JP3798017B2 - 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株 - Google Patents
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Description
本発明は、双翅目の害虫に対して活性を示す新規の化合物に関する。本発明は、バチルス(Bacillus)属関連農薬、化学農薬及び/又は昆虫病原性(entomopathogenic)ウイルスの農薬活性に対して増強又は協力する(synergize)ような化合物にも関する。本発明は、この種の化合物を産生するバチルス チューリングエンシス(Bacillus thuringiensis)の新規の株にも関する。本発明は、前記化合物と農薬担体とを含むか、又は前記化合物とバチルス属関連農薬、化学農薬及び/又は昆虫病原性ウイルスとを含む農薬製剤にも関する。本発明は、害虫を防除するための前記農薬製剤の使用にも関する。
発明の背景
農業、森林及び公衆衛生に有害な害虫は、毎年何百万ドルもの損失を与えている。このような害虫の防除には様々な方策がとられてきた。
その一つは、広範囲の活性を有する化学農薬の使用である。
しかしながら、化学農薬の使用には多くの欠点がある。特に、活性の範囲が広いため、この種の農薬は益虫及び害虫寄生虫のような非標的生物を殺害し得る。また、化学農薬はしばしば、動物及びヒトに対して有毒である。更に、標的害虫はこの種の物質に繰り返し暴露されると耐性を生じることが多い。
別の方策は、昆虫、真菌及び雑草の蔓延を防除するための生物農薬(biopesticide)の使用に関する。生物農薬は、天然の病原体及び/又はこれらの病原体によって産生された物質である。生物農薬の使用の利点は、この種の農薬が非標的生物及び環境全体に対して化学農薬より低い毒性を示すことにある。
最も広く使用されている生物農薬はバチルス チューリングエンシス(Bacillus thuringiensis)である。バチルス チューリングエンシスは、自然界、特に土中及び昆虫の多い環境に広く分布する運動性桿状体グラム陽性細菌である。バチルス チューリングエンシスは胞子形成時にパラ胞子結晶細胞含有物(parasporal crystal inclusion)を産生する。この細胞含有物(inclusion)は摂取されると、鱗翅目、双翅目及び鞘翅目の感受性昆虫の幼虫に対して殺虫作用を示す。該細胞含有物は、様々な形状、数及び組成を有し得る。該含有物は、大きさが27〜140kDaの範囲であり得るδ内毒素と称する1種類以上のタンパク質からなる。殺虫性δ内毒素は通常、一般に、幼虫腸内でプロテアーゼによって、より小さい(端を切断した)毒性ポリペプチドに変換され、中腸の破壊を引き起こし、最終的に昆虫を死亡させる
森林、農業及び公衆衛生分野で生物農薬として広く使用されているバチルス チューリングエンシス株は数種類存在する。バチルス チューリングエンシス subsp.kurstaki及びバチルス チューリングエンシス subsp.aizawaiは、鱗翅目に特異的なδ内毒素を産生する。鞘翅目に特異的なδ内毒素は、バチルス チューリングエンシス subsp.tenebrionisによって産生される(Kriegら,1988,米国特許第4,766,203号)。また、バチルス チューリングエンシス subsp.israelensisは双翅目に特異的なδ内毒素を産生する(Goldberg,1979,米国特許第4,166,112号)。
双翅目害虫に特異的な別のバチルス チューリングエンシス株も記述されている。双翅目及び鱗翅目に対して毒性のバチルス チューリングエンシス分離株が開示された(Hodgmanら、1993,FEMS Microbiology Letters 114:17−22)。この分離株に由来する精製結晶δ内毒素のナトリウムドデシルポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、CryIA(b)、CryIB及びCryIIA毒素と同類の3種類のタンパク質が明らかにされた。分子量140、122、76、72及び38kDaのタンパク質からなる双翅目活性結晶を産生するバチルス チューリングエンシス分離株も開示された(Payne,1994,米国特許第5,275,815号)。欧州特許明細書第480,762号は、双翅目害虫に対してそれぞれ活性を示す5種類のバチルス チューリングエンシス株を開示している。各株はまた、独自の結晶δ内毒素パターンを有する。
鱗翅目、鞘翅目及び双翅目以外の害虫に対して農薬活性を示す数種類のバチルス チューリングエンシス株も記述されている。線虫に対して毒性のδ内毒素を産生するバチルス チューリングエンシス株が5種類開示された(Edwards,Payne及びSoares,1988,欧州特許出願公開明細書第0 303 426 B1号)。寄生原生動物の宿主となっているヒト及び動物の治療に使用できるバチルス チューリングエンシス株PS81Fも開示された(Thompson及びGaertner,1991,欧州特許出願公開明細書第0 461 799 A2号)。ダニ科害虫に対して活性を示すバチルス チューリングエンシス分離株も幾つか開示された。これらの分離株は、35kDa〜155kDaの(広)範囲の分子量を有するタンパク質からなる結晶を産生する(Payne,Cannon及びBagley,1992,PCT出願第WO92/19106号)。バチルス チューリングエンシスの、膜翅目の害虫に対して活性を有する株(Payne,Kennedy,Randall,Meier及びUick,1992,欧州特許出願公開明細書第0516 306 A2号)、半翅目の害虫に対して活性を有する株(Payne及びCannon,1993,米国特許第5,262,159号)、吸虫害虫に対して活性を有する株(Hickle,Sick,Schwab,Narva及びPayne,1993,米国特許第5,262,399号)及びPhthiraptera目の害虫に対して活性を有する株(Payne及びHickle,1993,米国特許第5,273,746号)も開示されている。また、オーストラリアの羊から刈り取った毛から分離されたバチルス チューリングエンシス subsp.kurstakiの別の株WB3S−16も開示された。これは、Phtiraptera害虫であるハジラミDamalinia ovisに対して毒性を示す(Drummond,Miller及びPinnock,1992,J.Invert.Path.60:102−103)。
δ内毒素は、通常プラスミド上に位置するcry(結晶タンパク質)遺伝子でコードされる。cry遺伝子は、相対的アミノ酸相同性及び農薬的特異性に基づいて、6種類のクラス及び数種類のサブクラスに分類された。主要クラスは、鱗翅目特異的(cryI)、鱗翅目及び双翅目特異的(cryII)、鞘翅目特異的(cryIII)、双翅目特異的(cryIV)
鞘翅目及び鱗翅目特異的(TailorらによりcryV遺伝子と称されている,1992,Molecular Microbiology 6:1211−1217)並びに線虫特異的(FeitelsonらによりcryV及びcryVI遺伝子と称されている,1992,Bio/Technology 10:271−275)である。
δ内毒素は組換えDNA法によって製造されてきた。組換えDNA法で製造したδ内毒素は結晶形態を有し得るか又は有し得ない。
バチルス チューリングエンシスの幾つかの株は、β外毒素I型又はチューリンギエンシン(thuringiensin)として知られている熱安定農薬活性アデニンヌクレオチド類似体を産生することが判明した。この外毒素は単独で農薬活性を示す(Sebestaら,H.D.Burges(編),Microbial Control of Pests and Plant Diseases,Academic Press,New York,1980,pp.249−281)。β外毒素I型は、一部のバチルス チューリングエンシスの培養の上清中に発見された。該毒素は分子量が701であり、アデノシン、グルコース及びアラル酸(allaric acid)からなる
Microbial and Viral Pesticides,Marcel Dekker,New York,1982,pp.35−72)。その宿主範囲には、非限定的具体例として、Musca domestica,Mamestra configurata Walker,Tetranychusurticae,Drosophila melanogaster及びTetranychus cinnabarinusが含まれる。β外毒素I型の毒性は、ATPとの競合によるDNA依存性RNAポリメラーゼの阻害に起因すると考えられる。β外毒素I型はバチルス チューリングエンシスの5種類の株でcryプラスミドによってコードされることが判明した(Levinsonら,1990,J.Bacteriol.172:3172−3179)。β外毒素I型は、バチルス チューリングエンシス subsp.thuringiensis血清型1、バチルス チューリングエンシス subsp.tolworthi血清型9及びバチルス チューリングエンシス subsp.darmstadiensis血清型10によって産生されることが判明した。
β外毒素II型として分類される別のβ外毒素が開示された(Levinsonら,1990,J.Bacteriol.172:3172−3179)。β外毒素II型はバチルス チューリングエンシス subsp.morrisoni血清型8abによって産生されることが判明しており、Leptinotarsa decemlineataに対して活性を示す。β外毒素II型の構造は完全には解明されていないが、プソイドウリジン部分が、そうでなければプロトンによって占拠されるであろう位置でリボース環への結合が行われるアデニンの場所に存在するという点でβ外毒素I型の構造とは有意に異なる(Levinson,Hickle及びFinch(編),Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis,ACS Symposium Series,Washington,D.C.,1990,pp.114−136)。また、プロトンNMRスペクトルにはヌクレオシド塩基に対応するシグナルが一つだけ存在し(7.95ppm)、リボース型アノマータンパク質シグナル(5.78ppm)は存在しない。
バチルス チューリングエンシスから単離された別の水溶性物質としては、Musca domesticaの幼虫に対して毒性のα外毒素(Luthy,1980,FEMS Microbiol.Lett.8:1−7)、レシチナーゼ、キチナーゼ及びプロテアーゼを含む種々の酵素であり、β外毒素もしくはδ内毒素と組合わせた時にだけ毒性効果を示すγ外毒素(Forsbergら,1976,Bacillus thuringiensis:Its Effects on Environmental Quality,National Research Council of Canada,NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality,Subcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena)、β外毒素と類似の構造を有し、Leptinotarsa decemlineataに対しても活性を示すσ外毒素(Argauerら,1991,J.Entomol.Sci.26:206−213)、及びアンヒドロチューリンギエンシン(anhydrothuringiensin)(Prystasら,1975,Coll.Czechosslovak Chem.Comm.40:1775)が挙げられる。
WO94/09630号は、バチルス チューリングエンシスの農薬活性を増強する因子を開示している。この因子はバチルス チューリングエンシス培養の上清から得られる。
当業者は、バチルス チューリングエンシスの効果を改善し且つ宿主範囲を拡大する努力をしてきた。そのための手段として、改善された又は新規の農薬活性を有するバチルス チューリングエンシス株の分離、現在のバチルス チューリングエンシス株の改良操作(engineering)、並びにバチルス チューリングエンシス結晶δ内毒素及び胞子と新規の農薬担体又は化学農薬とを組合わせることによるより効果的な製剤の設計等が行なわれてきた。
本発明の目的は、双翅目の害虫に対して活性を示す新規の物質を提供することにある。
本発明の別の目的は、既知のバチルス チューリングエンシス製剤の農薬活性を改善することにある。
本発明の更に別の目的は、農薬の農薬活性を増強することにある。
所与の害虫に対して使用できる生物農薬のスペクトラムが広がるように、新規の物質を製造するためには、新規のバチルス チューリングエンシス株を分離するのが有利である。
発明の概要
本発明は、下記の特性を有することを特徴とする新規の物質に関する。
(a) 双翅目の害虫に対する農薬活性、及び
(b) 例えば増強剤もしくは協力剤(synergizer)として、異なる抗害虫バチルス関連農薬、化学農薬及び/又は昆虫病原性ウイルスと一緒に作用する性質。
本発明の物質は、3個の糖部分と2個のホスフェートとを含み、約7.62(1H,d)、5.83(1H,d)及び5.78(1H,d)に1H−NMR化学シフトを有するウラシルヌクレオシドも有し得る。該物質は約1000未満の分子量を有し得る。該物質はバチルス発酵物から取得し得る。あるいは、該物質は、バチルスの株、例えばバチルス チューリングエンシス株の発酵物から取得し得る。前記株の農薬活性は本質的に総てが発酵物の上清中に存在する。特定的には、本発明の物質は、バイオアッセイで検定して、7μg活性成分/食餌1gのLC50をMusca domaestica幼虫に対して示す(LC50は害虫の50%を殺すのに必要な所与の農薬物質の濃度である)。前記株の発酵物のペレットのLC50は、バイオアッセイで検定して、Musca domestica幼虫に対し、約3000μg活性成分/食餌1gを超える。
本発明の物質は、双翅目ショウジョウバエ(Drosophila)属及びハエ(Musca)属の害虫に対して殺虫活性を示し得る。最も特定的的な具体例では、本発明の物質は双翅目のDrosophila melanogaster種及びMusca domestica種の害虫に対して殺虫活性を示す。別の具体例では、本発明の物質はバチルス関連農薬の農薬活性を増強する。特定具体例では、本発明の物質は、害虫に対するバチルス チューリングエンシス結晶δ内毒素の殺虫活性を増強する。別の具体例では、本発明の物質は、鱗翅目の害虫に対するバチルス チューリングエンシス subsp.kurstaki結晶δ内毒素の殺虫活性に対して増強又は協力する。
本明細書中の「バチルス関連農薬」とは、害虫に対して活性であるか、害虫を殺すか、もしくは植物を害虫から防護するバチルス[例えばバチルス チューリングエンシス又はバチルス サブティリス(Bacillus subtilis)]株、胞子もしくは物質、例えばタンパク質もしくはそのフラグメント、又は、害虫に対して活性であるか、害虫を殺すか、もしくは植物を害虫から防護するバチルスタンパク質もしくはそのフラグメント(例えばバチルス チューリングエンシスδ内毒素)をコードするバチルス遺伝子を発現することができる微生物、及び許容し得る担体である。害虫は例えば、昆虫、線虫、ダニ又はカタツムリであり得る。害虫に対して活性であるか、害虫を殺すか、もしくは植物を害虫から防護するバチルスタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするバチルス遺伝子を発現することができる微生物は、葉面(植物の葉の表面)、及び/又は根圏(植物の根を包囲する土壌)、及び/又は水性環境に生息しており、特定の環境(作物及び他の昆虫生息環境)で野生型微生物と競合して勝つことができ、害虫に対して活性であるか又は害虫を殺すバチルスタンパク質又はそのフラグメントをコードするバチルス遺伝子の安定な維持及び発現を行う。このような微生物の非限定的具体例としては、細菌、例えばBacillus属、Pseudomonas属、Erwinia属、Serratia属、Klebsiella属、Xanthomonas属、Streptomyces属、Rhizobium属、Rhodopseudomonas属、Methylophilius属、Agrobacterium属、Acetobacter属、Lactobacillus属、Arthrobacter属、Azotobacter属、Leuconostoc属、Alcaligenes属及びClostridium属;藻類、例えばCyanophyceae科、Prochlorophyceae科、Rhodophyceae科、Dinophyceae科、Chrysophyceae科、Prymnesiophyceae科、Xanthophyceae科、Raphidophyceae科、Bacillariophyceae科、Eustigmatophyceae科、Cryptophyceae科、Euglenophyceae科、Prasinophyceae科及びChlorophyceae科;並びに真菌、特に酵母菌、例えばSaccharomyces属、Cryptococcus属、Kluyveromyces属、Sporobolomyces属、Rhodotorula属及びAureobasidium属が挙げられる。
本明細書中の「農薬活性(pesticidal activity)」は、害虫を殺すかもしくはその成長を阻害することによる、又は植物を害虫の侵入から防護することによる、抗害虫活性の量を評価する。
本発明は、前述のような物質を産生する新規のバチルス株、特にバチルス チューリングエンシス株にも関する。本発明のバチルス チューリングエンシス株の発酵物から得られる結晶δ内毒素及び胞子は、本質的に農薬活性を有していない。特定具体例では、NRRL B−21269の識別特性(identifying characteristic)を有するEMCC−0110、又はEMCC−0110と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、NRRL B−21270の識別特性を有するEMCC−0111、又はEMCC−0111と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、NRRL B−21271の識別特性を有するEMCC−0112、又はEMCC−0112と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、並びにNRRL B−21272の識別特性を有するEMCC−0113、又はEMCC−0113と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株の中から前記株を選択する。EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113の突然変異株及び変異株は、本発明の物質を産生する能力を保持する。
本発明は、前述のような物質が親株より大量に得られるバチルスの突然変異株又は変異株、並びにこのような突然変異株又は変異株を得る方法にも関する。
本発明は、前記物質と農薬担体とを含む農薬組成物、前記物質とバチルス関連農薬、化学農薬及び/又は昆虫病原性ウイルスとを含む農薬組成物、並びに害虫を防除するための前記農薬組成物の使用方法にも関する。
本発明は、「実質的に純粋な」本発明の物質の入手方法にも関する。この方法は、(a)適当な増殖培地でバチルス株を培養し、(b)(a)の上清を回収し、(c)(b)の上清から該物質を分離して実質的に純粋な物質を得るステップからなる。
本明細書中の「実質的に純粋な」物質とは、例えばδ内毒素タンパク質のような夾雑物の含量が5%未満の物質を意味する。
【図面の簡単な説明】
本発明の前述の及び他の特徴、局面及び利点は、下記の説明、「請求の範囲」及び添付図面に基づいてより良く理解されよう。
添付図面中、第1図は本発明の物質の1H−NMRスペクトルである。
第2図はβ外毒素の1H−NMRスペクトルである。
発明の詳細な説明
該物質の入手
本発明の物質は、バチルス属、例えばバチルス チューリングエンシスに属する微生物によって産生され、バチルスを培養し上清から該物質を回収することによって得られる。特定具体例では、本発明の物質を、NRRL B−21269の識別特性を有するEMCC−0110、又はEMCC−0110と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、NRRL B−21270の識別特性を有するEMCC−0111、又はEMCC−0111と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、NRRL B−21271の識別特性を有するEMCC−0112、又はEMCC−0112と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株、並びにNRRL B−21272の識別特性を有するEMCC−0113、又はEMCC−0113と実質的に同じ特性を有するその突然変異株及び変異株の中から選択したバチルス チューリングエンシス株の発酵物の上清から得る。EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113の突然変異株及び変異株は、本発明の物質を産生する能力を保持する。
ある具体例では、本発明の物質を、バチルスの突然変異株又は変異株、特に、親株に比較して、該物質をより大量に産生するバチルス チューリングエンシスの突然変異株又は変異株から得るか、あるいは、親株によって産生されるものより大きい殺虫活性を有する物質を産生するバチルス チューリングエンシスの突然変異株又は変異株から得る。本明細書中の「親株」とは、突然変異誘発前の元のバチルス株である。このような突然変異株又は変異株を得るために、親株は例えばN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン又はエチルメタン−スルホネートのような化学的手段、又はγ線、X線もしくは紫外線の照射を用いて、突然変異原で処理し得る。特に、バチルス株を突然変異させて前述のような突然変異株又は変異株を選択することからなる方法では、下記の手順を使用する:i)親株を突然変異原で処理し、ii)親株の推定上の突然変異株又は変異株を突然変異株の選択に適した培地で増殖させ、iii)該物質をより多く産生する突然変異株又は変異株を選択する。
この方法の好ましい具体例では、選択したコロニーを産生培地で増殖し、該物質をより多く産生することができる突然変異株又は変異株の最終選択を行う。産生の増加は、当業者に公知の方法、例えば高性能液体クロマトグラフィー、毛管電気泳動、又は薄層クロマトグラフィーによって決定できる。
バチルスは当業者に公知の培地及び発酵方法を用いて培養し得る(例えばRogoffら,1969,J.Invertebrate Path.14:122−129;Dulmageら,1971,J.Invertebrate Path.18:353−358;Dulmageら,Microbial Control of Pests and Plant Diseases,H.D.Burges(編),Academic Press,New York,1980参照)。発酵サイクルが終了したら、当業者に良く知られている方法、例えば遠心分離及び/又は限外濾過によって発酵ブイヨンからバチルス チューリングエンシス胞子及び結晶を分離することにより、上清を回収し得る。本発明の物質は上清中に含まれており、上清は当業者に良く知られている方法、例えば限外濾過、蒸発及び噴霧−乾燥により回収し得る。
本発明の物質の精製は、当業者に公知の種々の方法、例えば非限定的具体例としてクロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティ及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、電気泳動操作、示差溶解度(differential solubility)、抽出又は他の任意の当業者に公知の標準的方法によって実施できる(例えばCRC Handbook of Natural Pesticides:Methods,第II巻,Isolation and Identification,N.Bhushan Mandava編,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Florida,1985参照)。
本発明の物質の活性は、当業者に公知の方法、例えば人工餌に混入する、人工餌上にオーバーレイする、葉に塗布する、葉を浸漬させる、葉に噴霧する、水中に入れる等の方法を用いてバイオアッセイし得る。このようなバイオアッセイの特定具体例は後述の実施例で挙げる。
本発明の物質を含む組成物
本発明の物質は単独で、あるいはバチルス関連農薬、即ち前述の定義に従えば、害虫に対して活性であるか、害虫を殺すか又は植物を害虫から防護するバチルス株、胞子、タンパク質又はそのフラグメントもしくは別の物質であるバチルス関連農薬と、あるいは化学農薬及び/又は昆虫病原性ウイルスと、並びに許容し得る担体と一緒に製剤して、農薬組成物、例えば懸濁液、溶液、エマルション、微粉末(dusting powder)、分散性顆粒、水和剤、乳剤、エーロゾル又は含浸顆粒(impregnatedgranule)を形成し得る。このようなバチルス株の非限定的具体例としては、バチルス チューリングエンシス subsp.kurstaki(Abbott Laboratories Inc.から市販されているDIPEL(登録商標)、Sandoz社のJAVELIN(登録商標)、Novo Nordisk A/SのBIOBIT(登録商標)、Novo Nordisk A/SのFORAY(登録商標)、Novo Nordisk A/SのBIOCOT(登録商標)、Mycogen社のMVP(登録商標)、Novo Nordisk A/SのBACTOSPEINE(登録商標)及びSandoz社のTHURICIDE(登録商標));バチルス チューリングエンシス subsp.aizawai(Novo Nordisk A/Sから市販されているFLORBAC(登録商標)及びAbbott Laboratories Inc.のXENTARI(登録商標));バチルス チューリングエンシス subsp.tenebrionis(Novo Nordisk A/Sから市販されているNOVODOR(登録商標)、Sandoz社のTRIDENT(登録商標)、Mycogen社のM−TRAK(登録商標)及びM−ONE(登録商標)、並びにAbbott Laboratories Inc.のDITERRA(登録商標));バチルス チューリングエンシス subsp.israelensis(Novo Nordisk A/Sから市販されているBACTIMOS(登録商標)又はSKEETAL(登録商標)、Sandoz社のTEKNAR(登録商標)及びAbbott Laboratories Inc.のVECTOBAC(登録商標));バチルス チューリングエンシス kurstaki/tenebrionis(Ecogen社から市販されているFOIL(登録商標));バチルス チューリングエンシス kurstaki/aizawai(Ecogen社から市販されているCONDOR(登録商標)及びCiba−Geigy社のAGREE(登録商標));並びにバチルス チューリングエンシス kurstaki/kurstaki(Ecogen社から市販されているCUTLASS(登録商標))が挙げられる。バチルス関連タンパク質は、非限定的具体例として、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryV及びCryVIの中から選択し得る。化学農薬は例えば、ジフルベンズロンのような昆虫成長調節剤、チオジカルブ及びメソミルのようなカーバメート剤、クロルピリホスのような有機リン酸剤、シペルメスリン及びエスフェンバレレートのようなピレスロイド、氷晶石のような無機フッ素、並びにピロールであってよい。昆虫病原性ウイルスは、バキュロウイルス、例えばAutographa californica核多角体病ウイルス(nuclear polyhedrosis virus=NPV)、Syngrapha falcifera NPV、Cydia pomonella GV(グラニュローシスウイルス)、Heliothis zea NPV、Lymantria dispar NPV、Orgyia pseudotsugata NPV、Spodoptera exigua NPV、Neodiprion lecontei NPV、Neodiprion sertifer NPV、Harrisina brillians NPV及びEndopiza viteana Clemens NPVであり得る。
本発明の物質は、バチルスの上清から得た別の因子又は物質、例えば非限定的具体例として外毒素及び/又はWO94/09630号(1993年11月3日に出願された米国特許出願第08/146,852号)に開示されている増強因子、及び/又は1994年3月14日に出願された米国特許出願第08/212,462号に開示されている物質と一緒に製剤してもよい。これらの特許明細書は本明細書に参考として包含される。製剤は任意に、バチルス関連農薬、化学農薬及び/又は農薬特性を有するウイルス並びに許容し得る担体も含み得る。
特定具体例では、前記組成物の成分は相乗的に作用し得る。前記組成物はその場合、個々の成分によって得られる効力より大きい効力を有し得る。相乗作用は、各成分を個々に用いた場合必要とされる量より少量の及び/又はより低い頻度の用量で同等以上の効力が与えられることによって示され得る。あるいは、本発明の物質は、バチルス関連農薬を増強するように作用し得、その場合には本発明の物質自体は農薬活性を有していなくてもよい。
本発明の物質とバチルス関連農薬とを含む組成物は、本発明の物質を、少なくとも約0.1g/BIU又は0.05g因子/1gバチルスδ内毒素及び胞子の量で含み得、任意に約300g/BIU又は150g物質/1gバチルスδ内毒素及び胞子までの量、好ましくは2g/BIU又は1g物質/1gバチルスδ内毒素及び胞子の量で含み得る。ここで使用する「BIU」は、バイオアッセイによって決定されるビリオン国際単位であると定義される。バイオアッセイは、Trichoplusia ni又は他の害虫を標準的試験昆虫として使用して、試料を標準的バチルス基準物質と比較する。効力は、基準の標準LC50を割り算し、次いで基準の標準効力を掛けることによって決定する。
別の具体例では、前記組成物は、実質的に純粋な形態の本発明の物質、又は乾燥、濃縮もしくは液体形態のバチルス由来上清と、下記に具体例を示す適当な農薬担体とを含み得る。この組成物は、植物、例えばトランスジェニック植物に別個に適用し得る。特定的には、該組成物は、予めバチルス チューリングエンシス遺伝子を含み且つ発現している植物に施用し得る。別の具体例では、該組成物は、予めバチルス チューリングエンシス含有組成物に暴露した植物に適用し得る。別の具体例では、該組成物は、双翅目害虫の別の環境、例えば水又は土壌に適用し得る。該組成物は本発明の物質を約0.001%〜約60%(w/w)の濃度で含む。
本発明の物質と農薬的に許容し得る担体とを含む組成物は、害虫防除の他に、農薬に対する害虫の耐性を低下させるために使用し得る。あるいは、該組成物は、バチルス関連農薬の効能を高めるために使用し得る。ある具体例では、該組成物は、少なくとも約2g物質/BIUから任意に約300g物質/BIUまでの量で、農薬と同時に適用し得る。別の具体例では、該組成物は、農薬適用後約24時間以内に、残留農薬の効力を引き延ばすアジュバントとして適用し得る。
前述のような組成物は、界面活性剤、不活性担体、防腐剤、保湿剤、採餌刺激剤(feeding stimulant)、誘引剤、封入剤(encapsulating agent)、結合剤、乳化剤、染料、紫外線遮断剤、緩衝剤、流動剤(flow agent)、又は生成物の取り扱い及び特定の標的害虫への適用を容易にする別の成分を加えることによって製造し得る。
適当な界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば長鎖脂肪酸の金属カルボキシレートのようなアニオン化合物;N−アシルサルコシネート;リン酸と脂肪アルコールエトキシレートとのモノもしくはジエステル又はこの種のエステルの塩;脂肪アルコールスルフェート、例えばドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムもしくはセチル硫酸ナトリウム;エトキシル化脂肪アルコールスルフェート;エトキシル化アルキルフェノールスルフェート;リグニンスルホネート、石油スルホネート、アルキルアリールスルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネートもしくは低級アルキルナフタレンスルホネート、例えばブチルナフタレンスルホネート;スルホン化ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物の塩;スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩;あるいはアミドスルホネートのようなより複雑なスルホネート、例えばオレイン酸とN−メチルタウリンとのスルホン化縮合生成物、又はジアルキルスルホスクシネート、例えばスルホン酸ナトリウムもしくはコハク酸ジオクチルが挙げられる。非イオン界面活性剤としては、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、脂肪酸アミド又は脂肪アルキルもしくはアルケニル置換フェノールとエチレンオキシド、多価アルコールエーテルの脂肪エステル、例えばソルビタン脂肪酸エステルとの縮合生成物、この種のエステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタル脂肪酸エステル、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー、アセチレングリコール、例えば2,4,7,9−テトラエチル−5−デシン−4,7−ジオール、又はエトキシル化アセチレングリコールが挙げられる。カチオン界面活性剤の具体例としては、例えば、脂肪族モノ、ジもしくはポリアミンのアセテート、ナフテネート又はオレエート;酸素含有アミン、例えばポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシド;カルボン酸とジもしくはポリアミンとの縮合によって製造したアミド結合アミン;又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。
不活性材料の具体例としては、無機鉱物、例えばカオリン、雲母、石膏、化学肥料、フィロシリケート、カーボネート、スルフェートもしくはホスフェート;有機物質、例えば糖、澱粉もしくはシクロデキストリン;又は植物性材料、例えば樹木製品、コルク、トウモロコシ穂軸粉、コメ外皮、落花生外皮及びクルミの殻が挙げられる。
本発明の組成物は直接適用に適した形態を有し得、又は適用前に適量の水もしくは他の希釈剤で希釈する必要がある濃厚物もしくは一次組成物の形態を有し得る。農薬濃度は、特定製剤の性質、特に製剤が濃厚物であるのか又は直接使用できるのかに応じて変化する。該組成物は1〜98%の固体又は液体不活性担体と、0〜50%、好ましくは0.1〜50%の界面活性剤とを含む。これらの組成物は、市販製品について表示されている割合、好ましくは乾燥形態の場合には約0.01ポンド〜5.0ポンド/エーカー、液体形態の場合には約0.01パイント〜25パイント/エーカーで適用する。
更に別の具体例では、予備処理がバチルス チューリングエンシス結晶δ内毒素又は本発明の物質に悪影響を与えない限り、該結晶δ内毒素及び/又は物質を、製剤前に、標的害虫の環境に適用した場合の農薬活性が長く持続するように処理し得る。この種の処理は、組成物の特性に悪影響を与えない限り、化学的及び/又は物理的手段で実施し得る。化学的試薬の非限定的具体例としては、ハロゲン化剤;ホメムアルデヒド及びグルタルアルデヒドのようなアルデヒド;塩化ゼフィラン(zephiran chloride)のような抗感染薬;イソプロパノール及びエタノールのようなアルコール;並びにBouinの定着剤及びHellyの定着剤のような組織定着剤(例えばHumason,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Co.,1967参照)が挙げられる。
本発明の組成物は、害虫が植物上に出現し始めた時点で、又は害虫が出現する前の防護手段として、例えば噴霧又は散粉によって植物に直接適用できる。本発明の範囲内で防護される植物の非限定的具体例としては、穀類(コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、モロコシ及び関連作物)、ビート類(テンサイ及び飼料ビート)、核果類、仁果類及び小果樹類(リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリー及びブラックベリー)、マメ科植物(アルファルファ、マメ(beans)、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ)、油料植物(アブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマ(castor oil plants)、カカオマメ、アメリカホドイモ(groundnut))、ウリ科植物(キュウリ、ペポカボチャ、メロン)、繊維料植物(ワタ、アマ、アサ、ジュート)、柑橘類果実(オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン)、野菜(ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ及び他のアブラナ科、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ)、クスノキ科(アボカド、ニッケイ、クス)、落葉樹及び針葉樹(リンデン、イチイ、オーク、ハンノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マツ)、又はトウモロコシ、シバフ、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、チャ、ブドウの木、ホップ、バナナ及び天然ゴムの木のような植物、並びに鑑賞植物が挙げられる。本発明の組成物は茎葉散布、畝間施用、広幅顆粒(broadcast granule)散布、「レイバイ(lay−by)」施用又は土壌灌注施用によって適用できる。一般的には、植物生長の初期段階で害虫を十分に防除することが重要である。なぜなら、植物はこの段階で最も大きな被害を受け得るからである。噴霧又は微粉は、必要と思われる場合には、別の農薬を含み得る。好ましい具体例では、本発明の組成物を植物に直接適用する。
本発明の組成物は、池、湖、小川、河川、淀及び他の双翅目害虫、特に公共衛生にかかわる害虫が繁殖しやすい地域に直接適用することもできる。本発明の組成物は、噴霧、散粉、灌水等によって適用し得る。
本発明の組成物は、双翅目昆虫害虫、例えば、
に対して効果的であり得る。しかしながら、本発明の組成物は鱗翅目の昆虫害虫、例えば
に対しても効果を示し得る。
特定具体例では、本発明の組成物は双翅目のショウジョウバエ(Drosophila)属(例えばDrosophila melanogaster)又はハエ(Musca)属(例えばMusca domestica)の害虫に対して活性を示す。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例1:バチルス チューリングエンシス分離株の培養
栄養ブイヨン寒天斜面に保持したバチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、EM−CC−0112及びEMCC−0113の継代培養物を用いて、下記の組成の培地を50ml入れた250mlバッフル付き振盪フラスコ(baffled shake flask)に接種する:
トウモロコシ浸漬液 15g/l
Maltrin−100 40g/l
ジャガイモ澱粉 30g/l
KH2PO4 1.77g/l
K2HPO4 4.53g/l
培地のpHは10N NaOHで7.0に調整する。
接種後、振盪フラスコを250rpmの回転振盪器上で30℃で胞子形成まで72時間インキュベートし、細胞が溶解して結晶及び胞子を放出するのを顕微鏡で観察する。結晶及び胞子を15,000rpmの遠心分離(Sorvall GSAローター)で全培養ブイヨンから採取する。形成された上清も回収し、使用前に0.2μメンブランで濾過する。前記発酵で得られた全培養ブイヨン並びに上清及び結晶+胞子を用いて、殺虫活性の原因物質の特性を調べる。
実施例2:バチルス チューリングエンシス分離株の特性
双翅目活性バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113は下記の特性を有する。
分離株EMCC−0110:
コロニー形態:大コロニー、艶のない(dull)表面、典型的バチルス チューリングエンシス、
栄養細胞形態:典型的バチルス チューリングエンシス、
細胞含有物(inclusions):フェーズブライト(phase bright)両錐形(bipyramidal)細胞含有物。
分離株EMCC−0111:
コロニー形態:大コロニー、艶のない表面、典型的バチルス チューリングエンシス、
栄養細胞形態:典型的バチルス チューリングエンシス、
細胞含有物:フェーズブライト中間サイズ両錐形細胞含有物。分離株EMCC−0112:
コロニー形態:大コロニー、艶のない表面、典型的バチルス チューリングエンシス、
栄養細胞形態:典型的バチルス チューリングエンシス、
細胞含有物:フェーズブライト両錐形細胞含有物、但し縁部は分離株EMCC−0111の両錐形細胞含有物ほど鋭くない。分離株EMCC−0113:
コロニー形態:大コロニー、艶のない表面、典型的バチルス チューリングエンシス、
栄養細胞形態:典型的バチルス チューリングエンシス、
細胞含有物:フェーズブライト球形及び涙形細胞含有物。
実施例3:バチルス チューリングエンシス分離株の結晶細胞含有物のSDS−PAGE分析
バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113によって産生された結晶細胞含有物を構成するタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で決定する。結晶タンパク質のSDS−PAGE分析の前に、ナトリウムデキストランスルフェート及びポリエチレングリコールでの二相抽出によって胞子から結晶を分離する。
栄養ブイヨン寒天傾斜面に保持したバチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113の継代培養物を用いて、下記の組成の培地を50ml入れた250mlバッフル付き振盪フラスコに接種する:
D−グルコース 2.0g/l
クエン酸ナトリウム 2.0g/l
CaCl2 0.1g/l
MnCl2・4H2O 0.016g/l
MnCl2・6H2O 0.43g/l
ZnCl2 0.007g/l
FeCl2 0.003g/l
カザアミノ酸 5.0g/l
KH2PO4 0.86g/l
K2HPO4 0.55g/l
接種後、振盪フラスコを250rpmの回転振盪器上で30℃で胞子形成まで72時間インキュベートし、細胞が溶解して、結晶及び胞子を放出するのを顕微鏡で観察する。
各全培養ブイヨンの1.5ml試料をエッペンドーフ(Eppendorf)遠心分離管に移して遠心分離し、結晶及び胞子を採取する。結晶/胞子ペレットを1.0mlの1.0M塩化ナトリウム及び1.0mlの脱イオン水で順次洗浄する。ペレット化した結晶及び胞子をナトリウムデキストラン溶液(下相)に再懸濁する。ナトリウムデキストラン溶液は、115μlの脱イオン水、120μlの20%ポリエチレングリコール8000(DuPont)、170μlの20%ナトリウムデキストランスルフェート、及び50μlの3.0M塩化ナトリウムからなる。次いで500μlのポリエチレングリコール溶液(上相)を、下相溶液に懸濁した結晶/胞子混合物に加える。ポリエチレングリコール溶液は、100mlの脱イオン水中の30mgのナトリウムデキストランスルフェート、7.0gのポリエチレングリコール8000及び1.75gの塩化ナトリウムからなる。上相及び下相を激しく混合し、二つの相が分離するまで室温で20分間静置する。
多量の胞子を含む上相をピペットで除去する。下相は結晶及び残留胞子を含む。追加の上相を前述のように加え、上相が顕微鏡で検出できる胞子を本質的に含まなくなるまで操作を繰り返す。次いで、最終的に得られた下相を1.0mlの脱イオン水で希釈し、遠心分離して結晶をペレット化する。結晶ペレットを1.0mlの1.0M塩化ナトリウム及び1.0mlの脱イオン水で順次洗浄する。結晶ペレットは最終的に500μlの脱イオン水に再懸濁する。
前記結晶懸濁液の50μl試料をエッペンドーフ遠心分離管に移して遠心分離し、結晶をペレット化する。上清を除去し、廃棄する。10μlの脱イオン水及び10μlの可溶化緩衝液を順次加え、該結晶溶液を100℃で10分間加熱することによって、ペレット化結晶を可溶化する。可溶化溶液は、10mMトリス−10mM EDTA−0.15Mジチオトレイトール(dithiothretol)−2.5%w/v SDS、pH8.0からなる。可溶化した結晶タンパク質をSDS−PAGEで分析する。SDS−PAGE後、タンパク質をクーマシーブルー染料で視覚化する。
双翅類活性バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110によって産生された細胞含有物(inclusions)は、分子量120キロダルトンのタンパク質を有する。双翅類活性バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0111によって産生された細胞含有物は、分子量92及び40キロダルトンのタンパク質を有する。双翅類活性バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0112によって産生された細胞含有物は、分子量92及び40キロダルトンのタンパク質を有する。双翅類活性バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0113によって産生された細胞含有物は、分子量56及び48キロダルトンのタンパク質を有する。
実施例4:種々のバチルス チューリングエンシス分離株に由来する全培養ブイヨン中の双翅類活性
実施例1に記載のようなバチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113に由来する全培養ブイヨンの殺虫活性を、餌混入バイオアッセイを用いて、Drosophila melanogaster成虫に対して試験する。
特定的には、暖かい昆虫用人工餌を最終濃度20%まで希釈全培養ブイヨンと混合し、該混合物2.0mlを13×100mm管内に配置し、乾燥させる。試験試料を含まない対照、及び陽性対照としてのAVID(登録商標)(Merck)も同様に試験する。次いで、週齢1週間のDrosophila melanogaster成虫8〜10匹を各管に入れる。綿で管の栓をし、28〜30℃でインキュベートする。7〜10日後、管を死亡率及び成長阻害について採点する。成長阻害の採点は、同日の成虫の大きさを生きている対照成虫と比較して行う。成長阻害の点数3、2、1及び0は、点数4で示される生きている対照成虫の75%、50%、25%の成虫の大きさを表す。点数0は100%死亡率を表す。
全培養ブイヨンに関するDrosophila melanogaster成虫バイオアッセイの結果を下記の表1に示す。これらの結果は、総ての全培養ブイヨンがDrosophila melanogaster成虫に対して殺虫活性を有することを示している。
実施例5:バチルス チューリングエンシス分離株の全培養ブイヨン中の双翅類活性の局在性
双翅類活性の所在、即ち該活性が結晶δ内毒素及び胞子又は上清のいずれにあるのかをバイオアッセイで調べる。実施例1に記載のようなバチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、E0112及びEMCC−0113の各全培養ブイヨンの10ml試料を15,000rpm(Sorvall SS34ローター)で15分間遠心分離して、ペレット化した結晶δ内毒素及び胞子から上清を分離する。上清を回収する。結晶/胞子混合物を蒸留水で洗浄し、前述のように遠心分離して回収する。
Drosophila melanogaster成虫に対して実施例4に記載のものと同じバイオアッセイ手順を行う。
バチルス チューリングエンシス分離株EMCC−0110、EMCC−0111、E0112及びEMCC−0113に由来する結晶δ内毒素/胞子混合物は、Drosophila melanogaster成虫に対して活性を示さなかった。上清に関するこれらのバイオアッセイの結果を下記の表2に示す。上清は総て、Drosophila melanogaster成虫に対する殺虫活性を有していた。
実施例6:双翅類活性物質の精製
バチルス チューリングエンシス株EMCC−0110を実施例1に記載のように発酵させ、上清を回収する。三ステップ精製操作を用いて、上清由来の双翅類活性物質の精製を行う。精製中に、Drosophila melanogaster成虫バイオアッセイによって活性を監視し、実施例8に記載のような毛管電気泳動によって純度を測定する。クロマトグラフィーステップは総て278nmで監視する。
特定的には、Drosophila melanogaster成虫に対するバイオアッセイは下記のように実施する。暖かい昆虫用人工餌2mlを13×100mm管内に配置し、乾燥させる。100μlの試験試料を餌の上に配置する。1.3倍に濃縮した昆虫用人工餌を電子レンジで加熱して液状にし、200μlを試料の上に配置する。管を高速で撹拌して、試料を暖かい1.3倍濃縮人工昆虫餌と混合させる。上部の餌/試料混合物が乾燥した後、10〜20匹のDrosophila melanogaster成虫を各管に入れる。綿で管の栓をし、28〜30℃でインキュベートする。5日後、管を死亡率について採点する。
ステップ1では、細胞、細胞残渣及び他の不溶性物質を実施例1に記載のようにバチルス チューリングエンシス株EMCC−0110の全培養ブイヨンから除去し、次いで得られた上清を0.2μフィルターで濾過する。0.2μ濾過上清1lを10ml/分で100%アセテニトリルで予めならし、次いで脱イオン水中5%アセテニトリルで予備平衡化してあるベーカー結合オクタジル(Baker bonded Octadyl)C18カラム(2.5×35cm)に充填(load)する。充填後、カラムを250mlの脱イオン水で10ml/分で洗浄する。通過液(pass−through)(約1250ml)を回収し、バイオアッセイで活性を調べる。
ステップ2では、ステップ1の通過液を脱イオン水で2000mlに希釈する。1.21gのTrizma(登録商標)Base(Sigma Chemical Co.)を最終濃度5mMで加える。次いでこの溶液をpH8.0に調整する。該溶液の1000ml試料を、20mMトリス、pH8.0で予備平衡化したPharmacia Q−Sepharose高速流カラム(2.5cm×30cm)に8.0ml/分で充填する。次いでカラムを、1〜2カラム容量の20mMトリス−HCl、pH8.0で8.0ml/分で洗浄し、次いで20mMトリス−HCl、pH8.0から20mMトリス−HCl−0.5M塩化ナトリウム、pH8.0の1.5l連続勾配で溶離する。16.0mlの画分を収集し、バイオアッセイにかけ、且つ純度を調べる。活性画分をプールし(約200ml)、凍結乾燥し、脱イオン水に元の量の1/20〜1/50で再溶解する。
ステップ3では、ステップ2の20倍濃縮物プールの5.0ml試料を、脱イオン水で予備平衡化したPharmacia Sephadex G−25カラム(1.6cm×80cm)に1.4ml/分で充填する。このカラムを脱イオン水で1.4ml/分で溶離する。3.0mlの画分を収集し、バイオアッセイにかけ、且つ純度を調べる。活性画分をプールし(約30ml)、凍結乾燥させる。
毛管電気泳動によって、本発明の物質は前述の三ステップ精製で約98%まで精製されていることが判明した。
精製した該物質は水に溶解する。該物質は、約2〜約12のpHで水中で10日間にわたり安定であり、約72℃では水中で約60分以上安定であり、分子量が1000未満であり、230及び262nm(pH7.0)にUV最大値を有する。β外毒素I型は227及び259nm(pH7.0)にUV最大値を有し、β外毒素II型は230及び262nm(pH7.0)にUV最大値を有する。
実施例7:双翅類活性物質構造データ
実施例6の精製化合物について得た分光分析情報から、本発明の物質の構造データを得る。
該化合物の質量スペクトルデータは、分子量758、フラグメントイオン679である。β外毒素I型は分子量701である。β外毒素II型の質量スペクトルデータによれば、最大フラグメントイオンの質量は481である。
該化合物について得たNMRデータは、該化合物が、3個の糖部分と2個のホスフェートとを有し、7.62(1H,d)、5.83(1H,d)及び5.78(1H,d)に1H−NMR化学シフトを有するウラシルヌクレオシドであることを明らかにした(第1図、表3及び表4参照)。該化合物は、β外毒素I型(第2図参照)及びβ外毒素II型とは著しく異なる。β外毒素I型はアデニンヌクレオシドであり、β外毒素II型はヌクレオシド塩基にプロトンを1個だけ有するプソイドウレイドヌクレオシドである(Levinson,Hickle及びFinch(編)、Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis,ACS Symposium Series,Washington,D.C.,1990,pp.114−136)。
実施例8:双翅類活性を有する物質の定量
バチルス チューリングエンシス株EMCC−0110を実施例1に記載のように発酵させる。発酵ブイヨン中の本発明の物質の量を毛管電気泳動で測定する。
特定的には、50μm×36cm非コーティング毛管を備えたBiorad Biofocus 3000毛管電気泳動システム、0.1Mトリス−ボレート−0.0002M EDTA、pH8.3、電圧20KV、正から負の極性及び260nmでのUV検出によって測定する。5.2分で溶離する本発明の物質の分析時間は10分である。
実施例1に記載の発酵で得られた上清を遠心分離で回収し、0.2μフィルターで濾過し、前述のように毛管電気泳動で分析する。その結果、本発明の物質はブイヨン1l当たり約0.2gの量で存在することが判明した。
実施例9:Musca domestica幼虫に対する活性
バチルス チューリングエンシス株EMCC−0110を実施例1に記載のように培地で増殖する。本発明の物質を含む上清を、実施例1に記載のように全ブイヨンから回収する。バイオアッセイ用の試料を下記のように調製する:(1)非希釈上清、(2)5mlの水+10mlの(1)、(3)5mlの水+10mlの(2)、(4)5mlの水+10mlの(3)、(5)5mlの水+10m1の(4)、(6)5mlの水+10mlの(5)、及び(7)5mlの水+10mlの(6)。
Musca domestica(イエバエ)幼虫をCSMA標準的ハエ幼虫培地(Purina Mills#5060)で30℃で3日間にわたり卵から飼育する。新しく調製したCSMA培地19gを秤量して4オンス試料カップに入れる。各試験試料1mlを培地に加え、金属ヘラで十分に撹拌する。カップに蓋をし、2時間静置させる。25匹のMusca domestica幼虫を各カップに移す。各カップを32メッシュナイロンシフォンで覆い、輪ゴムで留める。希釈毎に反復試料三つと対照(無菌水)一つとを組合わせる。各アッセイを28℃で14日間インキュベートする。
14日後、各カップ内のMusca domestica成虫の数を数える。Musca domestica成虫の数を当該カップ内に入れた幼虫の数で割り算して、対照に対する%死亡率(percent of control morality)を算出する(%CM)。結果を下記の表4に示す。この結果から明らかなように、上清はMusca domestica幼虫に対して殺虫活性を有する。
実施例10:バチルス チューリングエンシス subsp.kurstakiの殺虫活性の増強
バチルス チューリングエンシス株EMCC−00110を実施例1に記載のように培地で増殖する。精製した本発明の双翅類活性物質を実施例6に記載のように得る。
該双翅類活性物質によるBIOBIT(登録商標)FC結晶δ内毒素の農薬活性の増強を、第二齢Spodoptera exigua幼虫を用いて人工餌混入バイオアッセイで調べる。
水、寒天、砂糖、カゼイン、コムギ胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、亜麻仁油、セルロース、塩及びビタミンからなる標準的人工餌を201ケトルで調製する。1.0mlアリコートを240個のウェルを有するプラスチックトレイにピペットで分配し、凝固させる。
脱イオン水1l当たり1.7gの寒天(Difco)からなる希寒天溶液中で、力価8BIU/mgのBIOBIT(登録商標)FC(Novo Nordisk A/S)1mg/ml保存溶液(20ml)を形成する。次いで、この1mg/ml保存溶液を寒天溶液で希釈して、0.25、0.12及び0.06mg/ml希釈液(各40ml)を調製する。BIOBIT(登録商標)FCを含まない寒天溶液の対照も調製する。4種類の薬量の各々の3.0mlアリコートをハミルトン・ピペッターで個々のウェルに各薬量あたり10ウェルの割合で分配する。
本発明の物質4mgを10mlの脱イオン水に溶解して、本発明の物質の0.4mg/ml溶液を調製する。本発明の物質の該溶液の50μlアリコートをピペッターで各ウェルに分配し、振盪してBIOBIT(登録商標)FC溶液と混合し、次いで一晩乾燥させる。
各ウェルに第二齢Spodoptera exigua幼虫を一匹ずつ加え、次いで穿孔した透明マイラーシートでトレイを覆う。これらのトレイを、温度28℃、相対湿度65%で4日間インキュベートする。4日後、ウェル10個当たりの生存幼虫の数を採点する。
下記の表5に示す結果は、本発明の双翅類活性物質がBIOBIT(登録商標)FC結晶δ内毒素の殺虫活性を増強することを明らかにしている。
微生物の寄託
下記のバチルス チューリングエンシス株はブダペスト条約に従いAgricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Laboratory(NRRL),1815 Universtiy Street,Peoria,Illinois,61604,USAに寄託された。
これらの株は、37C.F.R§1.14及び35U.S.C.§122のもとに特許及び商標委員会によって資格を認められた者が本特許出願の係属中に培養にアクセスできるという条件で寄託された。寄託物は各寄託株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、本出願の対応出願又は後継出願が出願される国で外国特許法によって要求された時には使用可能である。
しかしながら寄託物の使用は、政府の決議によって授与された特許権を逸脱して本発明を実施する許可を構成するものではない。
本明細書の本文及び請求の範囲に記載の発明は、本明細書に開示した特定具体例によってその範囲を制限されることはない。これらの具体例は本発明の幾つかの面を説明するためのものだからである。同等の実施態様は総て本発明の範囲内に含まれるとみなされる。実際、前述の説明から、当業者にはここに記載のもの以外に種々の変形例が明らかであろう。このような変形例も請求の範囲の中に含まれるものとする。
本明細書では種々の文献を引用したが、その開示内容全体が参考として本明細書に包含される。
Claims (13)
- 下記の特性
(a)双翅目の害虫に対する農薬活性を有し;
(b)EMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113からなる群から選択されるバチルス・チューリングエンシス(Bacillus thuringiensis)株の発酵ブロスの上清から得られ得;
(c)水に溶解し;
(d)2から12のpHで10日間にわたり安定であり、
(e)72℃の水中で60分以上安定であり、
(f)230および262nm(pH7.0)のUV最大値;
(g)フラグメントイオン679を有する分子量758の質量スペクトル;
(h)プロトン化学シフト(ppm);
(i)1Hおよび13Cデータ
(j)3個の糖部分と2個のホスフェートとを有するウラシルヌクレオシドである;を有することを特徴とする物質。 - 請求項1に記載の物質を生産することができるEMCC−0110、EMCC−0111、EMCC−0112及びEMCC−0113並びに当該物質を生産することができるこれらの突然変異株かからなる群から選択したバチルス・チューリングエンシス株の生物学的に純粋な培養物。
- 請求項1に記載の物質を対応する親株によって産生される量より多い量で生産するバチルス・チューリングエンシス株の突然変異株。
- 請求項3に記載のバチルス・チューリングエンシス株の突然変異株の獲得方法であって、(a)バチルス・チューリングエンシス株を突然変異原で処理すること;(b)ステップ(a)の処理したバチルス・チューリングエンシス株を突然変異株の選択に適した培地で培養すること;および(c)請求項1に記載の物質をより多く生産することについてステップ(b)の突然変異株を選択すること;を含む突然変異株の獲得方法。
- 請求項1に記載の物質を農薬的に許容し得る担体と共に2g/BIU以上の量で含む農薬組成物。
- (a)請求項1に記載の物質と、(b)バチルス・チューリングェンシス株のδ内毒素とを含む農薬組成物であって、前記物質が前記組成物中に、少なくとも0.05g/gバチルス・チューリングエンシス株のδ内毒素の量で存在する、前記組成物。
- 害虫防除有効量の請求項5に記載の農薬組成物に害虫を暴露することを含む害虫防除方法。
- 害虫防除有効量の請求項6に記載の農薬組成物に害虫を暴露することを含む害虫防除方法。
- バチルス・チューリングエンシスのδ内毒素の農薬活性を増強する方法であって、バチルス・チューリングエンシスのδ内毒素の農薬活性を増強するのに十分な量の請求項5に記載の農薬組成物に害虫を暴露することを含む、前記方法。
- バチルス・チューリングエンシスのδ内毒素の農薬活性を増強する方法であって、バチルス・チューリングエンシスのδ内毒素の農薬活性を増強するのに十分な量の請求項6に記載の農薬組成物に害虫を暴露することを含む、前記方法。
- 実質的に純粋な請求項1に記載の物質を製造する方法であって、(a)バチルス・チューリングエンシス株を適切な増殖培地で培養して上清を形成すること;(b)(a)の上清を回収すること;および(c)(b)の上清から前記物質を分離すること;を含む前記方法。
- 請求項1に記載の物質を含む、請求項1に記載の物質を生産することができるバチルス・チューリングエンシス株の発酵ブロス。
- バチルス・チューリングエンシスのδ内毒素をさらに含む、請求項12に記載の発酵ブロス。
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