene Anbaufläche gespeichert und bearbeitet werden müßten. Zusätzlich müssen die Anwender weniger Containermaterial entsorgen, wodurch die Einwirkung auf die Umwelt reduziert wird.
Von Verbesserungen der Herstellung von delta-Endotoxin durch Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis durch Mutationen wurde bislang nicht berichtet.
Ein Problem, das bei der Anwendung insbesondere von B. thuringiensis subspecies tenebrionis bei der Bekämpfung von Käferlarven auftritt, ist die relativ niedrige Wirksamkeit oder Stärke der Präparate, die die Anwendung von relativ großen Mengen Präparat auf den zu behandelnden Flächen erfordert, wie etwa 5 bis 10 Liter/ha verglichen mit 1 bis 2 Liter/ha der meisten anderen B. thuringiensis Produkte oder der meisten anderen Insektizide.
Demzufolge besteht ein anerkanntes Bedürfnis an Produkten mit erhöhter Stärke.
Ein Weg um dieses Problem zu bewältigen, wäre es, die Präparate zu konzentrieren. Jedoch würde dies die Produktionskosten im Vergleich zu den Einsparungen, die bei Lagerung und Transport erreicht würden, ersichtlich erhöhen.
Eine wesentlich elegantere Lösung wäre es, Mutanten der existierenden B. thuringiensis Stämme zu schaffen, die in der Lage sind, wesentlich höhere Mengen von delta-Endotoxinen pro Zelle zu erzeugen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich demzufolge unter einem Aspekt auf Varianten oder Mutanten von Bacillus thuringiensis susp. Tenebrionis Stämmen, die in der Lage sind, wesentlich größere Mengen von Toxinen zu bilden als ihre Urstämme.
Weitere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf den Einsatz einer solchen Variante oder Mutante von Bacillus thuringiensis susp. tenebrionis Stämmen zur Herstellung von Pestiziden und ebenfalls von pestiziden Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil delta-Endotoxine besitzen, die von einer Variante oder Mutante von Bacillus thuringiensis susp. Tenebrionis Stämmen gemäß der Erfindung hergestellt werden.
Ebenfalls bezieht sich die Erfindung unter einem ihrer Aspekte auf ein Verfahren zur Bekämpfung von Plagen, bei dem eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung auf eine Fläche aufgebracht wird auf der Schädlinge, die gegenüber der Aktivität der in Frage kommenden delta-Endotoxine empfindlich sind, bekämpft werden sollen.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf Verfahren der Selektion oder Mutation und Selektion von B. thuringiensis susp. tenebrionis Stämmen, um solche variierte oder mutierte B. thuringiensis susp. tenebrionis Stämme zu erhalten, die in der Lage sind, wesentlich größere Mengen von delta-Endotoxinen herzustellen als ihre Hauptstämme.

HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

Um diese Erfindung im Detail zu beschreiben, wurde eine Mutante von Bacillus thuringiensis susp. Tenebrionis, die hohe Mengen von delta-Endotoxin produziert, zum Zweck des Patentierungsverfahrens an dem unten genannten Datum bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt. DSM ist eine internationale Hinterlegungsstelle, die gemäß dem Budapester Vertrag die Konservierung der Hinterlegung gemäß Regel 9 des besagten Vertrages sichert.
Hinterlegungsdatum 10. August 1989
Hinterlegeraktenzeichen NB 176-1
DSM Bezeichnung DSM 5480
Die Mutante DSM 5480 wurde durch Mutation von Bacillus thuringiensis susp. tenebrionis, Stamm DSM 5526, der ebenfalls nach dem Budapester Vertrag wie unten beschrieben hinterlegt wurde, erhalten:
Hinterlegungsdatum 14. September 1989
Hinterlegeraktenzeichen NB 125
DSM Bezeichnung DSM 5526

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich unter ihrem generellen Aspekt auf Varianten oder Mutanten von Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis, die, verglichen mit ihrem Urstamm, hohe Mengen von aktiven delta-Endotoxinen produzieren, und die einen parasporalen Kristall besitzen, der eine mittlere Kantenlänge von 2 um oder mehr besitzt und eine Sporulationsfrequenz, die mindestens 10 mal niedriger ist als die Sporulationsfrequenz des Urstammes, und wobei die delta-Endotoxine, die von der Mutante oder Variante von B. thuringiensis subsp. tenebrionis produziert werden, gegen Coleoptera aktiv sind. In diesem Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck "hohe Mengen" vorzugsweise mindestens zwei mal soviel oder mehr.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der variierte oder mutierte B. thuringiensis subsp. tenebrionis in der Lage, mehr als drei mal soviel delta-Endotoxin zu produzieren, wie der Stamm DSM 2803.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt variierte oder mutierte B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stämme, die eine Sporulationsfrequenz besitzen, die 10 bis 100 oder sogar 106 mal niedriger ist als die Sporulationsfrequenz des Urstammes oder des Stammes DSM 2803.
Eine noch spezifischere Ausführungsform umfaßt die hinterlegte Mutante B. thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 5480.
Während der Entwicklung dieser Erfindung wurde eine Mutante des B. thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 5480) isoliert, die eine mehr als zweifache Erhöhung der delta-Endotoxinproduktion verglichen mit ihrem Urstamm (DSM 5526) aufweist. Phasenkontrastmikroskopie, Scanning Elektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie dieser Mutante zeigen, daß die hohe Produktivität der Mutante durch Veränderungen in der Regulierung der delta-Endotoxinproduktion bei der Sporulation verursacht ist, was zur Produktion von Proteinkristallen führt, die bis zu fünf mal größer sind, als die Kristalle die durch die existierenden coleoptera aktiven B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stämme produziert werden. Die enge Korrelation zwischen Kristallbildung und Sporulation scheint entfernt worden zu sein, und die Mutante produziert hohe Mengen von delta- Endotoxin vor der Sporulation.
Einer der Aspekte der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von variierten oder mutierten Stämmen der Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von insektiziden B. thuringiensis subsp. tenebrionis Produkten, wobei bei diesem Verfahren der variierte oder mutierte B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stamm in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und andere Komponenten enthält, die den im Fachgebiet bewanderten Personen bekannt sind, und zwar während eines geeigneten Zeitraums, wonach die delta-Endotoxine erhalten werden.
Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das wie oben erhaltene B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta- Endotoxinprodukt in pestiziden Zusammensetzungen als ein aktiver Bestandteil verwendet.
In solchen Zusammensetzungen können die delta-Endotoxine der Erfindung entweder alleine oder in Verbindung mit anderen biozid aktiven Produkten verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf solche pestiziden Zusammensetzungen oder Präparate, die das B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta-Endotoxinprodukt der Erfindung in Vermengung mit landwirtschaftlich verträglichen Verdünnern oder Trägern beinhalten.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf solche pestizide Zusammensetzungen oder Präparate, die ein B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta-Endotoxinprodukt umfassen, wobei die pestizide Zusammensetzung in einer flüssigen Form eine Wirksamkeit von mindestens 15,000 BTTU/g besitzt, was wenigstens 3 Gewichtsprozent (Gewicht/Gewicht) an gegenüber Coleoptera insektizidem Kristallprotein entspricht, oder eine pestizidale Zusammensetzung in einer trockenen Form, die eine Wirksamkeit von wenigstens 50,000 BTTU/g aufweist, was wenigstens 10 Gewichtsprozent (Gewicht/Gewicht) an gegenüber Coleoptera insektizidem Kristallprotein entspricht.
Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf pestizide Zusammensetzungen, die aus DSM 5480 produziert werden und die mindestens zweimal die Stärke von pestiziden Zusammensetzungen besitzen, die aus DSM 2803 oder anderen gegenüber Coleoptera aktiven Btt Stämmen produziert werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können jegliche Form annehmen, die im Fachgebiet zur Formulierung von Agrochemikalien bekannt ist, zum Beispiel eine Suspension, eine Dispersion, eine wässerige Emulsion, ein Staubpulver, ein dispergierbares Pulver, ein emulgierbares Konzentrat oder Granulat. Weiterhin kann es in einer geeigneten Form zur direkten Anwendung vorliegen oder als ein Konzentrat oder eine primäre Zusammensetzung, die die Verdünnung mit einer geeigneten Menge Wasser oder einem anderen Verdünner vor der Anwendung erfordert.
Die Konzentration der insektizid aktiven B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta-Endotoxine in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, wenn alleine verwendet oder in Verbindung mit anderen Pestiziden, wie sie auf Pflanzen aufgebracht werden, liegt vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 bis etwa 25 Gewichtsprozent, insbesondere 1 bis 15 Gewichtsprozent.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, wobei eine pestizide Zusammensetzung gemäß dem vorhergehenden Aspekt, auf eine Fläche aufgebracht wird, die mit den Schädlingen befallen ist.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist der zu bekämpfende Coleopteraschädling der Colorado Kartoffelkäfer.
In einer spezifischen Ausführungsform kann der Schädling durch die Anwendung von 23,4 ml/are (1 Quart pro Acre) einer flüssigen pestiziden Zusammensetzung gemäß der Erfindung oder durch die Anwendung von 5,6 g/are (0,5 Pfund pro Acre) einer trockenen pestiziden Zusammensetzung gemäß der Erfindung bekämpft werden.
Die aktiven B. thuringiensis subsp. tenebrionis Präparate oder die Zusammensetzungen der Erfindung können direkt auf die Pflanzen aufgebracht werden, beispielsweise durch Sprühen oder Zerstäuben zu dem Zeitpunkt, zu dem der Schädling auf den Pflanzen aufzutauchen beginnt. Die bevorzugte Art der Aufbringung ist das Sprühen. Es ist im allgemeinen wichtig, eine gute Bekämpfung der Schädlinge in den frühen Stadien der Larvenentwicklung zu erreichen, da dies der Zeitpunkt ist, zu dem die Pflanze den geringsten Schaden erlitten hat.
In einem Verfahren der Mutierung von B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stämmen und der Auswahl solcher Mutanten, die in der Lage sind, wesentlich größere Mengen von delta-Endotoxin als ihre Urstämme zu erzeugen, wird der Urstamm:
i) mit einem Mutagen behandelt,
ii) die so behandelten Mutanten werden auf einem geeigneten Medium zur Auswahl von asporogenen und/oder oligosporogenen Stämmen angezüchtet,
iii) durchscheinende Kolonien werden selektiert und in einem Medium gezüchtet, das bei Erwärmung nicht flüssig wird, und
iv) echt asporogene Stämme werden entselektiert, indem die Kolonien einer Hitzebehandlung unterzogen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden die so ausgewählten Kolonien in einem normalen Produktionsmedium gezüchtet, und eine abschließende Selektion wird für die Stämme durchgeführt, die in der Lage sind die delta-Endotoxinproduktion zu erhöhen.
In Schritt (i) des obigen Verfahrens kann das Mutagen jegliches geeignetes konventionelles chemisches Mutagen sein, wie etwa N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanid oder Ethylmethansulfonat, oder der Urstamm kann mit elektromagnetischer Strahlung, wie etwa γ-, Röntgen- oder UV- Strahlung behandelt werden.
In Schritt (ii) könnte ein geeignetes Medium ein modifiziertes Nährstoffsporulationsmedium sein, das Phosphat enthält (NSMP Medium) wie von Johnson et al., In "Spores VI": eds. P. Gerhardt et al., Seiten 248-254, 1975 beschrieben.
In Schritt (iv) des Verfahrens der Erfindung könnte ein geeignetes Medium ein NSMP Medium sein, das ist mit MgCl&sub2; und Gelrite, Kelco bezusatzt ist.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalt der hochproduktiven Varianten oder Mutanten der Erfindung könnte in Betracht gezogen werden, wie etwa das Züchten der Urstämme in einem flüssigen Medium und das Selektieren von spontanen Mutanten oder Varianten, nachdem die Kulturbrühe auf einem Agarmedium verteilt wurde, das zur Selektion von asporogenen und/oder oligosporogenen Mutanten geeignet ist.
Andere Verfahren zum Screening in Bezug auf hochproduktive Varianten oder Mutanten der Erfindung könnten in Betracht gezogen werden, wie etwa die Zugrundelegung der Masse dieser Mutanten direkt durch Zentrifugation oder andere Mittel, die gemäß der Masse auftrennen.

Beispiel 1

Eine Mutante von B. thuringiensis subsp. tenebrionis mit einer mehr als zweifachen Erhöhung der delta-Endotoxinproduktion wurde isoliert. Die Phasenkontrastmikroskopie, Elektronenscanningmikroskopie und die Transmissionselektronenmikroskopie dieser Mutante zeigen, daß die hohe Produktivität der Mutante durch Veränderungen in der Regulation der delta- Endotoxinproduktion relativ zur Sporulation bedingt ist, die zur Produktion von Proteinkristallen führen, die bis zu fünf mal größer sind als die Kristalle, die von den existierenden Coleoptera aktiven Bacillus thuringiensis Stämmen produziert werden. Die enge Korrelation zwischen Kristallbildung und Sporulation scheint entfernt worden zu sein und die Mutante prodziert hohe Mengen von delta-Endotoxin vor der Sporulation.

Produktion einer Hochertragsmutante

Sporen von B. thuringiensis subsp. Tenebrionis, Stamm D5M5526 wurde γ-bestrahlt um eine Dosis von 7kGy zu ergeben. Die bestrahlten Sporen wurden auf NSMP Agarplatten verteilt (modifiziertes Nährstoffsporulationsmedium, das Phosphat beinhaltet, wie von Johnson et al., In "Spores VI": eds. P. Gerhardt et al., Seiten 248-254, 1975 beschrieben), einem Medium, das zur Auswahl von asporogenen und/oder oligosporogenen Mutanten geeignet ist.
Die NSMP-Agarplatten wurden bei 30ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Durchscheinende Kolonien wurden ausgewählt und auf NSMP Gelrite-Platten transferiert (NSMP Medium, bezusatzt mit MgCl&sub2; (0,57 g/l) und Gelrite, Kelco (20 g/l).
Die NSMP-Gelriteplatten wurden eine Stunde lang bei 90ºC inkubiert und dann während 1-2 Tagen bei 30ºC weiter inkubiert.
Mutanten, die auf den NSMP Gelriteplatten gut anwuchsen, wurden ausgewählt. Auf diesem Weg wurden alle asporogenen Mutanten entselektiert, das sie nach der Hitzebehandlung nicht weiterwachsen.
Die gewählten Mutanten wurden in Schüttelflaschen gezüchtet, die ein kommerzielles Medium enthielten. Die Mengen von produziertem delta-Endotoxin wurden durch immunologische Verfahren nachgewiesen, die unten beschrieben sind.
Nur Mutanten, die signifikant höhere Mengen von delta- Endotoxin produzierten als die Urstämme wurden selektiert.
Die Morphologie der ausgewählten Mutanten auf festem Medium und in flüssigem Medium wurde durch Phasenkontrastmikroskopie (x 2500) und durch "Scanning"- und Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Die Zahlen der Sporen und Kristalle wurden gezählt und die Größe der Proteinkristalle wurde bestimmt.
Unter den erzielten Mutanten wurde eine (DSM 5480) aufgrund ihrer außerordentlichen Fähigkeit, delta-Endotoxin zu produzieren, ausgewählt.
Die Menge von delta-Endotoxin, die durch die Mutante DSM 5480 produziert wurde, wurde mit jener von DSM 2803, dem ursprünglichen Isolat von Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis, mit Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Stamm DSM 5526, verwendet zur Herstellung von NOVODOR®, mit Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Stamm NB178, isoliert aus Sandoz' Bacillus thuringiensis tenebrionis Produkt TRIDENT® aus 1989, mit Stamm NB 198, isoliert von Sandoz' B. thuringiensis subsp. tenebrionis Produkt TRIDENT® von 1990, mit "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", Stamm NRRL-B-15939, und mit Stamm NB 197 isoliert von Mycogen's B. thuringiensis subsp. san diego" Produkt M-ONE® von 1990, verglichen. Wie in Tabelle I für Beispiel 2 gezeigt ist, produziert die ertragsverbesserte Mutante der Erfindung 2-3,5 mal soviel delta- Endotoxin wie die Coleoptera aktiven Stämme von Bacillus thuringiensis, die heute verfügbar sind.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde der delta-Endotoxinertrag von Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis, Mutante DSM 548D mit den delta-Endotoxinerträgen von Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis Stämmen DSM 2803 (dem ursprünglichen Isolat von Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis), mit DSM 5526 (Produktionsstamm von Novo-Nordisk), und mit NB 178 und mit NB 198 (Produktionsstämme von Sandoz), und mit Bacillus thuringiensis subsp. san diego, Stämme NRRL-B 15939 und NB 197 (Produktionsstämme von Mycogen) in einem kommerziellen Medium verglichen. Jeder der Stämme wurde 17 Stunden lang bei 30ºC auf Agarblöcken der folgenden Zusammensetzung, ausgedrückt als Gramm pro Liter destilliertem Wasser, angezüchtet:
Pepton, Difco 5g
Rinderfleischextrakt, Difco 3g
Agar, Difco 20g
pH 7,0
5 ml einer Zellsuspension von jedem Stamm wurden dann in 100 ml Produktionsmedium in 500 ml Erlenmeyerkolben mit Pralleinbauten überführt. Das Produktionsmedium bestand aus den folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen (ausgedrückt in Gramm pro Litern Leitungswasser).
Sojabohnenmehl 50g
Hydrolysierte Stärke 40g
KH&sub2;PO&sub4; 1,77g
K&sub2;HPO&sub4; 4,53g
pH 7,0
Die inokulierten Kolben wurden bei 30ºC unter Schütteln (250rpm) inkubiert. Nach 96 Stunden Inkubation wurden die Kulturmedien auf ihren delta-Endotoxinertrag gemäß immunologischen Methoden untersucht.
Die Mengen von delta-Endotoxin, die durch die individuellen Stämme erzeugt wurde, wurde durch "Rocket"-Immunelektrophorese (RIE) und durch einen photometrischen Immunoassay (PIA) unter Verwendung von Antikörpern gegen gereinigte Proteinkristalle von Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis hergestellt.
400 mg jedes Kulturmediums wurden abgewogen. 7 ml Trinatriumphosphatpuffer (0,125M, pH 12) wurde jeder Probe hinzugefügt. Die Suspensionen wurden 1 Stunde lang geschüttelt, um die delta-Endotoxine zu lösen.
Die Proben wurden dann bei 3,500 rpm während 15 Minuten zentrifugiert und die Überstände wurden durch Rocket- Immunoelektrophorese gegen Antiserum, das gegen gereinigte Proteinkristalle von B. thuringiensis subsp. tenebrionis hergestellt worden war, auf delta-Endotoxin getestet. Die Mengen von delta-Endotoxin wurden relativ zu einem Standard mit bekannten Gehalt von Kristallprotein nachgewiesen.
Die Konzentration von Kristallprotein wurde ebenfalls durch einen photometrischen Immunoassay festgestellt. Die Kristallproteine wurden in einer alkalischen Lösung aufgelöst. Die aufgelösten Proteine wurden durch ihre Antikörper ausgefällt. Das Ausmaß dieser Reaktion wurde turbidimetrisch festgestellt. Die Menge von delta-Endotoxin wurde relativ zu einem Standard mit bekanntem Kristallproteingehalt nachgewiesen.
Kristallantigene zur Herstellung der Antikörper, die in den Assays verwendet wurden, wurden von Kristallen erhalten, die aus B. thuringiensis subsp. tenebrionis isoliert wurden.
Polyklonale Antikörper wurden gezüchtet, indem Kaninchen subkutan alle 14 Tagen 0,25 mg Kristallantigen gespritzt bekamen. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, sind in den folgenden Tabellen 1a und 1b gezeigt. Die delta-Endotoxinerträge sind als BTTU/g (Einheiten pro g Kulturmedium, nachgewiesen durch Rocket- Immunoelektrophorese, RIE, oder durch einen photometrischen Immunoassay, PIA) ausgedrückt. Der Wert der für reines B. thuringiensis subsp. tenebrionis Kristallprotein verwendet wurde, beträgt 500,00 BTTU/g. Die angezeigten Werte in Tabelle Ia unterhalb sind Mittelwerte aus 6-7 unabhängigen Fermentationen und jene in Tabelle Ib sind Durchschnittswerte aus 3 unabhängigen Fermentationen. Tabelle 1a Delta-Endotoxinproduktion durch Stämme von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis in Schüttelkolben

Tabelle 1b

Delta-Endotoxinproduktion durch Stämme von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis in Schüttelkolben

Delta-Endotoxinausbeute
RIE
Stamm BTTU/g
NB 197 1103
NB 198 1237
DSM 5480 2867
Aus den Tabellen 1a und 1b wird klar, daß DSM 5480 mehr als drei mal soviel delta-Endotoxin produziert wie der Originalstamm von B. thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803 und "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", Stamm NRRL-B15939 und mehr als zwei mal die Menge von delta-Endotoxin, wie die Stämme, die heute zur Herstellung von kommerziellen Produkten von B. thuringiensis subsp. Tenebrionis verwendet werden.
Die Phasenkontrastmikroskopie, Scanning- Elektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie von B. thuringiensis subsp. tenebrionis, Mutante DSM 5480 haben gezeigt, daß die Proteinkristalle, die durch diese Mutante erzeugt werden, viel größer sind, als die korrespondierenden Proteinkristalle, die von B. thuringiensis subsp. tenebrionis, Stämme DSM 2803, DSM 5526, NB178 und BN 198 und "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", Stämme NRRL-B 15939 und NB 197 produziert werden.
Die Kulturmedien der B. thuringiensis subsp. tenebrionis, Mutante DSM 5480 wurden auf ihre Aktivität gegen Colorado Kartoffelkäferlarven getestet. Die erhöhte Menge von delta- Endotoxin, die durch die Mutante DSM 5480 produziert wird, wie nachgewiesen durch immunologische Methoden, zeigte sich in der biologischen Aktivität gegen Colorado Kartoffelkäferlarven.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurden die Sporulation und die Bildung von parasporalen Kristallen bei B. thuringiensis subsp. tenebrionis, Stämmen DSM 2803, DSM 5526, NB 178 und NB 198, und Mutante DSM 5480 und "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", Stämme NRRL-B 15939 und NB 197 auf festen Medium und in flüssigem Medium verglichen.
Jeder der Stämme wurde 2 Tage lang bei 30ºC auf Agarplatten gezüchtet, die die folgende Zusammensetzung aufwiesen, ausgedrückt als Gramm pro Liter destilliertem Wasser:
Pepton, Difco 5g
Rindfleischextrakt, Difco 3g
Agar, Difco 20g
pH 7,0
Jeder der Stämme wurde ebenfalls in flüssigem Medium gezüchtet. Alle Stämme wurden 17 Stunden lang bei 30ºC auf Agarscheiben angezüchtet. 5 ml einer Suspension von Zellen von jedem Stamm wurden dann in 500 ml Prallflächen-Erlenmeyerkolben überführt, wobei jeder 100 ml Medium enthielt.
Das Medium bestand aus den folgenden Bestandteilen in den angegebenen Quantitäten (ausgedrückt als Gramm pro Liter Leitungswasser):
Flüssiges Medium:
Hefeextrakt 5g
Trypton 5g
Glucose 1 g
KH&sub2;PC&sub4; 0,8g
pH 7,0
Die inokulierten Kolben wurden bei 30ºC unter Schütteln (250rpm) 96 Stunden lang inkubiert.
Die Morphologie der Stämme auf dem festen Medium und in dem flüssigen Medium wurde täglich durch Phasenkontrastmikroskopie (x 2500) untersucht. Die Zahl der Sporen und Kristalle wurde gezählt, und die Größe der parasporalen Kristalle wurde festgestellt. Ein paar ausgewählte Proben wurden ebenfalls durch Scanning- und Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
B. thuringiensis subsp. tenebrionis, Stämme DSM 2803, DSM 5526, NB 178 und NB 198, und "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", Stämme NRRL-B 15939 und NB 197 sporulierten alle auf beiden Medien gut. Vor der Zell-Lyse enthielt jede Zelle ein Spore und einen parasporalen Kristall. Die Größe der Kristalle betrug zum Zeitpunkt der Zell-Lyse von 0,4 bis 0,9-1,1 um in Länge. Die durchschnittliche Größe der Proteinkristalle betrug 0,6-0,7 um Länge.
Die Mutante DSM 5480 produzierte nur wenige Sporen (< 10&sup6; Sporen/ml) auf dem festen Medium und in dem definierten flüssigen Medium. Vor der Zell-Lyse enthielten die meisten Zellen einen großen Proteinkristall aber keine Spore. Die Größe des Proteinkristalls betrug von 0,4-0,7 um bis 5,0 um, die mittlere Größe des Proteinkristalls betrug 2,2-2,3 um Länge.
Die Ultrastrukturanalyse von Zellen aus diesen Medien durch Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, daß der Sporulationsprozeß in der Mutante begonnen hatte, aber zum Zeitpunkt der Zell-Lyse noch nicht abgeschlossen war. Der Sporulationsprozeß hatte unterschiedliche Stadien in den verschiedenen Zellen erreicht. In den Zellen, in denen der Sporulationsprozeß nur Stadium II (Vorsporenseptum Formation) erreicht hatte, füllten die Proteinkristalle die gesamte Zelle aus.
In dem Produktionsmedium (Beispiel 2) erzeugte die Mutante eine größere Anzahl von Sporen (10&sup7;-10³ Sporen/ml). In diesem Medium war die Sporulationfrequenz der Mutante 10-100 mal niedriger als jene des Urstammes.
Daher hat die Mutante ihre Fähigkeit, normale Sporen zu produzieren, beibehalten. Jedoch scheint die Sporulationsfrequenz der Mutante stark von dem Medium abhängig zu sein.
Die Größe der Proteinkristalle, die durch die unterschiedlichen Stämme produziert werden, wird in den Tabellen IIa und IIb gezeigt.

Tabelle IIa

Größe der Proteinkristalle, die durch Coleoptera aktive B. thuringiensis Stämme hergestellt werden, die die heute verfügbar sind. Länge des Proteinkristalls in um

Tabelle IIb

Größe der Proteinkristalle, die durch Coleoptera aktive B. thuringiensis Stämme produziert werden, die heute verfügbar sind. Länge des Proteinkristalls in um
Aus den Tabellen IIa und IIb wird klar, daß die Mutante DSM 5480 viel größere Proteinkristalle erzeugt als jede der heute verfügbaren Coleoptera aktiven B.t. Stämme.
Aus den erhaltenen Daten wird klar, daß die Regulation der delta-Endotoxinproduktion in Bezug auf die Sporulation in der Mutante verändert wurde.
Die Mutante scheint die Proteinkristalle vor der Entwicklung der Sporen zu produzieren, wodurch den Zellen ein längerer Zeitraum zur delta-Endotoxinproduktion zur Verfügung steht, was zu einer Bildung eines viel größeren Proteinkristalls zum Zeitpunkt der Zell-Lyse führt als in dem Urstamm.
Abhängig von den verfügbaren Nährstoffen und der Größe der Proteinkristalle in den Zellen zur Zeit der Sporulation wird eine normale Spore vor dem Zeitpunkt der Zell-Lyse entwickelt.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde die Hochertrags-Btt-Mutante DSM 5480 verwendet, um hochwirksame Produkte zur Bekämpfung von Colorado Kartoffelkäferlarven zu produzieren.
DSM 5480 wurde auf dem Produktionsfermentierungsmedium fermentiert, das in Beispiel 2 beschrieben ist, in einem belüfteten, gerührten Produktionsfermentationstank. Nach 96 Stunden wurde das Medium durch Zentrifugation auf einer kontinuierlichen Zentrifuge erhalten.
Die konzentrierte Creme, die die aktiven Proteinkristalle enthielt, wurde durch den Zusatz von mikrobiellen Konservierungsstoffen stabilisiert, und der pH wurde auf 5.0 eingestellt.
Ein Teil der konzentrierten Creme wurde sprühgetrocknet und später verwendet zur Formulierung von benetzbarem Pulver verwendet. Der Rest der konzentrierten Creme wurde direkt zur Formulierung von zwei wässerigen fließfähigen Konzentraten (FC) verwendet.
Das benetzbare Puder wurde wie in Tabelle III beschrieben formuliert. Die Formulierung der beiden FC~s ist in Tabelle IV beschrieben.

Tabelle III: NOVODOR® benetzbare Pulverformulierung

Komponente Gewichtsprozent
sprühgetrocknete konzentrierte Creme von Btt 40
Detergenzien 9
Antizusammenballungsmittel 1
Inerte Füllstoffe 50 Tabelle TV NOVODOR® FC Formulierungen
Wenn man einen Wert von 500.000 BTTU/g von reinem Kristallprotein verwendet, ist der Gehalt von aktivem Kristallprotein in den Formulierungen wie folgt: % Btt Kristallprotein
Die Detergenzien wurden gewählt aus der weiten Auswahl von Suspensionshilfen und Benetzungsmitteln, die normalerweise bei landwirtschaftlichen Pestizidprodukten verwendet werden.
Das Antizusammenballungsmittel ist ein hydrophiles Silica und der inerte Füllstoff ist aus den üblicherweise gewählten inerten Füllstoffen wie Bentoniten, anorganischen Salzen oder Tonen gewählt.
Die verwendeten Konservierungsstoffe in den FC's wurden aus der Gruppe der Nahrungs- und der kosmetischen Konservierungsstoffe gewählt. Der pH-Regulator ist eine anorganische Säure.

Beispiel 5

Ein Feldversuch wurde durchgeführt, um die biologische Wirkung der Hochertrags-Btt-Mutante DSM 5480 auf den vorwiegenden Zielschädling, die Colorado Kartoffelkäferlarve, im Vergleich mit den beiden kommerziellen Produkten Tridentt und Mone® zu testen. Die Feldfrüchte waren Kartoffeln.
Die Feldfrüchte wurden drei mal, am 20. Juli, 27. Juli und 3. August (Larven der 2. Generation) besprüht.
Die Produkte und Dosierungen waren wie folgt:
Der mittlere Prozentwert der Kontrollversuche von CPB Larven, verglichen mit den unbehandelten Kontrollversuchen ist in Tabelle V angegeben. Der Ansturm von Colorado Kartoffelkäfern war bei den unbehandelten Kontrollversuchen sehr stark: 370 Larven pro 20 Pflanzen am 1. August und 904 Larven pro 20 Pflanzen am 8. August. Tabelle V
Diese Ergebnisse zeigen klar an, daß Produkte, die mit der Hochertragsmutante DSM 5480 gemacht wurden, für die Kontrolle von Colorado Kartoffelkäferlarven im Feldversuch effektiv sind. Das Kristallprotein, das von den Hochertragsstämmen produziert wird, ist voll aktiv da 1,5 Quarts NOVODOR® FC genau so gute Ergebnisse liefern wie Trident bei 4 Quarts und so gut wie M-one bei 2 Quarts.

Claims

1. Eine Mutante oder Variante eines Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis Stammes, die große Mengen an insektiziden delta-Endotoxinen, verglichen mit ihrem Urstamm herstellen kann und die einen parasporalen Kristall mit einer mittleren Kantenlänge von 2 um oder mehr aufweist und eine Sporulationsfrequenz, die wenigstens 10 mal niedriger ist, als die Sporulationsfrequenz des Urstammens, und wobei die delta- Endotoxine, die von dieser Mutante oder Varinate von B. thuringiensis subsp. tenebrionis produziert werden, gegen Coleoptera aktiv sind.

2. Mutante oder Variante nach Anspruch 1, wobei die Mutante oder Variante des B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stammes in der Lage ist, doppelt soviel oder mehr insektizide delta- Endotoxine herzustellen, wie ihr Urstamm.

3. Mutante oder Variante nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutante oder Variante des B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stammes zum Pathotyp C von B. thuringiensis subsp. tenebrionis zählt.

4. Mutante oder Variante nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Mutante oder Variante des B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stammes zur Herstellung von mehr als drei mal soviel delta- Endotoxin befähigt ist, wie der Stamm DSM 2803.

5. Mutante oder Variante nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Mutante oder Variante des B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stammes eine Sporulationsfrequenz aufweist, die 10 bis 100 oder sogar 106 mal niedriger ist, als die Sporulationsfrequenz des Stammes DSM 2803.

6. Mutante nach Anspruch 1, wobei die Mutante die hinterlegte Mutante B. thuringiensis subsp. tenebrionis Stamm DSM 5480 ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta-Endotoxin-Produktes unter Verwendung eines Mutanten oder varianten Stammens gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Mutante oder Variante des B. thuringiensis Stammes in einem geeigneten Kulturmedium aufgezogen wird, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und andere Komponenten für einen geeigneten Zeitraum lang umfaßt, wonach ein insektizides Produkt, das die delta-Endotoxine umfaßt, alleine oder zusammen mit Zellen und/oder Sporen aus dem Kulturmedium erhalten wird, und wobei dieses Produkt wahlweise mit landwirtschaftlich verträglichen Hilfsstoffen vermengt wird.

8. Pestizide Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil das B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta-Endotoxin-Produkt umfaßt, das in Übereinstimmung mit Anspruch 7 erhältlich ist.

9. Pestizide Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das delta- Endotoxin-Produkt entweder alleine oder in Kombination mit anderen biozid aktiven Produkten verwendet wird.

10. Pestizide Zusammensetzung oder Präparat nach Anspruch 8 oder 9, das das B. thuringiensis subsp. tenebrionis delta- Endotoxin-Produkt in Vermengung in einem landwirtschaftlich verträglichen Verdünner oder Träger umfaßt.

11. Pestizide Zusammensetzung nach Anspruch 8, 9 oder 10, mit einer Wirksamkeit, die mehr als doppelt so stark wie diejenige der pestiziden Zusammensetzungen ist, die mit dem Urstamm hergestellt werden.

12. Flüssige pestizide Zusammensetzung nach Anpruch 10, die eine Wirksamkeit von wenigstens 15,000 BTTU/g aufweist, was wenigstens 3 Gewichtsprozent an gegenüber Coleoptera insektizidem Kristallprotein entspricht.

13. Trockene pestizide Zusammensetzung nach Anspruch 10, die eine Wirksamkeit von wenigstens 50,000 BTTU/g aufweist, was wenigstens 10 Gewichtsprozent an gegenüber Coleoptera insektizidem Kristallprotein entspricht.

14. Pestizide Zusammensetzung, die aus DSM 5480 hergestellt wird, die wenigstens die doppelte Wirksamkeit der pestiziden Zusammensetzungen aufweist, die aus DSM 2803 oder anderen gegenüber Coleoptera aktiven Btt Stämmen hergestellt werden.

15. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 8-14, wobei der Verdünner oder Träger in der Zusammensetzung ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, wahlweise unter Miteinbeziehung eines oberflächenaktiven Mittels.

16. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, wobei eine pestizide Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 15 auf eine Fläche aufgebracht wird, die von dem Schädling befallen ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schädling zu den Coleoptera zählt, speziell der Coloradokartoffelkäfer.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die pestizide Zusammensetzung eine flüssige pestizide Zusammensetzung ist, und wobei der Schädling durch das Aufbringen von 23,4 ml/are (1 quart per acre) der flüssigen pestiziden Zusammensetzung bekämpft werden kann.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die pestizide Zusammensetzung eine trockene pestizide Zusammensetzung ist, und wobei der Schädling durch das Aufbringen von 5,6 gram/are (0,51b per acre) der trockenen pestiziden Zusammensetzung bekämpft werden kann.

20. Verfahren zur Mutation von Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis Stämmen und zur Auswahl solcher Mutanten gemäß Anspruch 1, die zur Erzeugung von im wesentlichen größeren Mengen an delta-Endotoxinen als ihre Urstämme befähigt sind, wobei der Urstamm folgenden Schritten unterworfen wird:

i) Behandlung mit einem Mutagen,

ii) Aufzucht der so behandelten Mutanten in einem Medium, das für die Auswahl von asporogenen und/oder oligosporogenen Stämmen geeignet ist,

iii) Auswahl durchscheinender Kolonien und Aufzucht in einem Medium, das sich bei Erwärmung nicht verflüssigt und

iv) Deselektion von echt asporogenen Stämmen durch Hitzebehandlung der Kolonien.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die so ausgewählten Kolonien in einem Normalproduktionsmedium aufgezogen werden, und wobei eine Endselektion für Stämme, die zur Erhöhung der delta- Endotoxin-Produktion befähigt sind, durchgeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 wobei in Schritt (i) das Mutagen jedwedes geeignete chemische Mutagen ist, wie etwa N- Methyl-N'-nitto-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat.

23. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei der Urstamm in Schritt (i) mit geeigneter elektromagnetischer Strahlung behandelt wird, wie etwa γ-, oder Röntgen- oder UV-Strahlung.

24. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 23, wobei in Schritt (ii) das Medium ein abgewandeltes Sporulationsnährmedium ist, das Phosphat enthält (NSMP Medium).

25. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 24, wobei in Schritt (iv) das Medium ein NSMP Medium ist, das mit MgCl&sub2; und Gelrite, Kelco bezusatzt ist.