DE3874608T2 - Acetat ausgewaehlter bacillus thuringiensis und verfahren zu seiner verwendung. - Google Patents
Acetat ausgewaehlter bacillus thuringiensis und verfahren zu seiner verwendung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue biologische Inzektizide. Insbesondere betrifft diese Erfindung neue Stämme von Bacillus Thuringiensis, "B. thuringiensis," das Verfahren zu ihrer Herstellung und das Verfahren zu ihrer Verwendung als biologische Insektizide zur Steuerung von Insektenarten der Ordnung Lepidoptera, insbesondere von Trichoplusia ni, "der Kohllarve" und von Artogeia rapae, "dem importierten Kohlwurm".
- Der Sporen-bildende Mikroorganismus B. thuringiensis wurde vor über 80 Jahren isoliert und ist seitdem für die biologische Steuerung kommerziell wesentlich geworden. Die sporenbildenden Zellen von B. thuringiensis bilden jeweils eine Spore (Endospor) und einen diamantförmigen, proteinhaltigen Kristall (Paraspore oder Einschlußkörper). Die entomoletalen Eigenschaften wurden lediglich dem δ -Endotoxin, welches eine Hauptkomponente des parasporalen Kristalls ist, zugeschrieben. Wenn der Kristall sich in dem Insektendarm auflöst, veranlaßt er die Bildung eines Protoxins, welches durch proteolytische Verdauung aktiviert wird. B. thuringiensis ist, obwohl es sehr spezifisch für Lepidopteran-Insekten und bestimmte Fliegen und Moskitos ist, für nicht-empfängliche Ordnungen von Insekten, für Tiere und für Menschen unschädlich. In den Vereinigten Staaten umfaßt B. thuringiensis var. kurstaki die B. thuringiensis-Insektizidprodukte, welche am weitesten verbreitet zur Steuerung dieser Schädlinge angewandt werden. Jedoch mangelt diesen Produkten eine effektive Steuerung bei ökonomischen Anwendungswerten.
- Andererseits sind synthetische Pyrethroide die am weitesten verbreitet angewandten chemischen Insektizidenmittel zur Steuerung von Lepidopteran-Befall. Pyrethroide sind hochwirksam und bieten eine verbesserte Steuerung gegenüber den häufig verwendeten B. thuringiensis-Insektizidprodukten. Ein Nachteil, welcher mit der Anwendung von Pyrethroiden verbunden ist, liegt jedoch in der Tatsache, daß sie gegenüber wirbellosen Tieren, welche keine Zielgruppe darstellen, toxisch sind und daher eine Umweltgefahr für das Leben in Wasser darstellen. Es besteht daher eine Notwendigkeit für wirksame Lepidopteran-aktive Insektizide, welche für die Umwelt sicher und kosteneffektiv sind, und welche die Wirksamkeit von synthetischen Pyrethroiden verdoppeln.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Stämmen des Mikroorganismus B. thuringiensis, welche für die biologische Steuerung von Insekten der Ordnung Lepidoptera hocheffektiv sind.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Stämmen von B. thuringiensis, welche eine synthetische Pyrethroiden gleiche toxigene Aktivität oder eine größere toxigene Aktivität als zuvor verwendete B. thuringiensis- Insektizidprodukte besitzen.
- Ein noch weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur biologischen Steuerung der Kohllarve und des importierten Kohlwurms.
- Lebensfähige Kulturen der neuen Stämme von B. thuringiensis wurden unter dem Budapester Vertrag bei der Kultursammelstelle am "Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt, und ihre Zugangsnummern sind NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL B-18197. Abkömmlinge dieser Stämme sind entsprechend der Regel 28 EPC zugänglich.
- Die neuen Stämme sind sporogene, Kristalle enthaltende Mutantenstämme von aus der Umwelt isolierten B. thuringiensis und besitzen die Fähigkeit zur Bildung von bipyramidalen Kristalle, zusammengesetzt aus toxischem Protein, und sie sind einzigartig darin, daß sie eine Auxotrophie mit dem Erfordernis eines Leucin- und Valin-aminosäurekomplexes für das Wachstum, die Sporenbildung und die Kristallbildung aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten früher beobachtete Stämme von B. thuringiensis eine Auxotrophie, welche ohne eine Aminosäure befriedigt werden kann. K.W. Nickerson, et al., Appl. Microbiol. 28:124-128 (1974).
- Für die Zwecke der Erfindung wird der Ausdruck "Auxotrophie" so definiert, daß er die Nährerfordernisse bedeutet, welche für das Wachstum, die Sporenbildung und die Kristallbildung des Mikroorganismus erforderlich sind.
- Der Ausdruck "komplexes Aminosäuremedium" ist hier so definiert, daß er ein Medium bezeichnet, welche eine Kombination von zwei oder mehr Aminosäuren umfaßt.
- Die neuen Stämme NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL B-18197 werden aus dem Boden unter Verwendung eines nicht klassischen Natriumacetat-Hitzeauswahlprozesses gewonnen. Gemäß dieser Arbeitsweise wird ein wässriges Nährmedium auf etwa 0,25M mit Natriumacetat gepuffert, um die Keimbildung nur von unerwünschten, sporenbildenden Organismen, die in einer Bodenprobe der Umgebung enthalten sind, zu ermöglichen. Als nächstes werden die gewachsenen, sporenbildenden Organismen und die nichtsporenbildenden Organismen in der Probe durch Hitzebehandlung abgetötet. Die überlebenden Sporen werden danach auf Platten übertragen und auf einem geeigneten Agarmedium wachsen gelassen, um die neuen Stämme der Erfindung zu erhalten. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die neuen Stämme der Erfindung während des Selektionsprozesses als Ergebnis einer Mutagenese von natürlich vorkommenden B. thuringiensis- Stämmen mit anschließenden Behandlungen mit Natriumacetat und Hitze gebildet werden.
- Ein Beispiel des Auswahlverfahrens ist wie folgt: 0,5 g Erde werden zu 10 ml L-Nährlösung (100 ml H&sub2;O, 1 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl) in einen 125 ml Schüttelkolben gegeben. Das L-Nährmedium wurde auf 0,25 M mit Natriumacetat abgepuffert. Das Gemisch wurde während 4 h bei 30ºC mit 250 Upm geschüttelt. Unter Anwendung einer Hitzebehandlungseinrichtung zur Durchströmungspasteurisierung wurde das Gemisch dann auf 80ºC für 3 min erhitzt. Das hitzebehandelte Gemisch wurde auf L-Agarplatten (mit 1,5 % Agar verfestigtes L-Nährmedium) aufgetragen und über Nacht (16 h) bei 30ºC inkubiert.
- Die Stämme NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL B-18197 haben folgende Charakteristika: Die Kolonien sind kreisförmig, ganz, konvex und cremefarbig mit einem Koloniedurchmesser von 2-7 mm auf Nähragar nach 24 h. Die vegetativen Zellen sind aerobe, gram-positive, bewegliche Stäbchen mit den Maßen 1 um bis 1,2 um x 3 um bis 5 um. Die Endsporen der vegetativen Zellen füllen die Sporangien nicht auf und machen 33% bis 50% der vegetativen Stäbchen aus. Die Zellen sind positiv für Katalase, ferementieren Glucose, hydrolysieren Casein, jedoch nutzen die erfindungsgemäßen Stämme Citrat nicht aus im Gegensatz zu der taxonomischen Beschreibung der zuvor beobachteten Stämme von B. thuringiensis. Die neuen Stämme fermentieren ebenfalls nicht Mannit, Arabinose und Xylose.
- Zusätzlich hydrolysierte der Stamm NRRL B-18195 Stärke, fermentierte Saccharose und bildete eine Lecithinase; die Zellen verwerteten nicht Esculin, bildeten keine Urease und fermentierten Salicin und Mannose. Der Stamm NRRL B-18196 hydrolysierte Stärke und fermentierte Salicin, Mannose und Saccharose; die Zellen nutzten Esculin nicht aus und sie bildeten keine Urease oder eine Lecithinase. Der Stamm NRRL B-18197 hydrolysierte Stärke, nutzte Esculin aus, bildete eine Lecithinase und fermentierte Salicin; die Zellen bildeten keine Urease und fermentierten Mannose oder Saccharose nicht. Alle drei Stämme sind gegenüber Antibiotika vom Penicillin-Typ wie Naficillin, Ampicillin und Methicillin resistent und sie sind gegenüber geringen Werten, d.h. etwa 10 g/ml, von Neomycin, Kanamycin und Ethidiumbromid resistent.
- Wie zuvor beschrieben erfordert die Bildung von Sporen und proteinhaltigen Kristallen von Stämmen von B. thuringiensis mit den Charakteristika von NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL-B-18197 ein wässriges Nährmedium, das einen Leucin- Valin-aminosäurekomplex enthält. Für optimale Kristallbildung der erfindungsgemäßen Bakterien ist die spezifisch bevorzugte Mediumzusammensetzung die folgende: 0,3% Trypton, 0,2 % Tryptose, 0,45 % Hefeextrakt, auf 0,01 M in Natriumphosphatpuffer bei pH 6,8 durch Zugabe von 10&supmin;&sup8; MgSO&sub4; und 10&supmin;&sup9; MnSO&sub4; nach der Autoklavenbehandlung gebracht. Ein anderes geeignetes Medium mit dem erforderlichen Aminosäurekomplex kann für das Wachstum der Bakterien der Erfindung verwendet werden. Jedoch können andere eingesetzte Medien als das bevorzugte Medium eine verminderte Kristallbildung ergeben.
- Die Bildung der Zellen wird unter aeroben Bedingungen bei einer beliebigen Temperatur, welche für das Wachstum der Organismen der Erfindung zufriedenstellend ist, d.h. von etwa 10ºC bis 40ºC, wobei der bevorzugte Temperaturbereich etwa 27ºC bis 32ºC ist, durchgeführt. Der pH der Nährmedien, welche für das Wachstum der B. thuringiensis-Kultur geeignet ist, beträgt etwa neutral, d.h. pH 6,7 bis 7,2. Die Inkubationszeit ist die Zeit, welche für die vollständige Freisetzung von Sporen und Kristallen erforderlich ist und sie beträgt vorzugsweise etwa 18 bis 24 Stunden. Die Zellen können in jedem beliebigen konventionellen mit Prallblech versehenen Schüttelkolben für kleine Durchsätze gezüchtet werden. Für den Betrieb in größerem Maßstab ist es vorteilhaft, die Kultur in einem Tank auszuführen, wobei Rühren und Belüftung an dem geimpften flüssigen Medium durchgeführt werden. Nach der Inkubation werden die Zellen durch konventionelle Methode der Sedimentierung wie Zentrifugieren oder Abfiltern geerntet. Die Zellen können als solche oder eingefroren für eine spätere Verwendung eingesetzt werden. Die Mutanten der B. thuringiensis-Stämme NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL B-18197 sind hochwirksame Insektizide und sie können bei Programmen zur Steuerung von Insekten der Ordnung Lepidoptera, insbesondere der Kohllarve und des importierten Kohlwurms, eingesetzt werden. Die Stämme können in Formulierungen mit einem inerten flüssigen Träger wie Wasser angewandt werden. Wahlweise können die Stammformulierungen konventionelle Zusatzstoffe wie Verdickungsmittel, Ausbreitungshilfsstoffe, Emulgatoren, Tenside und Streckmittel enthalten. Die Stammformulierung kann unter Verwendung konventioneller Sprüharbeitsweisen und -einrichtungen ausgesprüht werden. Die neuen Stämme können ebenfalls in einem geeigneten Einkapselungsmaterial eingekapselt oder eingeschlossen werden, z.B. einem organischen Polymeren, und sie können in Pulverform aufgebracht werden. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß das genetische Material für das δ-Endotoxin der neuen B. thuringiensis-Stämme der Erfindung auf andere Bakterien und Pflanzen unter Anwendung von rekombinanten DNA-Arbeitsweisen transferiert werden kann, um eine verbesserte Insektensteuerung bereitzustellen.
- Es liegt im Rahmen der Erfindung, die neuen Stämme alleine oder in Kombination mit anderen Steuerungsmitteln wie Insektiziden und Wirkstoffen zu verwenden. Bei einer solchen Verwendung sollten diese Mittel in einer Menge eingesetzt werden, wie sie von dem Fachmann auf dem Gebiet einfach bestimmt werden kann und welche die Effektivität des biologischen, insektiziden Materials der Erfindung nicht beeinträchtigt.
- Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern, den Rahmen der Erfindung, wie er durch die Ansprüche definiert wird, jedoch nicht beschränken.
- Bei einem Feldtest wurde die Effektivität der B. thuringiensis-Stämme NRRL B-18195, NRRL B-18196 und NRRL B-18197 gegenüber der Kohllarve und dem importierten Kohlwurm mit der Effektivität des ein synthetisches Pyrethroid enthaltenden Insektizidproduktes "Pydrin" und dem Insektizidprodukt B. thuringiensis, var. kurstaki, "Dipel" verglichen. "Pydrin" ist der Handelsname für ein von der Shell Corporation verkauftes Produkt, und es enthält 30% Cyano(3-phenoxy-phenyl)- methyl-4-chlor-alpha(1-methylethyl)benzolacetat und 70% inerte Inhaltsstoffe. "Dipel" ist der Handelsname eines von Abbott Laboratories verkauften Produktes und enthält 3,2% B. thuringiensis, var. kurstaki und 98,8 % inerte Inhaltsstoffe.
- An der Ostküste von Maryland wurde Kohl direkt in vierreihiger Anordnung mit einer Länge von 6,1 m (20 ft.) am 07. Juli 1986 gesät. Die Pflanzen waren in einem Abstand von 5,1 cm (2 inch) in der Reihe und mit einem Abstand von 91,5 cm (36 inch) zwischen den Reihen. Die Behandlungen wurden in einem willkürlich ausgewählten vollständigen Blockmuster mit 4 Wiederholungen angeordnet. Jede Reihe wurde durch eine Beobachtungsreihe abgegrenzt. Die Erde war ein Norfolk "A" Lehmsand. Alle Sprühbehandlungen hatten 5,5 x 10&sup9; Sporenäquivalent pro 0,5 l Wasser, zu welchen 0,010 flüssiges Tensid als Ausbreitungshilfe zugesetzt wurde. Die Sprühbehandlungen wurden mit einem Gartensprüher vom Ausgußtyp aufgebracht, der so eingestellt war, daß 30 gal/acre der Formulierung angeliefert wurden. (30 gal/acre = 28,1 l/1000 m²)
- Die Reihen wurden mit Anwendungen am 11., 18. und 25. August und am 02. und 08. September behandelt. Am 15. September wurden die Einstufungen der Blattschädigungen und Insektenzählungen durchgeführt. Der Insektendruck von natürlich vorkommendem Befall mit Kohllarven und dem importierten Kohlwurm war mäßig. Die Einstufungen der Blattschädigung reichten von 1-5 und wurden wie folgt indexiert: (1) 0-3% Schädigung -- etliche Löcher auf den Blättern; (2) 4-10 % Schädigung -- wenige Blätter mit Löchern; (3) 11-25 % Schädigung -- mäßige Anzahl der Blätter mit Löchern; (4) 26-50 % Schädigung -- die meisten Blätter mit Löchern; und (5) 51-100 % Schädigung -- Kronenschädigung und/oder alle Blätter mit Löchern.
- Die Daten wurden mittels Schwankungsanalyse analysiert, und die Mittelwerte wurden nach dem Vielbereichstest von Duncan (DMRT) bei einem Wert P = 0,05 (Duncan 1951) getrennt.
- Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
- Die Tabelle zeigt deutlich die ausgezeichneten insektiziden Eigenschaften der neuen Stämme der Erfindung gegenüber Kohllarven und importiertem Kohlwurm. Der Stamm B. thuringiensis NRRL B-18197 liefert statistisch denselben Schutz für Kohl wie "Pydrin". Sicherlich waren die Stämme NRRL B-18195 und NRRL B-18196, welche identische Schutzwerte zeigten, in Werten der mittleren Blattschädigung beide statistisch dem "Pydrin" unterlegen. Jedoch lieferten diese neuen Stämme eine 10-fache Steigerung der Aktivität gegenüber dem kommerziellen Produkt "Dipel" von B. thuringiensis. Eine solche Steigerung wurde gut gezeigt, wo Behandlungen mit "Dipel" den identischen Steuerungswert (weniger als 10% Schädigung) zeigten wie der Stamm NRRL B-18195 bei einer Verdünnung von 1:10.
- Es wird darauf hingewiesen, daß Modifilzierungen und Änderungen von der zuvor gegebenen Beschreibung durchgeführt werden können, ohne von dem Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Tabelle 1 Behandlung und Menge/Acre Mittelwert T. ni. pro 10 Pflanzen 15. Sept. Mittelwert A. rapae pro 10 Pflanzen 15. Sept. Einstufung der mittleren Blattschädigung 1,2,3 15. Sept. Pydrin 2,4 EC 0,21lb (AI)/Acre B. thuringiensis Dipel 1,01 lb&sup4; Unbehandelte Kontrolle ¹Beliebige zwei Ziffern in derselben Spalte, denen derselbe Buchstabe folgt, sind nicht signifikant verschieden (P = 0,05) DMRT. ²Gesprüht am 11., 18., 25. August; 2., 8. Sept. ³Schädigung hauptsächlich hervorgerufen durch Kohllarve und importierten Kohlwurm. &sup4;Dipel = 7,26 x 10&sup9; internationale Einheiten pro Pound. &sup5;Geeicht, um 7,26 x 10&sup9; internationale Einheiten pro Pound zu ergeben.
Claims (8)
1. Kultur einer sporogenen, Kristalle enthaltenden Mutante von
Bacillus thuringiensis mit den identifizierenden
Charakteristika eines Stammes, ausgewählt aus NRRL B-18195, NRRL
B-18196 und NRRL B-18197, worin der Stamm dadurch
gekennzeichnet ist, daß er die Fähigkeit hat, bipyramidale
Kristalle zu bilden, welche aus toxischem Protein bestehen,
und ein Leucin und Valin enthaltendes Nährmedium für
Wachstum, Sporenbildung und Kristallbildung erfordert.
2. Kultur nach Anspruch 1, worin der Stamm die identifizierenden
Charakteristika von NRRL B-18195 besitzt.
3. Kultur nach Anspruch 1, worin der Stamm die identifizierenden
Charakteristika von NRRL B-18196 besitzt.
4. Kultur nach Anspruch 1, worin der Stamm die identifizierenden
Charakteristika von NRRL B-18197 besitzt.
5. Biokontrollmittel zur Steuerung von Lepidopteran-Insekten,
umfassend eine Kultur von sporogener, Kristalle enthaltender
Mutante von Bacillus thuringiensis, wie in einem der
vorhergehenden Ansprüche beansprucht.
6. Verfahren zur Steuerung von Lepidopteran-Insekten, umfassend
das Unterziehen des Insekten einer wirksamen Menge einer
sporogenen, Kristalle enthaltenden Mutante von Bacillus
thuringiensis, wie in einem der Ansprüche 1 - 4 beansprucht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Stamm in einem inerten,
flüssigen Träger enthalten ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die
Lepidopteran-Insekten aus der Gruppe Trichoplusia ni oder
Artogeia rapae sind.
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