UA49800C2 - Штам bacillus thuringiensis (варіанти), пестицидна композиція, спосіб боротьби із шкідливими комахами, спосіб підвищення пестицидної активності та спосіб одержання речовини з пестицидною активністю - Google Patents

Abstract

Винахід відноситься до нових штамів Bacillus thuringiensis, у яких практично вся пестицидна активність міститься у супернатанті, отриманому при ферментації зазначених штамів. Штами продукують речовину, що діє проти шкідливих комах отряду жорсткокрилих і збільшує пестицидну активність пестицидів на основі Bacillus. Винахід також відноситься до пестицидної композиції, яка містить речовину і пестицидний носій або речовину і пестицид на основі Bacillus, а також до способу застосування пестицидних препаратів для боротьби із шкідниками, способу посилення пестицидної активності і з способу одержання речовини, що має пестицидну активність.

Description

Опис винаходу

Изобретение касается нового штамма(ов) Васійиз (пигіпдіепзіз, у которого практически вся пестицидная 2 активность находится в супернатанте, полученном при ферментации указанного штамма. Штамм продуцируєт вещество, действующее против вредного насекомого(ьх) отряда Жесткокрьільх и повнішающую пестицидную активность пестицидов на основе Васіїй5. МИзобретение также касаєется пестицидньїх композиций, которье содержат вещество и пестицидньїй носитель или вещество и пестицид на основе Васійи5, химический пестицид и/или вирус с пестицидньіми свойствами, а также способов применения пестицидньїх композиций для борьбь с 70 вредителями.

Каждьй год значительная часть мировьїх коммерчески важньїх сельскохозяйственньїх посевов, в том числе пищевьїх, текстильньїх и других культурньїх растений, теряется вследствие поражения вредителями, что приводит к убьіткам в миллионьі! долларов. В попьітках борьбь! с зтими вредителями применяют различнье пОдходь. 19 Первьім подходом является применение пестицидов широкого спектра действия, например химических пестицидов с широким спектром активности. Однако, при использованиий химических пестицидов существует ряд отрицательньх моментов. В частности, обладая широким спектром активности, зти пестицидь! могут поражать нецелевье организмьі, например полезньїх насекомьїх и паразитов целевьїх вредителей. Кроме того химические пестицидь!ї часто токсичньі для животньїх и человека, а у целевьїх вредителей часто развивается устойчивость при повторньїх обработках зтими веществами.

Другой подход предусматривает применение биопестицидов, в которьїх использованьі! природнье патогень, для борьбьії с заражениями посевов насекомьми, грибками и сорняками. Биопестицидь! содержат бактерию, образующую токсин - вещество, токсичное для вредителя. Биопестицидьі в целом менее вреднь! для нецелевьїх организмов и окружающей средь! по сравнению с химическими пестицидами. с

Наийболее широко применяемьм биопестицидом является Васйивз (Пигіпдіепзіз (84). В - широко Ге) распространенньій палочковидньій азробньій спорообразующий микроорганизм. Во время цикла споруляции В... образует белок(и), известньій как кристаллический дельта-токсин(ь)), которьій убивает личинок насекомьїх. В. вследствие зтого широко применяют как сельскохозяйственньй пестцид.

Бьло обнаружено, что некоторье штаммь), например Васіййв5 (пигіпдіепзіз зирер. Кигвіакі и ВасшШив о

Іпигіпдієпвіз зирер. аігамжмаї, специфичньі в отношений Чешуекрьільїх. Васійиз (Пигіпдіепвіз зирер. ізгаєїепвії, «З как бьіло обнаружено, специфична в отношений Двукрьільх (Патент США Мо 4166112). Другие штаммь, например Васійиз (Пигіпдіепзіз зиргр. (епебгіопіз (Патент США Мо 4766203), как бьіло показано, специфичнь! в со отношений Жесткокрьльіх. Ф

Вьіделение других токсичньїх для жесткокрьільїх штаммов бьло описано в 1986 г. (Негппзіаді еї аїї 325 Віо/ТесппоІоду, 4, 305-308,1986, Патент США 4764372). Зтот штамм, названньй Васіїїиз (пигіпдіепвіз зирер. зап в діедо, М-7, депонирован в Северной региональной Исследовательской Лабораториий США под регистрационньм номером МКК 8-15939. Однако, правопреемник патента Мо 4764372 Мусодеп, Согр. публично признал, что

Васійив (пигіпдіепвіз зибезр. зап діедо является Васійшв (Пигіпдіепвіз зиБезр. (епергіопіз. Более того, зтот « патент бьіл передан Момо МогаїзкК А/5. Дополнительно бьіл описан штамм В.ї, токсичньій для Чешуекрьльїх и З 50 Жесткокрьїільїх (заявка РСТ Мо МО 90/13651). Токсин, описанньій в УУО 90/13651, имеет мол. массу 81кД. с Во время цикла споруляции В.ї ообразует белок(и) в кристаллической форме, известньій как

Із» дельта-зндотоксинц(ь), с мол. массой 27-140кД, которьій при поедании убиваєт личинки насекомьїх. Токсическая активность может находиться в одном или нескольких таких дельта-зндотоксинах данного штамма В..

Большинство дельта-зндотоксинов предсталяют собой протоксинь!і, которье протеолитически конвертируются в более мелкие токсичнье (процессированньє) полипептидьі в среднем кишечнике целевого насекомого (Нойе шк апа Му/пісеіеу, 1989, МісгоріоІї. Кем. 53: 242-255). Дельта-зндотоксинь! кодируются генами сгу (кристаллических (Те) белков). Геньї сту разделеньі на шесть классов и несколько подклассов по структурной близости и пестицидной специфичности. Основнье классьі представленьї специфичньми к Чешуекрьільм (сгуЇ), специфичньми к бо Чешуекрьїіль!м и Двукрьільїм (сгуїІ), специфичньіми к Жесткокрьіль!м (сг), специфичньїми к Двукрьільм (сгуїМ) ав! 20 (Нопе апа уУпі(еіеу, 1989, МісгобіоІї. Кем. 53: 242-255), специфичньми к Жесткокрьільм и Чешуекрьльм (гень сум по Таїог еї аїІ., 1992, МоІесшіаг Місгобіоюду 6 1211-1217) и специфичньми к нематодам (сгум и сгумі по мк Рейеїзоп еї а!., 1992, Віо/Гесппоіоду, 10:271-275) генами.

Дельта-зндотоксинь! бьіли получень! с использованием рекомбинантной ДНК. Полученнье с использованием рекомбинантной ДНК способами дельта-зндотоксинь! могут бьїіть или не бьіть в кристаллической форме. 25 Дельта-токсин В.І. не растворим в воде за исключением щелочньїх значений рН и почти всегда кодируется

ГФ) плазмидой. Бьло показано, что некоторье штаммь! Васіїйи5 (пигіпдіепзвіз образуют термостабильньй юю пестицидньій аналог нуклеотида аденина, известньй как р-зкзотоксин или тюрингиензин, которьій является пестицидньмм в индивидуальном виде (Зебезіа еї аіІ., в Н.О.Вигдез (ед.) МісгодіаІ. Сопіго!Ї ої Ревів апа Ріапі

Оізеазевз, Асадетіс Ргевзз, Мем/ Могк, 249-281, 1981). Д-зкзотоксин бьіл обнаружен в супенатанте некоторьх 60 культур Васійшв (пигіпдіепвіз. Он имеет мол. массу 789 и содержит аденозин, глюкозу и алларовую кислоту (шу еї аїЇ., в Кигвеіак (ей.) Місгоріаї апа Міга! Резіїсідез, Магсе! ЮОессег, Мем МогКк, 1982, 35-72). Круг его хозяев включаєт, но не ограничен МизКа дотевіїса, Матевіга сопіїдигайа УУаїКег, Тейгапуспив игісае,

Огозорнйа теїІаподазіег и Тегапуспиз сіппарагіпив. Считаеєтся, что токсичность р-зкзотоксина обусловлена в5 ингибированиегм ДНК-направленной РНК-полимеразьй за счет оконкуренции с АТФ. Показано, что зтот Д-зкзотоксин кодируєтся плазмидой Сту у пяти штаммов Васійив ІПигіпдіепвіз (В) и что он может бьть классифифцирован как р-зкзотоксин типов | и І (Геміпвоп еї аЇ., 1990, 9. Васіегіої. 172: 3172-3179). Как бьло показано, р-зкзотоксин типа | образуєтся В... вирер. ІПигіпдіеєпвіз серотипа 1, В. зибвр. (юмогійі серотипа 9 и В. зирер. даптзіадіепвіз серотипа 10. Обнаружено, что р-зкзотоксин типа ІІ образуется В... 8урер. Мотзвопі серотипа ваб и активен в отношении І ерііпоїагза десетіїпеаіа (колорадский картофельньй жук).

Инье водорастворимье субстанции, которне бьіли вьіделень из В.., включают о-зкзотоксин, которьій токсичен в отношений личинок МизКа дотевіїса (ІшШйпу, 1980, РЕМ МісгобріоЇї. ен. 8:1-7); гамма-зкзотоксиньї, представленнье различньми протеолитическими ферментами, в том числе лецитиназами, хитиназами и протеазами, токсический зффект которьх проявляется только в сочетании с бета-зкзотоксином или 70 дельта-зндотоксином (Рогебегд ей аїЇ., 1976, Васійи5 (Пигіпдіепвіз: 85 ЕПесів оп Епмігоптепіаії Опаїйу,

Национальньій Исследовательский Совет Канадь), Обьединенньй Комитет Совета по Научньм Критериям

Качества Окружающей Средь, Подкомитетьї по Пестицидам и Близким Соединениям и Биологическим

Явлениям), сигма-зкзотоксин, которьій имеет структуру, близкую бета-зкзотоксину и также является активньм в отношений І ерііпоїагза десептіїпеа(а (Агдацегеї аї., 1991, 9. Епіотої. Зсі.26: 206-213) и ангидротюрингиензин 75 (СоїІ. Сгесповіомак Спет. Сотт. 40, 1775, 1975).

МО 94/09630 описьювает водорастворимое вещество, которое повьішаєт активность Васіїйив (пигіпдіепвів зуБегр. Кигеїакі и Васійшзв (пигіпдіепзіз зибзр. аігамуаї.

Зіопага еї а). (1994, в Майштгаі апа Епдепеегей Резі Мападетепі Адепі5, Раш А. Мапп, Кореї М.

Ноїподуогій, еавз., АС5, У/азпіпдіюп, О.С., рр. 25-36) описьявают диабротицинь! структурь

Ї | Ва ОВ

М

МН ( ШЕ МВІВо с дв ВІВЖ як 4 й ра о г у 1 Кк, к, К2 - Н, КЗ - ОН Диабротицин А о 2 К, "Ка, КЗ - ОН Диабротицин В

Диабротицинь бьли вьделень из В. зиИрійв. Они активньй в отношений Оіаргоїса ипдесітрипсіаїд, (3

Ї ерііпоїагза десетіїпеаіа, Апіпотив дгапаіїв Вопетап, личинок комаров, Зіарпуіососсив ацгеив и Місгососсив со

ІЇшеа, но не активньї в отношений мотьілька кукурузного, ЕзсПегіспіа сої, В. зиИбБійв и Рвепдотопав аегидіпоза. Активность в отношений других вредителей Зіопага еї аі. не показали. Диабротицин А бьл также Ф) вьіделен из культуральньїх жидкостей В. сегецв. «

Бьіли предпринять! попьітки повьісить летальньій зффект препаратов В. Її. Средства включали поиск новьїх штаммов с повьішенньім летальньм зффектом, дальнейшую разработку существующих штаммов и разработку более зффективньїх композиций при смешиваний спор и/или кристаллов В с новьіми пестцидньїми носителями или с химическими пестицидами. « дю Целью настоящего изобретения является улучшение инсектицидной активности известньїх препаратов В. -

Другим обьектом настоящего изобретения является повьішение пестицидной активности пестицидов, а с также поиск новьїх способов применения пестицидньїх продуктов. :з» Полезньм является вьіделение новьїх штаммов Васіїйиз (Пигіпдіепвіз для получения новьїх веществ, расширяющих спектр биопестицидов для каждого насекомого-вредителя.

Сущность изобретения їх но Изобретение относится к новому штамму Васіїїиз (пигіпдіепзіз, у которого практически вся пестицидная активность сосредоточена в супернатанте, полученном при ферментации указанного штамма. Кристаллический се) белок и спорьії, полученнье при ферментации штамма Васіїиз (Пигіпдіепзіз по настоящему изобретению, не со имеют никакой пестицидной активности. В частности, штамм вьібран из группьї, содержащей ЕМСОСС-0077 с идентификационньіми характеристиками МКК. В-21090 или его мутанть! с практически теми же свойствами, что («в) 50 ЕМСС-0077, ЕМСС-0078 с идентификационньми характеристиками МАККІ 8-21091 или его мутанть! с о практически теми же свойствами, что ЕМСС-0078, ЕМОСС-0079 с идентификационньіми характеристиками МКК.

В-21092 или его мутантьь с о практически теми же свойствами, что ЕМСС-0079, ЕМСС-0080 с идентификационньіми характеристиками МКК. В-21093 или его мутанть! с практически теми же свойствами, что

ЕМСС-0080, ЕМСС-0081 с идентификационньми характеристиками МАККІ 8-21094 или его мутанть! с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0081. (Ф) Из супернатанта ферментации указанного штамма получено вещество, обладающее пестицидной

ГФ активностью в отношений вредньїх насекомьх из отряда ЖесткокрьіІльсх и действующее совместно как, например, усилитель или синергидньій агейт с другим пестицидом на основе Васіїйв5, против вредителей. В предпочтительном варианте зто вещество имеет І Сво (І Сво - концентрация данной пестицидной субстанции, бо необходимая для гибели 5075 вредителей) 126 у активного ингредиента/г общего материала в отношений

І еріїпоїагза (ехапа. ІСво осадка, полученного при ферментации указанного штамма, превьшаєт З000у активного ингредиента/г общего материала по (ай/г) данньім биотеста.

С другой стороньі, указанное вещество обладает пестицидной активностью против вредньїх насекомьх б5 отряда Жесткокрьільїх. В частности, зто вещество имеет пестицидную активность против вредньїх насекомьсх видов Оіабгоїїса ипаесітрипсіай(а, І ерііпоїагзга (ехапа, Апіпотивз дгапаів, а также проявляет неожиданную активность против вредньх насекомьїх видов Ірз саїЙогарпивз, РорійПа |іаропісив, Еріїасппа магімавіїв,

Ї ерііпоїагза десетіїпеаіа и ЮОепагосіопиз їгопіаїїз из отряда Жесткокрьльїх.

Зто вещество может усиливать инсектицидную активность кристаллического дельта-зндотоксина(ов) Васійв

ШВигіпдіепвіз против вредньх насекомьх. В частности оно повьшаєт инсектицидную /активность кристаллического дельта-токсин а Васіїйив (Пигіпдіепзів зирер. Їепебгіопіз против вредньїх насекомьїх отряда

ЖесткокрьІльх.

В настоящем описаний "пестицид на основе Васіййв" означает штамм или спорьі Васійиз (например, Васійшв

Іпигіпдіепзіз или Васіїйив з,ибБійв). Пестицид на основе Васійи5 может бьіть также веществом, вьіделенньі!м из 7/о Васійив, например белком или его фрагментом, обладающими активностью в отношений вредителей или убивающими их, веществом, обеспечивающим защиту растений, например веществом, препятствующим поеданию, или микроорганизмом, способньім зкспрессировать ген Васійш5, кодирующий белок Васіїйи5 или его фрагмент, обладающие активностью в отношений вредителей или убивающими их (например, дельта-токсин

Васійив (пигіпдіепзіз) и приемлемьїй носитель (см. следующий раздел Композиции). Вредителями могут бьїть, /5 например, насекомьсе, нематодь, клещи или улитки. Микроорганизм способен зкспрессировать ген Васіїнв8, кодирующий белок Васі или его фрагмент, обладающие активностью в отношений вредителей или убивающие вредителей, обитающих в филлоплане (поверхность листьев растений) и/или в ризосфере (почва вокруг корней растений) и/или в водной среде, и способньійй успешно конкурировать в определенной среде (посев или иное место обитания насекомого) с микроорганизмами дикого типа и обеспечивающий стабильное го поддержание и зкспрессию гена Васіїйи5, кодирующего белок Васійй5 или его фрагмент, обладающие активностью в отношений вредителей или убивающие вредителей. Примерь! таких микроорганизмов содержат в числе прочих бактерии родов Васій5, Рзепдотопавз, Егміпіа, Зеїтайа, Кіерзівеійа, Хапіпотопаз, Зігеріотусез,

КПігорішт, КПподорзепдотопаз, МеїПуіорпййшв5, Адгорасіегішт, Асейорасіег, І асіорасійи5, Аппгобасіег,

Агоіобрасіег, І еисоповіос и Сіовігідішт, водоросли из семейств Суапорпусеае, Ргоспіогорпусеае, Кподорпусеаеє, сч Ріпорпусеаєе, Спгузорпусеае, Ргутпезіорпусеае, Хапіпорпусеае, Карпідорпусеаеє, ВасіПагіорпусеае,

Еизіїдтайрпусеае, Стгуріорпусеае, Ейдіепорпусеае, Ргазіпорпусеае и СПіогорпусеае, и грибьі, в частности і) дрожжи, например из родов Засспаготусев, Стуріососсив, Кісумеготусевз, Зрогороіотусевз, Кподоїпогца и

Ацгеордвіаіт.

В данном описаний "пестицидная активность" означает количественное вьіражение активности против о зо вредителя, которое убивает или задерживаєт рост вредителя или защищаеєт растение от заражения вредителем. о

Изобретение далее касается пестицидньїх препаратов, содержащих вещество и пестицид на основе Васіїи5, (у а также способов применения пестицидньїх композиций для борьбь! с вредителями.

Изобретение относится также к способу получения "практически чистого" вещества по изобретению, которьй Ме з5 предусматривает стадий «г (а) культивирования штамма Васійшз (пигіпдіепзіз в подходящей среде для роста, (б) вьіделение супернатанта (а) и (в) обработку супернатанта (б) с помощью колоночной хроматографии для очистки вещества.

В настоящем описаний, "практически чистое" вещество означает вещество, которое содержит менее 590 « 0 примесей, например белка дельта-токсина. в с Краткое описание чертежей

Зти и инье признаки, особенности и преимущества настоящего изобретения будут более понятньіми из ;» следующего описания, прилагаемой формуль! изобретения и сопутствующих чертежей, где:

На Фиг. 1 представлена схема синтеза для получения структурь! І

На Фиг. 2 представлень структурь! производньх Ли В, їх Фиг. З показьівает проявление синергизма Іа/ЛЬ и МОМОБО Км в отношении І ерііпоїагза десетіїіпеаца.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения о Получение вещества о Вещество(а) может бьть получено из супернатанта ферментации Васіїйиз (Пигіпдіепвів из группь, содержащей в числе прочих штаммь В. ЕМСС-0077 с идентификационньми характеристиками МАК. В-21090 о или его мутантьї с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0077, ЕМСС-0078 с идентификационньіми о характеристиками МАК 8В-21091 или его мутантьі с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0078,

ЕМСС-0079 с идентификационньіми характеристиками МКК! 8В-21092 или его мутанть! с практически теми же свойствами, что ЕМССОС-0079, ЕМСОСС-0080 с идентификационньми характеристиками МКК! В-21093 или его Мутантьі с опрактически теми же свойствами, что ЕМСС-0080, ЕМСС-0081 с идентификационньми характеристиками МКК. В-21094 или его мутанть с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0081. іФ) Вещество активно против вредньїх насекомьїх отряда Жесткокрьільїх и действует вместе с пестицидами на ко основе Васі: как, например, усилитель или синергидньй агент. В частности, вещество имеет структуру (І). где:

Кі - аминогруппа, гидроксил, алкил (С.4.140), алкиловьій (С4.40) зфир, ариловьй (например, бензоиловьй, бо нитробензоиловьй, динитробензоиловьй, галобензоиловьй) зфир, галоген, (С--5) алкокси-группа или аминокислота б5

А;

Не ра Не,

Аз й: А ;

Ах 7-- Ав

В из группьї, содержащей в числе прочих, аланил, валинил, лейцинил, изолейцинил, фенилаланил, глицинил и фенилглицинил;

Ко - алкил (С..40);

Кз - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (С.-10о), алкиловьій (С4.40) зфир, ариловьій (например, бензоиловьй, нитробензоиловьйй, динитробензоиловьй, галобензоиловьй)зфир, галоген, (С. в)алкокси-группа, 79 Метиламин, диметиламин, тионил, метилтионил, цианогруппа или их соли из группьї, включающей в числе прочих фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат;

К; - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (С.-10о), алкиловьій (С4.40) зфир, ариловьій (например, бензоиловьй, нитробензоиловьій, динитробензоиловьй, галобензоиловьй)зфир, галоген, (Сі. 5)алкокси-группа или их соли из группьї, включающей, но не ограниченной, фосфатом, сульфатом, ацетатом, карбонатом и 20 нитратом;

Кв - водород, метокси-, аминогруппа, гидроксил, алкил (С..10), алкиловьй (С..10) зфир, ариловьій (например, бензоиловьй, нитробензоиловьій, динитробензоиловьй, галобензоиловьй) зфир, сгалоген или (Св) алкокси-группа;

Кв - аминогруппа, гидроксил, алкил (С..40), алкиловьій зфир, галоген или (С..5) алкокси-группа; с 25 К; - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (С.-10о), алкиловьій (С4.40) зфир, ариловьій (например, г) бензоиловьй, нитробензоиловьй, динитробензоиловьй, галобензоиловьй)зфир, галоген, (С..5) алкокси-группа или их соли из группьі, включающей в числе прочих, фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат;

Ка - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (С.-10о), алкиловьій (С4.40) зфир, ариловьій (например, бензоиловьй, нитробензоиловьй, динитробензоиловьй, галобензоиловьй)зфир, галоген, (С. в)алкокси-группа, о 30 метиламин, диметиламин, тионил, метилтионил, цианогруппа или их соли из группьї, включающей в числе о прочих фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат;

Ко - алкил (С..40) и со

К:іо - аминогруппа, гидроксил, алкил (С4.140), алкиловьій (С.-.10) зфир, ариловьйй (например, бензоиловьй, Ге! нитробензоиловьй, динитробензоиловьй, галобензоиловьй) зфир, галоген, (Сі5) алкокси-группа или 32 аминокислота из группьі, содержащей в числе прочих, аланил, валинил, лейцинил, изолейцинил, фенилаланил, - глицинил и фенилглицинил;

Атомь азота пиразина могут бьть замещень алкилом (Со), алкиловьм (Сі.40) зфиром, ариловьм (например, бензоиловьім, нитробензоиловьм, динитробензоиловьм, галобензоиловьм) зфиром или «ф кислородом. 40 Следует понимать, что изобретение охватьшает все стереоизомернье формь! соединений структурь! Ії, а З с также рацемать!. » В большинстве случаев, вещество структурь! іа далее будет упоминаться как Іа, а вещество структурь! ІБ - как ІБ.

Ї в ОВ т- М (Се) їн С 7 МК,»

Со ВІВоМ 4 не, ри о 50 ті ко ОК с Іа: Е, Р, Ко К3- Н

І: Кк, К/,Ко- Н, Кз - ОН

Васійизв (пигіпдіепзіз можно культивировать с использованием известньїх сред и способов ферментации (см., 59 например, Кодоїй еї аїЇ.,, 1969, 9. Іпмепаргаїе Раф. 18: 353-358, ЮОцітаде еї аїЇ. в Місгоріаї СопігоЇ. ої

ГФ) резіз апа Ріапі Оізеазез, Н.Ю.Вигдевз, ед. Асадетіс Ргевззв, М.У., 1980). После завершения цикла ферментации 7 супернатант может бьіть получен вьіделением спор и кристаллов В... из культуральной жидкости известньіми способами, например центрифугированием и/или ультрафильтрацией. Вещество, содержащееся в супернатанте, можно вьіделить известньми способами, например ультрафильтрацией, вьшпариванием и бо вьісушиванием после разбрьізгивания.

Вещество согласно изобретению можно также получить химическим синтезом с помощью известньх способов.

Пиразиновое кольцо с подходящими замещающими и защитньми группами для структурь! | может бьть получено рядом реакций, например спонтанной конденсацией с-аминокарбонильньїх соединений. б5 Образующееся дигидропиразиновое промежуточное соединение легко окисляется кислородом до пиразина.

Димеризация одного а-аминокарбонильного соединения приведет к образованию одного пиразина, тогда как реакция двух различньїх а-аминокарбонильньїх соединений должна привести к образованию трех продуктов; указанное вещество можно вьіделить хроматографическим разделением (см, Фиг. 1). Последняя реакция позволяет вести синтез пиразинов с различньіми заместителями с каждой сторонь! цикла.

Очистку вещества проводят различньмми известньми способами, в том числе хроматографией (например, ионообменной хроматографией и гель-хроматографией), злектрофорезом, использованием различной растворимости, зкстракцией или иньіми известньіми стандартньіми способами (см, например Ргоїевіп Ригітісайоп, едз. 9-С. дапвоп апа І аг Кудеп, МСН Рибіїзпетгв, Мем ХогКк, 1989). 70 Активность указаного вещества можетбьть проанализирована биотестом с использованием известньх способов, например введением искусственного корма, раскладкой искусственного корма, окраской листьев, обмакиванием листьев и разбрьізгиванием по листве. Подобнье биотесть! приведеньї ниже в разделе Примернь!.

Композиции, содержащие вещество

Предлагаемоеє вещество можно использовать индивидуально; вместе с пестицидом на основе Вавсіїшв, 7/5 Которьйй определен вьіше как штамм, спорьі, белок или его фрагмент с активностью в отношений вредителей или убивающей их, или с приемлемь!м носителем в пестицидньїх составах, которне представлень, например, суспензией, змульсией, пьілевидньмм порошком, диспергируемьіми гранулами, смачивающимся порошком, змульгирующимся концентратом, азрозолем или пропитанньми гранулами. Примерь подобньх штаммов

Васіййз включают в числе прочих Васйивз (пиппдіепзіз зирер. Кигеіакі (товарньій знак СІРЕ! тм из Аррой

Гарогаюцев, Іпс., "ЗАМЕГІМтм из запао, ВІОВІТтм из Момо МогаїзК А/5, РОКАУтм из Момо МогаївкК А/5.ММРтм из

Мусодеп, ВАСТОБРЕЇМЕтм из Момо Могаїзк А/5 и ТНОКІСІОЄтм из Запдо Васійиз (пиппдіепвіз зибзр. аігамаї (товарньій знак РІОКВАСтм из Момо Могаїзк А/5, ХЕМТАКіІтм из Арроїй Іарогайфойевз, Іпс.); Васішв5

Іпиппдіепзіз зиИирезр. (епергіопіз (товарньій знак МОМОБОМтМ из Момо Могайзк А/5, ТКІОЕМТ м из Запао?,

М-ТЕАКтм и М-ОМЕтм из Мусодеп) Васіїйив (пиппдієпзів зирер. ізгаєіепвіз (товарньій знак ВАСТІМО тм из Запдог.ї СМ или ЗКЕЕТАЇтм из Момо Могаїзк А/5, ТЕКМАКІтм из Запдол и МЕСТОВАСтм из Арроїй Іарогаїйоїіев, Іпс.), Ге)

Васійнив зрпаєгісиз (товарньй знак ЗРКЕКІМОтм из Момо Могазвк о А/5); Васій5 (пиппдіепвів

КиггїакіЛепебгіопіз (товарньй знак БОЇтм из Есодеп); Васійи5 (пиппдіепвзіз Кигвіакі/аіїгажаії (товарньій знак

СсОоМроктм из Есодеп; и АОКЕЕ из Сіра-Сеїду) и ВасШиз (пиппдіепвів Кигеїакі/киггїакі (товарньй знак

СИТГА55 тм из Есодеп). Белок на основе Васіїїиз5 может бьїть вьібран из группьї, содержащей в числе прочих о

Стуї, СтуїІ, Ступ, СтуїМ, СтумМ, и Стумі. (ав)

Предлагаемое вещество может находиться в составе с другими факторами или веществами, вьіделенньіми со из супернатанта Васійй5, включающими, но не ограниченньми зкзотоксином и/или усиливающим фактором.

Композиция может также содержать пестицид на основе Васійй5 и/или вирус с пестицидньїми свойствами и (22) приемлемьій носитель. «

В частности, компоненть! состава могут проявлять синергетический зффект. В результате предлагаемьй состав может иметь более вьісокую зффективность, чем зффективность каждого отдельного компонента.

Синергизм может проявляться как равная или повьішенная зффективность при более низких дозах и/или менее частьїх обработках, чем рекомендуется для каждого отдельного компонента. Как вариант, указанное вещество « 20 может усиливать пестицид на основе ВасіПшв. -в

В составах, содержащих вещество и пестицид на основе Васіїїй5, количество вещества составляет 0,001-300 с // ТО. В настоящем описаний "ІТИ" означаєт единицу І ерііпоїагза Їехапа, определенную биотестом. В биотесте :з» сравнивают образец с стандартньм референс-материалом Васіїйїи5, используя І еріїпоїагза (ехапа или иного вредителя в качестве стандартного тест-организма. Активность определяют делением 1сС БО референс-стандарта с последующим умножением на активность референс-стандарта. їх що В частности, состав может содержать указанное вещество практически в чистом виде или супенатант

Васіїїш5 в вьісушенной, концентрированой или жидкой форме и подходящий пестицидньїй носитель, примерь се) которого приведеньї ниже. Зтот состав можно наносить отдельно на растения, например трансгеннье растения. со В частности, состав можно наносить на растения, уже несущие ген Васіїйиз5 (пигіпдіепвзіз. С другой сторонь, состав можно нанести на растения, предварительно обработаннье составом Васіїйшз (пигіпдіепзіз. Вещество (ав) присутствует в составе в количестве 0,001-6090 (вес.). о Такие описаннье вьіше составьі можно получить добавлением поверхностно-активного агента, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, пищевого стимулятора, аттрактанта, инкапсулирующего агента, связьивающего агента, змульгатора, красителя, агента, защищающего от УФ-лучей, буфера, агента текучести дб ли иНьх компонентов, облегчающих обращение с продуктом и его применение против определенньїх целевьсх вредителей. (Ф) Подходящие поверхностно-активнье агентьь включают в числе прочих анионнье соединения, такие, как г) карбоксилат, например карбоксилат металла жирной кислоть! с длинной цепью; М-ацилсаркозинат; моно- или дизфирьі фосфорной кислоть! и зтокислатов жирного спирта или соли указанньїх зфиров; сульфать! жирного бо спирта, например додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цитилсульфат натрия; сульфать зтоксилированного жирного оспирта; сульфатьй зтоксилированного алкилфенела, сульфонать! лигнина, сульфонатьї нефтяньх продуктов, алкиларилсульфонать, например алкилбензолсульфонатьі или низшие алкил-нафталинсульфонатьі. напримербутил-нафталинсульфонат, соли конденсатов сульфонированного нафталин-формальдегида; соли конденсатов фенол-формальдегида или более сложнье сульфонать, например амидь сульфонатов, например сульфонированньй продукт конденсации олеиновой кислоть! и б5 М-метилтаурина, или диалкилсульфосукцинатьї, например сульфонат натрия или диоктилсукцинат. Неионнье агентьі включают в числе прочих продуктьі конденсации зфиров жирньїх кислот, жирньїх спиртов, амидов жирньїх кислот или фенолов, замещенньїх жирньми алкилами или алкенилами, с зтиленоксидом, жирньми зфирами простьїх зфиров спиртов, содержащих несколько атомов водорода, например сорбитановье зфирь! Жирньх кислот, продуктьі конденсации /указанньх зфиров с о зтиленоксидом, например зфирь полиоксизтиленсорбита и жирной кислотьі, блоксополимерь! зтиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовье гликоли, например 2,4,7,9-тетразтил-5-децин-4,/7-диол, или зтоксилированнье ацетиленовье гликоли.

Катионнье поверхностно-активнье агентьї включают, например, алифатические моно-, ди- или полиаминь в виде ацетата, нафтената или олеата; кислород-содержащий амин, например аминоксид 7/0 полиоксизтиленалкиламина, амин, связанньій с амидом, полученньій конденсацией карбоновой кислоть! с ди- или полиамином, или четвертичную соль аммония.

Примерь! инертньїх материалов включают в числе прочих неорганические минеральі, например каолин, слюду, гипс, удобрения, филлосиликатьі, карбонатьі, сульфатьі или фосфать; органические материальї, например сахар, крахмальі! или циклодекстриньі, или материаль! растительной природьі, например древесину, пробку, порошок из стержней початков кукурузьі, шелуху риса, скорлупу арахиса или грецких орехов.

Составь! настоящего изобретения могут бьіть в форме, подходящей для непосредственного применения или в виде концентрата или первичного состава, которьій требует разведения соответствующим количеством водьї или иного растворителя перед применением. Концентрация пестицида изменяется в зависимости от природь! определенного состава, в частности, представлен ли он концентратом, или готов к употреблению. Состав го содержит 1-9875 твердого или жидкого инертного носителя и 0-5095, преимущественно 0,1-5090 поверхностно-активного вещества. Зти составьї применяют в концентрации, рекомендуемой для коммерческих продуктов, как правило 0,011-5,5кг/га в сухой форме и 0,0125-31,25л/га в жидкой форме.

Далее, пестицид и/или вещество на основе Васіййв могут бьіть обработаньі! перед получением состава для пролонгирования пестицидной активности при применении в среде обитания целевого вредителя. с Продолжительность обработки не должна бьіть вредной для пестицида и/или вещества на основе ВасіїЇшв5.

Такую обработку проводят химическими и/или физическими средствами и продолжительность обработки не о должна отрицательно сказьуваться на свойствах составов. Примерь! химических реагентов включают в числе прочих галогенирующие агентьії, альдегидьї, например формальдегид и глугаральдегид, обеззараживающие агентьі, например хлорид зефирана, спиртьі, например изопропанол и зтанол, и гистологические фиксаторь, су зо Ннапример фиксаторь Воціп и Неїу (см., например, НОМАЗОМ, Апітаї! Тівзце Тесппідцез, МУ.Н.Ргеетап апа Со., 1967). о

Составьі по изобретению наносят непосредственно на растения, например разбрьзгиванием или со распьіилением во время начала появления вредителей на растениях или перед появлением вредителей в качестве профилактической мерьі. Растения, которьше можно защищать согласно изобретению, включают в Ме)

Зз5 чЧисле прочих злаки (пшеницу, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и близкие культурьї), свеклу (сахарную и «г кормовую), косточковьіе, семечковье и сочньіми плодьі! (яблоки, груши, сливьі, персики, миндаль, вишню, землянику, малину и черную смородину), бобовне растения (люцерну, бобьї, чечевицу, горох, сою), масличнье растения (рапс, горчицу, мак, оливьі, подсолнечник, кокос, клещевину, какао, арахис), тьіквеннье (огурец, кабачок, дьіни), текстильнье растения (хлопок, лен, коноплю, джут), цитрусовье растениями (апельсинь, « 70 ЛИМОНЬ, грейпфрутьі, мандариньї), овощи (шпинат, салат, спаржу, капусту и другие растения рода Вгазвіса, в с морковь, луки, томать, картофель), лавровне (авокадо, коричное и камфорное деревья), лиственнье и хвойнье деревья (например, липа, тис, дуб, ольху, тополь, березу, ель, лиственницу, сосну) или такие растения, как з кукурузу, дерновье растения, табак, орехи, кофе, сахарньій тростник, чай, виноград, хмель, банан и растения-каучуконосьі, а также декоративнье растения. Субстанцию применяют по листу, при вспашке, разбрасьвают гранульі, раскладьвшают или пропитьшают почву. Важно получить хорошие результать! при ї5» борьбе с вредителями на ранних стадиях роста растения, когда оно может бьіть сильно повреждено. Спрей или порошок могут при необходимости содержать другой пестицид. Желательно нанесение предлагаемого состава ісе) прямо на растения. Составь! данного изобретения могут бьіть использованьі для уничтожения вредителей

Го! отряда Жесткокрьільїх, например, І ерііпоїагза зр. (І ерііпоїагза (ехапа, І ерііпоїагза десетіїпеайа), Оіабгоїїса упдесітрипсіаїа, ЮОепагосіопиз їопіаійв, Апіпопотив дгапаіїз, Асапіпйозсеїйдез оБбіесіив, Саїовзоргиспив о спіпепзіз, Еріїасппа магімевіїв, Ругпама Ішеоіа, Суїаз Тогтісагіиз еіедапішив, | івігопої5 огедопепвів, о зЗйорпйиз звр., Сусіосерпаій бБогеаїів, Сусіосерпаїа Іттасціайа, Масгодасіуїнв звиреріпозив, РоріШа |аропіса,

КПігоїгодиз таїайв, АїЇрпйоріиз аіарегіпиз, Раїогиз гаїгеригді, Тепергіо тоїйог, Тепебгіо орзсигив,

Ттіроїйцт савзіапецт, Тгіроїйцт сопіизит, Трої девігисіог; Составьі по изобретению также можно в Мспользовать для уничтожения в числе прочих вредителей отряда Чешуекрьільїх, например, Аспгоїа адгізеПа,

Асіегів діомегапа, Асіегів магпапа, Адохорпуез огапа, Адгоїїв ірвіоп, АїЇарата агойМасеа, АїІзорпіййа (Ф) ротегйагіа, Атуеїріз ігапзйейа, Ападавзіа КиеппіеМа, Апагзіа Ііпеа(еМйа, Апізоїа зепайгіа, Апіпегагеа ка регпуі, Апіїсагвіа деттаїйар|йв, АгсПпірв зр., Агдугоїаепіа взр., АїПпейв тіпдага, Вотрух тогі, Виссціаїйгіх

Іпигрегіеа, Садга сашейЦа, СпПогізіопецга вр., Соспуїв позрез, СоЇаз ецгуїШете, Согсуга серпаї|опіса, во Суадіа Іацйегеапиз, Судіа ротопейа, Оайапа іпіедегіта, ЮОепагоїйтив вірегіси5, ЮОезтіа Шпегаїїв, Оіарпапіа

Нуаїїпага, Оіарпапіа пійда|йв, Оіайаєеа дгапаїозеМйа, Оіайаєа засспагайв, Еппотовз зирзідпагіа, Еогепта

Іойіпі, Ерпезіа еїшеМйа, Егаппіз (Шага, Евідтепе асгеа, Еціа взаїЇШргісоїа, Еийросоеєїйа атрбідцейа,

Еипроесійа атбідцеМйа, Еиргосіїв спгузогпіпоеа, Еихоа тевзвогіа, Саїйега теїйПЙопеїа, гарпоїйа тоїевіа,

Наїтізіпза атегісапа, Неїїсомегра зИиБбПеха, Неїїсомегра 7еа, Неїйоїйіз умігезсепе, Нетієцйса оїїміае, 65 Нотоеозота еїесіеішШт, Нурпапіга сипеа, Кеїегіа ІусорегвзісеМйа, Іатбаіїпа їзсеПагіа їізсеПагіа, І атраіпа

ТізсеМПагіа Ідибгоза, іесота взаїїсіз, іоревіа Броїгапа, іоховіеде віїсіїсайв, ІУутапіга аівраг, Масаїїа

Іпугзізаїйв, Маїасозота зр., Матевзіга Бргаззісае, Матезіга сопіїдигаїа, Мапдиса диїпдоетасціаїа, Мапацйса зехіа, Магиса (евзіціаійв5, Меїапспга рісіа, Орегорпіега бБгитайа, Огдуїа звр., Овііпіа пибііайв, Раїеасгійа мегпаїа, Рарійо сгезрпопіевз, Ресііпорпога доззуріеМПа, РІгудапідіа саїйогпіса, РНуПопогусіег БіапсагаегІа,

Ріегів парі, Ріегіз гарає, Ріаїйугепа зсарга, Ріайїупоїа Поцепдапа, Ріаїупоїа зішШапа, Ріагурійа сагацідасіуїа, Ріоаіа іпсіегрипсіеІа, РіІшеїйа хуіовівІа, Ропііа ргоїодісе, Разецааїейа ипірипсіа,

Рзецйдоріазіа іпсіцдепе, Заршодевз аедгоїаїа, Зспігига осопсіппа, Зіоїгода сегеаІеМНйа, Зріопоїа осейПІапа,

Зродоріега зр. Тпашгпзіорога ріуосатра, Тіпеоіїа брівзейПейПйа, Тгіспоріизвіа пі, Одеа гибрідаїй5, Хуіотудев сигіайв, Мропотеціа радеїІа; Двукрьільїх, например, Аедез зр., Апдез міцайв5, Апавзігерпа Ішдепв, Апазігерна /о 8визрепза, Апорпеїез бБагрегі, Апорпеїез дцаагітасціафй5, Агтідегез зибраїраєиз, Саїйїрнога звіудіа, Саїйірнпога місіпа, Сегаїйів сарйаєа, СПігопотив (епіап5, СПпгузотуа гиййїасіев, Соспіотуіа тасейПагіа, Сех зр.,

Сшцівега іпогпаїа, ОЮасиз сієае, Оеїйа апідца, ОЮеїйа ріаїшга, ЮОеїЇйа гадісит, Оговорпйа теїіаподазвзіег,

Ецпреодевз согоМае, Сіоввіпа ацвіепі, Сіовзвіпа БгеміраІріз, Сіозвіпа Тизсіре5, Сіовзвіпа тогвзійапе сепігаїїв,

Сіозвіпа тогейапе тогейапе, Сіозвіпа тогвейапе зИиБтогвіап5, Сіозвіпа раїїріре5, Сіозвіпа раїраїв 7/5 Затріепзів, Сіозвіпа раїраїїв раїраїї5, Сіовзвіпа (аспіпоїдез, Наетадодив едціпи5, Наетайорбіиз іпйапв,

Нуродегпта ромів, Нудодегта Іпеайшт, Іеисоріз піпае, І исйа сиргіпа, І исійа вегісага, І Шшготуїіа

ІопаіІраїріз, І шг2отуїа зпаппопі, Іусогіенйа таїї, Мауеїййсіа адевігисіог, Мивзса ашцшитпвпаїї5, Мивзса адотевіїса,

Меобейегіа вр., Мерпгоїота зцшішгаійв, Орпуга аепевзсеп5, РПІаепісіа зегісаїа, РПероїтив звр., РІогтіа гедіпа, Забреї(Шевз суапеиз, бЗагсорпада бБиМаа, Зсарпада зіегсогагіа, Зіотахуз саїЇсйгапе, Тохогпупспев 2о атброіпепвів, Тгіріегоїдез ратбриза; Клещей, например, Оіїдопуспиз ргайфепзіз, Рапопуспиз цті, Тегапуспивз цпісае; Перепончатокрьільх, например, Ігідотугптех питіїїв, ЗоІепорзів іпмісбїа; Термитов, например,

Кеїїсційегтевз Ппезрегиз, Кеїісційептевз ПШамірез, Соріоїептевз їоппозапив, 2оо0і(егпторвзів апдивіїсоїїв,

Меоіїегтевз соппехив, Іпсівйегтев тіпог, Іпсівйегтевз іттідгапе; Блох, например, Сегайрпуїиз адаїЇпаеє,

Сегаїорпуйиз підег, МоворзуПиве Тавзсіайи5, ІеріорзуПа зеодпіз, Сіепосерпа|йдез сапів, Сіепосерпаїідез Теїїв, сч ов Еспізпорпада даїЇпасеа, Риїех ігіапз, Хепорзуа спеоріз, ХепорзуПа мехаріїз, Типда репеїгапе; Тиленхид, например, Меїіодідодупе іпсодпіга, Рга(уіепспив репеїгапзв. і)

Следующие примерь! представлень! в качестве иллюстрации, а не для ограничения.

Примерь!

Пример 1: Культивирование различньїх изолятов В... о зо Субкультури ЕМОСС-0077, ЕМССОС-0078, ЕМСОСС-0079, ЕМСС-0080 и ЕМСС-0081, которне поддерживали в пробирках со скошенньм агаризованньм питательньм бульоном, использовали для инокуляции колб для о качалок емкостью 250мл, содержащих 5Омл средь! следующего состава: со

Кукурузньій зкстракт 15г/л Ге)

Малтрин-100 40г/л «г

Картофельньй крахмал ЗоОг/л

КНоРО» 1,77г/л

КоНРО» 4,53г/л « рН средь довели до 7,0, используя 10 М Маон. -о с После инокуляции колбьї для качалок инкубировали при 30"7С на роторной качалке при 250об/мин в течение 72 час. Цельнье культуральнье жидкости тестировали в отношений Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа. :з» Пример 2: Активность цельньїх культуральньїх жидкостей различньїх изолятов В. в отношений Оіабгоїїса упаесітоцпсіа(а

Из цельньїх культуральньїх жидкостей, полученньїх при описанной вьіше ферментации отобрали по 2,5мл и ї5» перенесли из качалочньх колб в полипропиленовьіе пробирки для биотестов емкостью 5Омл. В каждую из пробирок добавили корм для Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа до конечного обьема 25мл. Корм и тест-материал ік интенсивно перемешали и распределили на пластинках для биотеста для проведения биотеста. По три-шесть о яиц Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа разложили на поверхности "корма". Пластинки для биотеста закрьли Муїаг и инкубировали их при 28"С без фотопериода. Подсчет проводили в течение 7 дней. Гибель оценили на 7-ой день о после инкубирования. 557 - размеру мертвой личинки на 7 день при сравнений с живой контрольной личинкой о на тот же день, что 557 из 4. 557 - 3. 557 -2 и 557 - 1 представляют размер личинки как 7595, 50905, 2590 относительно живой контрольной личинки из 4.

Результать! представленьі ниже в Таблице 1. Зти результать! показьшвают, что все провереннье 5 штаммов ов давали 10095 гибели. Более того, размер мертвьїх личинок составлял 12,5956 от размера контрольной живой о личинки. ю й вв

Пример 3: Локализация активности в отношений Оіабгоїїса ипаесітрипсіайа

Для проверки, связана ли активность Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа с дельта-зндотоксином/спорами или супернатантом 2,5мл цельньїх культуральньїх жидкостей ЕМСС-0077, ЕМСС-0080 и ЕМСС-0081 и МВ125 (ВасШиз (пПигіпдіепвів зибрзр. (епебгіопіз, вніращенная в идентичньїх условиях) центрифугировали на центрифуге

Зогма!! КО-58 при 15000об/мин (ротор бЗогмаї! 5534) в течение 15мин для разделения супернатанта и осадка. В осадке вьіделялись кристаллические дельта-зндотоксинь! и спорьі. Дельта-зндотоксиньі, образуемье активньм в отношений Оіабгоїїса ипаесітрипсіаїа изолятом В. ЕМОСС-0077, имели молекулярнье массь! ббкД, 29кД и 12кД по данньм 50О5-РАСЕ. Дельта-зндотоксинь, образуемье активньм в отношений Оіабгоїїса 70 упдесітрипсіаїа изолятом В. ЕМСС-0078 имели мол. массь! 153кД, 77кД, б7/кД, б1кД, 50кД, 42кД, З4кД, ЗОкКД, 24кД по данньм 5О5-РАСЕ. Дельта-зндотоксинь, образуемье активньм в отношений Оіабгоїїса упдесітрипсіаїа изолятом Ві. ЕМСС-0079 имели мол. массьй 135-1455юД по данньм 505-РАОБЕ.

Дельта-зндотоксиньі, образуемье активньмм в отношений Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа изолятом В. ЕМОСС-0080 имели мол. массьї 94кД и 40кД поданньімм 5О05-РАСЕ. Дельта-зндотоксиньі, образуемье активньм в отношений

Оіабгоїїіса ипдесітрипсіаіа изолятом В. ЕМСС-0081 имели мол. массьї 129кД и З2кД по данньм 505-РАСЕ.

Каждьй супернатант (2,5мл), полученньй описанньм вьше центрифугированием перенесли в полипропиленовье пробирки для биотестов емкостью 5Омл. Затем осадок ресуспендировали в 2,5мМл стерильной дистиллированной водьі и перенесли в отдельную полипропиленовую пробирку для биотестов емкостью 5Омл. Затем в пробирки для биотестов, которье содержали супернатант или ресуспендированньй 2о осадок добавили корм для Оіабгоїїса ипаесітрипсіага до конечного обьема 25мл. Остальнье стадии биотеста идентичньї описанньїм вьіше. Результать! учитьівали как описано вьіше.

Результатьї, представленнье в Таблице 2 показьшвают, что активность ЕМСС-0077, ЕМСС-0080 и

ЕМСС-0081 в отношений Оіаргоїїса ипдесітрипсіаїа присутствует во всех супернатантах, тогда как в осадке незначительная активность в отношений Оіабгоїїса ипаесітрипсіаїа известного Васійив (Пигіпдіепвів зирегр. сч ов їепебгіопів сконцентрирована (спорь и кристалль)). о о з вдо о со

Пл ов111000111100о

Ф зв Пл овю0000000000зо -

С жвж) о оуерают 1110030 1бввдою вт

Пример 4: Активность в отношении І еріїіпоїагза (ехапа «

После фильтрации через мембрану 0,2, супернатант ЕМСС-0080, полученньй в Примере 1, использовали "у с для анализа активности в отношений жуков.

Фильтрованньй супернатант нанесли на листья баклажана в обьеме 190 (л/га). Использовали разведения 0, з 1:1, 1:4, 1:8 (супернатант: дейонизированная вода, обьем/обьем).

Личинки І ерііпоїагза (ехапа поместили на обработаннье листья согласно стандартньім способам. На каждьй лист помещали по 20 личинок ГГерііпогагза (ехапа. їх Результатьі приведеньії в Таблице З ниже, где показано, что фильтрованньй супернатант ЕМСС-0080 активен в отношении І ерііпоїагза (ехапа. се) со й о зв во о 1111 Меобработанннйконтроль! о г Пример 5: Синергичньій зрфект ЕМССОС-0080 и МОМОрО тм

Результатьї, представленньве в Таблице З вьіше, показьівают, что один супернатант ЕМСС-0080 не активен в 6р разведений 1:8. Однако, при обработке листьев баклажана 1,2595 или 2,596 сконцентрированньм в 10 раз супернатантом ЕМСС-0080 вместе с 200цг МОМОрО Ктм (Момо Могаїзк А/5, Вадзмаєга, Оептагк)уумл получают синергичньій зффект, проявляющийся в резком уменьшений ІС со и Соду МОМОрОк тм, Даннье приведень! в

Таблице 4 ниже. ве

Синергичньій зффект ЕМОС-0080 и МОМОрОоДдтм

МомороктовжЕМОСОВО 98/40 183 1 С5о определена, как концентрация, которая убиваєт 5095 популяции целевьх насекомьх. 2| Сед определена, как концентрация, которая убивает 90965 популяции целевьїх насекомьх.

З наклон кривой представляет собой кривую зависимости 95 гибели от логарифма концентрации.

Пример 6: Очистка активного в отношений Жесткокрьільїх вещества, образуемого штаммом В.І. ЕМСС-0080

Штамм В. ЕМССОС-0080 вьіращивают в течение 24 час при 30"С в среде следующего состава в г/л при рН 7,0:

Мальтодекстрин дог

Соевьй белок /-40г

КНоРОд 1,8г

КоНРОд 4,5г

МазО4 х7НгО 0 ОЗг

Микрозлементь 0,2мл - -

Клетки и инье нерастворимье компонентьь удалили из цельной культуральной жидкости штамма В...

ЕМОС-0080 центрифугированием с последующей фильтрацией супернатанта через Целит и мембрану 0,2.

Раствор после мембранного разделения, затем сконцентрировали в 10 раз вьіпариванием.

Вьіделение активньїх в отношений жесткокрьільх веществ(а) из сконцентрированного в 10 раз раствора сч дв провели четьірехстадийньмм способом очистки. Во время очистки провели мониторинг активности с помощью поверхностного биотеста с использованием Оіаргоїїса упдесітрипсіаїа, а чистоту определили капиллярньім (о) злектрофорезом, как описано в Примере 8. На всех хроматографических стадиях провели детекцию при длине волньі 226бнм.

В частности, поверхностньій биотест провели следующим образом. Образць! сконцентрированного в 10 раз о зр раствора после мембранной фильтрации внесли в отдельнье лунки планшета для микротитрования, содержащие 200 ул отвержденного искусственного корма для насекомьїх на лунку и вьісушили на воздухе. (ав)

Двух-четььрех новорожденньїх Оіаргоїїса ипдесітрипсіаїа (корневье черви, СКМУ) осторожно поместили в с каждую лунку с помощью кисточки. Затем планшетьі! для микротитрования закрьли Муїаг с отверстиями для воздухообмена и инкубировали их при 302С и 80965 влажности. Оценку процента гибели проводили в течение 5. /-Ф3

Зв ВНеЙ. -

На первой стадии сконцентрированньй в 10 раз раствор сначала очистили на хроматографических колонках

Рпагтасіа 5Р Зерпадехе С-25 (катионобменник) (размер колонки 5х3Осм). Образцьї сконцентрированного в 10 раз раствора по 450мл развели до 18л дейонизированной водой, нанесли на колонку, предварительно уравновешенную 20мММ аммоний-ацетатньм буфером рН 5,0. Злюацию с колонки проводили со скоростью « 20 18мл/мин 5,0л непрерьівного градиента от 20ММ до 0,5М аммоний-ацетатного буфера рН 5,0. Фракции по їОмл У с отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту. Активнье фракции обьединили (приблизительно 150мл), лиофилизировали и перерастворили в дейонизированной воде до приблизительно 1/5 исходного :з» обьема.

На второй стадии 25мл образца, полученного на первой стадии, нанесли на колонку для гель-фильтрации

Віокадй Р2 (ехіга їпе) размером 5х100см, которую предварительно уравновесили дейонизированной водой. їх Злюацию с колонки проводили со скоростью 1мл/мин дейонизированной водой. Фракции по 1Омл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту капиллярньім злектрофорезом. Активньіе фракции обьединили со (приблизительно 400Омл). со На третьей стадии 400Омл, полученнье на второй стадии, развели до 1бл дейонизированной водой. Раствор 5р нанесли на колонку Рпагтасіа 5 Зерпагозеф ГРаві Ріом/ (сильньій катионообменник) размером 5хЗОсм, которую о предварительно уравновесили 20мММ аммоний-ацетатного буфера при рН 5,0. Злюацию с колонки проводили со о скоростью 17мл/мин 5,0л непрерьвного градиента от 20ММ до 0,5М аммоний-ацетатного буфера рН 5,0.

Фракции по 20мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту. Активнье фракции обьединили (приблизительно 250мл), а затем лиофилизировали досуха для удаления летучего аммоний-ацетатного буфера.

На четвертой стадии лиофилизированньй образец, полученньй на третьей стадии, перерастворили в 400мл (Ф) дейионизированной водьї. Раствор наносили на колонку ВіоКай СпеїехФ 100 (0,9хЗОсм), которую предварительно ко уравновешивали 20ММ аммоний-формиатньм буфером, рН 4,0. Злюацию с колонки проводили со скоростью

БбБмл/мин 2,4л ступенчатого градиента от 0,02. 50,1. 50,2. 50,35. 50,5. 51,0М аммоний-формиатного буфера, рН 4,0. бо Фракции по 20мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту. Активнье фракции обьединили (приблизительно З0Омл), а затем лиофилизировали досуха для удаления летучего аммоний-формиатного буфера.

С помощью капиллярного злектрофореза показали, что очищенньій активньій в отношений Жесткокрьільх материал содержит два вещества, Іа и Ір. 65 Пример 7: Доказательство структурьї вещества, активного в отношений Жесткокрьільх

Структурьі соединений Іа и ІБ установили на оснований данньїх спектроскопии, полученньїх для их ацетилированньїх производньх. 114мг смеси Іа и Ір ацетилировали бмл уксусного ангидрида в бмл пиридина с кристаллами 4-диметиламинопиридина в качестве катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре, а затем очистили с ПОМОЩЬЮ полупрепаративной КР-Сі8 ВЗЖХ. 5мг образца в 25ул нанесли на колонку и злюировали со скоростью 4мл/мин смесью вода-ацетонитрил (80965:2095). Детекцию проводили при длине волнь 254нм.

После очистки получили 2 ацетилированньїх производньїх, названньїх Производное А и Производное В.

Структурь! производньх А и В представлень на Фиг. 4.

Даннье ЯМР-спектроскопии, полученнье для Производного А указьівают на присутствие 14 атомов углерода 70 М 17 протонов. Однако, масс-спектральнье даннье предполагают мол. массу 652 и формулу

СовНаоМегО 342 (точная масса 653,2801,МН я, расчетная 653,2782). Зто позволило установить, что соединение симметрично, причем только половина сигналов наблюдаєется при ЯМР-спектроскопиийи.

При ЯМР-спектроскопий наблюдается несколько спиновьїх систем. Центральное пиразиновое кольцо, замещенное в положениях 2 и 5 определено по синглетам протонов в сильном поле при 8,бррт (Н-З и Н-6), 75 Которне проявили широкий диапазон взаймодействия со всеми атомами углерода в цикле и с первьім атомом углерода боковой цепи (С-7). Боковая цепь из трех атомов углерода ацетилирована по положениям 7 и 8 с метиленом в положений 9. Атом углерода 9, как показано, имеет широкий диапазон корреляции с карбонилом зфира, а зфир, как установлено, является частью аланина, которьій ацетилирован по аминогруппе.

Структура Производного В отличается по одному положению от Производного А. В одной из боковьїх цепей производного В атом углерода С-7 не ацетилирован и не связан с кислородом, а, как бьло показано, представлен метиленом. Другая боковая цепь идентична таковой Производного А. Зто различие только по одному атому кислорода также наблюдали в данньїх масс-спектрометрии. Даннье масс-спектрометрий показали точную массу 595,2722 (МНяк, расчетная 595,2727) для Производного В, что соответствует формуле СовНазвМеОзо. Оптические плотности Производньїх А и В следующие: Производное А - (А)р2/- -6,97, Ге а Производное В - |А|р2! - 327. Полнье оценки данньїх ПМР- и "ЗС-ЯМР-спектроскопии сделаньі на основе о зкспериментов по нарушению влияния, СО5У, НМОС и НМВС. Данньсе представлень в таблице 5. о » о 110 проювдя 01010101 Прожводнві дв нини со

Ф пн ПО ПЕРУ ЕК зв ню мово ч мн зявомну вмовоз

С важеанотпіввтнахзватноттівелн. 000 ялвалноспавтлазоютин 635 663 « стави «о що с :» в 7 в пнани

Ф со тата й о ат00000000000пввютя о ни нн ЕСЕ ов 1 тятв, о трата ю я нн ПО сх: НН бо юю хи Т - сигналь! могут обмениваться.

Даннье масс-спектроскопиий для смеси соединений Іа и ІБ дают два молекулярньїх иона - 400 и 384. На оснований зтих данньїх установлено, что молекулярная формула соединения Іа - С 16Нов8МеОв и соединения Ір в5- Св6НовМеОБ. Структурь! Іа и Ір установлень! сравнением данньїх ЯМР-спектрометрии для Производного А и

Производного В с данньіми ЯМР-спектрометрии для смеси Іа и ІБ. Структурь! Іа и Ір приведень ниже.

Іаї Е, Ку, Р», З ЕН

ІВ: К, К/,К» - Н, Кз - ОН

Свойства соединений Іа и ІБ и их ацетилированньїх производньх

Ї В ов

М

Мн С Хе мів у) ВІвМ нак 4 НИ, ра се) ок Й! представлень! ниже: 2 зв см в о) о зо шу щі со

Ф

З

Пример 8: Определение количества соединений Іа и ІБ в культуральньїх жидкостях.

Штамм В.І. ЕМСС-0080 вьіращен, как описано в Примере 1. Концентрация соединений Іа и б в « культуральньїх жидкостях установлена капиллярньім злектрофорезом.

Для количественного определения бьла использована система капиллярного злектрофореза ВіоКкаа - с Віоїосиз 3000, снабженная капилляром без оболочки (50 цм х 5Осм), 0,1М фосфат при рН 2,5, напряжение 2ОКВ, ч» полярность от положительной до отрицательной и детекция при длине волньї 200нм. Обьем образца " составляєт ЗОцл при дополнительной инжекции О,З5кг/см2. Время анализа составило 10 минут при злюации активньїх в отношений ЖесткокрьІільїх соединений Іа и ІБ 6,0 и 5,9 минут, соответственно.

Альтернативно, для количественного определения бьла использована система капиллярного пи злектрофореза Весктап Р/АСЕ 2100, снабженная капилляром без оболочки (50 ум х 47см), 0,1М фосфатньй

Ге) буфер при рН 2,5, напряжение 20ОКВ, полярность от положительной до отрицательной, и детекция при длине волньі 200нм. Обьем образца составляеєт ЗО ул при инжекции под давлением в течение 1Осек. Время анализа бо составляет 10 минут при злюции активньїх в отношений Жесткокрьільїх соединений Іа и ІБ 7,0 и 6,7 минут, о 20 соответственно.

Клетки и инье нерастворимье компонентьь удалили из цельной культуральной жидкости штамма В.. с ЕМСС-0080 центрифугированием и фильтрацией через Целит и мембрану 0,2. Полученньій супернатант анализировали способом капиллярного злектрофореза, как описано вьіше. Результать! показали, что активнье в отношений Жесткокрьїльїх соединения Іа и ІБ присутствуют в культуральной жидкости в концентрации 52 приблизительно 9Омг/л каждая.

ГФ) Пример 9: Определение активности соединений Іа и ІБ.

Относительная активность неочищенной смеси соединений Іа и ІБ (в соотношениий приблизительно 1:1) о установлена при использовании І еріїпоїагза (ехапа в качестве тест-насекомого и сравнении гибели, ассоциированной с препаратом Васіїйиз (пигіпдіепзіз зирегр. (епебгіопіз в качестве внутреннего стандарта. 60 Биотестьі на листьях провели для установления активности неочищенной смеси соединений іа и Ір в отношений І ерііпоїагза (ехапа. Для проведения биотеста на листьях тест-материаль! и стандарть! отвесили в центрифужнье пробирки емкостью 5Омл и суспендировали в дейонизированной воде, содержащей 0,190

Тмеепе 20. 1200мг стандарта Васійшзв Іпигіпдіепвзіз зибзр. (епебгіопіз отвесили и суспендировали с получением конечной концентрации 12000у/г. Тест-образцьі (например МОМОБОР тм и МОМОБОК м с соединениями Іа и ІБ) бо обрабатьвшали подобньм образом, пока уровень результатов биотеста не показьшвал, что внесенная доза слишком велика или слишком низка для получения достаточного количества достоверньїх данньїх. В таком случае концентрацию первичного раствора повьішали или понижали изменением количества добавленного в него растворителя. Затем каждьй образец гомогенизировали в течение Зб0сек, используя гомогенизатор Міпів и обработали ультразвуком в течение 20сек, 100вт с помощью ультразвукового гомогенизатора Вгайпзопіс 1510.

Каждьй из зтих исходньїх растворов затем развели, используя Натійоп Місгоїар 1000 для получения 7 серийньїх разведений, содержащих 3000, 2000, 1333, 857, 545, 364 и 245 у/мл в 1бмл. Каждьй из зтих растворов по 1бмл нанесли на приблизительно 19дм2 листьев баклажана с помощью распьлителя Оеємгієв І іпеаг Тгаск, откалиброванного для нанесения 190л/га. Контрольнье листья опьілили 1бмл дейонизированной водь. Листья 70 Ввісушили на воздухе и поместили в одноунциевую прозрачную пластмассовую чашку, содержащую 5 личинок

І ерііпоїагза (ехапа второй возрастной стадии. На листья затем поместили картоннье крьішки и вдавливанием крьішек внірезали из листьев диски по 4см и внесли их в чашки. Затем чашки перевернули и личинки упали на обработанньюе поверхности листьев. Для каждого из 7 серийньїх разведении готовили по 8 чашек. Чашки сложили, пометили, поместили на подставки и инкубировали в течение З дней при 30"С и 6595 относительной 75 влажности. Зти 56 зкспериментальньх и 8 контрольньїх чашек составляли один биотест.

Через З дня определили уровень гибели насекомьїх. После резкого удара по каждой чашке определили, какие личинки неподвижнь!, и посчитали их мертвьми. Процент гибели вьічислили, а даннье анализировали с помощью параллельного пробит-анализа. При зтом оценивали і!Сво, І/Соор наклон линии регрессии, козффициент вариации, а также активности.

Для определения активности неочищенную смесь соединений іа и ІБ развели, анализировали биотестом и сравнили со стандартом Васійшв (пПигіпдіепзів зибер. (епергіопіз, активность которого составляла 20000 ГГ ТИ/г (единиц І! ерііпоїагза (ехапа/г).

Результать! активности, представленньсе в таблице 6 ниже, показьівают, что неочищенная смесь соегдинений

Іа и ІБ (1:1) имеет активность 75555 ІТ на г активного ингредиента при ЇС50 7Оцг/мл (1,8мг общего активного с ингредиента/мл). (5)

Фо 3о о

Пример 10: Потенцирование кристаллического дельта-зндотоксина Васіїйив (пигіпдіепвів зирер. іепебгіопігї 0 соединениями Ів и ІБ.

Способность соединений Іа и ІБ усиливать инсектицидную активность кристаллического дельта-зндотоксина б з5 Васіййв (Нигіпдіепзіз зирер. (епергіопів в отношений Іеріїпоїагга (ехапа бьла установлена добавлением «ж неочищенной смеси соединений Іа и ІБ к МОМОБОмтмМ и определением І/С5о с помощью параллельного пробит-анализа.

Биотесть! на листьях проводили в отношений І ерііпоїагза (ехапа, как описано в примере 9, для определения « уровня усиления, полученного при добавлений соединений іа и ІБ к МОМОро Кк м. Растворьі серийно разводили, используя Натійоп Місгоїар 1000 для получения исходньїх растворов, содержащих МОМОБОК м в концентрации - с 1000,0, 666,7, 444,4, 285,7, 181,8, 121,2 и 80,Оцг/г. Два различньїх разведения смеси Іа и ІБ готовили для "» получения 7 серийньїх разведениий, содержащих 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 131, 8,7 и 5,8 ш/г (2,596506. с 1000цг/г " МОМОрогмтм) и 3з6,0, 24,0, 16,0, 10,3, 6,5, 4,4 и 2,9цг/г (1,259606. с 1000цг/г МОМОрок тм), Неразбавленнье образць! без соединений Іа и Ір и упомянутье вещества готовят таким же образом. І С 5о пар неразбавленньх 42 образцов делят на значения ІС Бо при усилении, что дает степень снижения ІС со, связанного со смесью те соединений Іа и ІБ.

Ге) Результать! представлень в таблице 7 ниже, они показьівают, что неочищенная смесь соединений іа и Б со усиливает инсектицидную активность МОМОМО КК м в отношении І ерііпоїагза іехапа. о с ворон 00060000 їй 7 оуоровяттовють 11111918

Ф) 7 Пример 11: Активность смеси соединений Іа и ІБ в отношений жуков ІЮ5 саїЇїдгаопісиз и Оепагосіопив

Топіаїв.

Токсичность неочищенной смеси соединений Іа и ІБ определяли в отношений жуков Ірз саїПагарпісив и 60 Оепагосіопив Іопіаїйз. Змл неочищенного раствора соединений Іа и ІБ (1,8мг активного ингредиента в мл) добавили к 5г лиофильно вьісушенной флозмь! сосньі ладанной и 7мл дистиллированной водьі. Контрольньй корм готовили с 1Омл водь. Корм разделили на З чашки Петри и 5-10 молодьх жуков Ірв и только что появившихся жуков Юепагосіопиз поместили на каждую чашку. Три различньїх чашки обработанного корма и контрольного корма заселили 10-20 насекомьіми. Чашки Петри инкубировали в темноте при 25С и 65 подсчитьівали количество мертвьїх насекомьїх на 4, 7 и 10-12 дни после заселения. Представленнье даннье являются средними по 2 или З опьтам для каждого вида насекомьїх. Результать! для Ірз саїІдгарнпісив представлень! в таблице 8 ниже. Они указьівают на то, что неочищенная смесь соединений Іа и Ір является инсектицидной. кю! 00000004,0000010010100000о о і 00000000001051000001010о й

Результать! для ЮОепагосіопиз Ігопіаїїз представлень! в таблице 9 ниже. Они показьівают, что неочищенная смесь соединений Іа и ІБ является инсектицидной. 2 коню! 000000004р06ю00010600000о см о

Пример 12: Активность в отношений Роріїйа іаропіса (японского жука).

Неочищенную смесь соединений Іа и ІБ тестировали на пестицидную активность в отношений Роріїйа о 3о |аропіса третьей возрастной стадии. Корни плевела (11-дневнье) обмакнули в неочищенную смесь соединений с

Іа и Ір (1,8мг їа и Ірб/мл) и подсушили. Одну треть личинок третьей возрастной стадии Роріїйа |аропіса поместили в металлическую емкость с несколькими обработанньми корнями. Через 24 часа корни и личинки со покрьіли глиной МУоовіег. Контрольнье корни обмакнули в воду и необработаннье контроли, содержащие (Ф) личинки, поместили непосредственно в глину на день 1. Емкости инкубировали в темноте при температуре 25"С, а число мертвьїх личинок учитьівали через 7, 10, 21, 28 и 36 дней и отмечали гибель относительно т контроля (Вьіживаемость в контроле - вьіїживаемость при обработке)/вьіживаемость в контроле) х 10095). Для каждой обработки использовали в общем 25 личинок. Результатьі, приведеннье в таблице 10 показали, что неочищенная смесь соединений Іа и ІБ зффективна в отношений Роріїїа іаропіса третьей возрастной стадии. « зо З с з тв рову ро вол зву, 5 Знонтоля 0043, 79, 2530 т о жетннкові вові

Ф бо Пример 13 Активность в отношений Еріїаснпа магімевіз (мексиканского Фасолевого жука) ав! 20 Неочищенную смесь соединений Іа и ІБ тестировали на пестицидную активность в отношений Еріїасппа магімезіз третьей возрастной стадии. Колонию взросльїх жуков Еріїасппа магімезвіз поддерживали на кустовой с лимской фасоли Вигрее в камерах для роста при фотопериоде 16:8 при 26,77С и относительной влажности 5090.

Кладки яиц собрали и обеспечили их вьіведение на чашках Петри, содержащих влажнье хлопковье фитили и листья лимской фасоли. Через 2 дня собрали личинок второй возрастной стадии и использовали их в биотестах 25 с обмакиванием листьев. Для проведения биотеста собрали листья фасоли и пропустили черешок каждого

ГФ) листа через резиновую перегородку ботанической пробирки, содержащей 4мл водь. Затем листья обмакнули в серийнье разведения в диапазоне 0-1295 неочищенного материала, содержащего соединения Іа и Ір. Листья о вьісушили и на каждьй лист поместили по 8-10 личинок второй возрастной стадии. Насекомьїх, листья и ботанические пробирки поместили в 22-унциевую бумажную чашку, покритую мелкоячеистой сеткой. Чашки 60 держали в той же камере роста, что и для колоний жуков. Каждье 2 дня чашки вьінимали из камерь! роста, учитьівали личинок, а листья заменяли свежими обработанньми листьями. Тестирование закончили через 8 дней.

Результатьії, приведеннье в таблице 11, показали, что неочищенная смесь соединений Іа и Іб активна в отношений личинок Еріїаснпа магімевів. б5

Таблица 11

Дней после обработки) 1 С50 95 нн их НЕ т НН втомі ов

Пример 14: Полевье испьїтания в отношении І ерііпоїагза десетіїпеаіа (колорадского картофельного жука). 70 Проведень испьітания по защите картофеля (вариетет Каїапаїп) от І ерііпоїагза десетіїпеаіа с неочищенной смесью соединений Іа и ІЮ, применявшейся в концентрации 125, 250, 375 и 750г/га в сочетаний с МОМОБОК тм в концентрации 1,4 и 2,вл/га. МОМОБО тм также применяли отдельно в концентрации 1,4, 2,8 и 5,бл/га.

Обработки проводили дваждьі через 7 дней с помощью ранцевого распьилителя СО», снабженного З польіми коническимай патрубками систем разбрьізгивания ТХУХ-12/ряд и откалиброванного для разбрьізгивания 32 СРА 75 при 4,8км/час и 3,9кг/см2. Каждая обработка проводилась 4 раза на делянках по два ряда (на расстояний 86,4см) по 7,5м, вьібранньїх случайнь!м образом. Подсчеть! взросльїх особей и личинок І ерііпоїагза десетіїпеаіа проводили без повреждения листвьї на свьіше 15м ряда/делянку.

Результатьі, представленнье на Фиг. З показьвают, что неочищенная смесь соединений Іа и ІБ дает значительную синергичную активность с МОМОБО Км на картофеле. При 14л МОМОБОоК м/га бьіл отмечен 2190 от уровня контроля, тогда как 125г неочищенной смеси соединений Іа и ІрБ/га дает 1395 от уровня контроля.

Однако, при совместном применений МОМОБОКтм и неочищенной смеси соединений Іа и Іб на зтих уровнях процент в контроле поднимался до 8195. Аналогично, при использованиий 250г неочищенной смеси соединений

Іа и Іб/га получили 2895 от уровня контроля, тогда как 14л МОМОБОК тм/га бьіло отмечено 2195 от уровня контроля. Но при совместном применений МОМОБОВ тм и неочищенной смеси соединений Іа и ІБ, процент СМ контроля повьішался до 8195. Более того, когда неочищенную смесь соединений Іа и Іб в концентрации 125г/га и г)

МОМОрОоК тм в концентрации 2,вл/га применяли вместе, процент в контроле повьішался до 88905.

Депонирование микроорганизмов.

Следующие штаммь Васіййв5 Іпигіпдіепвіз бьли депонированьій согласно Будапештскому Договору в

Коллекции Культур Патентной Службьі! Сельскохозяйственньїх Исследований Северного Регионального Центра -

Исследований (МАК), 1815 Опімегейу зігееї, Реогіа, Шіпоіз, 61604, ОА. о со

Ф т

Штаммь бьіли депонировань! на условиях, обеспечивающих доступность культурьі! в период рассмотрения ч зтой патентной заявки лицам, которне определеньі Комиссаром по Патентам и Товарньїм Знакам, согласно 37 т с С.Б.К. параграф 1.14 и 35 |И.5.Сб. параграф 122. Депозит представляет чистье культурь каждого в депонированного штамма. Депозит доступен, как предписано зарубежньіми патентньіми законами в странах, где ни подань! копий заявки или ее продолжение. Однако, следует понимать, что доступность депозита не означает права на использование изобретения в нарушение патентньїх прав, предоставляемьх правительственньім решением. ве Описанное и заявленное изобретение не ограничено представленньми примерами применения. Примерь! со приведеньй как иллюстрация различньхх аспектов изобретения. Различнье модификации изобретения в дополнение к тем, что показань! и описаньі, будут для специалистов очевидньї из описания. Зти модификации (ее) считаются входящими в прилагаемую формулу изобретения. о 50 Содержание ссьілок, использованньх в описании, полностью включено в описание.

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Штамм бактерий Васі» Іпигіпдіепзів МКК. В-21090 или его мутант с теми же свойствами, что иуказанньй о штамм, используемьй для получения вещества, имеющего структурную формулу юю о б ов бо Как. | й: МАК, в, М их. Во ов о. бо где Б, Ку, Б», Вз - Н соединение (Іа) или

   ЕК, Ку, КЕ» - Н, Кз - ОН соединение (ІБ), или их смеси и обладающего пестицидной активностью.

   2. Штамм бактерий Васйиз (пигіпдіепзіз МАККІ. 8В-21091 или его мутант с теми же свойствами, что и указанньій штамм, используемьй для получения вещества, имеющего структурную формулу М 70 - НМ в.вЖ М ) ко ок /5 где К, Ку, Ко, Кз - Н (Іа) или К, КІ, К2 - Н, КЗ - ОН (ІБ), или их смеси и обладающего пестицидной активностью.

   З. Штамм бактерий Васіїйив (пигіпдіепзві МАКІ 8В-21093 или его мутант с теми же свойствами, что и указанньій штамм, используемьй для получения вещества, имеющего структурную формулу І М МН -к МКК, - НМ

   К.М М ак о с 29 ко ок Го) где К, Ку, К», Кз - Н (Іа) или КЕ, Ку, К» - Н, Кз - ОН (ІБ), или их смеси и обладающего пестицидной активностью.

   4. Штамм бактерий по любому из пп. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанное вещество обладаєт су зо пестицидной активностью в отношений вредньїх насекомьїх отряда Жесткокрьільїх и получено из супернатанта ферментации штамма. о

   5. Пестицидная композиция, отличающаяся тем, что она содержит вещество общей формуль! со вк о зок Ф

   М . в | г МАВ. З я НМ шк М - « ) ко ок - с где РК, Вч, В», Вз - Н (Іа) или "» ЕР, Ку, К» - Н, Кз - ОН (ІБ), или их смесь, " обладающее пестицидной активностью в отношений вредньх насекомьх отряда ЖесткокрьІльх, в количестве не менее 1 г/І Ту, и пестицид на основе Васіїїш5, причем вещество Іа или Ір, или их смесь получено из супернатанта ферментации штамма Васійи5, у которого вся пестицидная активность находится в те супернатанте ферментации штамма. со 6. Пестицидная композиция по п. 5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пестицидно зффективньй носитель. со 7. Способ борьбь! с вредньмми насекомьми отряда Жесткокрьільїх, вьібранньіми из группьі, состоящей из о 20 |ерііпоїагза десетіїпеаїйа, Іре сайдгарпиз, Оепагосіопив їїопіайв, Еріасппа магімавзіїв, Роріїйа даропісих, отличающийся тем, что вредителей обрабатьвают зффективньм количеством пестицидной ме, композиции по любому из пп. 5, 6.

   8. Способ усиления пестицидной активности пестицида на основе Васійй5 путем обработки вредителя пестицидной композицией, содержащей вещество, обладающее пестицидной активностью и пестицидно 2 зффективньй носитель, отличающийся тем, что в качестве вещества, обладающего пестицидной активностью, ГФ) используют вещество, полученное из супернатанта ферментации штамма бактерий ВасшШив (пигіпдіепвів, вьібранного из группьї, состоящей из штамма МАК. В-21090, штамма МКК. В-21091, штамма МКК. В-21093 или о его мутантов с теми же свойствами, причем указанное вещество используют в количестве, достаточном для усиления пестицидной активности указанного пестицида на основе Васійшв. 6о 9. Способ получения вещества структурной формуль! б5 о з ов М Как : Ме, ря в. М но Во ов о где Р, Ку, Р», Кз - Н (Іа) или ЕК, Ку, КЕ» - Н, Кз - ОН (ІБ), или их смеси, обладающего пестицидной активностью, заключающийся в том, что культивируют штамм бактерий Васійн5 Іпигіпдіепвзіз, внібранньй из группьі, состоящей из штамма МКК. В-21090, штамма МКК. В-21091, штамма МКК. В-21093, на подходящей для роста среде, отделяют супернатант и вьіделяют целевой продукт из полученного 72 супернатанта. с о «в) о с (22) « ші с ;» щ» се) (ее) о 50 (42) Ф) іме) 60 б5