DE69233007T2 - Bacillus thuringiensis isolate - Google Patents
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Description
- Technisches Gebiet
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Organismen, welche biologische Pestizide produzieren. Genauer gesagt, bezieht sie sich auf neue Stämme des Bakteriums Bacillus Thuringiensis, welche wirksam sind gegen bestimmte Insektenspezies, ebenso wie auf Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
- Hintergrund der Erfindung
- Insektizide haben sich einer weit verbreiteten Verwendung in der kommerziellen Landwirtschaft erfreut und haben einen enormen Anstieg in Ernteerträgen und Produktqualität ermöglicht. Pestizide werden ebenfalls routinemäßig verwendet, um verschiedene Insekten zu bekämpfen, wie beispielsweise Fliegen oder Moskitos, wenn die Schädlings-Populationen ein Ärgernis darstellen oder eine Gesundheitsgefahr für Menschen oder den Viehbestand. Es gibt jedoch ein ansteigendes Bewusstsein für Umweltrisiken, welche mit der Verwendung von bestimmten synthetischen Pestiziden assoziiert sind, einschließlich der Besorgnis über die Bioakkumulation von Pestiziden in der Nahrungskette oder ihren schädlichen Auswirkungen auf nicht-Ziel-Organismen. Biologische Pestizide und insbesondere natürliche Bio-Pestizide sind deshalb von beträchtlichem Interesse für diejenigen, welche umweltverträgliche Mittel zur Schädlingsbekämpfung wünschen.
- Der Mikroorganismus B. Thuringiensis wurde seit langer Zeit als nützlich bei der Schädlingsbekämpfun gerachtet. Die sporenbildende B. Thruingiensis Zelle produziert eine Klasse von Verbindungen, früher als ein einzelnes δ-Endotoxin betrachtet, aber jetzt als verschiedene unterschiedliche Toxinproteine umfassend erkannt, welche in einem kristallinen Protein-Inklusionskörper konzentriert sind, welcher in dem Endospor gefunden wird. Nach Verdauung des Inklusionskörpers durch eine empfindliche Insek tenlarve und Proteolyse in dem Insektendarm, werden die Endotoxin-Proteine in aktive Verbindungen umgewandelt, welche das Darmepithel zerstören und schließlich den Schädling selbst.
- Es wurde jetzt herausgefunden, dass B. Thuringiensis δ-Endotoxine nützlich sind als Pestizide, wenn sie in Form von Lysaten oder anderen Fermentationsextrakten von Kulturen des Mikroorganismus angewendet werden. Diese Toxine zeigen eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegen eine Vielzahl von Lepidoptera Spezies und anderen Insekten. Jedoch haben sich B. Thuringiensis Zubereitungen als nur von begrenztem Wert bei der Bekämpfung von Insekten erwiesen, wie denjenigen, der Gattungen Spodoptera und Plutelle, ebenso wie verschiedenen anderen Lepidoptera-Schäd- lingen. Es wird geglaubt, dass diese Toxizität von B. Thuringiensis Zubereitungen gegen nur bestimmte Schädlings-Spezies oder ihre unterschiedliche Toxizität, begründet ist, in der Expression von nur bestimmten Endotoxin-Genen in irgendeiner gegebenen B. Thuringiensis-Variante, wobei jedes Toxin in einer unvorhersehbaren Art und Weise zu dem gesamten Toxizitäts-Profil beiträgt.
- Zahlreiche Forscher haben versucht, B. Thuringiensis-Stämme zu identifizieren, welche ein breiteres oder unterschiedliches Spektrum an pestizider Wirksamkeit besitzen oder das B. Thuringiensis-Genom zu manipulieren, um die Expression von bestimmten δ-Endotoxinen zu fördern. Anstrengungen bezüglich des Toxizitäts-Screenings von individuellen Isolaten haben zu der Isolation von einigen vorher unbekannten Stämmen geführt, wie beispielsweise B. Thuringiensis var. Tenebionis, offenbart durch Krieg et al. in U.S. Patent-Nr. 4.766.203, ausgegeben am 23. August 1988, wobei der Stamm nachweislich wirksam ist zur Bekämpfung von Coleoptera. Die Verwendung von konventionellen Screening-Verfahren, um Stämme mit neuer pestizider Wirksamkeit zu identifizieren, ist jedoch Zeit- und Arbeitsaufwändig, wegen der unzähligen Varianten von B. Thuringinsis, die in der Natur vor kommen.
- Insektizide Zusammensetzungen, welche entweder ein B.
- Thuringiensis-Isolat oder ein δ-Endotoxin umfassen, wurden eben falls offenbart in der EP-A-0 401 979; EP-A-0 256 553; Haider, M.Z. et al., Gene vol. 52 (1987) 285–290; U.S. Patent-Nummern 4.935.353, 4.206.281, 4.902.507 und 4.695.455; B. Visser et al., J. Bacteriology, Dec. 1990, p. 6783–6788; V. Sanchis et al., Molecular Microbiology (1988), 2(3), 393–404. H. Hofte et al., Microbiological Reviews, June 1989, p. 242–255 und G. Prefontaine et al., Applied and Environmental Microbiology, Dec. 1987, p. 2808–2814 offenbaren die Verwendung von genspezifischen Oligonukleotid-Sonden, um die δ-Endotoxin-Gene in verschiedenen B. Thuringiensis-Stämmen zu identifizieren.
- Eine andere Vorgehensweise war es, Gene zu klonieren, welche für B. Thuringiensis δ-Endotoxine kodieren und das B. Thuringiensis-Genom in einer günstigen Art und Weise neu zuordnen oder die klonierten Gene in neue mikrobielle Wirte zur Expression einzuführen.
- Shimizu, M. et al., Agric. Biol. Chem., 52(6), 1565–1573 (1988) offenbaren die Klonierung und Expression in E. Coli eines B. Thuringiensis-insektiziden Protein-Genes.
- Herrnstadt et al., in U.S Patent-Nr. 4.771.131, ausgegeben am 13. September 1988, beschreiben die Klonierung eines M-7 Toxin-Genes, welches anscheinend geeignet ist, zur Expression in anderen Mikroben, wie beispielsweise Pseudomonas und um dabei die Fähigkeit, Käfer der Ordnung Coleoptera zu bekämpfen, zu verleihen. Diese Verfahren jedoch leiden an dem Nachteil, dass die resultierenden Organismen einer erhöhten Untersuchung für die Zulassung unterworfen werden, gegenüber Organismen, welche natürlich vorkommen.
- Es besteht daher ein andauerndes Bedürfnis nach der Identifikation von B. Thuringiensis-Stämmen, welche ein breiteres oder unterschiedliches Spektrum an pestizider Wirksamkeit zeigen. Idealerweise würden solche Stämme von natürlich vorkommenden Varianten identifiziert werden, ohne die Verwendung von zufälligen Screening-Verfahren.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Dem entsprechend umfasst die vorliegende Erfindung neue bakterielle Isolate von B. Thuringiensis, welche eine verbesserte Toxizität bezüglich der vorher resistenten oder unzureichend empfindlichen Insektenspezies besitzen. Diese Isolate können gegen verschieden Insektenspezies, welche resistent sind gegenüber der Behandlung mit B. Thuringiensis, verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Plutelle Xylostella (diamondback moth – Kohlschabe), Spodoptera frugiperda (fall armyworm – asiatischer Baumwollwurm) und Spodoptera exiqua (beet armyworm – Zuckerrübeneule), ebenso wie bestimmten sekundären Schädlingen, wie z. B. Trichoplusia ni (cabbage looper). Die bakteriellen Isolate der Erfindung können charakterisiert wer- den, durch ihren Besitz an speziellen Teilmengen der Gene, welche für die unterschiedlichen B. Thuringiensis-Endotoxin-Proteine kodieren und durch ein charakteristisches Plasmid-Profil oder eine Anordnung, welche bekanntermaßen damit assoziiert ist.
- Die vorliegende Erfindung umfasst ein bakterielles Isolat von Bacillus Thuringiensis, welches eine Kombination an Genen besitzt, einschließlich cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID, welche für B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Proteine kodieren und als diese exprimiert werden, wobei das Isolat gekennzeichnet ist, durch das Plasmid-Profil, welches in der
1 , Spur 3 gezeigt ist, verglichen mit dem Molekulargewicht-Marker und Plasmid-Profile von Stämmen HD-1, HD-133, HD-11, gezeigt in der1 , Spuren 1, 2, 4 bzw. 5, erhalten durch Gel-Elektrophorese auf einem agarose 0,8% Gel in TBE-Puffer, unter Verwendung eines Pulsewave® 760 Switchers, worin das Gel bei 4°C gehalten wurde, durchgeführt bei 80 V für eine Stunde, bedeckt mit einem Plastikfilm und durchgeführt bei 50 V für 26 Stunden, wobei die Wellenform-Parameter der Feldinversion des Normaldurchgangs eine Anfangs-A-Zeit von 9 Sekunden und eine End-A-Zeit von 60 Sekunden besitzen und worin das Startverhältnis 3 war und die Durchgangszeit 26 Stunden betrug. - Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zur effizienten Identifikation solcher bakteriellen Isolate, worin eine generalisierte Nukleotid-Sonde verwendet werden kann, um in einem Stamm, der schon bekannt ist, dass er eine Toxizität gegenüber einem speziellen Insektenschädling besitzt, die Identität der Endotoxin-Gene dieses Stammes zu liefern. Als nächstes werden genspezifische DNA-Sonden für die Detektion dieser Endo- toxin-Gene; diese Sonden werden dann verwendet zum Pre-Screening von B. Thuringiensis-Stämmen, um ein Set von Varianten zu identifizieren, welche in der Lage sind, die entsprechenden Endotoxine zu synthetisieren. Die so ausgewählten Varianten können schließlich einem weiteren Screening einer konventionelleren Natur unterworfen werden, um speziellen Varianten zu erhalten, welche noch höhere Spiegel an pestizider Wirksamkeit zeigen.
- Offenbart sind klonierte oder synthetisierte Nukleotid-Sequenzen, welche nützlich sind bei der Herstellung der genspezifischen DNA-Sonden, welche verwendet werden können, um die Isolate der Erfindung zu identifizieren. Diese Sequenzen werden bes-timmt durch Sequenzanalyse des Ziel-Genes von Interesse und in Übereinstimmung mit dem Grad an Spezifität, die gewünscht ist. Wo eine generalisierte Sonde benötigt wird (d. h. eine, die in der Lage ist, multiple Endotoxin-Gene zu erkennen), kann eine Nukleotid-Sequenz konstruiert werden, welche auf einer konservierten Region des B. Thuringiensis-Toxin-Genes basiert ist. Wahlweise können Sequenzen, welche eindeutig gegenüber den unterschiedlichen Toxin-Genen sind, verwendet werden, um hochspezifische Sonden herzustellen.
- Die vorliegende Erfindung umfasst zusätzlich die Verwendung von bakteriellen Isolaten der Erfindung bei der Kontrolle oder der Ausrottung von Schädlingen, ebenso wie Zusammensetzungen, welche eine Insektizid-wirksame Menge eines solchen Isolates in Kombination mit einem verträglichen Träger enthalten.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
- Die vorliegende Erfindung wird beschrieben unter Bezugnahme auf die angehängte Zeichnung, in welcher
1 ein Satz an Plasmid-Profilen für B. Thuringiensis-Stamm ABTS 1857 und verschieden Referenz-Stämme ist. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind bakterielle Isolate von Bacillus Thuringiensis offenbart, welche gewählt sind, aus den erhältlichen B. Thuringiensis-Varianten, durch ein Verfahren, welches das Pre-Screening für eine gewählte Untermenge (cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID) dieser Gene einschließt, welche für B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Proteine kodieren, und das Identifizieren solcher Isolate, welche das oben angezeigte Plasmid-Profil besitzen. Die Isolate der vorliegenden Erfindung besitzen unterschiedliche Toxizität gegenüber speziellen Schädlingen und schließen Isolate von B. Thuringiensis-Varianten ein, welche toxisch sind gegenüber Schädlings-Spezies, die zuvor als restistent oder ungenügend empfindlich gegenüber B. Thuringiensis-Insektiziden gefunden wurden.
- Beispielhaft für die Erfindung sind Stämme, welche wirksam sind, gegen Schädlinge, die gewählt sind, aus der Gruppe bestehend aus Spodoptera frugiperda, S. exigua, Plutella xylostella und Trichoplusia ni.
- Es wurde jetzt herausgefunden, dass diese Schädlings-Spezies bekämpft werden können mit einem Isolat von B. Thuringiensis, welche die cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID-Gene exprimiert und dem wahlweise das cryIA(c)-Gen fehlt. Während es nicht beabsichtigt ist, durch die Theorie eingeschränkt zu sein, wird von diesem Gen-Komplement angenommen, dass es zumindest teilweise erhöhte pestizide Wirksamkeit dieser Stämme verantwortlich ist. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Wirksamkeit dieser Gene in Relation steht mit ihrer Organisation innerhalb des bakteriellen Genoms. Eine Plasmid-Anordnung oder ein Profil, welches leicht erhältlich ist, wie beispielsweise durch elektrophoretische Trennung von bakteriellen Plasmiden, kann dazu dienen, um die genetische Architektur eines Stammes zu charakterisieren und um solchermaßen als ein weiterer Identifizierer eines bakteriellen Isolates der Erfindung zu dienen. Ein repräsentatives Plasmid-Profil, erhalten von B. Thuringiensis ABTS 1857, ist in der
1 gezeigt. - Ein bevorzugtes Beispiel der bakteriellen Isolate der vorliegenden Erfindung ist das neue bakterielle Isolat B. Thurin giensis ABTS 1857, welches hierin beschrieben ist, welches das oben beschriebene Gen-Komplement besitzt und welches eine verbesserte Toxizität gegenüber Plutella xylostella zeigt, wenn es mit kommerziellen B. Thuringiensis-Stämmen verglichen wird. B. Thuringiensis ABTS 1857, welches zu der Subspezies Aizawai gehört, ist hinterlegt unter der Zugriffsnummer SD-1372 bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland. Zusätzlich zu dem Plasmid-Profil von
1 , ist der Stamm ABTS 1857 identifizierbar durch die biochemischen Charakteristika von Beispiel 4 hierin und durch das Anzeigen des flagellaren Serotypes H-7 (identisch zu dem U.S. Department of Agriculture B. Thuringiensis Typ-Stamm HD-11), ebenso wie der Anwesenheit von mindestens drei Endotoxin-Gen-enthaltenden Plasmiden (gezeigt durch heiß-vulkanisieren). - In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind biologisch reine Kulturen der oben genannten Isolate offenbart. Mit "biologisch reiner Kultur", wie hierin verwendet, ist eine Kultur gemeint, die im wesentlichen frei ist von biologischer Kontamination und die eine genetische Gleichförmigkeit besitzt, so dass unterschiedliche Subkulturen, welche davon entnommen werden, im wesentlichen identische Genotypen und Phenotypen zeigen. Solche Kulturen sind nützlich in großtechnischer Fermentation oder wahlweise als Startmateriel für wohl bekannte Stamm-Manipulationstechniken. Dem entsprechend werden Mutanten, Rekombinanten und genetisch verarbeitete Varianten, welche das gewünschte Plasmid-Profil besitzen, welche von den Isolaten der vorliegenden Erfindung und den Kulturen davon abgeleitet sind, als innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung betrachtet.
- Wünschenswerte Kombinationen von B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Genen können identifiziert werden unter Verwendung einer generalisierten Nukleotid-Sonde, welche in der Lage ist, mit allen diesen Genen zu hybridisieren. Eine Anzahl an Toxin-Genen, einschließlich cryIA(a), cryIA(b), cryIA(c), cryIB, cryIC, cryID, cryIE, cryIIIA, cryIIIB, cryIVA, cryIVB und cryIVC, wurden identifiziert und Teile oder ganze Sequenzen davon wurden veröffentlicht, wie beispielsweise durch Schnepf et al., in J. Biol. Chem., 260: 6264–6272 (1985). Es wurde herausgefunden, dass bestimmte Regionen dieser Gene hoch konserviert sind, wobei die Herstellung einer DNA-Sonde erlaubt wird, welche B. Thuringiensis-Endotoxin-Gene im Allgemeinen erkennt. Eine solche generalisierte Sonde kann, wenn sie mit dem Genom eines Stammes hybridisiert ist, von welchem herausgefunden wurden, durch übliches Screening, dass er einen gewissen Grad an Toxizität gegenüber einer Schädlings-Spezies von Interesse besitzt, dann verwendet werden, um die Endotoxin-Gene, welche in dem Typ Stamm anwesend sind, zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese Manipulationen, ebenso wie andere, welche nützlich sind in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifikation der Endotoxin-Gene, können erreicht werden, unter Verwendung von Techniken, welche wohl bekannt sind und welche in Referenzen, wie beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 gefunden werden können.
- Gemäß der Erfindung ist ein Beispiel einer generalisierten Sonde, welche verwendet wird, um die Gene cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID zu identifizieren, welche scheinbar bessere Toxizitäts-Charakteristika gegenüber B. Thuringiensis verleihen, die neue Sonde, welche die Sequenzenthält.
- Solche Sequenzen können, wenn sie in der Literatur berichtet werden, unter Verwendung von Standardverfahren für die Synthese von Polynukleotiden hergestellt werden. Alternativ gazu können Sequenzen direkt von bekannten Genen von Interesse kloniert werden. Verwandte Sonden können ebenso verwendet werden; zum Beispiel sind Fragmente der obigen Sequenz, welche in der Länge ausreichend sind, um spezifisch mit δ-Endotoxinen zu hybridisieren, ebenso geeignet zur Verwendung als generalisierte DNA-Sonden der vorliegenden Erfindung seoin. Es sollte bemerkt werden, dass hier und überall sonst in dieser Offenbarung, die Nukleotid-Sequenzen in der konventionellen Art und Weise exprimiert werden, nämlich in der 5'- bis 3'-Richtung, worin A Adenin ist, G Guanin ist, C Cytosin ist und T Thymin ist.
- Das Verfahren der Erfindung stellt die Isolation eines Sets von B. Thuringiensis-Varianten bereit, welche die obige Kombination an Genen enthalten und daher in der Lage sind, die entsprechende Kombination an Endotoxin-Proteinen zu produzieren. Die Isolation von Varianten kann erreicht werden, indem zuerst eine eindeutige Nukleotid-Sequenz eines Teiles von jedem Gen bestimmt wird, welches für jedes der gewünschten Endotoxine kodiert, und in dem dann ein Set von genspezifischen Nukleotid-Sonden hergestellt wird, welche in der Lage sind, mit diesen Sequenzen zu hybridisieren. Solche eindeutigen Sequenzen werden erhalten von was als hoch variable (d. h. nicht konservierte) Regionen der B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Gene beschrieben wurde. Wie im Fall der generalisierten Sonden, die oben beschrieben sind, kann die Konstruktion von genspezifischen Sonden in einigen Fällen erreicht werden, durch Bezugnahme auf veröffentlichte Nukleotid-Sequenzen. Alternativ dazu müssen, wo die Sequenz-Daten nicht verfügbar sind oder wo ein neues Endotoxin-Gen identifiziert wurde, die Gene von Interesse kloniert oder sequenziert werden, und zwar zu einem Grad, welcher die Identifikation von eindeutigen Sequenzen erlaubt, die nützlich sind zur Klonierung oder Synthese der entsprechenden Sonden-Sequenzen.
- Genspezifische Sonden, welche bei der Identifikation der δ-Endotoxin-Gene von B. Thuringiensis verwendet werden könne, wie beispielsweise diejenigen, welche in der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegende Erfindung verwendet werden, können von Nukleotid-Sequenzen konstruiert werden, welche folgendes einschließen:zur Identifikation des cryIA(a)-Genes;
zur Identifikation des cryIA(b)-Genes;
zur Identifikation des cryIA(c)-Genes;
zur Identifikation des cryIC-Genes; und
zur Identifikation des cryID-Genes.
- Diese Sequenzen können in ihrer Gesamtheit verwendet werden oder können verkürzt werden, verlängert werden oder intern modifiziert werden, um Sonden zu erhalten, welche den gewünschten Grad an Homologie gegenüber und die entsprechende Hybridisierung-Spezifität für die Endotoxin-Gene besitzen, welche identifiziert werden wollen.
- Die oben genannten genspezifischen Sonden, welche in irgendeiner Weise einer Vielzahl an konventionellen Wegen markiert werden können, um die Beurteilung ihrer Bindung zu erlauben, können dann verwendet werden, um alle verfügbaren Stämme von B. Thuringiensis schnell und ökonomisch vorzuscreenen. Diese Pre-Screening kann ausgeführt werden, unter Verwendung von wohl bekannten Techniken, wie beispielsweise dem Replica-Plating, der Hybridisierung, der Autoradiographie und ähnlichem. In dieser Weise kann man leicht aus den Stämmen, die getestet wurden, ein Set an Varianten auswählen, welches ein Muster an Hybridisierung zeigt, welches repräsentativ ist für das Gen-Komplement, nach welchem gesucht wird. Es sollte diesbezüglich bemerkt werden, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung Pre-Screening nicht nur für die Anwesenheit von speziellen Endotoxin-Genen einschließen kann, sondern auch für die Abwesenheit von anderen, von welchen herausgefunden wurde, dass sie hemmen oder das sie einen erkennbaren Effekt auf die gewünschte Toxizität besitzen.
- Es wird erwartet, dass das obige Isolationsverfahren. der Erfindung, obwohl es oben in Zusammenhang mit der Identifikation und dem Pre-Screening für B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Gene beschrieben wurde, gleichgut geeignet ist für die Selektion von Sets von Varianten-Stämmen, welche andere, nicht Toxin-DNA-Sequenzen tragen, von denen gleichwohl herausgefunden werden könnte, dass sie in der Bestimmung von unterschiedlicher Toxizität teilnehmen. Beispielsweise können, sollte ein regulatorisches Gen oder eine unexp-rimerte Sequenz identifiziert werden, welche die Anzahl an produzierten Endotoxinen oder die Spezi- fität dieser Toxine gegenüber einem Ziel-Schädling beeinflusst, sequenz-spezifische Nukleotid-Sonden hergestellt werden und verwendet werden, um natürlich vorkommende B. Thuringiensis-Var-ianten für die Anwesenheit oder Abwesenheit solcher Sequenzen vorzuscreenen. Dementsprechend sind mit "Genen" oder "Genen, welche für Endotoxin-Proteine kodieren", wie hierin verwendet, nicht nur DNA-Sequenzen gemeint, welche als Endotoxine exprimiert werden, sondern ebenso jene Sequenzen, welche eine solche Expression regulieren oder welche, wenn sie selbst exprimiert werden, das Toxizitätsprofil des B. Thuringiensis-Stammes, welcher sie enthält, modifizieren.
- Aus den Varianten, die durch Pre-Screening ausgewählt wurden, kann ein bevorzugter B. Thuringiensis-Stamm durch konventionelles, aber Screening im Labormaßstab für die Toxizität identifiziert werden. Das zuletzt ausgewählte Isolat kann dann für die Toxin-Produktion optimiert werden unter Verwendung von bekannten Techniken von Ausbeuteverbesserung oder durch die Manipulation des Stammes selbst, wie beispielsweise durch die Produktion von Mutanten, Rekombinanten oder genetisch verarbeiteten Derivaten davon, welche eine Kombination an Genen besitzen, die cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID einschließen und die das Plasmid-Profil von
1 , Spur 3 besitzen. - Eine solche Manipulation kann ebenfalls die Herstellung eines bevorzugten Phenotypes des ausgewählten Isolates ein schließen, wie beispielsweise eine spo(asporogene) Mutante, welche ein Toxin-Kristall produziert, aber keine Sporen.
- In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen offenbart, welche eine insektizid-wirksame Menge eines bakteriellen Isolates der Erfindung umfassen oder die Kombination von Endotoxinen, welche daraus erhalten wird, und zwar in Kombination mit einem verträglichen Träger. Nach der Identifikation und Stabilisierung einer geeigneten B. Thuringiensis-Variante gemäß dem oben genannten Verfahren, kann eine großtechnische Fermentation durchgeführt werden, unter Verwendung von Medien und Fermentationstechniken, welche in der Industrie Standard sind. Die Endotoxin-Kristalle (zusammen mit den Sporen, von welchen die Kristalle nicht leicht abtrennbar sind) können dann aus der Fermentationsbrühe ausgesondert werden und lyophilisiert werden oder in irgendeinem einer Anzahl von wohl bekannten Weisen formuliert werden, einschließlich als ein flüssiges Konzentrat, ein trockenes oder befeuchtbares Pulver oder einer Suspension zum Sprühen auf oder unter die Blätter und einer Granulatzubereitung, für die Anwendung auf den Boden. Mit "verträglichem Träger", wie hierin verwendet, ist ein anderweitiger inerter Füllstoff gemeint oder ein Bindemittel, welches der Zusammensetzung eine gewünschte Lagerfähigkeit, eine Materialhandhabung und Anwendungscharakteristika verleiht; üblicherweise verwendete Trägerstoffe können Füllstoffe, Bindemittel, oberflächenaktive Stoffe, Dispersionsmittel, Haftstoffe und ähnliches einschließen. Ein bevorzugtes Beispiel einer Zusammensetzung der Erfindung ist eines, welches das Isolat B. Thuringiensis ABTS 1857 enthält oder ein mutantes, rekombinantes oder genetisch verarbeitetes Derivat davon, welches eine Kombination an Genen besitzt, einschließlich cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID und welches das Plasmid-Profil von
1 , Spur 3 besitzt. - In wiederum einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen offenbart, welches das Anbringen auf ein Gebiet, welches von diesen Schädlingen befallen ist, einer Insektizid-wirksamen Menge eines bakteriellen Isolates der Erfindung oder der Kombination an Endotoxinen, welche daraus erhalten werden, umfasst. Mit "Insek tizid-wirksamer Menge", wie hierin verwendet, ist die Menge an bakteriellem Isolat oder Endotoxin gemeint, welche in der Lage ist, den Ziel-Schädling im wesentlichen auszurotten, wie beispielsweise gemessen durch die Schädlingsmortalität oder die Abwesenheit von weiterem Ernteschaden. Vielzählige Faktoren werden die Menge an bakteriellen Isolat oder Endotoxin beeinflussen, welche benötigt werden, einschließlich dem Verfahren der Applikation; den vorherrschenden Wetterbedingungen, wie beispielsweise der Temperatur, der Feuchtigkeit, dem Regenfall und dem Wind; dem Ausmaß des Schädlingsbefalls; dem Wachstumsstadium der Ziel-Spezies und ähnlichem. Wo die Insekten, die bekämpft werden sollen, Schädlinge sind, wie beispielsweise Spodoptera frugiperda, S. exigua, Plutelle Xylostella und Trichoplusia ni., ist eine bevorzugte Ausführungsform des Schädlingsbekämpfungsverfahrens der Erfindung eines, in welchem der aufgetragene aktive Wirkstoff ein bakterielles Isolat von B. Thuringiensis ABTS 1857 ist oder ein mutantes, rekombinantes oder genetisch-verarbeitetes Derivat davon, welches eine Kombination an Genen besitzt, einschließlich cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID und welches das Plsmid-Profil von
1 , Spur 3 besitzt. - Beispiel 1
- Allgemeine Methodik
- Probenherstellung und Wachstumsbedinaungen
- Die Isolation von B. Thuringiensis-Stämmen aus dem Boden wurde erreicht unter Verwendung von Verfahren, die ausgestaltet sind, um das Keimen von B. Thuringiensis-Typ-Bazillen über anderen Mikroorganismen zu favorisieren, welches 6 bis 10 Spezies von sporenbildenen Bazillen ebenso wie nicht sporenbildende Bakterien, ebenso wie Hefe und Pilze einschließt. Eine kurze Hitzebehandlung (80°C für 10 Minuten) wurde verwendet, um die Sporen zu aktivieren, wonach die Proben schnell auf NSMY Agar-Medium durch Myers und Youseten 1980 subkultiviert wurden.
- Kolonien von B. Thuringiensis-Typ-Bazillen wurden ausge wählt auf der Basis von Koloniemorphologie und Wachstumscharakteristika, die typisch sind für diese Spezies. Auch mikroskopische Prüfung wurde verwendet, um das Endotoxin-Protein-Kristall zu identifizieren, welche B. Thuringiensis von Bacillus Cereus, einem üblichen Bodenbakterium, welches anderweitig morpho- logisch und biochemisch nicht unterscheidbar ist, unterschiedet.
- B. Thuringiensis-Isolate zur Verwendung in Bio-Assays wurden in 250 ml Kulturflaschen gezüchtet, welche 50 ml Medium 168 enthielten (18 g Sojamehr, 0,3 g MgSO4•7H2O, 0,7 g K2HPO4, 0/5 g CaCO3, 1,0 ml 1% FeSO9•H2O und 1,0 ml 1% ZnSO4 in 1 Liter deionisiertem Wasser; autoklaviert; ungefähr 2,5 ml sterile 20% Glukoselösung pro 100 ml würde hinzugefügt vor der Verwendung. Die Kulturen wurden für 72 stunden bei 28°C unter Schütteln bei 250 U/Min inkubiert, wonach 3 ml Proben in sterile 15 ml Polypropylen-Röhrchen gegossen wurden und bei -20°C für die spätere Analyse gefroren wurden.
- Bio-Assay für die Stammtoxizität
- Die Toxizität der bakteriellen Isolate wurde im Labor untersucht, in dem Larven der Schädlings-Spezies einer Insektennahrung ausgesetzt wurden, welche mit unterschiedlichen Mengen an Bakterien behandelt worden war. Parallele Verdünnungsserien des Teststammes und von einem Referenzbakterium wurden hergestellt, wobei Konzentrationsbereiche ausgewählt wurden (nach einem anfänglichen Vortest, wenn nötig), um Serienmittelpunkte bei oder in der Nähe der entsprechenden LD50 zu erhalten. Zu 36 ml Aliquoten einer konventionellen Insektenernährung (prinzipiell Agar, Sojamehr, feste Nährstoffe und Vitaminzusatzstoffe), welche bei 60°C flüssig gehalten wurde, wurden 4 ml jeder Lösung hinzugefügt, einschließlich de-ionisierten Wasser-Standards. Nach dem Mischen wurde jede 40 ml Probe der behandelten Ernährung geteilt, während sie immer noch heiß war, in sechs 1 Unzen Plastikbecher, und Abkühlen gelassen, bis die Nahrung fest geworden war und für mindestens 1 Stunde Raumtemperatur erreicht hatte.
- Die Proben wurden dann mit der Schädlings-Spezies von Interesse befallen, beispielsweise mit zwei Sekunden Instar 2- Tage alten Larven im Falle von S. frugiperda, indem die Larven vorsichtig in jeden Behälter gegeben wurden. Die Behälter wurden individuell abgedeckt und für 64 bis 68 Stunden in einer Umgebungskammer inkubiert (24 Stunden Dunkelheit, 28°C, 20 bis 50% relative Feuchte). Nach der Inkubation wurden die Anzahlen von lebenden und toten Larven gezählt und die Resultate für die nachfolgende LC50 Analyse verwendet.
- DNA-Sonden-Herstellung und Kolonie-Hybridisierung
- Generalisierte und genspezifische DNA-Sonden zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung wurden hergestellt, in dem die gewünschten Oligonukleotide auf einem automatisierten Applied Biosystems 380B® 3-Säulen-DNA-Sythesizer, synthetisiert wurden, unter Verwendung der chemischen Zusammensetzungen von Standard-β-Cyanoethanol-Phosphoramidit, die mit dieser Vorrichtung bereitgestellt werden. Die resultierenden Olugonukleotide wurden entmarkiert, unter Verwendung von γ-AT32P (Amersham) und unter Verwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbert (1980) für die 5'-End-markierung mit T4 Polynukleotid-kinase.
- Bakterielle Isolate wurden hergestellt für die Hybridisierung mit den obigen Sonden, durch serielle Verdünnung und Plattierung, wonach einzelne Kolonien mit sterilen Zahnstochern in 96 Kammer-Mikrotiter-Schalen platziert wurden, welche flüssiges LB-Medium (5 g NaCl, 10 g Bactrotrypton und 5 g Hefeextrakt pro Liter) enthielten und wurden für mindestens 4 Stunden bei 28°C inkubiert. Unter Verwendung eines 96-zackigen Metall-Stempels wurden die Kulturanordnungen vielfach repliziert, durch den Transfer in 1,2 Micron Nylon-Hybridisierungs-Membranen, die über feste LB-Agar-Platten und in einem Master-Bio-Assay-Platte platziert wurden, und man ließ sie bei 28°C für ungefähr 16 Stunden inkubieren.
- Die resultierenden Kolonien wurden dann protoplastiert, indem die Filter für 1 Stunden mit der Kolonieseite nach oben mit einer 10 mg/ml Lysozymlösung in TES-Puffer geflutet wurden (30 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl). Nach der Protoplastierung wurden die Filter gewaschen, indem sie sanft in einem Überschuss zuerst an Denaturierungspuffer (0,5 M NaOH, 2,5 M NaCl) für 30 Minuten mit einem Wechsel des Puffers geschaukelt wurden und dann mit Neutralisierungspuffer (0,5 M Tris, ,pH 7,0, 3,0 M NaCl) auch für 30 Minuten mit einem Wechsel des Puffers. Die Filter wurden kurz luftgetrocknet und in einen 80°C Ofen für mindestens 1 Stunde platziert, vor der Pre-Hybridisierung und der Hybridisierung gemäß dem Verfahren von Southern (1975).
- Die hybridisierten Filter wurden zweimal gewaschen, jeweils für 1 Stunde, mit Zitratpuffer (0,1% SDS w/v, 30 mM Natriumzitrat, 0,3 M NaCl, eingestellt auf pH 7,0 mit HCl) bei 58°C für 1 Stunde und luftgetrocknet auf Löschpapier. Die Hybridisierungen wurden dann bewertet durch Aussetzen der Filter in einer –70°C Gefrierkammer, einem Kodak X-Ornat® AR Film über Nacht, unter Verwendung eines intensivierenden Schirms und durch nachfolgende Entwicklung und Analyse des Films.
- Beispiel 2
- Identifikation von bevorzugten Endotoxin-Kombinationen
- B. Thuringiensis δ-Endotoxin-Gene, die in Zusammenhang stehen mit der Toxizität gegen Zuckerrübeneule und asiatischen Baumwollwurm und die Kohlschabe wurden wie folgt identifiziert: verschiedene Beobachtungen von unterschiedlicher Toxizität gegen Spodoptera exiqua und Trichoplusia ni. auf dem Teil der B. Thuringiensis HD-1-Varianten führte zu der Entdeckung, dass der Verlust eines Toxin-Genes, wie bestimmt durch den Southern Blot in signifikant reduzierten Spodopera Tötungen resultierte. Der Verlust des entsprechenden Genes, später identifiziert als crylA(b) wurden bestätigt, durch die Southern Blot Analyse. Unabhängig davon, wurden klonierte cryIA(b) und cryIA(c)-Gene in Escherichia Coli exprimiert, woraus isolierte Granulate und Extrakte hergestellt wurden, welche ebenso eine ausgeprägte differenziert Toxizität gegen diese Schädlings-Spezies zeigten. Zusammen legen die Studien nahe, dass das cryIA(b)-Gen wesntlich ist, für die Toxizität, aber dass das cryIA(c) insgesamt unnötig sein könnte.
- Ein Derivat-Stamm von B. Thuringiensis HD-1 wurde dann hergestellt durch heiß-vulkanisieren und gereinigte Kristalle von diesem Stamm wurden auf ihre Toxizität gegen Larven von S. frugiperda und T. ni. untersucht. Der Derivat-Stamm, der die cryIA(a) und cryIA(b)-Gene enthielt, aber dem cryIA(c) fehlte, zeigte eine im wesentlichen verbesserte Wirksamkeit gegen S. frugiperda. Dementsprechend wurden genspezifische DNA-Sonden für cryIA(a), cryIA(b) und cryIA(c) hergestellt und verwendet, um B. Thuringiensis-Bodenisolate für Varianten, welche ein identisches Gen-Komplement besitzen, zu screenen.
- Ungefähr 20 solcher Varianten wurden identifiziert und einem Bio-Assay unterworfen, für die Wirksamkeit gegen S. frugiperda. Ein Stamm, insbesondere bezeichnet als ABTS 5803, wurde identifiziert als hoch wirksam, wobei er zweimal die Toxizität zeigte, gegen die Spezies, wie den Referenz-Stamm HD- 1. Der Stamm ABTS 5803 wurde deshalb analysiert durch Behandlung mit einer generalisierten Sonde, die gestaltet war, nach einer konservierten Region des dann bekannten B. Thuringiensis Endotoxin-Genes und es wurde herausgefunden, unter Verwendung von Southern-Analyse, dass der Stamm zwei neue Gene zusätzlich zu cryIA(a) und cryIA(b) enthält. Nach der Klonierung und der Sequenzierung wurden diese Gene identifiziert als cryIC und cryID. Weitere Studien unter Verwendung von Plasmid-heiß-Vulkanisation zeigten, dass die auf mindestens 3 separaten Plasmiden befindlich sind, wobei cryIC und cryID zusammen befindlich sind, wenn nicht angrenzend. Von Derivaten von ABTS, denen ein oder mehrere dieser Gene fehlten, wurde herausgefunden, dass sie verminderte Toxizitäten besitzen; dementsprechend wurde die Kombination von Genen cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID (außer von cryIA(c)) gewählt zur Verwendung im nachfolgenden Pre-Screening.
- Beispiel 3
- Identifikation von B. Thuringiensis-Varianten und Herstellung von Stamm-ABTS 1857
- Ein bakterielles Isolat, das repräsentativ ist für die vorliegende Erfindung, wurde folgendermaßen erhalten: Unter Verwendung von genspezifischen Sonden für die obige Kombination von vier Endotoxin-Genen, wurden B. Thuringiensis-Einzel-Kolonie- Boden-Isolate pre-gescreent, bis ungefähr 100 Varianten, welche diese Gene besitzen, identifiziert wurden. Diese wurden dann wieder auf ihre Wirksamkeit gegen S. frugiperda getestet. Von einer Variante, die aus Erde isoliert wurde, welche in Ephriam, Wisconsin gesammelt wurde und die identifiziert wurde als Stamm-ABTS 5686, wurde herausgefunden, dass sie eine überlegene Wirksamkeit verglichen mit allen anderen besitzt und dass sie einen Toxin/Sporen-Komplex produziert, der dreimal die Toxizität gegenüber S. frugiperda des Referenzstammes B. Thuringiensis HD-1 besitzt.
- Wiederum, unter Verwendung von genspezifischen Sonden, wurde die Genotyp-Reinheit von Stamm ABTS 5686 bestätigt, indem Einzel-Kolonie-Isolate dieses Stammes geprüft wurden auf ihre Einbehaltung aller vier gewünschten Endotoxin-Gene und daher aller Gen-tragenden Plasmide. Dreiunddreissig Kolonien mit einem vollen und daher scheinbar stabilen Gen-Komplement wurden gepoolt und wieder bezeichnet als Stamm ABTS 1857. Die weitere Prüfung der Plasmid-Stabilität bei 34°C (anstatt der üblichen Kultur-Temperatur von 28°C) bestätigte die Stabilität des Genomes, wobei ein cryIA(b)-Gen-Verlust von nur 2% über 72 Stunden bei dieser erhöhten Temperatur auftrat. B. Thuringiensis-Stamm ABTS 1857 wurde dann noch vollständiger charakterisiert und auf die pestizide Wirksamkeit wie unten beschrieben, getestet.
- Beispiel 4
- Charakterisierung von B. Thuringiensis ABTS 1857
- Unterschiedliches Wachstum und metabolische Charakteristika von B. Thuringiensis ABTS 1857 wurden bewertet in Übereinstimmung mit Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, 1986, pp. 1104–1129, mit Abweichungen von diesem Verfahren wie unten angegeben. Die folgenden Charakteristika (in denen X = positiv, 0 = negativ, V = variabel und T = Spurantwort) wurden festgestellt:
Zelldurchmesser > 1,0 Micron X runde Sporen 0 geschwollenes Sporangium 0 Parasporal-Kristalle X Katalase X anaerobes Wachstum X Voges-Proskauer-Test X pH in V-P Brühe < 6,0 X Säure von D-Glucose X L-Arabinose V D-Xylose V D-Mannitol V Gas aus Glucose 0 Hydrolyse von Kasein X Gelatine X Stärke X Verwendung von Zitrat X Proprionat X Abbau von Tyrosin 0 Desaminierung von Phenylalanin 0 Eidotter Lezithinase X Nitrat reduziert zu Nitrit X Bildung von Indol 0 Dihydroxyaceton 0 NaCl und Kcl erforderlich 0 Allatoin oder Urat erforderlich 0 Wachstum bei pH 6,8 Nährstoffbrühe X 5,7 X Wachstum in NaCl (%) 0 X 2 X 5 X 7 0 10 0 Wachstum bei (°C) 5 0 10 T 15 X 20 X 25 X 30 X 35 X 40 X 45 X 50 X 55 0 Wachstum mit anwesendem Lysozym X autotroph mit H2 und CO2 0 - Bei der Detektion von Lezithinase wurde ein festes Agar-Med.ium verwendet anstelle des flüssigen Mediums, dass in Bergey oben empfohlen wird, so dass die Einschätzung der Lezithinase-Produktion präziser war. Für die auxotrophe Wachstumsanalyse wurden Gaspak-Behälter und Gas-Generatoren (BBL) verwendet, um eine geeignete Gas-Umgebung bereitzustellen und das Wachstum wurde bewertet nach 3 und 6 Tagen an Inkubation von 20–30°C.
- Die antibiotischen Empfindlichkeiten waren, wenn sie durch die Kriterien von S.O.P. 047T-12-034A des National Committee for Clinical Laboratory Standards gemessen wurden, und zwar relativ zu der Antwort des Kontroll-Organismus Staphylococcus aureus, folgendermaßen (worin R = resistent und S = empfindlich):
Gentamycin S Kanamycin S Erythromycin S Clindamycin S Penicillin R Ampicillin R Cephalothin R Vancomycin S Chloramphenicol S Trimethoprim/ Sulfamethoxazol S - Beispiel 5
- Herstellung von Plasmid-Profilen
- Ein Plasmid-Profil von B. Thuringiensis-Stamm ABTS 1857 wurde erhalten unter Verwendung eines, Verfahrens, das von Gryczan et al., (1978) übernommen wurde, wie es modifiziert wurde durch Shivakumar et al. (1986) und verglichen mit Profilen von B. Thuringiensis kurstaki HD-1 und mit zwei Typen von Stämmen von B. Thuringiensis subsp. aizawai, HD-11 und HD-133, wie folgt: Kulturen der Stämme wurden in 50 ml Polypropylen-Zentrifugen-Röhrchen gezüchtet, welche 20 ml LB enthielten, für ungefähr 16 Stunden bei 28°C unter Schütteln (250 U/Min). Die Zellen wurden geerntet durch Zentrifugation bei 4800 × g für 10 Minuten bei 4°C und zweimal mit 1 ml TES-Puffer gewaschen (30 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 40 mM NaCl) bevor sie in einer Mikro-Zentrifuge nach jeder Waschung pelletiert wurden. Der Überstand wurde abgezogen und die Pellets wurden in 180 μl Saccharose Medium re-suspendiert (25% Saccharose, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,5). Die Proben wurden sorgfältig gemischt und 20 Ml Lyozym (50 mg/ml in Saccharose Medium) wurde hinzugefügt ohne weiteres Mischen. Nach der Inkubation bei 37°C für eine Stunde wurden die Zellen lysiert, durch Hinzufügen von 48 μl 5 M NaCl, 12 μl 0,5 M EDTA und 260 μl 2% SDS in 0,7 M NaCl zu jeder Probe und langsames Mischen, indem die Röhrchen zweimal gedreht wurden, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 10 Minuten bei 68°C. Die Proben wurden dann 1 Stunde in einem Eisbad abgekühlt und die chromosomale DNA und die Zellen-Debris wurde durch Mikro-Zentrifugation für 15 Minuten, während eine Temperatur von 4°C aufrechterhalten wurde, entfernt. Ungefähr 300 μl des Überstandes wurden vorsichtig von jeder Probe mit einer abgestumpften Eppendorf-Pipetten-Spitze entfernt, wobei sie gegen den Kontakt mit der Probengrenzfläche geschützt wurde, um das Zerreissen der DNA zu vermeiden und wurden in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführt.
- Die Proben wurden dann behandelt mit 33 μl 3 M Natrium acetat und 670 μl Ethanol bei 4°C, um die Plasmid-DNA auszufällen und wurden bei –20°C für 18 Stunden gehalten, bevor sie bei 4°C für 15 Minuten mikrozentrifugiert wurden. Das Ethanol wurde dekantiert und die Röhrchen-Enden wurden trockengetupft und die Pelltes wurden durch Zentrifugation unter Vakuum für 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Jedes Pellet wurde dann mit 200 μl TES-Puffer bedeckt und ungestört für 15 Minuten stehen gelassen, bevor es durch vorsichtiges Pipettieren unter Verwendung einer stumpfen Eppendorf-Pipetten-Spitze und durch einen kurzen Schlag mit einer Fingerspitze re-suspendiert wurde. 2 μl jeweils von RNase A (10 mg/ml) und T1 RNase (100 U/ml) wurden zu jeder Probe hinzugefügt und die Proben wurden in einem 37°C Wasserbad für eine Stunde inkubiert. Nachdem 20 μl Proteinase K (10 mg/ml) hinzugefügt wurde, wurde jede Probe für zusätzliche 2 Stunden inkubiert.
- Die Proteasen wurden von den Proben durch Phenol-Extraktion entfernt, unter Verwendung von 200 μl gepuffertem Phenol (8-Hydroxychinolon, hinzugefügt zu 0,1%; extrahiert mit einer Waschung von 1 M Tris, pH 8 und zwei Waschungen von 0,1 M Tris, pH 8, um einen pH von 7,6 einzustellen) und kurzes Mischen für 10 Sekunden. Jede Probe wurde dann für 3 Minuten mikrozentrifugiert und die wässerige Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt. Ein gleiches Volumen (200 μl) Chloroform Isoamylalkohol (24 : 1 v/v) wurde hinzugefügt und die Proben wurden gemischt und zentrifugiert wie zuvor. Die wässerige Phase wurde entfernt und wiederum ausgefällt, durch die Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (29 μl) und 2,5 Volumenanteile Ethanol (0,5 ml) bei 4°C, und die Proben wurden bei –20°C für eine Stunde gehalten. Die Proben wurden dann pelletiert, getrocknet und in TES-Puffer re-suspendiert wie zuvor.
- Gel-Trennungen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Pulsewave® 760 Switchers (Bio-Rad) und Brücken-Typ-Gel-Betten, 10 × 15 cm, welche an jedem Ende mit 1,5% Agarose, hergestellt in TBE-Puffer (8 mM Trisbase, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3), zugestöpselt. Die Agarosegels (0,8%), hergestellt in TBE-Puffer, wurden zu einer Tiefe von ungefähr von 4 mm eingegossen und mit 1,5 × 7 mm Gel-Kämmen eingepasst. Die Gele, welche bei 4°C gehalten wurden, wurden laufen gelassen bei 80 V für eine Stunden und wurden dann mit Plastikfilm bedeckt und die V-Zahl wurde auf 50 V für 26 Stunden abgesenkt. Die Wellenform-Parameter waren "Feld-Inversion, Normal-Durchlauf" mit einer anfänglichen A-Zeit von 9 Sekunden und einer End-A-Zeit von 60 Sekunden. Das Startverhältnis war 3 und die Durchlaufzeit wurde auf 26 Stunden festgesetzt.
- Die abgeschlossenen Gels wurden mit ungefähr 0,6% Ethidium-Bromid für 30 Minuten befleckt und für 15 Minuten in Wasser entfleckt, bevor sie fotographiert wurden mit Hintergrundbeleuchtung unter kurzwelligem UV-Licht. Eine Kombination von zwei Tiffen® Filtern (25-rot und-l6-orange) wurde verwendet, mit einem Polaroid 667 Film, der 20 Sekunden bei f22 ausgesetzt wurde.
- Das resultierende Plasmid-Profil von Stamm ABTS 1857 ist in der
1 als Spur 3 gezeigt, wobei die Spur 1 Molekulargewicht-Marker enthält, welche die angegebenen relativen Molekulargewichte besitzen (in mDa). Die Plasmid-Profile von Stämmen HD-1, HD-133 und HD-11 sind als Spuren 2, 4 bzw. 5 gezeigt. Es wurde festgestellt im Fall von ABTS 1857, dass 5 Plasmid-Banden hinter die chromosomale Bande gewandert sind und 10 wanderten davor, wobei eine der 10 teilweise durch den chromosomalen Abstrich verdeckt wurde. Von den übrigen 9 wanderten 2 nahe zusammen als ein Dublette. Es wurde beobachtet, dass das Plasmid-Profil von ABTS 1857 eindeutig war und sich klar von denjenigen der 3 Referenzstämme unterscheidbar war. - Beispiel 6
- Wirksamkeit von B. Thurinaiensis ABTS 1857 gegen Ziel-Schädlinge
- Gewächshaus- und Feldtests wurden durchgeführt, um die Effizienz eines bakteriellen Isolates der Erfindung bei der Bekämpfung von Signifikanten Lepidoptera-Insekten-Schädlingen von Pflanzenfrüchten zu bestimmen und insbesondere die Schädlinge Plutella xylostella (getestet im Feld) und Spodoptera exigua (getestet im Gewächshaus, nachdem jede Pflanze mit 20 zweiten-Instar, Labor-gezüchteten Larven künstlich befallen wurde). Eine Vielzahl an Früchten-Spezies wurde verwendet. Das Isolat, B. Thuringiensis ABTS 1857, wurde hergestellt als ein Pulver mit technischer Qualität und wurde getestet, unter Verwendung von einem randomisierten Komplett-Block-Experiment-Design mit 6 bis 8 Wiederholungen. Standards zum Vergleich waren ein B. Thuringiensis kurstaki HD-1 technisches Pulver, hergestellt in identischer Art und Weise und DiPel® 2X WP (Abbott), ein kommerzielles B. Thuringiensis-Pestizid. Die Pestizid-Zubereitungen wurden in dem Gewächshaus mit einem Airbrush-Sprayer bei Geschwindigkeiten im Bereich von 0,5 bis 4,8 mg/ml aufgebracht (wobei jede Pflanze 2 ml Spray erhielt) und in dem Feld mit einem CO2-Druck-Backpack-Sprayer bei Geschwindigkeiten von 0,125 bis 1,0 Pfund pro Acre, ausgedrückt in jedem Fall als technische Pulver-Equivalente.
- Die Wirksamkeiten der Zubereitungen wurden bewertet, basierend auf der Insektenlarven-Mortalität nach der Behandlung oder auf der Populationsreduktion, und die Einschätzungen des Ernteschadens waren entsprechend. Die Daten wurden nicht früher als 3 Tage nach der Behandlung aufgezeichnet und typischerweise bei 5 bis 7 Tagesintervallen, wo vielfache Anwendungen in saisonbedingten Versuchen ausgeführt wurden. Repräsentative Ergebnisse dieser Tests sind unten in der Tabelle 1 gezeigt, worin die Entblätterung auf einer Skala von 0 bis 4gemessen wurde, wobei 4 die komplette Entblätterung ist. Tabelle 1
- Diese Daten zeigen, dass der Teststamm, ABTS 1857, eine signifikant verbesserte Wirksamkeit gegen Pyrethroid- unc. B. Thuringiensis-resistente Kohlschabenlarven und Zuckerrübeneulen besitzt, verglichen mit dem HD-1 Standarstamm. Zusätzlich wurde von dem Teststamm herausgefunden, dass er einen kommerziell verträglichen Ernteschutz gegen nicht-resistente Kohlschaben, cabbage looper und importierten cabbage worm bereitstellt, wogegen er eine Wirksamkeit zeigt, die mindestens gleich war zu der von Standard B. Thuringiensis-Produkten.
- Die Isolate und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind oben beschrieben in Verbindung mit B. Thuringiensis-Stämmen, welche prinzipiell von der Subspezies kurstaki und aizawai sind. Es sollte jedoch bemerkt werden, dass die Techniken, welche hierin offenbart sind, anwendbar sind, für die Identifikation und die Verwendung von neuen B. Thuringiensis-Isolaten jeden Typs oder Serovariante.
Claims (16)
- Ein bakterielles Isolat von Bacillus thuringiensis, welches eine Kombination von Genen besitzt, die cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID einschließt, die für B. thuringiensis δ-Endotoxin-Proteine kodieren und als solche exprimiert werden, worin das Isolat gekennzeichnet ist durch das Plasmid-Profil, welches in
1 , Spur 3 gezeigt ist, verglichen mit dem Molekulargewichtmarker und den Plasmid-Profilen von Stämmen HD-1, HD-133, HD-11, welche in1 , Spuren 1, 2, 4 beziehungsweise 5 gezeigt sind, erhalten durch Gel-Elektrophorese auf einem Agarose 0,8%-Gel in TBE-Puffer, unter Verwendung eines Pulsewave® 760 Switchers, worin das Gel bei 4°C gehalten wurde, durchgeführt bei 80 V für eine Stunde, bedeckt mit einem Plastikfilm und durchgeführt bei 50 V für 26 Stunden, wobei die Wellenform-Parameter der Feldinversion des Normaldurchgangs eine Anfangs-A-Zeit von 9 Sekunden und eine End-A-Zeit von 60 Sekunden besitzen und worin das Startverhältnis 3 war und die Durchführungszeit 26 Stunden betrug. - Ein bakterielles Isolat gemäß Anspruch 1, dem das cryIA(c) Gen fehlt.
- Ein bakterielles Isolat gemäß Anspruch 1, wobei das Isolat gewählt ist aus B. thuringiensis Stämmen durch Mittel, welche ein Pre-Screening für die Anwesenheit dieser Kombination von Genen einschließen.
- Ein bakterielles Isolat gemäß Anspruch 1, das wirksam ist gegen einen Schädling, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Spodoptera frugiperda, S. exigua, Plutella xylostella und Trichoplusia ni.
- Ein bakterielles Isolat gemäß Anspruch 1, das zu der B. thuringiensis subspecies aizawai gehört.
- Ein bakterielles Isolat, worin dieses Isolat B. thuringiensis ATCC 69074 ist, oder ein Mutant, ein rekombinates oder genetisch hergestelltes Derivat davon, das die Identifikationscharakteristika, wie in Anspruch 1 beschrieben, besitzt.
- Eine biologisch reine Kultur eines Isolates gemäß Anspruch 1.
- Eine biologisch reine Kultur gemäß Anspruch 7, worin das Isolat die Identifikationscharakteristika des B. thuringiensis Stammes wie in Beispiel 4 beschrieben besitzt.
- Eine biologisch reine Kultur von B. thuringiensis ATCC 69074 oder ein Mutant, ein rekombinates oder genetisch hergestelltes Derivat davon, das die Identifikationscharakteristika, wie in Anspruch 1 beschrieben, besitzt.
- Ein Verfahren zum Erhalten eines Isolates von B. thuringiensis gemäß Anspruch 1, das folgendes umfasst: (a) Isolieren von Isolaten aus B. thuringiensis Stämmen, welche die Kombination von cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID Genen enthalten, welche für δ-Endotoxin-Proteine kodieren und als solche exprimiert werden, worin die Genome dieser Stämme zuerst mit einer markierten generalisierten Sonden in Kontakt gebracht werden, die in der Lage ist an jedes dieser Gene zu hybridisieren und wobei die markierte Sonde, welche an die Gene hybridisiert ist, detektiert wird, und (b) Screenen der Isolate, welche dieses Plasmid-Profil besitzen.
- Eine Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die generalisierte Sonde folgendes ist:(SEQ ID NR: 1) oder Fragmente davon, welche ausreichend sind in der Länge für eine spezifische Hybridisierung mit den B. thuringiensis Gen Sequenzen cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID, welche für δ-Endotoxin-Proteine kodieren.
- Ein Verfahren zum Erhalten eines Isolates von B. thuringiensis gemäß Anspruch 1, das folgendes umfasst: (a) Isolieren von Isolaten aus B. thuringiensis Stämmen, welche die Kombination von cryIA(a), cryIA(b), cryIC und cryID Genen enthalten, welche für δ-Endotoxin-Proteine kodieren und als solche exprimiert werden, worin die Genome dieser Stämme mit einem Set von markierten genspezifischen Sonden in Kontakt gebracht werden, die jeweils in der Lage sind an ein unterschiedliches dieser Gene zu hybridisieren und wobei die markierten Sonden, welche an die Gene hybridisiert sind, detektiert werden, und (b) Screenen der Isolate, welche dieses Plasmid-Profil besitzen.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die genspezifischen Sonden folgendes sind:(SEQ ID NR: 2) zur Identifikation des cryIA(a) Genes;
(SEQ ID NR: 3) zur Identifikation des cryIA(b) Genes;
(SEQ ID NR: 5) zur Identifikation des cryIC Gens; und
(SEQ ID NR: 6) zur Identifikation des cryID Gens, oder Fragmente davon, welche ausreichend sind in der Länge für eine spezifische Hybridisierung mit dem Gen.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 13 zum Erhalten eines Isolates, dem das cryIA(c) Gen fehlt, worin die Gen-spezifischen Sonden folgendes einschließen:(SEQ ID NR: 4) zur Identifikation des cryIA(c) Gens, wobei das Fehlen der Detektion von markierter SEQ ID NR: 4 bedeutet, dass diesem Isolat das cryIA(c) Gen fehlt.
- Eine Zusammensetzung, welche eine Insektizid wirksame Menge eines bakteriellen Isolates gemäß Anspruch 1 umfasst, oder die Kombination von Endotoxinen, welche daraus erhalten werden, in Kombination mit einem verträglichen Träger.
- Ein Verfahren zur Schädlingsbekämpfung, welches das Anbringen auf eine heimgesuchte Fläche einer Insektizid wirksamen Menge eines bakteriellen Isolates gemäß Anspruch 1 oder der Kombination von Endotoxinen, welche daraus erhalten werden, umfasst.
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