DE69630366T2

DE69630366T2 - PESTIZIDE ZUSAMMENSETZUNG UND Verfahren

Info

Publication number: DE69630366T2
Application number: DE69630366T
Authority: DE
Inventors: Chi-Li Liu; L. Robert STARNES; M. Anita MACMULLAN; C. Denise MANKER; A. Patricia LUFBURROW
Original assignee: Valent BioSciences LLC
Current assignee: Valent BioSciences LLC
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2016-03-13
Also published as: ES2210358T3; WO1996028031A1; PL184858B1; PL322250A1; CA2215159A1; EP0814663A1; AU708075B2; JP4150071B2; BR9607202A; CZ291438B6; CZ275997A3; JPH11502107A; DE69630366D1; ZA961747B; EP0814663B1; AU5421696A; ATE251842T1; KR19980703109A; MX9707017A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung offenbart einen Stamm von Bacillus Thuringiensis, in dem im Wesentlichen die gesamte pestizide Wirksamkeit dieses Stammes in dem Überstand einer Fermentation dieses Stammes ist. Der Stamm produziert eine Substanz, welche eine Wirksamkeit besitzt gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera und der die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus verwandten Pestizids verstärkt. Die Erfindung bezieht sich auf pestizide Zusammensetzungen, die die Substanz, einen pestiziden Träger und ein unterschiedliches Bacillus verwandtes Pestizid umfassen, ebenso wie auf Verfahren zum Erhalten einer solchen Substanz und zur Verwendung der pestiziden Zusammensetzungen, um einen Schädling zu bekämpfen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Verstärken der pestiziden Wirksamkeit eines unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizids, das das Kombinieren der Substanz und des Pestizids umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Jedes Jahr werden signifikante Teile der kommerziell wichtigen landwirtschaftlichen Früchte der Welt, einschließlich Nahrungsmitteln, Textilien und unterschiedlichen häuslichen Pflanzen an den Schädlingsbefall verloren, was zu Verlusten in Höhe von Millionen von Dollar führt. Verschiedene Strategien wurden verwendet beim Versuch, solche Schädlinge zu bekämpfen.
Eine Strategie ist die Verwendung von Breitspektrum-Pestiziden, d. h. chemischen Pestiziden mit einem breiten Bereich an Wirksamkeit. Jedoch gibt es eine Anzahl an Nachteilen bei der Verwendung solcher chemischer Pestizide. Genau gesagt können diese Pestizide wegen ihres breiten Wirkungsspektrums nicht-Ziel-Organismen zerstören, wie zum Beispiel nützliche Insekten und Parasiten von zerstörerischen Schädlingen. Zusätzlich sind diese chemischen Pestizide häufig toxisch für Tiere und Menschen und angezielte Schädlinge entwickeln häufig eine Resistenz, wenn sie wiederholt solchen Substanzen ausgesetzt werden.
Eine andere Strategie hat die Verwendung von Biopestiziden eingeschlossen, welche natürlich vorkommende Pathogene verwenden, um Insekten, Pilz- und Weed-Befälle von Früchten zu bekämpfen. Biopestizide umfassen ein Bakterium, welches ein Toxin produziert, eine Substanz, die für den Schädling toxisch ist. Biopestizide sind allgemein weniger schädlich gegenüber nicht Ziel-Organismen und der Umwelt insgesamt als chemische Pestizide.
Das am weitest verbreitet verwendete Biopestizid ist Bacillus Thuringiensis (B.t.). B.t. ist ein weit verbreiteter, stäbchenförmiger, aerober und sporenbildender Mikroorganismus. Während seines Sporulations-Zyklus produziert B.t. (ein) Protein(e), das/die bekannt ist/sind als (ein) kristallines) Delta-Endotoxin(e), welche(s) Insektenlaren tötet/n. Deshalb ist B.t. sehr nützlich als ein landwirtschaftliches Pestizid.
Es wurde herausgefunden, dass einige Stämme, zum Beispiel Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki und Bacillus Thuringiensis subsp. aizawai, spezifisch sind für Lepidoptera. Von Bacillus Thuringiensis subsp. israelensis wurde herausgefunden, dass er spezifisch ist für Diptera (Goldberg, U.S. Patent Nr. 4,166,112). Von anderen Stämmen, zum Beispiel Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg et al., 1988, U.S. Patent Nr. 4,766,203), wurde herausgefunden, dass er spezifisch ist für Coleoptera. Die Isolation von einem anderen Coleoptera toxischen Bacillus Thuringiensis Stamm wurde 1986 berichtet (Hernnstadt et al., Bio/Technology vol. 4, 305–308, 1986, U.S. Patent 4,764,372, 1988). Dieser Stamm, bezeichnet als "Bacillus Thuringiensis subsp. san diego" M-7, wurde beim Northern Regional Research Laboratory, USA unter der Zugriffsnummer NRRL B-15939 hinterlegt. Jedoch hat der Inhaber des '372 Patents, Mycogen, Corp., öffentlich zugegeben, dass Bacillus Thuringiensis subsp. san diego Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis ist. Des Weiteren wurde das '372 Patent Novo Nordisk A/S zugesprochen. Zusätzlich wurde ein B.t. Stamm offenbart, welcher toxisch ist gegen Lepidoptera und Coleoptera (PCT Anmeldung Nr. WO90/13651). Das Toxin, das in der PCT Anmeldung Nr. WO90/13651 offenbart ist, hat ein Molekulargewicht von 81 kd.
Während seines Sporulations-Zyklus produziert B.t. ein Protein in Kristallform, welches als ein kristallines Delta-Endotoxin bekannt ist, das ein Molekulargewicht im Bereich von 27 bis 140 kd hat, welches nach der Verdauung Insektenlaren tötet. Eine toxische Wirksamkeit kann in einem oder mehrerer solcher Delta-Endotoxine in einem gegebenen B.t. Stamm liegen. Die meisten Delta-Endotoxine sind Protoxine, welche proteolytisch in kleinere toxische (abgestumpfte) Polypeptide in Ziel-Insekten-Magen umgewandelt werden (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242–255). Die Delta-Endotoxine werden kodiert durch cry (crystal protein) Gene. Die cry Gene wurden unterteilt in sechs Klassen und unterschiedliche Unterklassen, basierend auf strukturellen Ähnlichkeiten und der pestiziden Spezifität. Die Hauptklassen sind Lepidoptera spezifisch (cryI); Lepidoptera- und Diptera spezifisch (cryII); Coleoptera spezifisch (cryIII); Diptera spezifisch (cryIV) (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242–255); Coleoptera- und Lepidoptera spezifisch (bezeichnet als cryV Gene, durch Tailor et al., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211–1217); und Nematoden spezifische (bezeichnet als cryV und cryVI, durch Feitelson et al., 1992; Bio/Technology 10: 271–275) Gene.
Delta-Endotoxine wurden durch rekombinante DNA Verfahren produziert. Die Delta-Endotoxine, welche durch rekombinante DNA Verfahren produziert wurden, können in Kristallform sein oder nicht.
B.t. Delta-Endotoxin ist Wasser-unlöslich, außer bei alkalischem pH und wird fast immer Plasmid-kodiert. Einige Stämme von Bacillus Thuringiensis haben gezeigt, dass sie ein Hitze-stabiles pestiziden Adenin-Nukleotid-Analog produzieren, bekannt als β-Exotoxin oder Thuringiensin, welches selbst Pestizid ist (Sebesta et al., in H. D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests ans Plant Diseases, Academic Press, New York p. 249–284, 1981). Es wurde herausgefunden, dass β-Exotoxin in dem Überstand von einigen Bacillus Thuringiensis Kulturen ist. Es hat ein Molekulargewicht von 789 und ist zusammengesetzt aus Adenosin, Glucose und Allarinsäure (Lüthy et al., in Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp. 35–72). Sein Wirts-Bereich schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, musca domestica, mamestra configurata Walker, tetranychus urticae, Drosophila melanogaster und tetranychus cinnabarinus. Von der Toxizität von β-Exotoxin wird geglaubt, dass sie begründet ist in der Inhibition von DNA gerichteter RNA Polymerase durch einen Wettbewerb mit ATP. Es wurde gezeigt, dass β-Exotoxin kodiert wird, durch ein cry Plasmid in fünf Bacillus Thuringiensis (B.t.) Stämmen und das β-Exotoxin klassifiziert werden kann als Typ I oder Typ II β-Exotoxin (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172–3179). Es wurde herausgefunden, dass β-Exotoxin Typ I produziert wird, durch B.t. subsp. Thuringiensis Serotyp 1, B.t. subsp. tolworthi Serotyp 9 und B.t. subsp. Darmstadiensis Serotyp 10. Es wurde herausgefunden, dass β-Exotoxin Typ II produziert wird, durch B.t. subsp. morrisoni Serotyp 8ab und das es wirksam ist gegen leptinotarsa decemlineata (Colorado potato beetle). Andere Wasser-lösliche Substanzen, welche isoliert wurden aus B.t. schließen Alpha-Exotoxin ein, welches toxisch ist gegen die Larven von musca domestica (Lüthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1–7); Gamma-Exotoxine, welche verschiedenartige proteologische Enzyme sind, einschließlich Lecithinasen, Chitinasen und Proteasen, wobei die toxischen Effekte dieser nur in Kombination mit β-Exotoxin oder Delta-Endotoxin ausgebildet werden (Forsberg et al., 1976, Bacillus Thuringiensis: Its Effects in Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); Sigma-Exotoxin, welches eine Struktur hat, die ähnlich ist zu β-Exotoxin und welches ebenfalls wirksam ist gegen leptinotarsa decemlineata (Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206–213) und Anhydrothuringiensin (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775, 1975).
Asano, S. et al., Appl. Entomol. Zool. 29(1): 39–45 (1994) schlagen vor, dass der Überstand von Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 Kultur irgend einen Faktor enthalten könnte, welcher die Toxizität verstärkt, die spezifisch ist, für spodoptera litura.
EP-A-0 750 682, welche Strukturen offenbart, die mit der vorliegend offenbarten Struktur I überlappen, zum Verstärken der pestiziden Wirksamkeit eines Bacillus verwandten Pestizids, ist gemäß Artikel 54 (3) und (4) EPC Stand der Technik. Jedoch wurde auf der EP-A-0 750 682 nicht Finnland benannt.
WO94/09630 offenbart eine Wasser-lösliche Substanz, welche die Wirksamkeit von Bacillus Thuringiensis var. kurstaki und Bacillus Thuringiensis var. aizawai verstärkt.
Stonard et al. (1994, In Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, eds., ACS, Washington, D.C., pp. 25–36) offenbaren Diabroticine mit der Struktur

1 R, R₁, R₂=H, R₃=OH Diabroticin A
2 R, R₁, R₂, R₃=H Diabroticin B

Diabroticine wurden isoliert aus B. subtilis und sie haben eine Wirksamkeit gegen diabrotica undecimpunctata, leptinotarsa decemlineata, anthomus grandis Boheman, Moskitolarven, staphylococcus aureus und micrococcus lutea, aber sie hatten keine Wirksamkeit gegen European corn borer, escherichia coli, B. subtilis und pseudomonas aeruginosa. Eine Wirksamkeit gegen andere Schädlinge wurde nicht offenbart in Stonard et al. Diabroticin A wurde ebenfalls isoliert aus den Fermentationsbrühen von B. cereus.
Der Stand der Technik hat sich bemüht, eine erhöhte Mortalität von B.t. Formulierungen zu erreichen. Die Mittel haben die Suche für neue Stämme eingeschlossen, mit einer erhöhten Mortalität, das Verarbeiten von vorliegenden Stämmen und das Bezeichnen von effektiveren Formulierungen durch Kombination von B.t. Storen und/oder Kristallen mit neuen pestiziden Trägern oder mit chemischen Pestiziden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Insektizide Wirksamkeit von bekannten B.t. Formulierungen zu verbessern.
Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die pestizide Wirksamkeit von Pestiziden zu verstärken, ebenso wie neue Verwendungen für bekannte pestizide Produkte zu finden.
Es ist vorteilhaft, neue Stämme von Bacillus Thuringiensis zu isolieren, um neue Substanzen zu produzieren, damit es ein breiteres Spektrum von Biopestiziden für jeglichen gegebenen Schädling gibt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung verwendet einen Bacillus Thuringiensis Stamm, in welchem im Wesentlichen die gesamte pestizide Wirksamkeit dieses Stammes in dem Überstand einer Fermentation von diesem Stamm ist. Kristallines Protein und Sporen, die aus einer Fermentation eines Bacillus Thuringiensis Stamms erhalten werden, der hierin offenbart ist, besitzen keine pestizide Wirksamkeit. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Stamm gewählt aus der Gruppe bestehend aus EMCC-0077, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21090 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0077 haben, EMCC-0078, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21091 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0078 haben, EMCC-0079 mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21092 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0079 haben, EMCC-0080, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21093 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0080 haben und EMCC-0081, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21094 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0081 haben.
Eine Substanz, welche pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera besitzt und die zusammen als, beispielsweise, ein Potenziator oder synergistisches Mittel mit einem unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizid gegen einen Schädling wirkt, wird erhalten aus einem Überstand einer Fermentation dieses Stammes. Eine solche Substanz wird unten definiert in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung. In einem bevorzugten Ausführungsform hat diese Substanz eine LC₅₀ (LC₅₀ ist die Konzentration einer gegebenen pestiziden Substanz, die erforderlich ist, um 50 Prozent der Schädlinge zu töten) von 126 μg an aktivem Inhaltsstoff pro Gramm an Gesamtmaterial gegen Leptinotarsa texana. Die LC₅₀ des Pellets der Fermentation dieses Stammes ist mehr als ungefähr 3000 μg an aktivem Inhaltsstoff pro Gramm des Gesamtmaterials, wie durch einen Bioassay bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform hat diese Substanz eine pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera. In einer am meisten spezifischen Ausführungsform hat diese Substanz pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Spezies Diabrotica undecimpunctata, Leprinotarsa texana, Anthomus grandia, ebenso wie eine überraschende Wirksamkeit gegen einen Schädling der Spezies Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata und Dendroctonus frontalis der Ordnung Coleoptera.
In einer spezifischen Ausführungsform verstärkt diese Substanz die insektizide Wirksamkeit eines Bacillus Thuringiensis kristallinen Delta-Endotoxins) gegen (einen) Schädling(e). In einer spezifischen Ausführungsform verstärkt diese Substanz die insektizide Wirksamkeit von Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis kristallinem Delta-Endotoxin gegen (einen) Schädling (e) der Ordnung Coleoptera.
Wie hierin definiert ist ein "Bacillus verwandtes Pestizid" ein Bacillus (z. B. Bacillus Thuringiensis oder Bacillus Subtilis) Stamm oder Spore. Ein Bacillus verwandtes Pestizid kann ebenfalls eine Substanz sein, die von Bacillus abgeleitet ist, zum Beispiel ein Protein oder Fragment davon, das eine Wirksamkeit gegen Schädlinge hat oder sie tötet; eine Substanz, welche einen Pflanzenschutz bereitstellt, zum Beispiel eine Anti-Feeding-Substanz; oder ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Bacillus Gen zu exprimieren, das ein Bacillus Protein oder Fragment davon kodiert, das eine Wirksamkeit gegen Schädlinge hat oder sie tötet (zum Beispiel Bacillus Thuringiensis Delta-Endotoxin) und ein verträglicher Träger (siehe den nächsten Abschnitt über Zusammensetzungen). Der Schädling kann beispielsweise ein Insekt, eine Nematode, eine Milbe oder eine Schnecke sein. Ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Bacillus Gen zu exprimieren, das ein Bacillus Protein oder Fragment davon kodiert, das eine Wirksamkeit besitzt, gegen Schädlinge oder sie tötet, dass das Phylloplane beherbergt (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder das Rhizosphere (der Boden, der die Pflanzenwurzel umgibt) und/oder wässerige Umgebungen, erfolgreich in der speziellen Umgebung (Frucht oder andere Insekten-Habitate) mit den Wild-Typ-Mikroorganismen zu konkurrieren und eine stabile Aufrechterhaltung und Expression eines Bacillus Genes bereitzustellen, das ein Bacillus Protein oder Fragment davon kodiert, das eine Wirksamkeit besitzt, gegen Schädlinge oder sie tötet. Beispiele solcher Mikroorganismen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bakterien, zum Beispiel genera Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serraria, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azatobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, and Clostridium; algae, e. g., families Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae, and Chlorophyceae; and fungi, particularly yeast, e. g., genera Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, and Aureobasidium.
Wie hierin definiert, misst "die pestizide Wirksamkeit" die Menge an Wirksamkeit gegen einen Schädling durch Töten oder Abschwächen des Wachstums des Schädlings oder schützen der Pflanze vor einem Schädlingsbefall.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf pestizide Zusammensetzungen, welche die Substanz, ein unterschiedliches Bacillus verwandtes Pestizid und einen pestizid wirksamen Träger umfassen, ebenso wie auf Verfahren zur Verwendung der pestiziden Zusammensetzungen, um einen Schädling zu bekämpfen und auf Verfahren zum Verstärken der pestiziden Wirksamkeit eines unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizids durch Kombination mit der Substanz.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren gerichtet, zum Erhalten einer "im Wesentlichen reinen" Substanz der vorliegenden Erfindung, dass folgende Schritte umfasst:

(a) Kultivieren eines Bacillus Thuringiensis Stammes auf einem geeigneten Wachstumsmedium;
(b) Gewinnen des Überstandes von (a); und
(c) Isolieren der Substanz aus dem Überstand von Schritt
(b), wie zum Beispiel durch Unterwerfen des Überstandes einer Säulenchromatographie, um die Substanz zu reinigen.

Wie hierin definiert, bedeutet eine "im Wesentlichen reine" Substanz eine Substanz, welche weniger als 5 Prozent Kontami nanten enthält, zum Beispiel ein Delta-Endotoxin-Protein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden werden mit Bezug auf die folgende Beschreibung, die angehängten Ansprüche und die begleitenden Figuren, worin:
1 ein Synthese-Schema zum Erhalten der Struktur I zeigt.
2 zeigt die Wirksamkeit eines Ia/Ib und NOVODOR^TM Synergismus auf Leptinotarsa decemlineata.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erhalten der Substanz
Die Substanz kann erhalten werden aus dem Überstand einer Bacillus Thuringiensis Fermentation, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die B. T. Stämme EMCC-0077, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21090 oder Mutanten davon, welche im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0077 haben, EMCC-0078, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21091 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0078 haben, EMCC-0079 mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21092 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0079 haben, EMCC-0080 mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21093 oder Mutanten davon, welche im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0080 haben und EMCC-0081, mit den Identifikationscharakteristika von NRRLB-21094 oder Mutanten davon, die im Wesentlichen die selben Eigenschaften von EMCC-0081 haben.
Die Substanz hat eine Wirksamkeit gegenüber einem Schädling der Ordnung Coleoptera und wirkt zusammen mit einem unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizid als beispielsweise ein Potenziator oder synergistisches Mittel. Den Ausschlüssen in den angehängten Ansprüchen unterworfen, hat die Substanz die Struktur (I), Ia oder Ib, wie unten definiert.
worin
R₁ ein Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder eine Aminosäure ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl;
R₂ ist Amino oder Alkylen (C_1-10);
R₃ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (z. B. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methyl, Amin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat;
R₄ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (z. B. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat;
R₅ ist Wasserstoff, Methoxy, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10)Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy;
R₆ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy;
R₇ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphat, Sulfat; Acetat, Carbonat und Nitrat;
R₈ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat;
R₉ ist Amino oder Alkylen (C_1-10); und
R₁₀ ist Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder eine Aminosäure, einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl.
Die Pyrazin-Stickstoffe können wahlweise substituiert sein mit Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroyl (d. h. Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl oder Halobenzoyl)Ester oder Sauerstoff.
Es soll verstanden werden, dass die Erfindung sich auf jede der stereoisomeren Formen der Verbindungen von Struktur (I) ebenso wie auf Racemate erstreckt.
Die Substanz mit der Struktur Ia, hiernach bezeichnet als "Ia" oder Ib, hiernach bezeichnet als "Ib" ist:

Ia: R, R₁, R₂, R₃=H.
Ib: R, R₁, R₂=H, R₃=OH

Bacillus Thuringiensis kann kultiviert werden, unter Verwendung von Medien und Fermentationstechniken, die im Fachgebiet bekannt sind (siehe beispielsweise Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Path. 14: 122–129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353–358; Dulmage et al., in Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H. D. Burges, ed., Academic Press, N.Y., 1980). Nach der Vervollständigung des Fermentationszyklus kann der Überstand gewonnen werden, durch Abtrennen der B.T. Sporen und Kristalle aus der Fermentationsbrühe durch Mittel, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, z. B. durch Zentrifugation und/oder Ultrafiltration. Diese Substanz ist in dem Überstand enthalten, welche gewonnen werden kann, durch Mittel, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, z. B. der Ultrafiltration, Evaporation und der Spray-Trocknung.
Alternativ kann die Substanz der vorliegenden Erfindung erhalten werden, durch chemische Synthese unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.
Um Struktur I zu erhalten, kann der einfache Pyrazin-Ring mit einer angemessenen Substitution und Schutzgruppen gebildet werden, durch eine Vielzahl von Reaktionen, zum Beispiel der spontanen Kondensation von Alpha-Aminocarbonyl-Verbindungen. Ein Dihydro-Pyrazin-Intermediat wird gebildet, aber es wird sogleich oxidiert mit Sauerstoff zu dem Pyrazin. Die Dimerisierung einer einzelnen Alpha-Aminocarbonyl-Verbindung durch dieses Verfahren würde zu einem einzelnen Pyrazin führen, wohingegen eine Reaktion mit zwei unterschiedlichen Alpha-Aminocarbonyl-Verbindungen zu drei Produkten führen würde; diese Substanz würde isoliert werden, durch eine chromatographische Trennung (siehe 1). Die letztere Reaktion erlaubt die Synthese von Pyrazinen mit unterschiedlichen Substituenten an jeder Seite des Ringes.
Die Reinigung der Substanz kann durchgeführt werden, durch unterschiedliche Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chromatographie (z. B. Ionenaustausch, Affinitäts- und Größenausschluss-Säulenchromatographie), elektrophoretischen Verfahren, Differenzial-Löslichkeiten, Extraktion oder irgendeiner anderen Standard-Technik, die im Fachgebiet bekannt ist (siehe beispielsweise Protein Purification, eds. J-C. Janson und Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989).
Die Wirksamkeit dieser Substanz kann einem Bioassay unterzogen werden, unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel der künstlichen Nahrungs-Inkorporation, dem künstlichen Nahrungsüberschuss, der Blattbemalung, dem Blatteintauchen und der Blattbesprühung. Spezifische Beispiele von solchen Bioassays werden in dem Beispiel-Abschnitt hierin gegeben.
Zusammensetzungen, welche die Substanz umfassen
Diese Substanz wird formuliert, zusammen mit einem unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizid, welches, wie oben definiert, ein Bacillus Stamm ist, eine Spore, ein Protein oder ein Fragment davon, das Wirksamkeit besitzt, gegen oder welches Schädlinge tötet und einem verträglichen Träger in (einer) pestiziden Zusammensetzung(en), welche beispielsweise eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein stäubendes Pulver, ein dispergierbares Granulat, ein befeuchtbares Pulver, ein emulgierbares Konzentrat, ein Aerosol oder ein imprägniertes Granulat ist. Beispiele von solchen Bacillus Stämmen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki (vermarktet als DIPEL^TM von Abbott Laboratories, Inc. JAVELIN^TM von Sandoz, BIOBIT^TM von Novo Nordisk A/S, FORAYT^TM von Novo Nordisk A/S, MVP^TM von Mycogen, BACTOSPEINE^TM von Novo Nordisk A/S, und THURICIDE^TM von Sandoz); Bacillus Thuringiensis subsp. aizawai (vermarktet als FLORBAC^TM von Novo Nordisk A/S, und XENTARI^TM von Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis (vermarktet als NOVODOR^TM von Novo Nordisk A/S, TRIDENT^TM von Sandoz, M-TRAK^TM und M-ONE^TM von Mycogen); Bacillus Thuringiensis subsp. isrealensis (vermarktet entweder als BACTIMOS^TM oder SKEETAL^TM von Novo Nordisk A/S, TEKNAR^TM von Sandoz und VECTOBRC^TM von Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus sphaericus (vermarktet als SPHERIMOS^TM von Novo Nordisk A/S); Bacillus Thuringiensis kurstaki/tenebrionis (vermarktet als FOIL^TM von Ecogen); Bacillus Thuringiensis kurstaki/aizawai (vermarktet als CONDOR^TM von Ecogen und AGREE^TM von Ciba-Geigy); und Bacillus Thuringiensis kurstaki/kurstaki (vermarktet als CUTLASS^TM von Ecogen). Das Bacillus verwandte Protein kann gewählt werden aus der Gruppe einschließlich, aber nicht beschränkt auf CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV und CryVI.
Diese Substanz kann auch in der Zusammensetzung der Erfindung formuliert werden mit anderen Faktoren oder Substanzen, die aus dem Überstand eines Bacillus Überstandes erhalten werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Exotoxin und/oder den verstärkenden Faktor, der in der Anmeldungsnummer WO94/09630/A1, angemeldet am 20. Juli 1993. Die Formulierung kann ebenfalls ein chemisches Pestizid umfassen und/oder einen Virus mit pestiziden Eigenschaften und einen verträglichen Träger.
In einer spezifischen Ausführungsform können die Komponenten dieser Zusammensetzung in einer synergistischen Art und Weise wirken. Als ein Ergebnis kann diese Zusammensetzung eine größere Wirksamkeit besitzen, als sie mit jeder einzelnden Komponente erreicht werden kann. Ein Synergismus kann ebenfalls festgelegt werden durch eine gleiche oder größere Effizienz mit niedrigeren oder geringeren häufigen Dosen, als sie erforderlich wären, für jede einzelne Komponente. Alternativ kann diese Substanz derart wirken, dass sie ein Bacillus verwandtes Pestizid verstärkt.
In Zusammensetzungen, welche die Substanz und ein Bacillus verwandtes Pestizid enthalten, ist die Substanz anwesend in der Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 300 g pro LTU. Wie hierin definiert, ist "LTU" eine Leptinotarsa texana Einheit, wie durch einen Bioassay bestimmt. Der Bioassay vergleicht die Probe mit einem Standard-Bacillus-Referenz-Material, unter Verwendung von Leptinotarsa texana oder einem anderen Schädling, wie dem Standard-Pest-Organismus. Die Potenz wird bestimmt durch Teilen des Referenz-Standards LC₅₀, dann multiplizieren durch die Referenz-Standard-Potenz.
In einem Verfahren zur Verstärkung der pestiziden Wirksamkeit eines unterschiedlichen Bacillus verwandten Pestizids kann eine Zusammensetzung, welche diese Substanz im Wesentlichen reiner Form oder einen Überstand von Bacillus in trockener, konzentrierter oder flüssiger Form und einen geeigneten pestiziden Träger enthält, wovon Beispiele oben offenbart sind, separat angewendet werden auf eine Pflanze, die ein unterschiedliches Bacillus verwandtes Pestizid hat, d. h. transgene Pflanzen. Speziell kann die Zusammensetzung auf eine Pflanze aufgebracht werden, die zuvor ein Bacillus Thuringiensis Gen enthielt. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung auf eine Pflanze aufgebracht werden, die zuvor einer Bacillus Thuringiensis Zusammensetzung ausgesetzt war. Die Substanz ist in der Zusammensetzung in einer Konzentration von ungefähr 0,001 Prozent bis ungefähr 60 Prozent (Gewicht/ Gewicht).
Solche Zusammensetzungen, welche oben offenbart sind, können erhalten werden, durch die Zugabe eines Oberflächen aktiven Wirkstoffes, eines inerten Trägers, eines Konservierungsstoffes, eines Befeuchtungsmittels, eines Zuführungsstimulanz, eines Anziehungsstoffes, eines Verkapselungsmittels, eines Bindemittels, eines Emulgators, eines Farbstoffes, eines UV-Filters, eines Puffers, eines Flußmittels oder einer anderen Komponente, um die Produkthandhabung und die Anwendung auf spezielle Ziel-Schädlinge zu erleichtern.
Geeignete Oberflächen aktive Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf anionische Verbindungen, wie zum Beispiel Metall-Carboxylat, beispielsweise ein Metall-Carboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acrylsarcosinat; Mono- oder Di-Esters von Phosphorsäure mit Fett-Alkohol-Ethoxylaten oder Salzen von solchen Estern; Fett-Alkohol-Sulfaten, wie zum Beispiel Natrium-Dodecyl-Sulfat, Natrium-Octadecyl-Sulfat oder Natrium-Cetyl-Sulfat; ethoxylierte Fett-Alkohol-Sulfate; ethoxylierte Alkyl-Phenol-Sulfate; Lignin-Sulfonate; Petroleum-Sulfonate; Alkyl-Aryl-Sulfonate, wie zum Beispiel Alkyl-Benzen-Sulfonate oder niedere Alkyl-Naphthalen-Sulfonate, d. h. Butyl-Naphthalen-Sulfonat; Salze oder sulfonierte Naphthalen-Formaldehyd-Kondensate; Salze von sulfonierten Phenol-Formaldehyd-Kondensaten; oder komplexere Sulfonate, wie zum Beispiel die Amid-Sulfonate, d. h. das sulfonierte Kondensationsprodukt von Ölsäure und N-Methyl-Taurin oder die Dialkyl-Sulfo-Succinate, d. h. das Natrium-Sulfonat oder Dioctyl-Succinat. Nicht-ionische Wirkstoffes schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Kondensationsprodukte von Fettsäure-Estern, Fett-Alkoholen, Fettsäure-Amiden oder Fett-Alkyl- oder Alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fett-Estern von Poly-Alkohol-Eshern, d. h. Sorbitan-Fettsäure-Ester, Kondensationsprodukte solcher Ester mit Ethylenoxid, d. h. Polyoxi-Ethylen-Sorbitol-Fettsäure-Ester, Block-Copolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Acetylen-Glycole, wie zum Beispiel 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decyn- 4,7-diol oder ethoxylierte Acetylen-Glycole. Beispiele eines kationischen Oberflächen aktiven Wirkstoffes schließen ein, beispielsweise ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamin, wie ein Acetat, Naphthalenat oder Oleat; ein Sauerstoff-enthaltendes Amin, wie zum Beispiel ein Aminoxid von Polyoxy-Ethylen-Alkylamin; ein Amid-verbundenes Amin, hergestellt durch die Kondensation einer Karbonsäure mit einem Di- oder Polyamin oder ein quaternäres Ammoniumsalz.
Beispiele von inerten Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf anorganische Minerale, wie zum Beispiel Kaolin, Glimmer-Mineral, Gips, Düngemittel, Phyllosilikate, Karbonate, Sulfate oder Phosphate; organische Materialien, wie zum Beispiel Zucker, Stärken oder Zyklodextrine; oder botanische Materialien, wie zum Beispiel Holzprodukte, Kork, pulverisierte Getreidefrüchte, Reishüllen, Erdnuss-Hüllen und Walnuss-Schalen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form für die direkte Anwendung oder als ein Konzentrat oder Primärzusammensetzung vorliegen, welches eine Verdünnung mit einer geeigneten Menge an Wasser oder einem anderen Lösungsmittel vor der Anwendung erfordert. Die pestizide Konzentration wird abhängig von der Natur der speziellen Formulierung variieren, insbesondere, ob sie ein Konzentrat ist oder direkt verwendet werden soll. Die Zusammensetzung enthält 1 bis 98 Gew.-% eines festen oder flüssigen inerten Trägers und 0 bis 50%, vorzugsweise 0,1 bis 50% eines Oberflächen aktiven Stoffes. Diese Zusammensetzungen werden verabreicht mit der angegebenen Geschwindigkeit für das kommerzielle Produkt, vorzugsweise ungefähr 0,01 Pfund bis 5,0 Pfunde pro Acre, wenn sie in trockener Form vorliegen und mit ungefähr 0,01 Pinte bis 25 Pinten pro Acre, wenn sie in flüssiger Form sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Bacillus verwandte Pestizid und/oder die Substanz vor der Formulierung behandelt werden, um die pestizide Wirksamkeit zu verlängern, wenn es in die Umgebung eines Ziel-Schädlings aufgebracht wird, solange die Vorbehandlung nicht nachteilig ist, für das Bacillus verwandte Pestizid oder die Substanz. Eine solche Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische Mittel erfolgen, solange die Behandlung nicht in schädlicher Weise die Eigenschaften der Zusammensetzung beeinflusst. Beispiele von chemischen Reagenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Halogenierungsmittel; Aldehyde, wie zum Beispiel Formaldehyd und Glutaraldehyd; Anti-Infektiva, wie zum Beispiel Zephiran-Chlorid; Alkohole, wie zum Beispiel Isopropanol und Ethanol und histologische Fixierungsmittel, wie zum Beispiel Bouin's Fixierungsmittel und Helly's Fixierungsmittel (siehe beispielsweise Hurnason, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman und Co., 1967).
Die Zusammensetzungen der Erfindung können direkt auf die Pflanze aufgebracht werden, beispielsweise durch Aufsprühen oder Einstäuben zum Zeitpunkt, wenn der Schädling begonnen hat, auf der Pflanze zu erscheinen oder vor dem Erscheinen der Schädlinge als eine protektive Maßnahme. Pflanzen, die geschützt werden sollen innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Getreide (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorgho und verwandte Früchte), Rüben (Zuckerrübe und Futterrübe), Steinfrüchte, Kernfrüchte und weiche Früchte (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirchen, Erdbeeren, Himbeeren und Brombeeren), Hülsenpflanzen (Luzerne, Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnüsse, Rizinusöl-Pflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Gurkenpflanzen (Gurken, Kürbisse, Melonen), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Zitrusfrüchte, (Orangen, Zitronen, Grapefruit, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Salat, Spargel, Kohlpflanzen und andere Brassicae, Karotten, Zwiebel, Tomaten, Kartoffeln), Lauracae (Avocado, Zimt, Kampfer), Laubbäume und Koniferen (d. h. Lindenbäume, Eiben, Eichen, Erlen, Pappeln, Birken, Tannen, Lärchen, Kiefern) oder Pflanzen, wie zum Beispiel Mais, Rasenpflanzen, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Wein, Hopfen, Bananen und natürliche Gummi-Pflanzen, ebenso wie Zierpflanzen. Die Substanz kann durch Blatt, Furchen, Flächengranulat, "beiseite legen" oder durch Boden-Durchnässungs-Anwendung aufgebracht werden. Es ist im Allgemeinen wichtig, eine gute Bekämpfung der Schädlinge in den frühen Stadien des Pflanzenwachstums zu erhalten, wobei dies die Zeit ist, wenn die Pflanze am schwersten beschädigt werden kann. Das Spray oder der Staub kann bequemerweise ein anderes Pestizid enthalten, wenn dies als notwenig erachtet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung der Erfindung direkt auf die Pflanze aufgebracht.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können wirksam sein gegen Schädling der Ordnung Coleoptera, d. h.
Leptinotarsa sp: (d. h. Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus frontalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides abtecus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sirophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitoblus diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscures, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch wirksam sein gegen Schädlinge einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schädlinge der Ordnung Lepidortera, d. h. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabana argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniela, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Atheris mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolismus sibericus, Desmia funeralis, Diapitania hryalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege stictialis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pecrinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota fluendana, Platynota stultana, Platyprilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaleria unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Diptera, e. g., Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Arcopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia planura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossing ausreni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericara, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; Acari, e.g., Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenoptera, e.g., Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, e.g., Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, e.g., Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopryllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalldes felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritars, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; and Tylenchida, e.g., Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung gezeigt, nicht zur Einschränkung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Kultivierung von verschiedenen B.T. Isolaten
Subkulturen von EMCC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 und EMCC-0081 erhalten auf Nährstoffbrühen-Schräg-Agar-Kulturen wurden verwendet, um 250 ml Prallflächen-Schüttelflaschen zu inokulieren, die 50 ml Medium enthielten, mit der folgenden Zusammensetzung.

Maisquellwasser 15 g/l

Maltrin-100 40 g/l

Kartoffelstärke 30 g/l

KH₂PO₄ 1,77 g/l

K₂HPO₄ 4,53 g/l
Der pH Wert des Mediums wurde eingestellt auf 7,0, unter Verwendung von 10 N NaOH.
Nach der Inokulierung wurden die Schüttelflaschen bei 30°C auf einem routierenden Schüttler bei 250 rpm für 72 Stunden inkubiert. Die gesamten Kulturbrühen wurden verwendet zum Test gegen Diabrotica undecimpunctata.
Beispiel 2: Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit in der Gesamt-Kulturbrühe von verschiedenen B.T. Isolaten
2,5 ml der gesamten Kulturbrühen, die aus der obigen Fermentation erhalten wurden, wurden entfernt und aus den Schüttelflaschen in 50 ml Polypropylen-Bioassay-Röhrchen überführt. Diabrotica undecimpunctata Nahrung wurde in jedes Röhrchen hinzugefügt, bis zu einem Endvolumen von 25 ml. Die Nahrung und das Testmaterial wurde dann heftig gemischt und in Bioassay-Schalen für den Bioassay verteilt. Drei bis sechs Eier von Diabrotica undecimpunctata wurden auf die Oberfläche der "Nahrung" aufgebracht. Mylar wurde auf die Bioassay-Schalen aufgebügelt und die Schalen wurden bei 28°C ohne Photo-Periode inkubiert. Nach sieben Tagen wurde die Zählung ausgeführt. Die Mortalität wurde am siebten Tag nach der Inkubation gezählt. SS7 = die Größe der toten Larven am siebten Tag, wenn verglichen mit den lebenden, Kontroll-Larven am selben Tag als es SS7 von vier. SS7 = drei, SS7 = zwei und SS7 = eins, stellen die Größe der Larven als 75%, 50% & 25% der Lebendigen dar; Kontroll-Larven von vier.
Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen an, dass in allen fünf getesteten Stämmen eine 100%ige Mortalität bestand. Des Weiteren waren die toten Larven 12,5% der Größe der lebenden Kontroll-Larven.
Tabelle 1 Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit in Gesamt-Kulturbrühen
Beispiel 3: Lokalisierung der Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit
Um zu testen, ob die Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit mit den Delta-Endotoxin/Sporen des Überstandes in Zusammenhang stehen, wurden 2,5 ml der Gesamt-Kulturbrühen von EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081 und NB125 (ein Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis, gezüchtet unter identischen Bedingungen) in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge bei 15.000 rpm zentrifugiert (Sorvall SS34 Rotor) für 15 Minuten, um den Überstand und das Pellet zu trennen. Die kristallinen Delta-Endotoxine plus die Sporen werden in dem Pellet wiedergewonnen. Die Delta-Endotoxine, die durch das Diabrotica undecimpunctata wirksame B.T. Isolat EMCC-0077 produziert wurden, haben Molekulargewichte von 66 kD, 29 kD und 12 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Die Delta-Endotoxine, die durch das Diabrotica undecimpunctata wirksame B.T. Isolat EMCC-0078 produziert wurden, haben Molekulargewichte von 153 kD, 77 kD, 67 kD, 61 kD, 50 kD, 42 kD, 34 kD, 30 kD, 24 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Die Delta-Endotoxine, die durch das Diabrotica undecimpunctata wirksame B.T. Isolat EMCC-0079 produziert wurden, haben ein Molekulargewicht von 135–145 kD, wie bestimmt durch SDS-PAGE. Die Delta-Endotoxine, die durch das Diabrotica undecimpunctata wirksame B.T. Isolat EMCC-0080 produziert wurden, haben Molekulargewichte von 94 kD und 40 kD, wie bestimmt durch SDS-PAGE. Die Delta-Endotoxine, die durch das Diabrotica undecimpunctata wirksame B.T. Isolat EMCC-0081 produziert wurden, haben Molekulargewichte von 129 kD und 32 kD, wie bestimmt durch SDS-PAGE.
Jeder Überstand (2,5 ml), der von der obigen Zentrifugation erhalten wurde, wird in ein 50 ml Polypropylen-Bioassay-Röhrchen überführt. Das Pellet wird dann in 2,5 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und in ein getrenntes 50 ml Polypropylen-Bioassay-Röhrchen überführt. Diabrotica undecimpunctata Nahrung wird dann in die Bioassay-Röhrchen hinzugefügt, welche entweder den Überstand oder das resuspendierte Pellet enthielten, bis zu einem Endvolumen von 25 ml. Die restlichen Schritte es Bioassays sind identisch zu denjenigen, die oben beschrieben sind. Die Zählung ist ebenfalls dieselbe, wie oben beschrieben.
Die Ergebnisse, wie gezeigt in Tabelle 2, zeigen, dass die Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit von EMCC-0077, EMCC-0080 und EMCC-0081 in allen Überständen anwesend ist, wohingegen die geringere Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit aus dem bekannten Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis in dem Pellet konzentriert ist (Spore plus Kristall).
Tabelle 2: Diabrotica undecimpunctata Wirksamkeit in Überstand und Pellet
Beispiel 4: Wirksamkeit gegen Leptinotarsa texana
Nach der Filtration durch eine 0,2 u Membran wurde der Überstand von EMCC-0080, erhalten von Beispiel 1, verwendet, um ihn auf die Wirksamkeit gegen Käfer zu untersuchen.
Der filtrierte Überstand wird auf Auberginen-Blätter aufgebracht, bei einem Volumen von 20 GPA (Gallonen pro Acre). Die Verdünnungen sind 0, 1 : 1, 1 : 4, 1 : 8 (Überstand : deionisiertem Wasser, v/v).
Leptinotarsa texana Larven werden den behandelten Blättern ausgesetzt, nach dem Standard-Protokoll. Jede Pflanze wird mit 20 Larven von Leptinotarsa texana beladen.
Die Ergebnisse, wie in Tabelle 3 unten aufgelistet, zeigen, dass der filtrierte Überstand von EMCC-0080 wirksam ist, gegen Leptinotarsa texana.
Tabelle 3 Leptinotarsa texana Wirksamkeit in EMCC-0080
Beispiel 5: Synergistischer Effekt von EMCC-0080 und NOCODOR^TM
Die Ergebnisse, welche in Tabelle 3 oben gezeigt sind, zeigen an, dass der Überstand von EMCC-0080 bei einer 1 : 8-Verdünnung (v/v) alleine nicht wirksam ist. Allerdings wird, wenn die Auberginen-Blätter mit 1,25% oder 2,5% von 10X konzentriertem EMCC-0080 Überstand plus 200 μg von NOVODOR^TM (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark) pro ml behandelt werden, ein synergistischer Effekt erreicht, wie bewiesen, durch den Abfall der LC₅₀ und LC₉₀ von NOVODOR^TM. Die Daten werden in Tabelle 4, unten, gezeigt.
Tabelle 4 Synergistischer Effekt von EMCC-0080 und NOVODOR^TM
Beispiel 6: Reinigung von Coleoptera wirksamer Substanz, produziert durch B.T. Stamm EMCC-0080
B.T. Stamm EMCC-0080 wurde gezüchtet für 24 Stunden bei 30°C in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung in Gramm pro Liter bei pH 7,0:

Maltodextrin 40 g

Sojaprotein 40

KHP₂O₄ 1,8 g

KHP₂O₄ 4,5 g

MgSO₄-7H₂O 0,3 g

Spurenmetalle 0,2 ml
Zellen und andere unlösliche Stoffe wurden aus der gesamten Kulturbrühe von B.T. Stamm EMCC-0080 durch Zentrifugation gefolgt von Filtration des resultierenden Überstandes durch Celite und einen 0,2 u Membran entfernt. Das resultierende Permeat wurde dann 10-fach durch Verdampfen konzentriert.
Die Reinigung der Coleoptera wirksamen Substanz aus dem 10-mal konzentrierten Permeat wurde erreicht, unter Verwendung einer 4-Schritt Reinigungsprozedur. Während der Reinigung wurde die Wirksamkeit durch einen Diabrotica undecimpunctata Oberflächen-Bioassay beobachtet, wie hierin beschrieben und die Reinheit wurde bestimmt durch Kapillar-Elektrophorese wie beschrieben in Beispiel B. Alle chromatographischen Schritte verwendeten eine Detektion bei 226 nm.
Spezifisch wurde der Oberflächen-Bioassay wie folgt durchgeführt. Die Proben des 10-mal konzentrierten Permeats wurden auf einzelne Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte aufgebracht, welche 200 μl verfestigte künstliche Insektennahrung pro Vertiefung enthielt und dann luftgetrocknet. Zwei bis vier Neugeborene von Diabrotica undecimpunctata (Getreide-Wurzel-Wurm, CRW) wurden vorsichtig in jede Vertiefung mit einem Pinsel platziert. Die Mikrotiter-Platten wurden dann mit Mylar verschlossen, welches mit Löchern versehen war für den Luftaustausch und wurden bei 30°C und 80% Feuchtigkeit inkubiert. Die Zählung für die %-Mortalität wurde bei 5 Tagen ausgeführt.
In dem ersten Schritt wurde das 10-mal konzentrierte Permeat zuerst durch Pharmazia SP Sephadex^® C-25 (Kationen-Austausch) Säulenchromatographie (5 × 30 cm) gereinigt. Eine 450 ml Probe des 10-mal konzentrierten Permeats wurde auf 18 Liter mit deionisiertem Wasser verdünnt, auf die Säule geladen, welche vorher mit 20 mM Ammoniumacetatpuffer. bei pH 5,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde bei 18 ml pro Minute mit einem 5,0 Liter kontinuierlichen Gradienten von 20 mM bis 0, 5 M Ammoniumacetatpuffer bei pH 5,0 eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt, einem Bioassay unterzogen und auf Reinheit geprüft. Die wirksamen Fraktionen wurden gepoolt (ungefähr 150 ml), lyophilisiert und wieder aufgelöst in deionisiertem Wasser auf ungefähr 1/5 des ursprünglichen Volumens.
In dem zweiten Schritt wurde eine 25 ml Probe des ersten Schrittes auf eine BioRad P2 (extrafeine) Größenausschluss-Säule (5 × 100 cm) geladen, welche vorher mit deionisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute mit deionisiertem Wasser eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt, einem Bioassay unterzogen und auf Reinheit überprüft, durch Kapillar-Elektrophorese. Die wirksamen Fraktionen wurden gepoolt (ungefähr 400 ml).
In dem dritten Schritt wurde der 400 ml Pool aus dem zweiten Schritt auf 16 Liter mit deionisiertem Wasser verdünnt.
Die Lösung wurde auf eine Pharmacia S Sepharose^® Schnell-Fluss (starke Kationen-Austauscher) Säule (5 × 30 cm) geladen, welche davor mit 20 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 5,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde bei einer Flussgeschwindigkeit von 17 ml pro Minute mit einem 5,0 Liter kontinuierlichen Gradienten von 20 mM bis 0,5 M Ammoniumacetatpuffer bei pH 5,0 eluiert. Fraktionen von 20 ml wurden gesammelt, einem Bioassay unterzogen und auf Reinheit geprüft. Die wirksamen Fraktionen wurden gepoolt (ungefähr 250 ml) und dann lyophilisiert bis zur Trockenheit, um den flüchtigen Ammoniumacetatpuffer zu entfernen.
In dem vierten Schritt wurde der lyophilisierte Pool aus dem dritten Schritt wieder aufgelöst in 400 ml deionisiertem Wasser. Die Lösung wurde auf eine BioRad Chelex^® 100 Säule (0,9 × 30 cm) geladen, welche davor mit 20 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 4,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml pro Minute mit einem 2,4 Liter Schritt-Gradienten von 0,02 → 0,1 → 0,2 → 0,35 → 0,5 → 1,0 M Ammoniumformatpuffer bei pH 4,0 eluiert. Fraktionen von 20 ml wurden gesammelt, einem Bioassay unterzogen und auf Reinheit geprüft. Die wirksamen Fraktionen wurden gepoolt (ungefähr 300 ml) und dass zur Trockenheit lyophilisiert, um den flüchtigen Ammoniumformapuffer zu entfernen.
Die Kapillar-Elektrophorese zeigt, dass das gereinigte Coleoptera wirksame Material zwei Verbindungen, Ia und Ib, umfasst.
Beispiel 7: Strukturaufklärung der Coleoptera wirksamen Substanzen
Die Strukturen der Verbindungen Ia und Ib wurden aufgeklärt aus den spektroskopischen Daten, die anhand ihrer acetylierten Derivate (Derivate A und B) gesammelt wurden.
Eine 114 mg Mischung von Ia und Ib wurde in 5,0 ml Pyridin mit 5,0 ml Essigsäureanhydrid und einem Kristall von 4-Dimethylaminopyridin als einen Katalysator für 24 Stunden bei Raumtemperatur acetyliert und dann gereinigt durch semipräparative RP-C₁₈ HPLC. Eine 5 mg Probe in 25 μl wurde auf die Säule geladen und bei 4 ml pro Minute mit 80% Wasser – 20% Acetonitril eluiert. Detektion erfolgte bei 254 nm.
Die NMR spektroskopischen Daten, die von Derivat A gesammelt wurden, zeigen die Anwesenheit von 14 Kohlenstoffen und 17 Protonen. Jedoch schlagen die massenspektroskopischen Daten ein Molekulargewicht von 652 vor und eine Formel von C₂₈H₄₀N₆O₁₇ (exakte Masse 653.2801, MH+, berechnet 653.2782). Daher wurde die Verbindung als symmetrisch bestimmt, wo nur die Hälfte der Signale durch NMR beobachtet wurde.
Unterschiedliche Spin-Systeme wurden durch NMR beobachtet. Ein zentraler Pyrazin-Ring, substituiert in der 2 und 5 Position, wurde angezeigt durch die Hoch-Feld-Protonen-Singlets bei 8,6 ppm (H-3 und H-6), was Langbereich-Kopplungen an alle der Kohlenstoffe in dem Ring und an dem ersten Kohlenstoff der Seitenkette (C-7) zeigte. Die Seitenkette der drei Kohlenstoffe ist sowohl an Position 7 als auch 8 acetyliert mit einem Methylen an Position 9. Von Kohlenstoff 9 wurde herausgefunden, dass er eine langbereichige Korrelation mit dem Carbonyl eines Esters hat und der Ester wurde als Teil eines Alanins bestimmt, welches acetyliert ist an der Aminogruppe.
Die Struktur von Derivat B unterscheidet sich in einer Position von Derivat A. In einer der Seitenketten von Derivat B ist der C-7 Kohlenstoff nicht mehr acetyliert oder an ein Sauerstoff angehängt, sondern es wurde herausgefunden, dass er ein Methylen ist. Die andere Seitenkette ist identisch zu der in Derivat A. Dieser Unterschied von lediglich einem Sauerstoff wurde ebenfalls in den massenspektroskopischen Daten beobachtet. Die massenspektroskopischen Daten wurden erhalten mit einer exakten Masse von 595.2722 (MH+, berechnet 595.2727) für Derivat B, was eine Formel von C₂₆H₃₈N₆O₁₀ anzeigte. Die optischen Dichten von Derivaten A und B sind wie folgt: Derivat A [α]_D ²⁷ = –6,9°C und Derivat B [α]_D ²⁷ = +32°C. Die gesamten Zuweisungen der ¹H und ¹³C NMR Daten wurden auf der Basis von Entkopplungs-Experimenten gemacht, COSY, HMQC und HMBC. Die Zuweisungen werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: ¹H und ¹³C NMR Daten von Derivat A und Derivat B in D-4 Methanol
Die massenspektroskopischen Daten für die Mischung von Verbindungen Ia und Ib ergeben zwei molekulare Ionen von 400 und 384. Aus diesen Daten wurde bestimmt, dass die Molekül-Formel von Verbindung Ia C₁₆H₂₈N₆O₆ ist und von Verbindung Ib C₁₆H₂₈N₆O₅. Die Strukturen von Ia und Ib werden bestimmt durch Vergleich der NMR Daten von Derivat A und Derivat B mit den NMR Daten der Mischung von Ia und Ib. Die Strukturen von Ia und Ib werden unten gezeigt.

Ia: R, R₁, R₂, R₃=H
Ib : R, R₁, R₂=H, R₃=OH

Die Eigenschaften von Verbindungen Ia und Ib und ihrer acetylierten Derivate werden unten zusammengefasst: Derivat A:

Molekulargewicht 652

empirische Formel C₂₈H₄₀N₆O₁₂

UV (MeOH): 275,310 nm

MS (FAB): (M + H)m/z 653.2801, ber. 653.2782

Derivat B:

Molekulargewicht 594

empirische Formel C₂₆H₃₈N₆O₁₀

UV (MeOH): 275.310 nm

MS (FAB): (M + H)m/z 595.2722, ber. 595.2727

Ia:

Molekulargewicht 400

empirische Formel C₁₆H₂₈N₆O₆

UV (MeOH): 275.310 nm

MS (FAB): (M + H) 401

Ib:

Molekulargewicht 384

empirische Formel C₁₆H₂₈N₆O₅

UV (MeOH): 275.310 nm

MS (FAB): (M + H) 385
Beispiel 8: Quantitative Bestimmung von Verbindungen von Ia und Ib in den Fermentations-Brühen
B.T. Stamm EMCC-0080 wurde gezüchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Konzentration der Verbindungen Ia und Ib in der Fermentations-Brühe wurde durch Kapillar-Elektrophorese bestimmt.
Genauer gesagt, wurde ein BioRad Biofocus 3000 Kapillar-Elektrophorese-System, das mit einer unüberzogenen Kapillare (50 μm × 50 cm) ausgestattet war, 0,1 M Phosphat bei pH 2,5, Spannung bei 20 KV, positive zu negative Polarität und Detektion bei 200 nM für die Quantitative Bestimmung verwendet. Das Probenvolumen, war 30 μl mit einer 5 psi zweiten Injektion. Die Analysezeit war 10 Minuten mit den Coleoptera wirksamen Verbindungen Ia und Ib, wobei bei jeweils 6,0 und 5,9 Minuten eluiert wurde.
Alternativ wurde ein Beckman P/ACE 2100 Kapillar-Elektrophorese-System, ausgestattet mit einer unüberzogenen Kapillare (50 μm × 47 cm), 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 2,5, Spannung bei 20 KV, positive zu negativer Polarität und Detektion bei 200 nm für die quantitative Bestimmung verwendet. Das Probenvolumen war 30 μl mit einer 10 Sekunden Druck-Injektion. Die Analysezeit war 10 Minuten mit den Coleoptera wirksamen Verbindungen Ia und Ib, wobei bei jeweils 7,0 und 6,7 Minuten eluiert wurde.
Zellen und andere unlösliche Stoffe wurden aus der gesamten Kulturbrühe von B.T. Stamm EMCC-0080 durch Zentrifugation und durch Filtration durch Celite und eine 0,2 Membran entfernt. Der resultierende Überstand wurde durch Kapillar-Elektrophorese wie oben beschrieben analysiert. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Coleoptera wirksamen Verbindungen Ia und Ib jeweils bei einem Spiegel von ungefähr 90 mg pro Liter Kulturbrühe anwesend sind.
Beispiel 9: Wirksamkeits-Bestimmungen von Verbindungen Ia und Ib
Die relative Wirksamkeit einer rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib (ungefähr 1 : 1 m/m) wurde bestimmt, unter Verwendung von Leptinotarsa texana als dem Test-Insekt und durch Vergleichen der Mortalität, die mit einer internen Standard-Zubereitung von Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis in Zusammenhang steht.
Blatt-Bioassays wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit einer rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib gegen Leptinotarsa texana zu bestimmen. Um den Blatt-Bioassay durchzuführen, wurden die Testmaterialien und Standards in 50 ml Zentrifugen-Röhrchen eingewogen und mit deionisiertem Wasser, das 0,1% Tween^® 20 enthielt, suspendiert. 1,200 mg von Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis Standard wurde ausgewogen und suspendiert, um eine Endkonzentration von 12,000 μg pro Gramm zu ergeben. Die Testproben (d. h. NOVODOR^TM und NOVODOR^TM mit Verbindungen Ia und Ib) wurden in einer ähnlichen Weise behandelt, solange nicht ein Geschwindigkeits-findender Bioassay gezeigt hat, dass die zugeführte Dosierung zu hoch ist oder zu niedrig, um in einer ausreichenden Anzahl von gültigen Datenpunkten zu resultieren. Wenn dies der Fall ist, wird die Konzentration der primären Stock-Lösung erhöht oder erniedrigt, durch Verändern der Menge an zugefügtem Verdünnungsmittel zu der Stock-Lösung. Jede Probe wurde dann homogenisiert für 30 Sekunden, unter Verwendung eines Virtis Homogenizers und dem Ultraschall unterworfen für 20 Sekunden bei 100 Watt, unter Verwendung eines Braunsonic 1510 Ultrasonic Homogenizers. Jede dieser Stock-Lösungen wurde dann unter Verwendung eines Hamilton Microlab 1000 verdünnt, um sieben serielle Verdünnungen zu ergeben, welche aus 3,000, 2,000, 1333, 857, 545, 364 und 245 μg/ml in einer Gesamtheit von 16 ml bestanden. Jede dieser 16 ml Lösungen wurde auf ungefähr 288 Quadrat-Zoll (1 Zoll = 2,54 cm) von Auberginen-Blättern aufgebracht, unter Verwendung eines Devries Linear-Track Sprayers, der kalibriert war, um 20 Gallonen pro Acre zuzuführen. Kontroll-Blätter wurden mit 16 ml deionisiertem Wasser besprüht. Die Blätter wurden luftgetrocknet und dann über den Rand eines ein Unzen klaren Plastikbehälters platziert, der 5 zweite Instar Leptinotarsa texana Larven enthielt. Karton-Deckel wurden dann über das Blatt platziert und der Deckel wurde zurecht gedrückt, wobei eine 4 cm Blattscheibe herausgeschnitten wurde und innerhalb des Behälters verschlossen wurde. Die Behälter wurden dann umgedreht und die Larven fielen auf die behandelte Oberfläche des Blattes. Acht Behälter wurden vorbereitet für jede der sieben seriellen Verdünnungen. Die Behälter wurden zusammen gebunden, markiert, auf Regale platziert und für drei Tage bei 30°C und 65% relativer Feuchtigkeit inkubiert. Diese 56 experimentellen Behälter und acht Kontroll-Behälter bilden einen Bioassay.
Nach drei Tagen wurde die Insekten-Mortalität beurteilt. Jeder Behälter wurde scharf abgeblasen und Larven, welche sich nicht bewegten, wurden als tot gezählt. Die Prozent-Mortalität wurde berechnet und die Daten wurden über eine parallele Probit-Analyse analysiert. Die LC_50S, LC_90S, die Neigung der Regressions-Linien, der Abweichungs-Koeffizient und die Wirksamkeiten wurden geschätzt.
Um die Wirksamkeit zu bestimmen, wurde eine rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib verdünnt, einem Bioassay unterworfen und mit einem Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis Standard verglichen, welchem eine Wirksamkeit von 20.000 LTU pro Gramm (Leptinotarsa texana Einheiten pro Gramm) zugesprochen.
Die Wirksamkeit-Ergebnisse werden in Tabelle 6 unten gezeigt und sie zeigen an, dass die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib (1 : 1 w/w) eine Wirksamkeit von 75.555 LTU pro Gramm wirksamen Inhaltsstoff mit einer LC₅₀ von 70 μg/ml (1,8 mg gesamt wirksamer Inhaltsstoff pro ml) hat.
Tabelle 6: Wirksamkeit einer Mischung von Verbindungen Ia und Ib
Beispiel 10: Potenzierung von Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis kristallinem Delta-Endotoxin mit Verbindungen Ia und Ib
Die Fähigkeit von Verbindungen Ia und Ib, die insektizide Wirksamkeit des kristallinen Delta-Endotoxins von Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis gegen Leptinotarsa texana zu verstärken, wurde bestimmt, indem eine rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib zu NOVODOR^TM hinzugefügt wurde und die LC_50S über eine parallel Probit-Analyse gemessen wurde.
Blatt-Bioassays wurden durchgeführt gegen Leptinotarsa texana, wie in Beispiel 9 beschrieben, um das Niveau der Potenzierung, der durch Hinzufügen von Verbindungen Ia und Ib zu NOVODOR^TM erzielt wurde, zu bestimmen. Eine rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib wurde zu NOVODOR^TM hinzugefügt. Die Lösungen wurden unter Verwendung des Hamilton Microlab 1000 seriell verdünnt, um Stock-Lösungen zu ergeben, welche NOVODOR^TM bei 1000,0, 666,7, 444,4, 285,7, 181,8, 121,2 und 80,0 μg/g enthielten. Zwei unterschiedliche Verdünnungen einer Mischung von Ia und Ib wurden hergestellt, was in sieben seriellen Verdünnungen resultierte, die 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 13,1, 8,7 und 5,8 μg/g.(2,5% v/v mit 1000 μg/g NOVODOR^TM) enthielten; und 36,0, 24,0, 16,0, 10,3, 6,5, 4,4 und 2,9 μg/g (1,25% v/v mit 1000 μg/g NOVODOR^TM). Reine Proben (ohne Verbindungen Ia und Ib) und die Referenz-Substanzen wurden ebenso hergestellt. Die LC_50S der paarweise angeordneten reinen Proben wurden geteilt durch die verstärkten LC₅₀ Werte, um die Reduktion der LC₅₀ zu ergeben, die mit der Mischung von Verbindungen Ia und Ib assoziiert ist.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 unten gezeigt und sie zeigen an, dass die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib die insektizide Wirksamkeit von NOVODOR^TM gegen Leptinotarsa texana verstärkt.
Tabelle 7: Verstärkung von NOVODOR^TM mit einer Mischung von Verbindungen Ia und Ib gegen Leptinotarsa texana
Beispiel 11: Wirksamkeit einer Mischung von Verbindungen Ia und Ib gegen Käfer Ips Calligraphus und Dendroctonus frontalis
Die Toxizität einer rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib wurde gegen die Käfer Ips Calligraphus und Dendroctonus frontalis bestimmt. 3 ml einer rohen Lösung von Verbindungen Ia und Ib (1,8 mg wirksame Inhaltsstoff pro ml) wurden hinzugefügt zu 5 g von Gefrier-getrocknetem Lobolly-Kiefern-Bast und 7 ml destilliertem Wasser. Eine Kontroll-Nahrung wurde mit 10 ml Wasser hergestellt. Die Nahrung wurde in drei Petri-Schalen unterteilt und fünf bis zehn nackte erwachsene Ips oder gerade hervorgekommene erwachsene Dendroctonus Käfer wurden in jede Schale platziert. Drei unterschiedliche Sätze von behandelter Nahrung und Konatroll-Nahrung wurden kolonisiert mit zehn bis 20 Insekten. Die Petri-Schalen wurden inkubiert in der Dunkelheit bei 25°C und die Anzahl an toten Insekten wurde 4, 7 und zehn bis zwölf Tage nach der Platzierung auf die Nahrung gezählt. Die gezeigten Daten sind Durchschnittswerte von zwei oder drei unterschiedlichen wiederholten Studien für jede Insekten-Spezies.
Die Ergebnisse für Ips Calligraphus werden in Tabelle 8 unten gezeigt und sie zeigen an, dass die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib Insektizid ist.
Tabelle 8: Bewertung einer Mischung von Verbindungen Ia und Ib gegen Ips Calligraphus
Die Ergebnisse für die Dendroctonus frontalis Bioassays werden in Tabelle 9 unten gezeigt und zeigen an, dass die Mischung von Verbindungen Ia und Ib Insektizid ist.
Tabelle 9: Bewertung einer Mischung von Verbindungen Ia und Ib gegen Dendroctonus frontalis
Beispiel 12: Wirksamkeit gegen Popillia japonica (japanischer Käfer)
Die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib wurde auf ihre pestizide Wirksamkeit gegen dritte Instar Popillia japonica getestet. Perrenium Roggen-Gras-Wurzeln (elf Tage alt) wurden in die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib (1.8 mg von Ia und Ib pro ml) getaucht und man ließ sie teilweise trocknen. Eine dritte Instar Popillia japonica Larve wurde in eine Dose mit unterschiedlichen behandelten Wurzeln platziert. Nach 24 Stunden wurden die Wurzeln und die Larven mit Wooster Schlamm-Lehm bedeckt. Kontroll-Wurzeln wurden in Wasser getaucht und unbehandelte Kontrollen bestanden aus Larven, die direkt in den Lehm am Tag eins platziert wurden. Die Dosen wurden inkubiert in der Dunkelheit bei 25°C und die Anzahl an toten Larven wurde nach 7, 10, 21, 28 und 36 Tagen überprüft und die Kontrollen korrigierte Mortalität wurde berichtet {(Kontroll-Überleben – Behandlungs-Überleben)/Kontroll-Überleben) × 100%}. Eine Gesamtheit von 25 Larven wurden für jede Behandlung verwendet. Die Ergebnisse, wie in Tabelle 10 gezeigt, zeigen, dass die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib wirksam ist, gegen dritte Instar Popillia japonica.
Tabelle 10: Wirksamkeit von Verbindungen Ia und Ib gegen Popillia japonica
Beispiel 13: Wirksamkeit gegen Epilachna varivestis (mexikanischer Bohnenkäfer)
Die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib (1,8 mg/ml) wurde auf ihre pestizide Wirksamkeit gegen dritte Instar Epilachna varivestis Larven getestet. Eine eingesperrte Kolonie von erwachsenen Epilachna varivestis wurde auf Burpee's Busch-Lima-Bohnen in einer Wachstumskammer unter einer 16 : 8-Foto-Periode bei 80°F und 50% relativer Feuchtigkeit gehalten. Die Ei-Massen wurden gesammelt und man ließ sie in einer Petri-Schale, die einen feuchten Baumwoll-Docht und Lima-Bohnen-Blätter enthielt, ausbrüten. Nach zwei Tagen wurden zweite Instar Larven gesammelt und für Blatt-Eintauch Bioassays verwendet. Um den Bioassay durchzuführen, wurden die Bohnen-Blätter geerntet und der Stiel eines einzelnen Blattes wurde durch das Gummi-Septum eines Floristen-Röhrchens gestoßen, das 4 ml Wasser enthielt. Die Blätter wurden dann in serielle Verdünnungen im Bereich von 0–12% v/v des rohen Materials getaucht, das Verbindungen Ia und Ib enthielt. Wenn die Blätter einmal getrocknet waren, wurden acht bis zehn zweite Instar Larven auf jedes Blatt gegeben. Die Insekten, Blätter und die Floristen-Röhrchen wurden in einen 22 Unzen Papierbehälter platziert, bedeckt mit einem feinen Netz. Die Behälter wurden in derselben Wachstumskammer gehalten, die für das Groß-Ziehen der Käfer-Kolonie verwendet wurde. Alle zwei Tage wurden die Behälter aus der Wachstumskammer entfernt, die Larven wurden gezählt und die Blätter wurden durch frische behandelte Blätter ersetzt. Die Tests wurden nach acht Tagen beendet.
Die Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 11, zeigen, dass die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib wirksam gegen Epilachna varivestis Larven ist.
Tabelle 11: Dosis-Mortalitäts-Antwort von Epilachna varivestis Larven
Beispiel 14: Feldversuch gegen Leptinotarsa decemlineata (Colorado Kartoffel-Käfer)
Der Versuch wurde durchgeführt gegen Leptinotarsa decemlineata für eine Bekämpfung in Kartoffeln (Sorte Katahdin) mit der rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib, aufgebracht bei 50, 100, 150 und 300 Gramm pro Acre in Kombination mit NOVODOR^TM, aufgebracht bei 0,5 und 1,0 Quart pro Acre und NOCODOR^TM wurde ebenfalls allein aufgebracht bei 0,5, 1,0 und 2,0 Quarts pro Acre. Die Behandlungen wurden zweimal sieben Tage auseinander aufgebracht mit einem Rucksack-CO₂-Sprayer, ausgestattet mit drei Spray-Systemen TXVX-12 hohle Kegel-Düsen pro Reihe und kalibriert, um 32 GPA bei 3 mph und 56 psi zu verabreichen. Jede Behandlung wurde 4-mal auf Parzellen von zwei Reihen wiederholt (34 Zoll Abstand) durch 25 Fuß in einem randomisierten Block-Design. Erwachsene Leptinotarsa decemlineata und Larven-Zählungen wurden durchgeführt von oben ohne die Blätter über 50 Fuß pro Reihe/Parzelle zu stören.
Die Ergebnisse, wie in 3 gezeigt, zeigen, dass eine rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib eine signifikante synergistische Wirksamkeit mit NOVODOR^TM auf Kartoffeln bereitstellen. Bei 0,5 Quarts von NOVODOR^TM pro Acre wurde 21% Bekämpfung beobachtet, während bei 50 Gramm der rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib pro Acre 13% Bekämpfung erzielt wurde. Jedoch, wenn, sowohl NOVODOR^TM als auch die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib zusammen bei diesen Geschwindigkeiten aufgetragen wurden, stieg die prozentuale Bekämpfung auf 81%. In gleicher Weise wurde bei 100 Gramm der rohen Mischung von Verbindungen Ia und Ib pro Acre 28% Bekämpfung erhalten, während bei 0,5 Quarts von NOVODOR^TM 21% Bekämpfung beobachtet wurde, aber, wenn, sowohl NOVODOR^TM als auch die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib zusammen bei diesen Geschwindigkeiten aufgebracht wurden, stieg die prozentuale Bekämpfung auf 81%. Des Weiteren, wenn die rohe Mischung von Verbindungen Ia und Ib bei 50 Gramm pro Acre und NOVODOR^TM bei 1,0 Quart per Acre zusammen aufgebracht wurden, stieg die prozentuale Bekämpfung auf 88%.
Hinterlegung von Microorganismen
Die folgenden Stämme von Bacillus Thuringiensis wurden hinterlegt, gemäß dem Budapest-Vertrag in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional-Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.
Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur von jedem hinterlegten Stamm dar. Die Hinterlegung ist verfügbar, wie durch das Patentgesetz gefordert. Jedoch sollte verstanden werden, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz darstellt, um die vorliegende Erfindung in Beeinträchtigung von Patentrechten durchzuführen, die durch Hoheitsakt erteilt wurden.

Claims

Eine pestizide Zusammensetzung, die folgendes umfasst: (a) eine Substanz, die pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera hat, wobei die Substanz erhältlich ist aus einem Überstand einer Fermentation von einem Stamm von Bacillus, worin im wesentlichen die gesamte pestizide Wirksamkeit des Stamms in dem Überstand der Fermentation ist, (b) ein unterschiedliches Bacillus-verwandtes Pestizid, und (c) einen pestizidal wirksamen Träger, wobei die Substanz folgende Struktur hat
worin R₁ ein Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder eine Aminosäure ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Gylcinyl und Phenylglycinyl; R₂ ist Amino oder Alkylen (C_1-10); R₃ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₄ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₅ ist Wasserstoff, Methoxy, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy, R₆ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy, R₇ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₈ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrent auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₉ ist Amino oder Alkylen (C_1-10) R₁₀ ist Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure, einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₁₁ und R₁₂ können unabhängig abwesend sein oder gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester und Sauerstoff; worin Aroyl bei jedem Vorkommen unabhängig gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl und Halobenzoyl; vorausgesetzt, daß R₂ Amino ist, R₆ Wasserstoff ist und/oder R₉ Amino ist.
Ein Verfahren zur Bekämpfung eines Schädlings einer Spezies der Ordnung Coleoptera, das das Aussetzen des Schädlings gegenüber einer wirksamen schädlingsbekämpfenden Menge einer Pestiziden Zusammensetzung umfasst, die folgendes umfasst: (a) eine Substanz, die eine Pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera hat, wobei die. Substanz erhältlich ist aus einem Überstand einer Fermentation eines Stamms von Bacillus, in dem im wesentlichen die gesamte Pestizide Wirksamkeit des Stamms in dem Überstand der Fermentation ist, (b) ein unterschiedliches Bacillus-verwandtes Pestizid, und (c) einen pestizidal wirksamen Träger, wobei die Substanz folgende Struktur hat:
worin R₁ ein Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder eine Aminosäure ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₂ ist Amino oder Alkylen (C_1-10) R₃ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₄ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₅ ist Wasserstoff, Methoxy, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy; R₆ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy; R₇ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrent auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₈ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder einem Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₉ ist Amino oder Alkylen (C_1-10) R₁₀ ist Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure, einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₁₁ und R₁₂ können unabhängig abwesend sein oder gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester und Sauerstoff, worin Aroyl bei jedem Vorkommen unabhängig gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl und Halobenzoyl; vorausgesetzt, daß R₂ Amino ist, R₆ Wasserstoff ist und/oder R₉ Amino ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Schädling gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Leptinotarsa decemlineata, Anthonomas grandis, Ips calligraphus, Dendroctonus frontalis, Epilachna varivestis und Popillia japonica.
Ein Verfahren zum Verstärken der Pestiziden Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids, das folgenden Schritt umfasst: Kombinieren von (a) einer Substanz, die eine Pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera hat, wobei die Substanz aus einem Überstand einer Fermentation eines Stamms von Bacillus erhältlich ist, in dem im wesentlichen die gesamte Pestizide Wirksamkeit des Stamms in dem Überstand der Fermentation ist, und (b) eines unterschiedlichen Bacillus-verwandten Pestizids gegen einen Schädling, und wahlweise (c) eines pestizidal wirksamen Trägers, wobei die Substanz (a) in einer Menge anwesend sein kann, die ausreichend ist, um die Pestizide Wirksamkeit des Bacillus-verwandten Pestizids zu verstärken, und folgende Struktur hat:
worin R₁ ein Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure ist, einschließlich, aber nicht begrent auf Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₂ ist Amino oder Alkylen (C_1-10); R₃ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₄ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10) Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₅ ist Wasserstoff, Methoxy, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy; R₆ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10). Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy, R₇ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10) Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₈ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10) Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₉ ist Amino oder Alkylen (C_1-10) R₁₀ ist Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure, einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₁₁ und R₁₂ können unabhängig abwesend sein oder gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester und Sauerstoff; worin Aroyl bei jedem Vorkommen unabhängig gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl und Halobenzoyl; vorausgesetzt, daß R₂ Amino ist, R₆ Wasserstoff ist und/oder R₉ Amino ist.
Ein Verfahren zum Erhalten einer im wesentlichen reinen Substanz, die pestizide Wirksamkeit gegen einen Schädling der Ordnung Coleoptera hat, und die zusammen mit einem unterschiedlichen Bacillus-verwandten Pestizid gegen einen Schädling wirkt, wobei die Substanz erhältlich ist aus einem Überstand einer Fermentation eines Stamms von Bacillus thuringiensis, in dem im wesentlichen die gesamte pestizide Wirksamkeit des Stamms in dem Überstand der Fermentation ist, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Kultivieren eines Bacillus thuringiensis Stamms, in dem im wesentlichen die gesamte pestizide Wirksamkeit des Stamms in dem Überstand einer Fermentation des Stamms auf einem geeigneten Wachstumsmedium ist; (b) Gewinnen des Überstands aus (a); und (c) Isolieren der Substanz aus dem Überstand von Schritt (b), um eine im wesentlichen reine Substanz mit folgender Struktur zu erhalten:
worin R₁ Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglyinyl; R₂ ist Amino oder Alkylen (C_1-10); R₃ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₄ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrent auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₅ ist Wasserstoff, Methoxy, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy; R₆ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen oder C_1-5 Alkoxy, R₇ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₈ ist Wasserstoff, Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy, Methylamin, Dimethylamin, Thionyl, Methylthionyl, Cyano oder ein Salz davon, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat; R₉ ist Amino oder Alkylen (C_1-10); R₁₀ ist Amino, Hydroxy, Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester, Halogen, C_1-5 Alkoxy oder Aminosäure, einschließlich Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Phenylalanyl, Glycinyl und Phenylglycinyl; R₁₁ und R₁₂ können unabhängig abwesend sein oder gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Alkyl (C_1-10), Alkyl (C_1-10) Ester, Aroylester und Sauerstoff; worin Aroyl bei jedem Vorkommen unabhängig gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, Nitrobenzoyl, Dinitrobenzoyl und Halobenzoyl; vorausgesetzt, daß R₂ Amino ist, R₆ Wasserstoff ist und/oder R₉ Amino ist.