DE3874512T2

DE3874512T2 - Bazillus thuringiensis-staemme.

Info

Publication number: DE3874512T2
Application number: DE8888312060T
Authority: DE
Inventors: Roger Laurent Bernier; Martyn Davies Collins; Ann Louise Gray
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1993-02-04
Anticipated expiration: 2008-12-21
Also published as: AU2848489A; DE3874512D1; EP0324254A1; GB8800652D0; EP0324254B1; JPH01309680A; ATE80259T1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Bacterienstamm und insbesondere auf einen neuen Stamm des Bacteriums Bacillus thuringiensis und auf Anwendungen desselben.
Der Organismus Bacillus thuringiensis erzeugt ein proteinisches kristallisches Endotoxin, das Insecten tötet. Es ist jedoch für Säuger ungiftig. Deshalb eignet es sich als landwirtschaftliches Insecticid, insbesondere gegen Lepodoptera. In der Tat werden Stämme des Bacillus thuringiensis bereits seit Jahren als landwirtschaftliche Insecticide verwendet.
Der Stamm des Bacillus thuringiensis, der kommerziell am häufigsten verwendet wird, besitzt die Bezeichnung HD-1 (und ist von der Collection of Bacillus thuringiensis Strains verfübar, die vom US Department of Agriculture unterhalten wird). Es wurde nunmehr ein neuer Stamm des Bacillus thuringiensis gefunden, der im allgemeinen ähnliche Eigenschaften wie HD-1 aufweist, der sich aber davon durch eine verbesserte insecticide Aktivität gegen Coleoptera Schädlinge unterscheidet.
Gegenstand der Erfindung ist also der neue Stamm A30 des Bacillus thuringiensis, der bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter der Bezugsnummer NCIB 12572 niedergelegt ist. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf neue insecticide Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie das durch den Stamm A30 produzierte δ-Endotoxin enthalten, und auf ein Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen einen Insectenangriff, bei welchem die Insecten dem durch den Stamm A30 erzeugten δ-Endotoxin ausgesetzt werden.
Der Stamm A30 wurde von geschrotetem Getreide isoliert, das aus Dalrymple, Ontario, Canada, stammte. Hinsichtlich der Morphologie der Kolonien ist er HD-1 im allgemeinen ähnlich. Die Morphologie der beiden Stämme ist in Tabelle 1 verglichen. Tabelle 1 Stamm Kristalle Morphologie der Zellen Morphologie der Kolonien Mittlere Bipyramiden und Kristalle undefinierter Form Große und kleine Bipyramiden sowie Dreiecke und unregelmäßige Kristalle Stäbchen in Paaren mit endständigen Sporen, die sich nicht von der Zelle ausweiten Einzelne Stäbchen oder kurze Ketten mit endständigen Sporen, die sich nicht ausweiten Lecithinase negativ; runde Kolonien; gewölbt; gelbe Zentren; Durchmesser 1 cm Lecithinase positiv; tränentropfenförmige Kolonien; gewölbt; gelbe Zentren;
Die biochemischen Eigenschaften der beiden Stämme werden in den Tabellen 2 - 4 verglichen. Tabelle 2 Biochemische Marker auf Microtiterplatten Reagenz Stärke DNAse Urease Mannose Saccharose Cellobiose Clucose Maltose Salicin Thorneley "-":negative Reaktion ; "+" : positive Reaktion "(+)": teilweise Reaktion; "Y": es entwickelt sich eine gelbe Farbe. Tabelle 3 Biochemische Marker auf ID-IDENT-Platten Indolproduction N-Acetyl-glucosaminidase α-Glucosidase α-Arabinosidase β-Glucosidase α-Fucosidase Phosphatase α-Glactosidase β-Galactosidase Inoxylacetat Verwendung von Arginin Leucin-aminopeptidase Prolin-aminopeptidase Pyroglutaminsäure Arylamidase Tyrosin-aminopeptidase Arginin-aminopeptidase Alanin-aminopeptidase Histidin-aminopeptidase Phenylalanin-aminopeptidase Glycin Catalase ID-IDENT ist ein Warenzeichen der API Analytab Products Tabelle 4 Bichoemische Marker auf API-ZYME-Platten Vergleich alkalische Phosphatase Esterase (C-4) Esterase-lipase (C-8) Esterase-lipase (C-14) Leucin-aminopeptidase Valin-aminopeptidase Cystein-aminopeptidase Trypsin-aminopeptidase Chymotrypsin saure Phosphatase Phosphoamidase α-Galactosidase ß-Galactosidase ß-Glucoronidase α-Glucosidase β-Glucosidase η-Acetyl-β-Glucosaminidase α-Mannosidase α-Fucosidase API-ZYME ist ein Warenzeichen der API Analytab Producst "0"= Keine Reaktion "+" = Positive Reaktion
Im Hinblick auf diese Ähnlichkeiten ist es überraschend, daß A30 eine wesentlich verbesserte insecticide Aktivität gegenüber Coleoptera-Schädlingen im Vergleich zu HD-1 aufweist.
Der erfindungsgemäße Stamm kann in jeder Menge hergestellt werden, wenn man eine Probe von NCIB 12572, die von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria erhalten worden sind, unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Medium fermentiert. Solche Bedingungen und Medien sind in der Technik allgemein bekannt. Die Medien werden natürlich beispielsweise im allgemeinen eine Stickstoffquelle (wie z.B. Fischprotein) und eine Kohlehydratquelle (wie z.B. Stärke), enthalten. Geeignete Bedingungen herrschen bei einer Temperatur im Bereich von 15 - 45 ºC und bei einem annähernd neutralen pH. Die Fermentation kann zweckmäßig in Chargen ausgeführt werden, typischerweise während Zeiten von 1 bis 3 Tagen.
Insecticide Zusammensetzungen gemäß der Erfindungen können aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten werden durch Konzentrierung, beispielsweise durch Zentrifugierung oder Filtration, und anschließende Zugabe irgendwelcher erwünschter und zweckmäßiger Formulierungsmittel. Brauchbare Formulierungsmittel sind beispielsweise oberflächenaktive Mittel, z.B. Netzmittel, sowie feste Verdünnungsmittel, Dispergiermittel und UV-Stabilisatoren. Gewünschtenfalls können feste Formulierungen durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen dadurch ausgeführt, daß man Pflanzen, die von Insecten befallen sind oder denen ein Befall durch Insecten droht, mit einer oben beschriebenen insecticiden Zusammensetzung, die mit einem Verdünnungsmittel , wie z.B. Wasser, verdünnt ist, behandelt (z.B. bespritzt). Das insecticide Mittel ist das giftige δ-Endotoxin. Gegebenenfalls kann dieses auf die Pflanzen oder die sie befallenden Schädlinge unabhängig von den Bacterien, welche es erzeugen, angewendet werden. Jedoch ist eine Abtrennung des kristallinen Proteins von den Bacterien im allgemeinen unnötig.
Eine Methode für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, so vorzugehen, daß die einem Insectenbefall unterliegenden Pflanzen in situ das Endotoxin produzieren. Dies geschieht dadurch, daß man ein δ-Endotoxin-Gen des Stamms NCIMB 12572 durch bekannte Maßnahmen clont, indem man sie mit einem geeigneten Promoter (beispielsweise den GaMV35S-Promoter) versieht, der eine Expression des Gens in die Pflanze verursacht, und indem man die Pflanze durch bekannte Methoden transformiert (z.B. durch die Verwendung von Ti-Plasmiden). Solche Verfahren sind näher in EPA 142924 (Agrigenetics) beschrieben, deren Angaben als in die vorliegende Beschreibung eingeschlossen gelten sollen.
Insecten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren bekämpft werden können, sind z.B. Coleoptera, wie z.B. die in der folgenden Tabelle 5 angegebenen. Tabelle 5 Allgemeiner Name lateinischer Name Colorado-Kartoffelkäfer Maiswurzelwurm Baumwollkapselkäfer Leptinotarsa decemlineata Diabrotica undecimpunctata howardi Anthonomus grandis
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um eine große Reihe von Pflanzen zu schützen, die zu einem Befall durch Coleoptera neigen. Spezielle Beispiele für kommerziell wichtige Pflanzen, die gemäß der Erfindung geschützt werden können, sind Mais und Coniferen wie auch Baumwolle, Kartoffeln, Reis, kleinkörnige Getreide, z.B. Weizen und Gerste, sowie Gemüse, z.B. Kopfsalat, Tomaten und Zuckerrüben.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Isolation des Bt-Stamms A30 gemäß der Erfindung.

Eine geschrotete Körnerprobe, die in Dalrymple, Ontario, isoliert worden war, wurde verdünnt, indem 5,0 g der Probe in eine Verdünnungsflasche eingebracht wurden, die 45 ml 0,05 %iges Pepton enthielt, so daß eine Verdünnung von 10&supmin;¹ erhalten wurde. Die Probe wurde dann wärmebehandelt, indem sie 10 Minuten in ein Wasserbad von 60 ºC gestellt wurde. Aufeinanderfolgende Verdünnungen wurden dadurch gemacht, daß 0,5 ml der Probe mit der höchsten Verdünnung genommen wurden und sie in 4,5 ml 0,05 %iges Pepton gebracht wurden (d.h., daß 0,5 ml der 10&supmin;¹-Verdünnung mit 4,5 ml Pepton- Verdünnungsmittel eine Verdünnung von 10&supmin;² ergab). Dies wurde wiederholt, bis eine Verdünnung von 10&supmin;&sup5; erreicht war. B. Cereus selectives Medium (Bacillus cereus Agar Base, Code CM617 von 0xoid, Canada) und Esculin-Agar (in g/l Wasser: Esculin 1,0; Eisen (III)-citrat 0,5; Pepton 10; NaCl 5; Agar 20) wurden verwendet, um Verdünnungen von 10&supmin;³ auf Verdünnungen von 10&supmin;&sup6; zu plattieren. Die plattierten Proben wurden bei 30 ºC 5 Tage incubiert und dann auf potentielle Bt-Kolonien untersucht. Unter Verwendung des Smirnoff-Anfärbeverfahren wurden von den ausgewählten Kolonien Mikroskopiergläser hergestellt und unter dem Mikroskop (bei einer Vergrößerung von 1000 x unter Verwendung von Ölimmersionslinsen) auf die Anwesenheit von dunkelfärbenden Parasporal-Kristallen untersucht, die üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, eine Bipyramidenform aufwiesen.
Kristallpositive Kolonien wurden auf Nähragar aufgestreift, um eine reine Kultur sicherzustellen, und weitere 5 Tage bei 30 ºC incubiert. Das Smirnoff-Anfärbeverfahren wurde wiederholt, um die Anwesenheit von Kristallen zu bestätigen und um die Reinheit zu prüfen. Gereinigte Kolonien wurden in Nähragar-Schrägkulturen überführt und für weitere Verwendung in einem Kühlschrank mit 4 ºC gelagert.

Beispiel 2

Propagierung des Bt-Stamms A30 gemäß der Erfindung.

Ein Inoculum wurde von einer Schrägkultur in einen 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml CRL#1 Medium enthielt (in g oder ml/l Wasser: Nährbrühe 8; Glucose 6; Hefeextrakt 5; Xylose 0,5; Baumwollsamenmehlextrakt 30 ml; Maisauszugsflüssigkeit 3,2 ml; Mary Mendel's Salzgemisch 1 ml) und unter Rühren bei 30 ºC und 3400 U/min incubiert. Nach 24 h wurden die gesamten 100 ml verwendet, um 1 Liter des gleichen Mediums in einen 2 l fassenden Kolben zu inoculieren. Dieses wurde 5 Tage unter Rühren mit 300 U/min bei 30 ºC incubiert. Die Zellen, Sporen und Kristalle wurden dann durch Zentrifugieren geerntet und unter Verwendung des Dulmage-Verfahrens aus Aceton ausgefällt.

Beispiel 3

Formulierung gemäß der Erfindung.

Nach Beendigung der Fermentation wurden A30-Bacterien geerntet, indem zunächst die Bt-Sporen und die Kristalle aus der Fermentationsbrühe abgetrennt wurden, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die abgetrennten Sporen und Kristalle wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert und in ein flüssiges Konzentrat formuliert, indem 4,9 g * Morwet D-425 (Dispergiermittei), 4,9 g * Veegum HV (Suspendiermittel), 4,9 ml * Tween 80 (Netzmittel) und 24,4 ml * Sorbo (Antigefriermittei) zugegeben wurden. Jeder Bestandteil wurde gesondert in der oben angegebenen Reihenfolge zugesetzt. Das Produkt wurde vor der Verwendung bei 4 ºC gehalten. Eine ähnliche Formulierung wurde unter Verwendung von HD-1 ausgeführt, welche als Vergleich diente.
Die Beispiele 4 bis 7 erläutern die Aktivität des neuen Bt-Stamms gegen verschiedene Coleoptera Insecten.

Beispiel 4

Kartoffelblätter wurden in eine Suspension von A30-Sporen und Kristallen (erhalten gemäß Vorschrift von Beispiel 2) mit verschiedenen Konzentrationen eingetaucht und dazu verwendet, einen Tag alte Colorado-Kartoffelkäferlarven zu füttern. Die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt. HD-1 besaß bei diesen Konzentrationen keine Wirkung. Tabelle 6 Rate (ug Pulver/ml Lösung) % Mortalität (4TNB) % Nahrungsreduktion * (4 TNB) * Maß für die Reduktion in % verbrauchter Blattfläche im Vergleich zu % verbrauchter Blattflache bei unbehandeltem Vergleich. * Eingetragene Warenzeichen

Beispiel 5

Ein Gemisch aus Bt-Sporen und Kristallen wurde dadurch hergestellt, daß der Stamm A30 bei 30 ºC 5 Tage auf 210 mm x 210 mm-Petri-Platten incubiert wurden, welche L Nähragar enthielt, (10 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 10 g Agar je l) und confluentes Wachstum von der Agaroberfläche abgekratzt und gefriergetrocknet wurde. Gefriergetrocknete Sporen und Kristalle wurden mit einer sterilen 8 %igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 4800 ppm gemischt. Diese Lösung wurde als Nahrungsquelle für den westlichen Maiswurzelwurm (Diabrotica virgifera virgifera) verwendet, wobei 25 erste Instar-Larven je Test verwendet wurden. Die Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 % Mortalität 3 TNB Replicat Stamm A30 unbehandelter Vergleich (TNB = Tage nach Behandlung)

Beispiel 6

Ein Gemisch aus A30-Sporen und -Kristallen wurde wie in Beispiel 5 hergestellt. Gefriergetrocknete Sporen und Kristalle wurden mit einer sterilen 2,5 %igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 2000 ppm gemischt. Diese Lösung wurde als Nahrungsquelle für den Südlichen Maiswurzelwurm (Diabrotica undecimpunctata howardi) verwendet. Eine ähnliche Formulierung, die den für Lepidoptera aktiven Stamm A20 (niedergelegt bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter der Nummer NCIB 12570) enthielt, wurde als Vergleich verwendet. Die Resultate sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Bt- Stamm Mortalität 3 TNB

Beispiel 7

Ein Gemisch aus A30-Sporen und -Kristallen wurde wie in Beispiel 5 hergestellt. Baumwollkeimblätter, die entweder mit Larven oder mit ausgewachsenen Baumwollkapselkäfern (Anthonomus grandis) infiziert waren, wurden in das gefriergetrocknete Gemisch eingetaucht. Die Resultate wurden nach 3 Tagen ermittelt. Sie sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Insectenzustand %Mortalität %Nahrungsreduktion Ausgewachsene Insecten Larven
Die Mortalität bei unbehandelten Larven (Vergleich) war 2 %.

Claims

1. Der neue Stamm A30 des Bacillus thuringiensis, der bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria Scotland unter der Bezugsnummer NCIB 12572 niedergelegt ist.

2. Insektizide Formulierung zur Bekämpfung von Coleoptera-Arten, welche als aktiven Bestandteil ein insektizides δ-Endotoxin enthält, das durch den Stamm A30 gebildet worden ist.

3. Insektizide Formulierung nach Anspruch 2, welche weiterhin ein festes Verdünnungsmittel oder ein oberflächenaktives Mittel enthält.

4. Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen den Angriff durch Insekten der Gattung Coleoptera, bei welchem die angreifenden Insekten dem δ-Endotoxin ausgesetzt werden, das durch den Stamm A30 gebildet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem die Pflanzen vor oder während des Angriffs mit einer insektizid wirksamen Menge einer Formulierung nach Anspruch 2 oder 3 behandelt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das δ-Endotoxin innerhalb der Pflanze durch ein Gen erzeugt wird, das sich von dem in Anspruch 1 genannten Stamm ableitet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei welchem die Pflanze eine Kartoffel- oder Baumwollpflanze ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem das Insekt aus Colorado-Kartoffelkäfer oder Baumwollkapselkäfer besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei welchem die Pflanze aus Mais besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem das Insekt aus südlichem oder westlichem Maiswurzelwurm besteht.