ES2206496T3 - Nueva composicion pesticida y cepa de (bacillus thuringiensis). - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA CEPA(S) DE BACILLUS THURINGIENSIS EN LA QUE ESENCIALMENTE TODA LA ACTIVIDAD PESTICIDA DE DICHA CEPA ESTA EN LA PARTE SUPERFICIAL DE UNA FERMENTACION DE DICHO TIPO. ESTE TIPO PRODUCE UNA SUBSTANCIA QUE TIENE ACTIVIDAD CONTRA UNA PLAGA DE INSECTOS DEL TIPO COLEOPTERO Y QUE AUMENTA LA ACTIVIDAD PESTICIDA DEL CORRESPONDIENTE PESTICIDA DE BACILLUS. LA INVENCION ADEMAS SE REFIERE A COMPOSICIONES DE PESTICIDA QUE COMPRENDEN LA SUBSTANCIA Y EL SOPORTE DEL PESTICIDA, O LA SUBSTANCIA Y UN PESTICIDA CORRESPONDIENTE AL BACILLUS, UN PESTICIDA QUIMICO Y/O UN VIRUS CON PROPIEDADES PESTICIDAS ASI COMO METODOS DE USO DE COMPOSICIONES PESTICIDAS PARA EL CONTROL DE LA PLAGA.

Description

Nueva composición pesticida y cepa de (Bacillus thuringiensis).

Campo de la invención

La invención tiene que ver con una nueva cepa(s) de Bacillus thuringiensis en la que, esencialmente, toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de un fermentación de dicha cepa. La cepa produce una sustancia que tiene actividad contra una plaga(s) de insectos del orden coleópteros, y que intensifica la actividad pesticida de un pesticida relacionado con el Bacillus. La invención se refiere además a composiciones pesticidas constando de la sustancia y de un soporte pesticida, o la sustancia y un pesticida relacionado con el Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas, así como métodos para utilizar las composiciones pesticidas para controlar una plaga.

Antecedentes de la invención

Cada año, por la infestación de plagas se pierden porciones significativas de los cultivos agrícolas comercialmente importantes del mundo, incluyendo alimentos, textiles, y diversas plantas domésticas, produciendo pérdidas de millones de dólares. Se han utilizado diversas estrategias para tratar de controlar tales plagas.

Una estrategia es el empleo de pesticidas de amplio espectro, esto es, pesticidas químicos con un amplio rango de actividad. Sin embargo, hay numerosas desventajas al utilizar tales pesticidas químicos. Específicamente, debido a su amplio espectro de actividad, estos pesticidas pueden destruir organismos no diana tales como insectos beneficiosos y parásitos de plagas destructivas. Adicionalmente, estos pesticidas químicos son frecuentemente tóxicos para animales y humanos, y las plagas elegidas como diana desarrollan frecuentemente resistencia cuando se exponen reiteradamente a tales sustancias.

Otra estrategia ha supuesto el empleo de biopesticidas, los cuales hacen uso de patógenos de existencia natural para controlar las infestaciones por insectos, fúngicas, y por hierbajos, de los cultivos. Los biopesticidas constan de una bacteria que produce una toxina, una sustancia tóxica para la plaga. Los biopesticidas son generalmente menos perjudiciales para los organismos no diana y el medio ambiente en su totalidad que los pesticidas químicos.

El biopesticida más ampliamente utilizado es el Bacillus thuringiensis (B.t.). El B.t. es un microorganismo extensamente distribuido, con forma de barra, aeróbico y formador de esporas. Durante su ciclo de esporulación, el B.t. produce una proteína(s) conocida como una delta-endotoxina(s) cristalina, la cual mata larvas de insectos. El B.t. es, por lo tanto, muy útil como pesticida agrícola.

Se ha descubierto que algunas cepas, por ejemplo, el Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki y el Bacillus thuringiensis subesp. aizawai, son específicas para lepidópteros. Se ha descubierto que el Bacillus thuringiensis subesp. israelensis es específico para dípteros (Goldberg, Patente U.S. Nº 4.166.112). Se ha descubierto que otras cepas, por ejemplo, el Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis (Krieg y col., 1988, Patente U.S. Nº 4.766.203) son específicas para coleópteros. En 1986 se informó del aislamiento de otra cepa de Bacillus thuringiensis, tóxica para coleópteros (Hernnstadt y col., Bio/Technology, vol. 4, 305-308, 1986, Patente U.S. 4.764.372, 1988). Esta cepa, denominada "Bacillus thuringiensis subesp. san diego", M-7, ha sido registrada en el Northern Regional Research Laboratory, EE.UU., bajo el número de entrada NRRL B-15939. Sin embargo, el cesionario de la patente '372, Mycogen Corp., ha reconocido públicamente que el Bacillus thuringiensis subesp. san diego es Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis. Además, la patente '372 ha sido cedida a Novo Nordisk A/S. Adicionalmente, se ha revelado una cepa de B.t. que es tóxica contra lepidópteros y coleópteros (Solicitud PCT Nº WO 90/13651). La toxina revelada en la Solicitud PCT Nº WO 90/13651 tiene un peso molecular de 81 kDa.

Durante su ciclo de esporulación, el B.t. produce una proteína(s) en forma cristalina conocida como una delta-endotoxina(s) cristalina, teniendo un peso molecular que oscila entre 27-140 kDa, que, en la ingestión, mata larvas de insectos. La actividad tóxica puede residir en una o más de tales delta-endotoxinas, en una cepa de B.t. dada. La mayoría de las delta-endotoxinas son protoxinas que son transformadas proteolíticamente en polipéptidos tóxicos más pequeños (truncados), en el intestino medio del insecto diana (Höfte y Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255). Las delta-endotoxinas están codificadas por genes cry (proteína cristalina). Los genes cry han sido divididos en seis clases y varias subclases basadas en similitudes estructurales y especificidad pesticida. Las clases principales son genes específicos de lepidópteros (cryI); específicos de lepidópteros y dípteros (cryII); específicos de coleópteros (cryIII); específicos de dípteros (cryIV) (Höfte y Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255); específicos de coleópteros y lepidópteros (mencionados como genes cryV por Taylor y col., 1992, Molecular Microbiology 6: 1.211-1.217); y específicos de nemátodos (mencionados como genes cryV y cryVI por Feitelson y col., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).

Las delta-endotoxinas han sido producidas mediante métodos de ADN recombinante. Las delta-endotoxinas producidas mediante métodos de ADN recombinante pueden estar o no en forma cristalina.

La delta-endotoxina de B.t. es insoluble en agua excepto a pH alcalino, y está casi siempre codificada por plásmidos. Se ha demostrado que algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen un análogo pesticida termoestable de nucleótidos de adenina, conocido como \beta-exotoxina o thuringiensina, el cual es únicamente pesticida (Sebesta y col., en H.D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, Nueva York, págs. 249-281, 1981). La \beta-exotoxina ha sido encontrada en el sobrenadante de algunos cultivos de Bacillus thuringiensis. Tiene un peso molecular de 789 y está compuesta de adenosina, glucosa, y ácido alárico (Lüthy y col., en Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, Nueva York, 1982, págs. 35-72). Su gama de huéspedes incluye, pero no se limita a, Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster, y Tetranychus cinnabarinus. Se cree que la toxicidad de la \beta-exotoxina es debida a la inhibición de la ARN polimerasa, dirigida a ADN, por competición con ATP. Se ha demostrado que la \beta-exotoxina está codificada por un plásmido Cry en cinco cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.), y que la \beta-exotoxina puede ser clasificada como \beta-exotoxina tipo I o tipo II (Levinson y col., 1990, J. Bacteriol. 172: 3.172-3.179). Se descubrió que la \beta-exotoxina tipo I estaba producida por el B.t. subesp. thuringiensis serotipo 1, el B.t. subesp. tolworthi serotipo 9, y el B.t. subesp. darmstadiensis serotipo 10. Se descubrió que la \beta-exotoxina tipo II estaba producida por el B.t. subesp. morrisoni serotipo 8ab, y es activa contra Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado). Otras sustancias hidrosolubles que se han aislado del B.t. incluyen alfa-exotoxina, que es tóxica contra las larvas de Musca domestica (Lüthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7); gamma-exotoxinas, que son diversas enzimas proteolíticas incluyendo lecitinasas, quitinasas, y proteasas, los efectos tóxicos de las cuales se expresan únicamente en combinación con beta-exotoxina o delta-endotoxina (Forsberg y col., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommitees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxina, que tiene una estructura similar a la beta-exotoxina, y es también activa contra Leptinotarsa decemlineata (Argauer y col., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213); y anhidroturingiensina (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40: 1.775, 1975).

WO 94/09630 revela una sustancia hidrosoluble que intensifica la actividad del Bacillus thuringiensis var. kurstaki y el Bacillus thuringiensis var. aizawai.

Stonard y col. (1994, In Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, eds., ACS, Washington, D.C. págs. 25-36) revela diabroticinas que tienen la estructura

1

1	R, R_{1}, R_{2} = H, R_{3} = OH	Diabroticina A
2	R, R_{1}, R_{2}, R_{3} = H	Diabroticina B

Las diabroticinas fueron aisladas del B. subtilis, y tienen actividad contra Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, larvas de mosquito, Staphylococcus aureus, y Micrococcus lutea, pero no tenían actividad contra el taladrador europeo del maíz, Escherichia coli, B. subtilis, y Pseudomonas aeruginosa. En Stonard y col. no fue revelada la actividad contra otras plagas. La diabroticina A fue aislada también de caldos de fermentación de B. cereus.

En "Studies on Insecticidial Ingredients from Culture Supernatant of Bacillus thuringiensis", Cui Yunlong y col., Acta Microbiol. 33 (1), 1993, 62-68, la actividad insecticida de un sobrenadante del cultivo de Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 fue analizada por centrifugación, cromatografía en columna, determinación de la secuencia proteica, bioensayo y otros métodos. Se descubrió que el principal ingrediente insecticida del sobrenadante del cultivo era la toxina-proteína de 60 kDa.

La técnica se ha esforzado para lograr la mortalidad incrementada de formulaciones de B.t.. Los métodos han incluido el buscar nuevas cepas con mortalidad incrementada, lograr cepas actuales, y diseñar formulaciones más eficaces combinando esporas y/o cristales de B.t. con nuevos soportes pesticidas, o con pesticidas químicos.

Es un objeto de la presente invención mejorar la actividad insecticida de formulaciones de B.t. conocidas.

Es también un objeto de la presente invención intensificar la actividad insecticida de pesticidas así como descubrir nuevos usos para productos pesticidas conocidos.

Es ventajoso aislar nuevas cepas de Bacillus thuringiensis para producir nuevas sustancias, a fin de que exista un amplio espectro de biopesticidas para cualquier plaga de insectos dada.

Sumario de la invención

La invención tiene que ver con una nueva cepa de Bacillus thuringiensis, como se define en las reivindicaciones, en la que, esencialmente, toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa. La proteína cristalina y esporas obtenidas a partir de la fermentación de una cepa de Bacillus thuringiensis de la presente invención no poseen ninguna actividad pesticida. En una forma de realización específica, la cepa se selecciona del grupo que se compone de la EMCC-0077 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21090, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0077, la EMCC-0078 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21091, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0078, la EMCC-0079 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21092, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0079, la EMCC-0080 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21093, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0080, y la EMCC-0081 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21094, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0081.

A partir del sobrenadante de la fermentación de dicha cepa se obtiene una sustancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden coleópteros y actúa conjuntamente, como potenciador o sinergizador por ejemplo, con un pesticida diferente relacionado con el Bacillus, contra una plaga. En una forma de realización preferida, dicha sustancia tiene una LC_{50} (LC_{50} es la concentración de una sustancia pesticida dada necesaria para matar el 50% de las plagas) de 126 \mug de principio activo/g de materia total contra Leptinotarsa texana. La LC_{50} del gránulo de fermentación de dicha cepa es mayor de unos 3.000 \mug de principio activo/g de materia total, como se probó mediante un bioensayo.

En otra forma de realización, dicha sustancia tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden coleópteros. En una forma de realización más específica, dicha sustancia tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos de las especies Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa texana, Anthomus grandis, así como, sorprendentemente, actividad contra una plaga de insectos de las especies Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata, y Dendroctonus frontalis del orden coleópteros.

En una forma de realización específica, dicha sustancia intensifica la actividad insecticida de la delta-endotoxina(s) cristalina de Bacillus thuringiensis contra una plaga(s) de insectos. En una forma de realización específica, dicha sustancia intensifica la actividad insecticida de la delta-endotoxina cristalina de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis contra una plaga(s) de insectos del orden coleópteros.

Como se define aquí, "un pesticida relacionado con el Bacillus" es una cepa o espora de Bacillus (por ejemplo, Bacillus thuringiensis o Bacillus subtilis). Un pesticida relacionado con el Bacillus puede ser también una sustancia derivada de Bacillus, por ejemplo, proteína o fragmento de la misma, teniendo actividad contra o que mata plagas; una sustancia que proporciona protección a las plantas, por ejemplo, sustancia antialimentación; o un microorganismo capaz de expresar un gen de Bacillus que codifica una proteína de Bacillus, o fragmento de la misma, teniendo actividad contra o que mata plagas (por ejemplo, delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis) y un soporte admisible (ver próxima sección en Composiciones). La plaga puede ser, por ejemplo, un insecto, un nemátodo, un ácaro, o un caracol. Un microorganismo capaz de expresar un gen de Bacillus que codifique una proteína de Bacillus, o fragmento de la misma, que tenga actividad contra o que mate plagas que habitan en el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas), y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de las plantas), y/o ambientes acuáticos, y sea capaz de competir con éxito en el medio ambiente particular (cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos silvestres, y proporcione el mantenimiento y expresión estables de un gen de Bacillus que codifique una proteína de Bacillus, o fragmento de la misma, teniendo actividad contra o que mate plagas. Ejemplos de tales microorganismos incluyen, pero no se limitan a, bacterias, por ejemplo, géneros Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, y Clostridium; algas, por ejemplo, familias Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae, y Chlorophyceae; y hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium.

Como se define aquí, la "actividad pesticida" mide la cantidad de actividad contra una plaga mediante la matanza o atrofiamiento del crecimiento de la plaga, o protegiendo la planta de la infestación por la plaga.

La invención se refiere además a composiciones pesticidas constando de la sustancia y el pesticida relacionado con el Bacillus, así como a métodos para utilizar las composiciones pesticidas para controlar una plaga.

La invención está además dirigida a un método para obtener sustancia "sustancialmente pura" de la presente invención, comprendiendo las etapas de:

(a) cultivar una cepa de Bacillus thuringiensis en un medio de crecimiento apropiado;

(b) recuperar el sobrenadante de (a); y

(c) someter el sobrenadante de la etapa (b) a cromatografía en columna para purificar la sustancia.

Como se define aquí, una sustancia "sustancialmente pura" significa una sustancia que contiene menos del 5% de contaminantes, por ejemplo, proteína delta-endotoxina.

Breve descripción de las figuras

Estas y otras características, aspectos, y ventajas de la presente invención serán mejor entendidas con respecto a la descripción siguiente, reivindicaciones adjuntadas, y figuras adjuntadas, donde:

La Figura 1 muestra un esquema sintético para obtener la estructura I.

La Figura 2 muestra las estructuras de los Derivados A y B.

La Figura 3 muestra la eficacia del sinergismo de Ia/Ib y NOVODOR™ en Leptinotarsa decemlineata.

Descripción detallada de la invención Obteniendo la sustancia

Se puede obtener la sustancia(s) a partir del sobrenadante de la fermentación de Bacillus thuringiensis que incluye, pero no se limitan a, las cepas de B.t. EMCC-0077 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21090, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0077, la EMCC-0078 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21091, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0078, la EMCC-0079 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21092, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0079, la EMCC-0080 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21093, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0080, y la EMCC-0081 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21094, o mutantes de la misma teniendo sustancialmente las mismas propiedades de la EMCC-0081.

La sustancia tiene actividad contra una plaga(s) de insectos del orden coleópteros, y actúa conjuntamente con un pesticida relacionado con el Bacillus como, por ejemplo, potenciador o sinergizador.

La sustancia tiene la estructura Ia, en lo sucesivo mencionada como "Ia", o Ib, en lo sucesivo mencionada como "Ib".

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Ia: R, R_{1}, R_{2}, R_{3} = H

Ib: R, R_{1}, R_{2} = H, R_{3} = OH

El Bacillus thuringiensis puede ser cultivado utilizando medios y técnicas de fermentación conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Rogoff y col., 1969, J. Invertebrate Path. 14: 122-129; Dulmage y col., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353:358; Dulmage y col., en Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, ed., Academic Press, Nueva York, 1980). A la terminación del ciclo de fermentación, se puede recuperar el sobrenadante separando las esporas y cristales de B.t. del caldo de fermentación por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, centrifugación y/o ultrafiltración, Dicha sustancia está contenida en el sobrenadante, el cual puede ser recuperado por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ultrafiltración, evaporación, y secado por pulverización.

Alternativamente, la sustancia(s) de la presente invención puede ser obtenida mediante síntesis química, utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Para obtener la estructura I, se puede formar el anillo simple de pirazina, con sustitución adecuada y grupos protectores, mediante varias reacciones, por ejemplo, condensación espontánea de compuestos de alfa-aminocarbonilo. Se forma un intermedio de dihidropirazina, pero se oxida fácilmente a pirazina con oxígeno. Mediante este método, la dimerización de un único compuesto de alfa-aminocarbonilo conduciría a una única pirazina, mientras que una reacción con dos compuestos de alfa-aminocarbonilo diferentes conduciría a tres productos; dicha sustancia sería aislada mediante separación cromatográfica (ver Figura 1). La última reacción permite la síntesis de pirazinas con diferentes sustituyentes fuera a cada lado del anillo.

La purificación de la sustancia(s) se puede llevar a cabo mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, de afinidad, y de exclusión granulométrica), procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, extracción, o cualquier otra técnica patrón conocida en la técnica (ver, por ejemplo, Protein Purification, eds. J-C. Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

La actividad de dicha sustancia puede ser bioensayada utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como incorporación en la dieta artificial, cubrimiento de la dieta artificial, pintado de las hojas, inmersión de las hojas, y pulverización foliar. En la sección de Ejemplos, abajo, se dan ejemplos específicos de tales bioensayos.

Composiciones comprendiendo la sustancia

Dicha sustancia puede ser formulada sola; junto con un pesticida relacionado con el Bacillus, el cual, como se definió antes, es una cepa de Bacillus, espora, proteína o fragmento de la misma teniendo actividad contra, o que mate plagas, y, opcionalmente, un soporte admisible dentro de una composición(s) pesticida, esto es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, unos polvos secantes, un gránulo dispersable, un polvo humectable, un concentrado emulsificable, un aerosol o gránulo impregnado. Ejemplos de tales cepas de Bacillus incluyen, pero no se limitan a, Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki (comercializada como DIPEL™ de Abbott Laboratories, Inc., JAVELIN™ de Sandoz, BIOBIT™ de Novo Nordisk A/S, FORAY™ de Novo Nordisk A/S, MVP™ de Mycogen, BACTOSPEINE™ de Novo Nordisk A/S, y THURICIDE™ de Sandoz); Bacillus thuringiensis subesp. aizawai (comercializada como FLORBAC™ de Novo Nordisk A/S, y XENTARI™ de Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis (comercializada como NOVODOR™ de Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ de Sandoz, M-TRAK™ y M-ONE™ de Mycogen); Bacillus thuringiensis subesp. israelensis (comercializada como BACTIMOS™ o SKEETAL™ de Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ de Sandoz, y VECTOBAC™ de Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus sphaericus (comercializada como SPHERIMOS™ de Novo Nordisk A/S); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (comercializada como FOIL™ de Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (comercializada como CONDOR™ de Ecogen, y AGREE™ de Ciba-Geigy); y Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (comercializada como CUTLASS™ de Ecogen). La proteína relacionada con el Bacillus puede ser seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV, y CryVI.

Dicha sustancia puede ser formulada también con otros factores o sustancias obtenidos del sobrenadante de un sobrenadante de Bacillus, que incluyen, pero no se limitan a, una exotoxina y/o el factor intensificador revelado en la solicitud nº de serie 08/095.240, registrada el 20 de julio de 1993, incorporada aquí como referencia. Opcionalmente, la formulación también puede comprender un pesticida relacionado con el Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas, y un soporte admisible.

En una forma de realización específica, los componentes de dicha composición pueden actuar de una manera sinérgica. Por consiguiente, dicha composición puede tener mayor eficacia que la que pueda ser lograda con cada componente individual. Alternativamente, dicha sustancia puede actuar para intensificar un pesticida relacionado con el Bacillus.

En composiciones constando de la sustancia y un pesticida relacionado con el Bacillus, la sustancia está presente en la cantidad de aproximadamente 0'001 a aproximadamente 300 g por ULT. Como se define aquí, "ULT" es una unidad de Leptinotarsa texana como se determinó mediante bioensayo. El bioensayo compara la muestra con una materia de referencia estándar de Bacillus, utilizando Leptinotarsa texana u otra plaga como organismo de ensayo estándar. La potencia se determina dividiendo la LC_{50} estándar de referencia y multiplicando luego por la potencia estándar de referencia.

En otra forma de realización, la composición puede constar de dicha sustancia, en forma sustancialmente pura, o de un sobrenadante de Bacillus en forma seca, concentrada, o líquida, y de un soporte pesticida admisible, ejemplos de los cuales están revelados posteriormente. Esta composición puede ser aplicada independientemente a una planta, por ejemplo, plantas transgénicas. Específicamente, la composición puede ser aplicada a una planta conteniendo previamente un gen de Bacillus thuringiensis. En otra forma de realización, la composición puede ser aplicada a una planta previamente expuesta a una composición de Bacillus thuringiensis. La sustancia está presente en la composición en una concentración entre aproximadamente el 0'001% y aproximadamente un 60% (p/p).

Tales composiciones reveladas anteriormente se pueden obtener mediante la adición de un agente tensoactivo, un soporte inerte, un conservante, un humectante, un estimulador de la alimentación, un atrayente, un agente de encapsulación, un aglomerante, un emulsificante, un colorante, un protector de U.V., un tampón, un agente de fluencia, u otro componente para facilitar el manejo y aplicación del producto para plagas diana particulares.

Los agentes tensoactivos apropiados incluyen, pero no se limitan a, compuestos aniónicos tales como un carboxilato, por ejemplo, un carboxilato metálico de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcoholes grasos o sales de tales ésteres; sulfatos de alcoholes grasos tales como dodecilsulfato sódico, octadecilsulfato sódico o cetilsulfato sódico; sulfatos de alcoholes grasos etoxilados; alquilfenolsulfatos etoxilados; ligninsulfonatos; sulfonatos de petróleo, alquilarilsulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos o alquilnaftalensulfonatos inferiores, por ejemplo, butilnaftalensulfonato; sales de condensados de naftalenformaldehído sulfonados; sales de condensados de fenolformaldehído sulfonados; o sulfonatos más complejos tales como los amidosulfonatos, por ejemplo, el producto de condensación sulfonado de ácido oleico y N-metiltaurina, o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato o dioctilsuccinato sódicos. Los agentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, productos de condensación de ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o fenoles grasos alquil- o alquenilsustituidos con óxido de etileno, ésteres grasos de éteres de alcoholes polihídricos, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, productos de condensación de tales ésteres con óxido de etileno, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno y sorbitán, copolímeros de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Ejemplos de un agente tensoactivo catiónico incluyen, por ejemplo, una mono-, di- o poliamina como un acetato, naftenato u oleato; una amina conteniendo oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilenalquilamina; una amina unida a amida preparada por la condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.

Los ejemplos de materias inertes incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos tales como caolín, mica, yeso, fertilizante, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, o fosfatos; materias orgánicas tales como azúcar, almidones, o ciclodextrinas; o materiales botánicos tales como productos de madera, corcho, mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de cacahuete, y cáscaras de nuez.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma adecuada para su aplicación directa, o como concentrado o composición primaria que requiera la dilución con una cantidad apropiada de agua u otro diluyente antes de su aplicación. La concentración de pesticida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o para ser utilizado directamente. La composición contiene 1 a 98% en peso de un soporte inerte sólido o líquido, y 0 a 50%, preferentemente 0'1 a 50%, de un surfactante. Estas composiciones serán administradas en la proporción marcada por el producto comercial, preferentemente alrededor de 0'01 libras a 5'0 libras por acre cuando esté en forma seca, y aproximadamente 0'01 pintas a 25 pintas por acre cuando esté en forma líquida.

En una forma de realización adicional, el pesticida relacionado con el Bacillus y/o sustancia pueden ser tratados antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se apliquen al entorno de una plaga diana siempre que el pretratamiento no sea nocivo para el pesticida relacionado con el Bacillus o sustancia. Tal tratamiento puede ser mediante un método químico y/o físico siempre que el tratamiento no afecte perjudicialmente las propiedades de la composición(s). Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no se limitan a, agentes halogenantes; aldehídos tales como formaldehído y glutaraldehído; antiinfecciosos tales como cloruro de zefirán; alcoholes tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos tales como fijador de Bouin y fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman y Co., 1967).

Las composiciones de la invención se pueden aplicar directamente a la planta mediante, por ejemplo, pulverización o fumigación en el momento cuando la plaga haya empezado a aparecer en la planta, o antes de la aparición de las plagas como medida protectora. Las plantas a proteger dentro del campo de aplicación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y cultivos afines), remolachas (remolacha azucarera y remolacha para forraje), drupas, pomas y frutas blandas (manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, y moras), plantas leguminosas (alfalfa, judías, lentejas, guisantes, habas de soja), plantas oleosas (colza, mostaza, amapola, olivas, girasoles, cocos, plantas de aceite de ricino, granos de cacao, cacahuetes), plantas cucurbitáceas (pepino, calabacines, melones), plantas fibrosas (algodón, lino, cáñamo, yute), frutos cítricos (naranjas, limones, pomelo, mandarinas), hortalizas (espinaca, lechuga, espárragos, repollos y otras brassicas, zanahorias, cebollas, tomates, patatas), lauráceas (aguacates, canela, alcanfor), árboles de hoja caduca y coníferas (tilos, tejos, robles, alisos, álamos, abedules, abetos, alerces, pinos), o plantas tales como maíz, plantas turba, tabaco, avellanos, café, caña de azúcar, té, parras, lúpulo, plátanos y plantas del caucho natural, así como plantas ornamentales. La sustancia se puede aplicar mediante aplicación foliar, surco, gránulo sembrado a voleo, "en un apartado", o humedecimiento de la tierra. Generalmente, es importante obtener buen control de las plagas en las etapas tempranas del crecimiento de las plantas ya que es el momento cuando la planta puede ser más severamente dañada. La pulverización o polvo puede contener convenientemente otro pesticida si se cree que es necesario. En una forma de realización preferida, la composición de la invención se aplica directamente a la planta.

Las composiciones de la presente invención pueden ser eficaces contra plagas de insectos del orden coleópteros, por ejemplo, Leptinotarsa sp. (por ejemplo, Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus frontalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolium destructor. Las composiciones de la presente invención pueden ser también eficaces contra plagas de insectos que incluyen, pero no se limitan a, plagas del orden lepidópteros, por ejemplo, Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phrygadinia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spinolota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; dípteros, por ejemplo, Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; ácaros, por ejemplo, Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; himenópteros, por ejemplo, Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; isópteros, por ejemplo, Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; sifonápteros, por ejemplo, Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; y tilénquidos, por ejemplo, Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.

Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustración, no como limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo de diversos aislados de B.t.

Se utilizaron subcultivos de EMCC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080, y EMCC-0081, mantenidos en pendientes de Caldo Nutriente/Agar, para inocular matraces de agitación de 250 ml, con deflectores, conteniendo 50 ml de medio con la composición siguiente.

Licor de macerado de maíz	15 g/l
Maltrin-100	40 g/l
Almidón de patata	30 g/l
PO_{4}H_{2}K	1'77 g/l
PO_{4}HK_{2}	4'53 g/l

El pH del medio se ajusta a 7'0 utilizando NaOH 10N.

Después de la inoculación, los matraces de agitación fueron incubados a 30ºC en un agitador rotativo, a 250 rpm durante 72 horas. Los caldos de cultivo íntegros son utilizados para ensayar contra Diabrotica undecimpunctata.

Ejemplo 2 Actividad de la Diabrotica undecimpunctata en caldo de cultivo integro a partir de diversos aislados de B.t.

Se extraen 2'5 ml de los caldos de cultivo íntegros obtenidos de la fermentación anterior, y se transfieren desde los matraces de agitación a tubos de bioensayo de polipropileno de 50 ml. Se añade dieta de Diabrotica undecimpunctata dentro de cada tubo, hasta un volumen final de 25 ml. Luego se mezcla vigorosamente la dieta y el material de ensayo, y para el bioensayo se dispensa en bandejas de bioensayo. Sobre la superficie de la "dieta" se aplican tres a seis huevos de Diabrotica undecimpunctata. Se plancha milar sobre las bandejas de bioensayo, y se incuban las bandejas a 28ºC sin fotoperíodo. La puntuación se lleva a cabo a los 7 días. Se puntúa la mortalidad al séptimo día después de la incubación. SS7 = el número de larvas muertas al séptimo día cuando se compara con las larvas vivas de control en el mismo día que SS7 de 4. SS7 = 3, SS7 = 2, y SS7 = 1, representan el número de larvas como 75%, 50%, y 25%, respectivamente, de las larvas vivas de control de 4.

En la Tabla 1, abajo, se muestran los resultados. Estos resultados indican que, en las cinco cepas ensayadas, la mortalidad fue del 100%. Además, las larvas muertas fueron el 12'5% del número de larvas vivas de control.

TABLA 1 Actividad de la Diabrotica undecimpunctata en caldos de cultivo íntegros

Cepa	% de Mortalidad	SS7
EMCC-0077	100	0,5
EMCC-0078	100	0,5
EMCC-0079	100	0,5
EMCC-0080	100	0,5
EMCC-0081	100	0,5

Ejemplo 3 Localización de actividad de la Diabrotica undecimpunctata

Para ensayar si la actividad de la Diabrotica undecimpunctata está asociada con la delta-endotoxina/esporas o el sobrenadante, se centrifuga 2'5 ml de los caldos de cultivo íntegros de EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081, y NB125 (un Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis cultivado en idénticas condiciones) en una centrífuga Sorvall RC-5B a 15.000 rpm (rotor Sorvall SS34), durante 15 minutos, para separar el sobrenadante y el gránulo. En el gránulo se recuperan las delta-endotoxinas cristalinas más las esporas. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado EMCC-0077 de B.t., activo para Diabrotica undecimpunctata, tienen pesos moleculares de 66 kDa, 29 kDa, y 12 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado EMCC-0078 de B.t., activo para Diabrotica undecimpunctata, tienen pesos moleculares de 153 kDa, 77 kDa, 67 kDa, 61 kDa, 50 kDa, 42 kDa, 34 kDa, 30 kDa, 24 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado EMCC-0079 de B.t., activo para Diabrotica undecimpunctata, tienen pesos moleculares de 135-145 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado EMCC-0080 de B.t., activo para Diabrotica undecimpunctata, tienen pesos moleculares de 94 kDa y 40 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta- endotoxinas producidas por el aislado EMCC-0081 de B.t., activo para Diabrotica undecimpunctata, tienen pesos moleculares de 129 kDa y 32 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE.

Cada sobrenadante (2'5 ml), obtenido de la centrifugación anterior, es transferido a un tubo de bioensayo de polipropileno de 50 ml. Luego, el gránulo es resuspendido en 2'5 ml de agua destilada estéril y transferido a un tubo independiente de bioensayo de polipropileno de 50ml. Después se añade Diabrotica undecimpunctata dentro de los tubos de bioensayo, los cuales contenían el sobrenadante o el gránulo resuspendido hasta un volumen final de 25 ml. Las etapas restantes del bioensayo son idénticas a las descritas anteriormente. La puntuación es también la misma que se describió antes.

Como se ve en la Tabla 2, los resultados muestran que la actividad para Diabrotica undecimpunctata de la EMCC-0077, EMCC-0080, y EMCC-0081, está presente en todos los sobrenadantes, mientras que la menor actividad para Diabrotica undecimpunctata del conocido Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis se concentra en el gránulo (espora mas cristal).

TABLA 2 Actividad de la Diabrotica undecimpunctata en sobrenadante y gránulo

Cepa	Fracción	% de Mortalidad	Puntuación de atrofia
EMCC-0077	Sobrenadante	100	0,5
	Gránulo	10	3,0
EMCC-0080	Sobrenadante	100	0,5
	Gránulo	0	4,0

TABLA 2 (continuación)

Cepa	Fracción	% de Mortalidad	Puntuación de atrofia
EMCC-0081	Sobrenadante	100	0,5
	Gránulo	0	3,0
NB125	Sobrenadante	0	3,0
	Gránulo	50	1,5

Ejemplo 4 Actividad contra Leptinotarsa texana

Después de filtración a través de una membrana de 0'2 \mu, se utiliza el sobrenadante de EMCC-0080, obtenido del Ejemplo 1, para ensayar la actividad contra escarabajos.

El sobrenadante filtrado es aplicado a las hojas de berenjena, en un volumen de 20 GPA (galones por acre). Las diluciones son 0, 1:1, 1:4, 1:8 (sobrenadante:agua desionizada, v/v).

Se exponen larvas de Leptinotarsa texana a las hojas tratadas, siguiendo un protocolo estándar. Cada planta se carga con 20 larvas de Leptinotarsa texana.

Los resultados tabulados en la Tabla 3, abajo, muestran que el sobrenadante de EMCC-0080 filtrado es activo contra Leptinotarsa texana.

TABLA 3 Actividad de la Leptinotarsa texana en EMCC-0080

Cepa	Dilución	% de Mortalidad
EMCC-0080	0	95
	1:1	55
	1:4	20
	1:8	0
Control no tratado		0

Ejemplo 5 Efecto sinérgico de EMCC-0080 y NOVODOR™

Los resultados mostrados en la TABLA 3, arriba, indican que el sobrenadante de EMCC-0080 no es activo a dilución 1:8 (v/v) solo. Sin embargo, cuando las hojas de berenjena se tratan con 1'25% ó 2'5% de sobrenadante de EMCC-0080 concentrado 10 veces más 200 \mug/ml de NOVODOR™ (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), se obtiene un efecto sinérgico como se demuestra por el fuerte descenso de la LC_{50} y LC_{90} del NOVODOR™. Los datos están presentados en la TABLA 4 abajo.

TABLA 4 Efecto sinérgico de EMCC-0080 y NOVODOR™

Muestra	LC_{50} (\mug/g)^{1}	LC_{90} (\mug/g)^{2}	Pendiente^{3}
NOVODOR™	642	4,286	1,55
NOVODOR™ +	250	1,292	1,79
1'25% de EMCC-0080
NOVODOR™ +	98	490	1,83
2'5% de EMCC-0080
^{1} La LC_{50} se define como la concentración que mata el 50% de la población de insectos diana.
^{2} La LC_{90} se define como la concentración que mata el 90% de la población de insectos diana.
^{3} La pendiente se refiere a la pendiente de una curva de % de mortalidad frente al log. de la concentración.

Ejemplo 6 Purificación de sustancia activa para coleópteros, producida por la cepa EMCC-0080 de B.t.

Se cultiva cepa EMCC-0080 de B.t. durante 24 horas, a 30ºC, en un medio con la siguiente composición en gramos por litro, a pH 7'0:

Maltodextrina	40 g
Proteína de soja	40 g
PO_{4}H_{2}K	1'8 g
PO_{4}HK_{2}	4'5 g
SO_{4}Mg \cdot 7H_{2}O	0'3 g
Metales traza	0'2 ml

Las células y otros insolubles son eliminados por centrifugación del caldo de cultivo íntegro de la cepa EMCC-0080 de B.t, seguido por filtración del sobrenadante resultante a través de Celite y una membrana de 0'2 \mu. Luego, el permeato resultante se concentra diez veces por evaporación.

La purificación de la sustancia(s) activa para coleópteros, a partir del permeato concentrado 10 veces, se logra utilizando un procedimiento de purificación de cuatro etapas. Durante la purificación, se supervisa la actividad mediante un bioensayo de superficie de Diabrotica undecimpunctata como se describe abajo, y se determina la pureza mediante electroforesis capilar como se describe en el Ejemplo 8. Todas las etapas cromatográficas emplean detección a 226 nm.

Específicamente, el bioensayo de superficie se conduce como sigue. Muestras del permeato concentrado 10 veces son aplicadas a pocillos individuales de una placa de microtitulación conteniendo 200 \mul/pocillo de dieta artificial solidificada para insectos, y luego se secan al aire. En cada pocillo se ponen suavemente, con un pincel, dos a cuatro neonatos de Diabrotica undecimpunctata (gusano de la raíz del maíz, GRM). Luego, las placas de microtitulación se sellan con milar perforado con agujeros para intercambio de aire, y se incuban a 30ºC y 80% de humedad. La puntuación del porcentaje de mortalidad se lleva a cabo a los 5 días.

En la primera etapa, el permeato concentrado 10 veces es en primer lugar purificado mediante cromatografía en columna (5 x 30 cm) SP Sephadex® C-25 (intercambio catiónico) de Pharmacia. Se diluye hasta 18 litros, con agua desionizada, una muestra de 450 ml del permeato concentrado 10 veces, se carga en la columna, la cual está preequilibrada con tampón de acetato amónico 20mM, a pH 5'0. La columna es elucionada, a 18 ml por minuto, con un gradiente continuo de 5'0 litros de tampón de acetato amónico desde 20mM hasta 0'5M, a pH 5'0. Se recogen fracciones de 10 ml, se bioensayan, y se examinan por su pureza. Se combinan las fracciones activas (aproximadamente 150 ml), se liofilizan, y se redisuelven en agua desionizada hasta aproximadamente 1/5 del volumen original.

En la segunda etapa, se carga una muestra de 25 ml de la primera etapa en una columna (5 x 100 cm) de exclusión granulométrica P2 (extrafina) de BioRad, la cual está preequilibrada con agua desionizada. La columna es elucionada, a una velocidad de flujo de 1 ml por minuto, con agua desionizada. Se recogen fracciones de 10 ml, se bioensayan, y se examinan por su pureza mediante electroforesis capilar. Se combinan las fracciones activas (aproximadamente 400 ml).

En la tercera etapa, la mezcla de 400 ml de la segunda etapa se diluye, hasta 16 litros, con agua desionizada. Se carga la solución en una columna (5 x 30 cm) S Sepharose® Fast Flow (intercambio catiónico fuerte) de Pharmacia, la cual está preequilibrada con tampón de acetato amónico 20mM, a pH 5'0. La columna es elucionada, a una velocidad de flujo de 17 ml por minuto, con un gradiente continuo de 5'0 litros de tampón de acetato amónico desde 20mM hasta 0'5M, a pH 5'0. Se recogen fracciones de 20 ml, se bioensayan, y se examinan por su pureza. Se combinan las fracciones activas (aproximadamente 250 ml), y luego se liofilizan hasta sequedad para eliminar el tampón de acetato amónico volátil.

En la cuarta etapa, la mezcla liofilizada de la tercera etapa se disuelve en 400 ml de agua desionizada. La solución se carga en una columna (0'9 x 30 cm) Chelex® de BioRad, la cual estaba preequilibrada con tampón de formiato amónico 20mM, a pH 4'0. La columna es elucionada, a una velocidad de flujo de 5 ml por minuto, con un gradiente por etapas de 2'4 litros, desde 0'02 \rightarrow 0'1 \rightarrow 0'2 \rightarrow 0'35 \rightarrow 0'5 \rightarrow 1'0M, de tampón de formiato amónico, a pH 4'0. Se recogen fracciones de 20 ml, se bioensayan, y se examinan por su pureza. Se combinan las fracciones activas (aproximadamente 300 ml), y luego se liofilizan hasta sequedad para eliminar el tampón de formiato amónico volátil.

La electroforesis capilar muestra que la materia purificada, activa contra coleópteros, consta de dos compuestos, Ia y Ib.

Ejemplo 7 Aclaración de las estructuras de las sustancias activas para coleópteros

Las estructuras de los compuestos Ia y Ib son explicadas a partir de los datos espectroscópicos recogidos de sus derivados acetilados.

Una mezcla de 114 mg de Ia y Ib es acetilada, en 5'0 ml de piridina, con 5'0 ml de anhídrido acético y un cristal de 4-dimetilaminopiridina como catalizador, durante 24 horas a temperatura ambiente, y luego purificada mediante HPLC RP-C_{18} semipreparativa. En la columna se carga una muestra de 5 mg en 25 \mul, y se eluciona, a 4 ml por minuto, con 80% de agua-20% de acetonitrilo. La detección es a 254 nm.

De la purificación se obtienen dos derivados acetilados, denominados como Derivado A y Derivado B. En la Figura 4 se muestran las estructuras de los Derivados A y B.

Los datos espectroscópicos de RMN recogidos del Derivado A indican la presencia de 14 carbonos y 17 protones. Sin embargo, los datos espectrales de masas sugieren un peso molecular de 652 y una fórmula de C_{28}H_{40}N_{6}O_{12} (masa exacta, 653'2801; MH+ calculado, 653'2782). Por lo tanto, se determina que el compuesto es simétrico, donde se observan únicamente la mitad de las señales mediante RMN.

Mediante RMN se observan varios sistemas de espín. Un anillo pirazina central, sustituido en las posiciones 2 y 5, está indicado por los singletes protónicos de alto campo a 8'6 ppm (H-3 y H-6), el cual muestra acoplamientos de gran amplitud para todos los carbonos en el anillo y para el primer carbono de la cadena lateral (C-7). La cadena lateral de tres carbonos está acetilada en ambas posiciones 7 y 8, con un metileno en la posición 9. Se descubre que el carbono 9 tiene una correlación de gran amplitud por el carbonilo de un éster, y se determina que el éster es parte de un alanina que está acetilado en el grupo amino.

La estructura del Derivado B difiere en una posición de la del Derivado A. En una de las cadenas laterales del Derivado B, el carbono C-7 no está más tiempo acetilado o unido a oxígeno, pero se descubre que es un metileno. La otra cadena lateral es idéntica a la del Derivado A. Esta diferencia de solamente un oxígeno es también observada en los datos espectrales de masas. Los datos espectrales de masas se obtienen con una masa exacta de 595'2722 (MH+, calculado, 595'2727) para el Derivado B, indicando una fórmula de C_{26}H_{38}N_{6}O_{10}. Las densidades ópticas de los Derivados A y B son como sigue:

Derivado A [\alpha]_{D}^{27} = -6'9ºC

Derivado B [\alpha]_{D}^{27} = +32ºC

Las asignaciones completas de los datos de RMN ^{1}H y ^{13}C se hacen según la base de experimentos de desacoplamiento, COSY, HMQC y HMBC. Las asignaciones están presentadas en la TABLA 5.

TABLA 5 Datos de RMN ^{1}H y ^{13}C del derivado A y derivado B en metanol D-4

3

\newpage

Los datos espectrales de masas para la mezcla de compuestos Ia y Ib dan dos iones moleculares de 400 y 384. A partir de estos datos se determina que la fórmula molecular del compuesto Ia es C_{16}H_{28}N_{6}O_{6} y la del compuesto Ib es C_{16}H_{28}N_{6}O_{5}. Las estructuras de Ia y Ib son determinadas comparando los datos de RMN del Derivado A y Derivado B con los datos de RMN de la mezcla de Ia y Ib. Abajo se muestran las estructuras de Ia y Ib.

4

Ia: R, R_{1}, R_{2}, R_{3} = H

Ib: R, R_{1}, R_{2} = H, R_{3} = OH

Las propiedades de los compuestos Ia y Ib, y de sus derivados acetilados, están resumidas abajo:

Derivado A:

	Peso molecular	652
	Fórmula empírica	C_{28}H_{40}N_{6}O_{12}
	UV (MeOH)	275'310 nm
	MS (FAB)	(M+H) m/z 653'2801; calculado, 653'2782

Derivado B:

	Peso molecular	594
	Fórmula empírica	C_{26}H_{38}N_{6}O_{10}
	UV (MeOH)	275'310 nm
	MS (FAB)	(M+H) m/z 595'2722; calculado, 595'2727

Ia:

	Peso molecular	400
	Fórmula empírica	C_{16}H_{28}N_{6}O_{6}
	UV (H_{2}O)	275'310 nm
	MS (FAB)	(M+H) 401

Ib:

	Peso molecular	384
	Fórmula empírica	C_{16}H_{28}N_{6}O_{5}
	UV (H_{2}O)	275'310 nm
	MS (FAB)	(M+H) 385

Ejemplo 8 Cuantificación de los compuestos Ia y Ib en caldos de fermentación

Se cultiva la cepa EMCC-0080 de B.t. como se describe en el Ejemplo 1. La concentración de los compuestos Ia y Ib se determina por electroforesis capilar.

Específicamente, para la cuantificación se utiliza un Sistema de Electroforesis Capilar Biofocus 3000 de BioRad, equipado con un capilar no revestido (50 \mum x 50 cm), tampón de fosfato 0'1M a pH 2'5, voltaje a 20 KV, polaridad positivo a negativo, y detección a 200 nm. El volumen de muestra es 30 \mul, con una segunda inyección de 5 psi. El tiempo de análisis es 10 minutos, con los compuestos Ia y Ib, activos para coleópteros, elucionando en 6'0 y 5'9 minutos, respectivamente.

Alternativamente, para la cuantificación se utiliza Sistema de Electroforesis Capilar P/ACE 2100 de Beckman, equipado con un capilar no revestido (50 \mum x 47 cm), tampón de fosfato 0'1M a pH 2'5, voltaje a 20 KV, polaridad positiva a negativa, y detección a 200 nm. El volumen de muestra es 30 \mul, con una inyección a presión de 10 segundos. El tiempo de análisis es 10 minutos, con los compuestos Ia y Ib, activos para coleópteros, elucionando en 7'0 y 6'7 minutos, respectivamente.

Las células y otros insolubles son eliminados del caldo de cultivo íntegro, de cepa EMCC-0080 de B.t., por centrifugación y por filtración a través de Celite y una membrana de 0'2. El sobrenadante resultante se analiza mediante electroforesis capilar como se describió antes. Los resultados indicaron que los compuestos Ia y Ib, activos para coleópteros, están presentes cada uno a un nivel de aproximadamente 90 mg por litro de caldo de cultivo.

Ejemplo 9 Determinación de la potencia de los compuestos Ia y Ib

La potencia relativa de una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib (aproximadamente 1:1, p/p) se determina utilizando Leptinotarsa texana como insecto de prueba, y comparando la mortalidad asociada con una preparación patrón interna de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis.

Se realizan bioensayos foliares para determinar la potencia de una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib contra Leptinotarsa texana. Para realizar el bioensayo foliar, se pesan las materias de ensayo y los estándares en tubos de centrífuga de 50 ml, y se suspenden con agua desionizada conteniendo 0'1% de Tween™ 20. Aparte se pesan 1.200 mg de estándar de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis y se suspenden para dar una concentración final de 12.000 \mug/g. Las muestras de ensayo (esto es, NOVODOR™, y NOVODOR™ con compuestos Ia y Ib) son tratadas de una manera similar a menos que un bioensayo descubridor de la proporción haya demostrado que la dosis liberada sea demasiado alta, o demasiado baja, para producir un número suficiente de puntos de los datos válidos. Si este fuera el caso, se aumenta o disminuye la concentración de la solución madre primaria cambiando la cantidad de diluyente añadido a la solución madre. Luego, se homogeniza cada muestra, durante 30 segundos, utilizando un Homogenizador Virtis, y se sonica durante 20 segundos, a 100 watios, utilizando un homogenizador ultrasónico Braunsonic 1510. Después, cada una de esas soluciones madre es diluida utilizando un Microlab 1000 Hamilton, para dar siete diluciones en serie comprendiendo 3.000, 2.000, 1.333, 857, 545, 364, y 245 \mug/ml en un total de 16 ml. Cada una de estas soluciones de 16 ml es aplicada a aproximadamente 288 pulgadas cuadradas de hojas de berenjena, utilizando un pulverizador Devries Linear Track calibrado para repartir 20 galones por acre. Las hojas de control son pulverizadas con 16 ml de agua desionizada. Las hojas son secadas al aire y puestas luego sobre el borde de una copa de plástico transparente, de una onza, conteniendo 5 larvas de Leptinotarsa texana de segundo estado larvario. Luego, se ponen tapas de cartulina sobre la hoja, y se presiona la tapa en el sitio, cortando un disco de hoja de 4 cm y cerrándolo dentro de la copa. Después se invierten las copas y caen las larvas sobre la superficie tratada de la hoja. Se preparan ocho copas para cada una de las siete diluciones en serie. Las copas son golpeadas a la vez, etiquetadas, puestas en estantes, e incubadas durante 3 días a 30ºC y 65% de humedad relativa. Estas 56 copas experimentales, y las 8 copas de control, constituyen un bioensayo.

Después de tres días, se estima la mortalidad de los insectos. A cada copa se le da un fuerte golpe, y las larvas que no movieron se cuentan como muertas. Se calcula el porcentaje de mortalidad, y los datos se analizan vía análisis de la unidad de probabilidad en paralelo. Se estiman las LC_{50}s, LC_{90}s, pendiente de las líneas de regresión, coeficiente de variación, y potencias.

Para determinar la potencia, se diluye una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib, se bioensaya, y se compara a un estándar de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis que tiene asignada una potencia de 20.000 ULT/gramo (Unidades de Leptinotarsa texana/gramo).

Los resultados de potencia están presentados en la Tabla 6, abajo, e indican que la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib (1:1 p/p) tiene una potencia de 75.555 ULT por g de principio activo, con una LC_{50} de 70 \mug por ml (1'8 mg de principio activo total por ml).

TABLA 6 Potencia de una mezcla de compuestos Ia y Ib

Muestra	LC_{50} (\mug/ml)	Potencia estimada
Mezcla Ia/Ib	70	75.555 ULT

Ejemplo 10 Potenciación de delta-endotoxina cristalina de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis con compuestos Ia y Ib

La capacidad de los compuestos Ia y Ib para potenciar la actividad insecticida de la delta-endotoxina cristalina de Bacillus thuringiensis subesp. tenebrionis contra Leptinotarsa texana fue determinada añadiendo una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib a NOVODOR™, y midiendo las LC_{50}s vía análisis de la unidad de probabilidad en paralelo.

Se realizan bioensayos foliares contra Leptinotarsa texana, como se describió en el Ejemplo 9, para determinar el nivel de potenciación ganado añadiendo compuestos Ia y Ib a NOVODOR™. Se añade una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib a NOVODOR™. Las soluciones se diluyen en serie utilizando el Microlab 1000 de Hamilton, para dar soluciones madre conteniendo NOVODOR™ a 1.000'0, 666'7, 444'4, 285'7, 181'8, 121'2, y 80'0 \mug/g. Se preparan dos diluciones diferentes de una mezcla de Ia y Ib, produciendo siete diluciones en serie conteniendo 72'0, 48'0, 32'0, 20'6, 13'1, 8'7, y 5'8 \mug/g (2'5% v/v con 1.000 \mug/g de NOVODOR™); y 36'0, 24'0, 16'0, 10'3, 6'5, 4'4, y 2'9 \mug/g (1'25% v/v con 1.000 \mug/g de NOVODOR™). También se preparan muestras puras (sin compuestos Ia y Ib) y sustancias de referencia. Las LC_{50} de las muestras puras emparejadas son divididas por los valores potenciados de LC_{50}, para dar las veces de reducción en LC_{50} asociadas con la mezcla de compuestos Ia y Ib.

Los resultados están presentados en la TABLA 7, abajo, e indican que la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib potencia la actividad insecticida del NOVODOR™ contra Leptinotarsa texana.

TABLA 7 Potenciación de NOVODOR™ con una mezcla de compuestos Ia y Ib contra Leptinotarsa texana

Muestra	LC_{50} (\mug/ml)	Factor de potenciación
NOVODOR™	624	0
NOVODOR™ + 1'25% de Ia/Ib	250	2,6
NOVODOR™ + 2'50% de Ia/Ib	98	6,5

Ejemplo 11 Actividad de una mezcla de compuestos Ia y IB contra escarabajos Ips calligraphus y Dendroctonus frontalis

Se determina la toxicidad de una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib contra los escarabajos Ips calligraphus y Dendroctonus frontalis. Se añaden 3 ml de una solución bruta de compuestos Ia y Ib (1'8 mg de principio activo por ml) a 5 gramos de parénquima de pino Lobolly liofilizado y 7 ml de agua destilada. Se prepara dieta de control con diez ml de agua. Se divide la dieta en 3 placas Petri, y en cada placa se ponen 5 a 10 escarabajos Ips adultos inexpertos o Dendroctonus frontalis adultos recién salidos. Tres diferentes lotes de dieta tratada y dieta de control son colonizados con 10 a 20 insectos. Las placas Petri se incuban en la oscuridad a 25ºC, y se cuenta el número de insectos muertos, 4, 7, y 10-12 días después de su colocación en la dieta. Los datos presentados son promedios de 2 ó 3 estudios replicados diferentes para cada especie de insecto.

Los resultados para Ips calligraphus están presentados en la TABLA 8, abajo, e indican que la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib es insecticida.

TABLA 8 Evaluación de una mezcla de compuestos Ia y Ib contra Ips calligraphus

	Días		Nº de muertes	% de mortalidad
Tratamiento	postratamiento	Nº de insectos	promedio	promedio
Control	4	20	0	0
Control	7	20	0	0
Control	10	20	1	3
Ia/Ib	4	20	1	5
Ia/Ib	7	20	7	35
Ia/Ib	10	20	20	100

Los resultados de los bioensayos de Dendroctonus frontalis están presentados en la Tabla 9, abajo, e indican que la mezcla de compuestos Ia y Ib es insecticida.

TABLA 9 Evaluación de una mezcla de compuestos Ia y Ib contra Dendroctonus frontalis

	Días		Nº de muertes	% de mortalidad
Tratamiento	postratamiento	Nº de insectos	promedio	promedio
Control	4	14-20	0	0
Control	7	14-20	1	7
Control	10-12	14-20	3	16
Ia/Ib	4	10-20	1	5
Ia/Ib	7	10-20	1	5
Ia/Ib	10	20	14	83

Ejemplo 12 Actividad contra Popillia japonica (Escarabajo japonés)

Se ensaya la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib por su actividad pesticida contra Popillia japonica de tercer estado larvario. Se sumergen raíces de hierba de centeno perenne (11 días de edad) en la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib (1'8 mg de Ia y Ib por ml) y se dejan secar parcialmente. Se coloca una larva de Popillia japonica de tercer estado larvario en un bote con varias raíces tratadas. Después de 24 horas, las raíces y las larvas son cubiertas con marga de aluvión. Las raíces de control son sumergidas en agua, y los controles no tratados se componen de larvas colocadas directamente dentro de la marga en el día 1. Los botes se incuban en la oscuridad a 25ºC, y se comprueba el número de larvas muertas después de 7, 10, 21, 28, y 36 días, y se informa de la mortalidad corregida con el control [(Supervivencia del Control - Supervivencia del Tratamiento/Supervivencia del Control) x 100%]. Para cada tratamiento se utilizan un total de 25 larvas. Los resultados, como se muestran en la Tabla 10, demuestran que la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib es eficaz contra Popillia japonica de tercer estado larvario.

TABLA 10 Actividad de compuestos Ia y Ib contra Popillia japonica

	7 días	10 días	21 días	28 días	36 días
Sin tratar	Nº de muertes	2	2	4	5	5
Control con agua	Nº de muertes	2	3	8	10	11
	% del control	0	4,3	19	25	30
Ia y Ib	Nº de muertes	6	8	13	14	15
	% del control	17,4	26,1	42,9	45	50

Ejemplo 13 Actividad contra Epilachna varivestis (Escarabajo mejicano del frijol)

Se ensaya la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib (1'8 mg por ml) por su actividad pesticida contra larvas de Epilachna varivestis de tercer estado larvario. Una colonia enjaulada de Epilachna varivestis adultos es mantenida, en frijoles de media luna de arbusto Burpee, en una cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo 16:8 a 80ºF y 50% de humedad relativa. Se recogen gran cantidad de huevos y se dejan incubar en una placa Petri conteniendo una mecha de algodón húmedo y hojas de frijol de media luna. Después de dos días, se recolectan larvas de segundo estado larvario, y se utilizan para bioensayos por inmersión de las hojas. Para realizar el bioensayo, se recolectan hojas de frijol, y el pecíolo de una hoja sencilla es pasado a través del tabique de caucho de un tubo de florista conteniendo 4 ml de agua. Luego, las hojas son sumergidas en diluciones en serie en el intervalo de 0-12% v/v de la materia bruta conteniendo compuestos Ia y Ib. Una vez que las hojas se han secado, en cada hoja se colocan 8-10 larvas de segundo estado larvario. Los insectos, hojas, y los tubos de florista se ponen en una copa de papel de 22 onzas, y se tapan con una malla fina. Las copas se mantienen en la misma cámara de crecimiento utilizada para criar la colonia de escarabajos. Cada dos días se sacan las copas de la cámara de crecimiento, se censan las larvas, y las hojas se reemplazan con hojas tratadas frescas. Los ensayos se terminan después de 8 días.

Los resultados, mostrados en la Tabla 11, demuestran que la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib es eficaz contra larvas de Epilachna varivestis.

TABLA 11 Respuesta de mortalidad de larvas de Epilachna varivestis a la dosis

Días después del	LC_{50}	Límites de confianza del 95%
tratamiento	%	Inferior	superior
4	5'6	2'58	10'65
6	2'12	3'03	9'37
8	1'94	0'75	2'81

Ejemplo 14 Prueba de campo contra Leptinotarsa decemlineata (Escarabajo de la patata de Colorado)

La prueba es conducida contra Leptinotarsa decemlineata, para su control en patatas (variedad Katahdin), con la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib aplicados a 50, 100, 150, y 300 gramos por acre, en combinación con NOVODOR™ aplicado a 0'5 y 1'0 cuartos de galón por acre, y también se aplica únicamente NOVODOR™ a 0'5, 1'0, y 2'0 cuartos de galón por acre. Los tratamientos se aplican dos veces en 7 días, por separado, con un pulverizador de CO_{2} de bomba de mochila equipado con 3 boquillas cónicas huecas TXVX-12 de Spray Systems por hilera, y calibrado para repartir 32 gpa, a 3 mph y 56 psi. Cada tratamiento se replica cuatro veces en parcelas de dos hileras (espaciamientos de 34 pulgadas) por 25 pies, en un diseño de bloques aleatorios. Los recuentos de adultos y larvas de Leptinotarsa decemlineata se hacen desde arriba, sin perturbar el follaje sobre 50 pies de hilera/parcela.

Los resultados, como se muestran en la Figura 3, demuestran que una mezcla bruta de compuestos Ia y Ib proporciona una actividad sinérgica importante con NOVODOR™ en patatas. Con 0'5 cuartos de galón por acre de NOVODOR™ se observa un 21% de control, mientras que con 50 gramos por acre de la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib se obtiene un 13% de control. Sin embargo, cuando se aplican juntos NOVODOR™ y mezcla bruta de compuestos Ia y Ib con estas proporciones, el porcentaje de control aumentó al 81%. De manera similar, con 100 gramos por acre de la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib se obtiene un 28% de control, mientras que con 0'5 cuartos de galón de NOVODOR™ se ve un 21% de control, pero cuando se aplican juntos NOVODOR™ y mezcla bruta de compuestos Ia y Ib a estas proporciones, el porcentaje de control aumentó al 81%. Además, cuando se aplican juntos NOVODOR™, a 1'0 cuartos de galón por acre, y la mezcla bruta de compuestos Ia y Ib, a 50 gramos por acre, el porcentaje de control aumentó al 88%.

Registro de microorganismos

Las siguientes cepas de Bacillus thuringiensis han sido registradas, según la Tratado de Budapest, en el Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604. EE.UU.

Cepa	Número de Entrada	Fecha del Registro
EMCC-0077	NRRL B-21090	10 de mayo de 1993
EMCC-0078	NRRL B-21091	10 de mayo de 1993
EMCC-0079	NRRL B-21092	10 de mayo de 1993
EMCC-0080	NRRL B-21093	10 de mayo de 1993
EMCC-0081	NRRL B-21094	10 de mayo de 1993

Las cepas han sido registradas bajo condiciones que aseguren que el acceso al cultivo estará disponible durante la resolución de esta solicitud de patente por uno determinado por el Comisario de Patentes y Marcas Registradas, para tener derecho a ello según 37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. El registro representa un cultivo sustancialmente puro de cada cepa registrada. El registro está disponible como requieran las leyes de patente extranjeras en países donde se registren los equivalentes de la solicitud objeto, o su progenie. Sin embargo, se debería comprender que la disponibilidad de un registro no constituye una licencia para practicar la invención objeto en derogación de los derechos de patente garantizados por la acción gubernamental.

La invención descrita y reivindicada aquí no está limitada en alcance por las formas de realización reveladas aquí, puesto que estas formas de realización son pretendidas como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualquier forma de realización equivalente esté dentro del ámbito de aplicación de esta invención. En efecto, además de las mostradas y descritas aquí, para aquellos especializados en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención a partir de la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones entren dentro del campo de aplicación de las reivindicaciones adjuntadas.

Aquí se citan varias referencias, las revelaciones de las cuales están incorporadas como referencia en sus totalidades.

Claims (7)

1. Una cepa de Bacillus thuringiensis en la que, esencialmente, toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa, en donde dicha cepa produce una sustancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden coleópteros, la cual sustancia actúa conjuntamente con un pesticida diferente, relacionado con el Bacillus, contra una plaga; y se obtiene del sobrenadante de la fermentación de dicha cepa, dicha sustancia teniendo la estructura

7

Ia: R, R_{7} = H

Ib: R = H, R_{7} = OH

2. La cepa de Bacillus thuringiensis según la Reivindicación 1, en la que la cepa de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que se compone de la cepa EMCC-0077, teniendo las características identificadoras del NRRL B-21090, o mutantes de la misma teniendo las mismas propiedades de la EMCC-0077, la cepa EMCC-0078 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21091, o mutantes de la misma teniendo las mismas propiedades de la EMCC-0078, la cepa EMCC-0079 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21092, o mutantes de la misma teniendo las mismas propiedades de la EMCC-0079, la cepa EMCC-0080 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21093, o mutantes de la misma teniendo las mismas propiedades de la EMCC-0080, y la cepa EMCC-0081 teniendo las características identificadoras del NRRL B-21094, o mutantes de la misma teniendo las mismas propiedades de la EMCC-0081.

3. Una composición pesticida constando de (a) una sustancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden coleópteros y actúa conjuntamente con un pesticida diferente, relacionado con el Bacillus, contra una plaga, dicha sustancia siendo obtenible a partir de un sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus en la que, esencialmente, toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación, y (b) un pesticida diferente relacionado con el Bacillus, la sustancia estando presente en dicha composición en la cantidad de al menos 1 g/ULT, dicha sustancia teniendo la estructura

8

Ia: R, R_{7} = H

Ib: R = H, R_{7} = OH

4. Un método para controlar una plaga comprendiendo el exponer la plaga a una cantidad eficaz, controladora de la plaga, de la composición pesticida de la Reivindicación 3.

5. Un método para controlar una plaga de insectos de una especie del orden coleópteros, seleccionada del grupo que se compone de Anthomus grandis, Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frontalis, Epilachna varivestis, y Popillia japonica, comprendiendo el exponer la plaga a una cantidad eficaz, controladora de la plaga, de una composición pesticida según la Reivindicación 3.

6. Un método para potenciar la actividad pesticida de un pesticida relacionado con el Bacillus, comprendiendo el exponer la plaga a una composición pesticida, según la Reivindicación 3, en una cantidad suficiente para potenciar la actividad pesticida de dicho pesticida relacionado con el Bacillus.

7. Un método para obtener la sustancia (a) de la composición según la Reivindicación 3, como sustancia sustancialmente pura, comprendiendo las etapas de:

(a) cultivar una cepa de Bacillus thuringiensis según la Reivindicación 1, en la que, esencialmente, toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa en un medio de crecimiento apropiado;

(b) recuperar el sobrenadante de (a); y

(c) aislar la sustancia del sobrenadante de la etapa (b), para obtener sustancia sustancialmente pura.