KR20010112933A - 식물 질병을 방제하는 ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ의균주 - Google Patents

식물 질병을 방제하는 ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ의균주 Download PDF

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Abstract

어떤 특정한 식물 병원균에 대해서만 항진균 활성을 나타내고, 항박테리아 활성은 본 발명에 의해 제공되지 않는 신규한 항생물질-생성Bacillus종, 뿐만 아니라 이 균주의 모든 확인된 특징을 갖는 생물학적으로 순수한 배양물이 제공된다. 또한, 이들 균주, 이들 균주에 의해 생성된 상청액 또는 이들 균주로부터 분리된 대사물질을 유효량으로 사용함에 의한, 식물, 열매 및 뿌리를 진균 감염으로부터 치료 또는 보호하는 방법이 제공된다. 본 발명은 더 이상으로 B-21661(AQ 713)과 함께 NRRL 기탁 번호 B-30087의 균주를 사용하는데 대한 상승적인 살진균성 효과를 포함한다.

Description

식물 질병을 방제하는 ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＰＵＭＩＬＵＳ의 균주{A STRAIN OF BACILLUS PUMILUS FOR CONTROLLING PLANT DISEASES}
여러가지 미생물이 식물 질병을 방제하는데 유용한 생물학적 활성을 나타낸다고 일반적으로 공지되어 있다. 농경 및 원예에 중요한 여러가지 식물 질병을 방제하는 생물학적 살충제를 확인 및 개발하는 분야의 진보에도 불구하고, 사용되는 대부분의 살충제는 여전히 합성 화합물이다. 많은 이들 화학적 살충제는 환경 보호기구(EPA)에 의해 발암물질로서 분류되며, 야생생물 및 다른 비-표적 종들에도 유독하다. 여기에 더하여, 병원균이 화학적 살충체에 대한 내성을 개발할 수 있다.
예를 들어, Schwinn et al., in: Advances In Plant Pathology:Phytopathora infestans, The Cause of Late Blight of Potato, p.244, Academic Press, San Diego, Calif (1991) 참조.
생물학적 방제는 합성 화학적 살충제에 대한 매력적인 대안을 제공한다. 생물살충제(살아있는 유기체 및 이들 유기체에 의해 생성된 자연생성 화합물)이 더 안전하고, 더욱 생물분해성이며, 개발 비용이 적을 수 있다.
한 통상적으로 사용되는 생물살충제는 그램 양성 박테리아인Bacillus thuringiensis이다. 살충성인B. thuringiensis균주는 포자형성 동안 결정 단백질을 생성한다고 공지되어 있으며, 어떤 목 및 종의 곤충 및 선충류에 특이적으로 유독하다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,999,192 및 미국 특허 번호 5,208,017 참조).B. thuringiensis에 의해 생성된 프로테이나세우스 내독소는 또한 옥수수 뿌리벌레 및 다른 갑충에 대한 살충제로서 작용한다(예를 들어, 미국특허 5,187,09 및 Johnsom, T. J. et al., (1993), J. Econ. Entomol., 86:330-333).
B. thuringiensis내독소는 결정을 정제하고, 세포 펠렛을 세척하고, 단백질을 발현함으로써 효과적이 된다고 알려져 있다. Warren 등의 WO 96/10083은Bacillus cereus및B. thuringiensis의 영양 단계 동안 생성된 비-내독소 단백질을 개시한다. Vip1 및 Vip2로 명명된 이들 영양 단백질은 옥수수 뿌리벌레(노던 및 웨스턴)에 대한 효능있는 활성을 가진다. 예를 들어, Estruch et al., (1997),Nature-Biotechnology 15:137-141 참조.
베타-외독소로 명명된 어떤B. thuringiensis열안정성 대사물질이 또한 살충성을 가지는 것으로 알려져 있다. Burgjeron and Biache (1979), Entomophaga 11:279-284는 콜로라도 감자 갑충(Leptinotarsa decemlineate)에 대해 활성인 베터-외독소를 보고한다. 여기에 더하여, 공지된B. thruingiensis베타-외독소는 비-특이적 살충 활성을 나타내어, 선충류 뿐만 아니라 파리, 멸강충, 진드기 및 옥수수 뿌리벌레도 죽인다. 시그마-외독소는 베타-외독소와 유사한 구조를 가지고, 콜로라도 감자 갑충에 대해 활성이다. Argauer et al., (1991), J. Entomol. Sci. 26:206-213 참조. 알파-외독소는Musca domestica의 유충에 유독하다 (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7). 감마-외독소는 여러가지 단백질분해효소, 키티나제 및 프로테아제이다. 감마-외독소의 독성 효과는 베타-외독소 및 델타-내독소와 조합하여서만 발현된다. Forsberg, C., "Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality" National Research Council of Canada, Publication No. NRCC 15385, pp. 91-109 (1976) 참조. Stonard 등, (1994), ACS Symposium Series 551:25는Baciluus cereus균주의 상청액에 있는 옥수수 뿌리벌레에 대해 활성인 수용성 이차 대사물질을 보고한다.
쯔위터마이신 A는 많은 진균 및 박테리아 식물 병원균에 대한 광범위한 활성을 깆는 수용성 산안정성 선형 아미노폴리올 분자 (He 등, (1994), Tetrahedron Lett. 35 (16):2499-2502)이다. 쯔위터마이신 A는 또한B. thuringiensis의 활성을 증진시킨다고 알려져 있다. Manker 등 (WO 96/39037)이 첫번째로 쯔위터마이신 A의B. thuringiensis-증진 능력 및 성질을 측정했다. 이어서, Schnepf 등이 또한 쯔위터마이신 A가B. thuringiensis를 증진시켰다고 보고했다 (미국 특허 5,702,703).
간균은 항진균성 및 항박테리아성 이차 대사물질을 생성한다고 공지되어 있다. Korzybski 등, "Antibiotics isolated from the genusBacillus(Bacillaceae)" in: Antibiotics - Origin, Nature and Properties, American Society for Microbiology, Washington, D.C.Vol.III (1978) 및 Berdy, CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1980-87) 참조.B. pumilus에 의해 생성된 화합물은 마이크로코코신 P, 푸밀린 및 테타인을 포함한다.
미국 특허 번호 4,250,170에서 Kawaguchi 등은 광범위한 그램 양성 및 그램 음성 박테리아에 대한 활성을 갖는Bacillus로부터 신규한 수용성 항생물질을 분리했다. Stabb 등 (1990) Applied Environ. Microbiol. 60:4404-4412는 항진균 활성을 나타내는 어떤Bacillus종(Bacillus종은B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis를 포함한다) 균주를 확인했다. 이들 균주는 쯔위터마이신 A 및/또는 카노사민을 생성한다고 알려져 있다. Milner 등, Appl. Environ. Microb. 62:3061-3066 (1996) 참조. 이들은Phytopathora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum또는Sclerotinia minor에 의해 야기되는, 토양감염질병 모잘록병에 대해 효과적인 항생제이다 (Stabb 등, 위와 같음, 참조). 쯔위터마이신 A는 수용성 산안정성 선형 아미노폴리올 분자이다. He 등, (1994), Tetrahedron Lett. 35 (16):2499-2502 참조. 그것은 많은 진균 및 박테리아 식물병원균에 대한 광범위한 활성을 가진다. 카노사민 (Milner 등, 1996)이 또한 광범위한 진균성 식물 병원균 및 소수의 박테리아 종을 억제한다.
미국 특허 번호 5,049,379에서 Handelsman 등은 쯔위터마이신 A-생성B. cereus가 자주개자리 및 대두에서 모잘록병을 어떻게 방제하는지 설명한다. 씨가 B. cereus ATCC 53522로 코팅되었을 때, 뿌리 부패 진균의 병원성 활성이 억제되었다. 유사하게도, 대두씨 또는 씨를 둘러싼 토양에서 어떤B. cereus균주의 포자-기제 제제의 사용이 밭에서 대두 생산량을 개선시키는 것으로 알려졌다. Osburne et al., (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79 (6): 551-556 참조. 생물살충제를 사용하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 적합한 배양물로부터의 세균, 전체 육즙 또는 항생작용 부분의 습윤성 분말, 건성 유동체, 미세캡슐, 및 액상 제조물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,061,495(Rossall) 및 미국 특허 번호 5,049,379(Handelsman 등) 참조.
Tsuno 등 (1986) J. Antibiotics XXXIX (7): 1001-1003은 생체내에서 광범위한 박테리아에 대한 활성을 갖는B. pumilus로부터의 새로운 아미노 당 항생물질을 보고한다.
SU 1817875 (1995)에서 Khmel, I. A. 등은Bacillus pumilusVKM CR-333D의 신규한 균주를 개시하며, 이것은 진균 식물 질병원균 및 박테리아를 방제하는데 사용된다.
Leifert 등, J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108 (1995)는 2개의Bacillus균주B. SubtilisCL27 및B. pumilusCL45에 의한 항-Botrytis및 항-Alternaria항생물질의 생성을 보고한다. 전체 육즙 및 세포가 없는 여과물은 생체내 시험에서Botrytis및Alternaria에 대해 활성이고,Astilbe상의 생체내 작은 식물 시험에서는Botrytis에 대해 활성이다. Leifert 등 (1997) 미국 특허 번호 5,597,565는 진균Alternaria brassicicola및Botrytis cinerea가 일으키는 수확 후 질병을 억제하는데 특히 효과적인B. subtilis, B. pumilus및B. polymyxa를 설명한다. 또한, 그것은 세포가 없는 배양 여과물에서 생성된 항생물질의 존재 및 상이한 pH 값에서 그것의 활성을 개시하지만, 이들 화합물을 확인하지는 않았다.B. subtilis로부터의 화합물은 낮은 pH에서 활성을 잃는 반면,B. pumilus추출물로부터의 활성은 5.6 이하의 pH 값에서만 생긴다. Leifert 등, (1998) 미국 특허 번호 5,780,080은Alternaria brassicicola및Botrytis cinerea를 억제하기 위해B. subtilis, B. pumilus및B. polymyxa균주로 처리될 수 있는 양배추를 개시한다.
Loeffler 등 (1986) J. Phytopathology 115: 204-213은 항진균 및 항박테리아 활성을 갖는 다양한 항생물질을 생성하는B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis및B. coagulans균주를 개시한다.B. pumilus는 바실리신 및 이투린 A를 생성했다. 바실리신은 이스트만을 억제하는 분자량이 270인 매우 작은 화합물이다. 극성 용매에 용해성인 인투린은 광범위한 항진균 및 항박테리아 활성을 갖는다.
Rossall의 미국 특허 번호 5,344,647에서는 광범위한 항진균 활성을 갖는Bacillus subtilis균주를 개시하고 있다. 추가적으로, Rossall의 미국 특허 번호 5,061,495은 63,500 달톤이고, 5 이하의 pH에서 침전하며, 그램 양성 박테리아 및진균(Bortrytis및Erysiphe)에 대한 활성을 갖는B. subtilis로부터의 신규한 항생물질을 제공한다. Sholberg 등, (1995) Can. J. Microbiol. 41:247-252, Swinburne 등 (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217, Singh 및 Deverall, (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490, Ferreira 등, (1991) Phytopathology 81: 283-287 및 Baker 등, (1983) Phytopathology 73: 1148-1152. 모두가 진균 식물 병원균의 생물방제제로서Bacillus spp.및Bacillus subtilis의 사용을 개시한다. Pusey 등, (1988) Plant Dis. 72:622-626, Pusey 등, 미국 특허 번호 5,047,239, 및 McKeen 등 (1986) Phytopathology 76: 136-139는B. subtilis를 사용한 수확 후 열매 부패의 방제를 개시한다. McKeen 등은 저분자량 인투린 고리 폴리펩티드와 유사한 항생물질이B. subtilis의 이런 살진균 활성에 기여한다고 나타낸다.
Liu 등의 미국 특허 번호 5,403,583은Bacillus종(ATCC 55000) 및 진균성 식물 병원균Rhizoctonia solani를 방제하는 방법을 개시한다. Islam 및 Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92 (3): 241-246은 쌀 갈색점의 원인제인Drechslera oryzae에 대해 길항작용을 하는Bacillus종을 개시한다. 동일한 저자인 Islam 및 Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92 (3): 233-240은 또한Drechslera oryzae, Alternaria alternata및Fusarium roseum에 대한Bacillus종의 생체내 길항작용을 개시한다. 그것들은 배양 여과물에 있는 3개 성분을 논의한다. 가장 활성인 항생물질은 물 및 메탄올에서 매우 가용성이며, 폴리옥신-유사 리포펩티드에 의해 제공된 255nm에서의 UV 피크 및 260nm에서의 문턱치를 갖는다.Cook 등 (1987) Beltwide Cotton Production Research Conferences, Dallas, TX, pp. 43-45는 면 뿌리 부패의 원인인Phymatotrichum omnivorum에 의해 죽는 면 식물의 수를 감소시키기 위한Bacillus종의 현탁액의 사용을 개시한다.
B'Chir 및 Namouchi (1988) Revue Nematologique 11 (2): 263-266은 선충류를 잡는 능력을 증가시키기 위해 선충을 잡는 진균을 자극하는Bacillus pumilus에 대해 보고한다. B'Chir and Belkadhi (1986) Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent 51/3b: 1295-1310은 감귤류에서 감염을 일으키는 진균(Fusarium)과 선충류의 세포 상호작용을 논의한다. 진균은B. pumilus(그것들은 함께 생긴다)과 관련되며, 또한 선충류가 있을 때, 진균은 더욱 심각해진다.B. pumilus가 음식에 선충류를 제공하는 것이 명백하다. Gokte and Swarup (1988) Indian J. Nematol. 18(2):313-318은 살선충성인B.pumilus에 대해 보고하지만, 그것들은 어떤 항진균성 활성도 보고되지 않았다. Slabospitskaya 등 (1992) Mikrobiol Zh(Kiev) 54(6):16-22는 키티나제를 생성하는 능력에 대해B. pumilus를 포함하는 많은 상이한Bacillus를 비교하지만, 그것들은 식물 병원균에 대한 활성은 보고되지 않는다.B. pumilus는 최저 키티나제 수준을 생성한다. McInroy 등 (1995) Plant and Soil 173(2):337-342는 식물 줄기 및 뿌리내에 있는 내생식물인 많은Bacillus및B. pumilus를 포함하는 많은 종류의 박테리아를 조사했다. 그러나, 그것들은 이들 내생식물 균주가 항진균성이라는 증거를 나타내지 않는다. Chernin 등 (1995) Molecular Genetics는 식물 질병을 야기하는 박테리아(예를 들어,Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia) 및 진균에 대한 광범위한 활성을 가지는Bacillus pumilus를 발견했다. Fey 등(1991) Akad Landwirts Kart는Rhizoctonia solani로부터 씨감자의 어떤 보호를 제공하는B. pumilus균주에 대해 보고한다.
본 출원은 1999, 3, 30 자로 제출된 미국 일련 번호 09/281,360의 연속되는 부분이며, 1999, 12, 14 자로 제출된 미국 일련 번호 09/461,700의 연속되는 부분이고, 그 내용이 본원에 참고로서 포함된다.
본 발명은 생물살충제의 분야이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 신규한Bacillus pumilus,NRRL 기탁 번호 B-30087의 균주가 생체내에서 광범위한 직균 식물 질병을 억제할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한Bacillus균주, 및 이 균주의 항생물질 및 정제 및 비정제 부분을 단독으로, 또는 다른 화학적 및 생물학적 살충제와 조합하여 포함하는 살진균성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 더 이상으로 NRRL 기탁 번호 B-21661(CCRC 910106)과 함께 NRRL 기탁 번호 B-30087을 사용하는 상승한 살진균성 효과에 관한 것이다.
도 1은 NRRL 기탁 번호 B-30087하에 기탁된Bacillus종의 부분적으로 정제된 살진균성 부분의 D2O 중의 400MHz에서 기록된 NMR 스펙트럼이다.
도 2는 D2O 중의 400MHz에서 기록된 쯔위터마이신 A의1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3a에서 도 3c는 실시예 9에 설명된 바와 같이Bacillus로부터 분리된 상청액의 모세관 일렉트로페로그램이다. 전기영동의 조건: 비코팅 56cm 모세관을 pH 5.8 인산나트륨 완충액과 함께 40C, 30kV, 양성 극성에서 사용했고, 200nm에서 UV 검출했다. 도 3a는Bacillus pumilusB-30087의 전체 육즙의 모세관 일렉트로페로그램이다. 도 3b는 쯔위터마이신 A 표준으로 스파이크된Bacillus pumilusB-30087의 전체 육즙의 모세관 일렉트로페로그램이다. 쯔위터마이신 A 피크는 3.25분의 런타임 근처에서 나타나며, 전체 육즙에서의 어떤 피크와도 함께 용출되지 않는다. 도 3c는 약 3.28분의 런타임에서 쯔위터마이신 A 표준을 나타낸다.
도 4는 NRRL 기탁 번호 B-30087만의 부분적으로 정제된 부분(도 4a), 쯔위터마이신 A와 함께 NRRL 기탁 번호 B-30087의 부분적으로 정제된 부분(도 4b), 및 쯔위터마이신 A만(도 4c)의 모세관 전기영동(CE) 분석으로부터의 3개 일렉트로페로그램을 비교한다.
도 5는 D2O 중의 400MHz에서 기록된 B-30078로부터 분리된 B+ 증진제로서 활성을 갖는 부분적으로 정제된 활성 부분의1H NMR을 스펙트럼을 나타낸다.
어떤 특정한 식물 병원균에 대해서만 항진균 활성을 나타내고, 항박테리아 활성은 없는 신규한 항생물질-생성Bacillus종이 제공된다. 또한, 유효량의 항생물질-생성Bacillus종을 사용하는 단계를 포함하는 진균 감염으로부터 식물, 열매 및 뿌리를 치료 또는 보호하는 방법이 제공된다. 항생물질-생성Bacillus종은 전체 육즙 배양물의 현탁액으로서, 또는 부분적으로 정제된 항생물질-생성Bacillus종으로서 제공될 수 있다. 또한, 특이적 항진균 활성을 나타내고, 항박테리아 활성은 없는 신규한 수용성 항생물질이 제공된다.
본 발명은 또한B. thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 신규한 화합물을 제공한다. 화합물은B. thuringiensis와 조합되었을 때, 그것의 살충 활성을 증진시키는B. pumilus의 전체 육즙 배양물 또는 상청액으로부터 분리된다. 본 발명은 또한 식물상에서 또는 식물안에서 곤충 감염을 방제하도록,Bacillus의 박테리아 현탁액, 또는Bacillus배양물의 대사물질-함유 상청액 또는 정제된 대사물질로 식물을 치료하는 방법을 포함한다.
더 이상으로, 본 발명은 살진균제로서 사용되는 균주 B-30087과 균주 B-21661(AQ 713)의 조합을 제공하며, 여기에서 균주를 함께 사용하는 것은 단독으로 사용했을 경우보다 더 큰 효능을 제공한다.
본 발명을 실행하는 방식
본 발명은 녹병균, 흰분말병 곰팡이 및 단연모 곰팡이와 같은 특정한 식물 병원균에 대해서만 항진균 활성을 갖는,Bacillus종의 신규한 균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 및 그것의 돌연변이 또는 변이체의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다. 이B. pumilus의 신규한 균주는 특허 진행의 목적을 위한 기탁된 미생물의 국제적 인정에 대한 부타페스트 조약의 규정하에 Agricultural Research Culture Collection(NRRL), 1815 North University Street, Peoria, I11. 61604, USA에 1999, 1, 14 자로 기탁되었고, 기탁 번호 NRRL B-30087을 부여받았다. NRRL B-21661로 표시된 균주가 1997, 3, 7 자로 동일한 기구에 기탁되었다. 이어서 그것은 American Type Culture Collection(ATCC)의해Bacillus subtilis로 확인되었다.
본 발명은 또한 그러한 박테리아 균주, 또는 그러한 박테리아 균주로부터 얻어진 항생물질-함유 상청액 또는 순수한 항생물질을 사용하는, 식물 뿌리를 포함하여, 식물에서 진균 질병을 방지 및 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 10,000 달톤 미만의 분자량을 갖고, 열에 약간 불안정하고, 양으로 하전되고, 최대 280nm에서 UV 흡광도 및 230nm에서 문턱값을 나타내는 HPLC 피크를 갖는 수용성 항진균성 항생물질을 포함한다. 항생물질은 쯔위터마이신 A가 아니다.
본 발명의 더 이상의 양태는B. thuringiensis와 조합되었을 때,B. thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는B. pumilus의 전체 육즙 배양물 또는 상청액을 포함한다. 또한, 본 발명은 식물상에서 또는 식물안에서 곤충 감염을 방제하도록,Bacillus의 박테리아 현탁액, 또는Bacillus배양물의 대사물질-함유 상청액 또는 정제된 대사물질로 식물을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 더 이상의 양태는 살진균제로서B. pumilus(NRRL B-30087)과B. subtilis(NRRL B-21661) 균주의 조합을 사용하는데 대한 놀라운 상승 효과이다. 본 발명은 이 조성물 및 살진균제로서 그것을 사용하는 방법을 포함한다.
정의
본 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같은, 단수형 "어떤", 및 "그"는 그 문맥이 다른 방식을 분명히 규정하지 않는다면, 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "어떤 세포"는 그것들의 혼합물을 포함하여, 복수의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 기술된 요소들을 포함하지만, 다른 것도 배재하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 규정하기 위해 사용될 때, "본질적으로 구성되는"은 조합에서 어떤 본질적인 중요성을 갖는 다른 요소들을 배재하는 것을 의미해야 한다. 따라서, 본원에 규정된 바와 같은 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 분리 및 정제법, 및 인산 완충된 살린, 보존제 등과 같은 제약학적으로 허용되는 담체로부터의 미량의 오염물질을 배재하지는 않는다. "으로 구성된"은 다른 성분 및 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계의 미량 이상의 요소들을 배재하는 것을 의미해야 한다. 이들 각각의 과도기적 용어에 의해 규정된 구체예는 본 발명의 범위내에 있다.
용어 "분리된"은 "생물학적으로 순수한"과 교환가능하게 사용되며, 구성요소, 세포 및 다른 상태로 분리되는 것을 의미하고, 보통 균주 또는 대사물질이 자연에서 이와 관련된다.
본원에 사용된 바와 같은, "생물학적 방제"는 제 2 유기체의 사용에 의한 병원균 또는 곤충의 방제로서 규정된다. 생물학적 방제의 공지된 메카니즘은 뿌리의 표면상의 공간에서 진균을 외부-경쟁시킴에 의해 뿌리 부패를 방제하는 장내세균을 포함한다. 항생물질과 같은 박테리아 독소가 병원균을 방제하는데 사용되고 있다. 독소는 분리되어 식물에 직접 사용될 수 있거나, 또는 박테리아 종이 투여되어 그자리에서 독소를 생성할 수 있다.
용어 "진균" 또는 "진균들"은 광범위한 엽록소가 없는 유핵 포자를 지닌 유기체를 포함한다. 진균의 예는 효모, 곰팡이, 백분병, 녹병균, 및 버섯을 포함한다.
용어 "박테리아"는 뚜렷한 핵을 가지지 않는 어떤 원핵생물을 포함한다.
"살진균성"은 사망률을 증가시키거나, 또는 진균의 성장률을 억제하는 물질의 능력을 의미한다.
"항생물질"은 미생물을 죽이거나 억제할 수 있는 어떤 물질을 포함한다. 항생물질은 미생물에 의해, 또는 합성 과정 또는 반합성 과정에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 용어는 진균을 억제하거나 죽이는 물질, 예를 들어 쯔위터마이신 A 또는 카노사민을 포함한다.
"항진균성"은 진균을 죽이거나, 또는 성장을 억제할 수 있는 어떤 물질을 포함한다.
용어 "배양"은 여러가지 종류의 배지상에서 또는 배지에서 유기체의 증식으로 간주한다.
"전체 육즙 배양물"은 세포 및 배지를 모두 함유하는 액체 배양물로 간주한다.
"상청액"은 육즙에 있는 성장한 세포가 원심분리, 여과, 침강 또는 본 분야에 잘 공지된 다른 수단에 의해 제거될 때, 남아있는 액체 육즙으로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "곤충"은 "곤충강"으로 분류되는 모든 유기체를 포함한다. "예비-성충" 곤충은, 예를 들어 달걀, 유충 및 애벌레를 포함하여, 성충 단계 전의 어떤 형태의 유기체로 간주한다. "살선충성"은 선충류의 사망률을 증가시키거나, 또는 성장률을 억제하는 물질의 능력으로 간주한다. "살충성"은 곤충, 선충류 및 진드기의 사망률을 증가시키거나, 또는 성장률을 억제하는 물질의 능력으로 간주한다.
"양성 대조군"은 살충 활성을 가진다고 공지된 화합물을 의미한다. "양성 대조군"은 상업적으로 입수가능한 화학 살충제를 제한 없이 포함한다. 용어 "음성 대조군"은 살충 활성을 가지지 않는다고 공지된 화합물을 의미한다. 음성 대조군의 예는 물 또는 에틸아세테이트이다.
용어 "용매"는 용액중에 다른 물질을 유지하는 어떤 액체를 포함한다. "용매 추출물"은 용매에 용해하고, 다음에 이것이 용매로부터 분리될 수 있는 어떤 화합물로 간주한다. 용매의 예는 에틸아세테이트와 같은 유기 용매를 제한 없이 포함한다.
용어 "대사물질"은 살충 활성을 갖는 미생물의 발효의 어떤 화합물, 물질 또는 부생성물로 간주한다. 상기 규정된 바와 같은 항생물질이 미생물에 대해 특이적으로 활성인 대사물질이다.
"조성물"은 활성 제제와 부형제와 같은 불활성(예를 들어, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성인 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미하도록 의도된다.
"부분"은 크기, 극성 또는 전하로 상청액의 분자를 분리하는데 사용된 분별 분석으로부터의 알리쿼트를 의미하도록 의도된다.
"부분적으로 정제된 부분"은 생물학적 분석(Bioassay)에서 발아를 억제하거나, 또는 레피올로플라우스에 대한 B+ 활성을 증진시킬 수 있는, 분별 분석에서 수집된 알리쿼트중 하나이다.
"유효량"은 유리하거나 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용도에서 사용될 수 있다. 치료 및 보호의 항목에서, "유효량"은 곤충 감염의 진행을 개량, 안정화, 역전, 저속화 또는 지연하기에 충분한 양이다.
우리는 특정한 식물 병원균에 대해서만 항진균 활성을 갖고, 항박테리아 활성은 가지지 않는, NRRL 기탁 번호 B-30087하에 기탁된Bacillus종의 신규한 항생물질-생성 균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 생물학적으로 순수한 배양물을 설명한다.
다른 양태로서, 균주는 NRRL 기탁 번호 B-30087하에 기탁된 균주의 모든 확인된 특징(이하 제공되는 바와 같은)을 갖는 NRRL 기탁 번호 B-30087의 돌연변이 또는 변이체이다. 돌연변이 또는 변이체는 본 명세서 전체에서 교환가능하게 사용되고, 더 이상으로 높은 긴축 조건하에 NRRL 기탁 번호 B-30087의 게놈에 혼성화하는 게놈을 가지고 있는 것이 확인될 수 있다. "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기간의 수소 결합에 의하여 안정화된 복합체를 형성하는 반응으로 간주한다. 수소 결합은 Watson-Crick 염기쌍, Hoogstein 결합에 의해, 또는 어떤 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 이중 구조를 형성하는 2개의 스트랜드, 다중-스트랜드 복합체를 형성하는 3개 이상의 스트랜드, 단일 자가-혼성화 스트랜드, 또는 이들의 어떤 조합을 포함한다. 혼성화 반응은 상이한 "긴축" 조건하에 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 긴축 혼성화 반응은 10×SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액중에서 약 40℃에서 실행된다. 온건한 긴축 혼성화는 전형적으로 6×SSC 중에서 약 50℃에서 수행되며, 높은 긴축 혼성화 반응은 일반적으로 1×SSC 중에서 약 60℃에서 수행된다.
또한, NRRL 기탁 번호 B-30087의 돌연변이 또는 변이체는 NRRL 기탁 번호 B-30087의 게놈과 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 또는 더욱 바람직하게는 95% 이상 서열 동일성인 게놈 서열을 갖는 균주로서 규정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 도는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 정렬되었을 때, 염기(또는 아미노산)의 퍼센트가 비교된 2개 서열에서 동일하다는 것을 의미하는, 다른 서열에 대한 어떤 퍼센트(예를 들어, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 갖는다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 본 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 설명된 것들이다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 스트랜드 = 2개; 컷오프 = 60; 익스펙트 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 디스크립션 = 50 서열; 소트 = HIGH SCORE; 데이타베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 내용은 다음 인터넷 주소 http://www.ncbi.nlm.nig.gov/cgi-bin/BLAST에서 알 수 있다.
더 이상으로, 본 발명은 상기 기재된 배양물로부터 얻어진 상청액을 제공한다. 상청액은 원심분리, 여과, 침강 등을 포함하여, 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 수용성 항진균 항생물질인 분리된 대사물질을 포함한다. 대사물질은 상술된 본 발명의 균주로부터 분리된다. 그것은 10,000 달톤 미만이고, 280nm에서의 UV 흡수피크 및 230nm에서의 문턱값을 가지고, 산 및 염기에 안정하고, 80℃ 이상의 열에 약간 불안정하고, 양으로 하전된다는 화학적 특징을 가지며, 특정한 식물 병원균에 대해 활성이 있지만, 박테리아에 대한 활성은 가지지 않는다. 더 이상으로, 본 발명은 이하 설명되는 방법을 사용하여, 본 발명의 균주를 배양하는 단계, 및 활성 대사물질을 분리하는 단계를 포함하는, 대사물질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 더 이상의 양태는 살진균 활성을 가지는 NRRL 기탁 번호 B-30087의 부분적으로 정제된 활성 부분이다. 활성 부분은 쯔위터마이신 A와 동일하지 않다.
단독 또는 서로 조합된, 상기 균주(그것의 돌연변이 또는 변이체를 포함함),상청액, 부분 및 대사물질 중 어느 것, 및 담체를 포함하는 조성물이 본 발명에 의해 더 제공된다. 이들 조성물은 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 첨가함으로써 더 보충될 수 있다. 이들 조성물은 습윤성 분말, 과립 제조물, 수성 현탁액, 유화성 농축물 또는 미세캡슐을 제한 없이 포함하는 여러가지 제조물의 형태를 취할 수 있다.
본 발명내의 조성물의 우수한 분산 및 접착을 달성하기 위해, 전체 육즙 배양물, 상청액, 부분 및/또는 대사물질/항생물질을 분산 및 접착을 돕는 성분과 함께 제조하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 적합한 제조물이 당업자들에게 공지될 것이다(습윤성 분말, 과립 등, 또는 적합한 배지중에서 미세캡슐화될 수 있는 것 등, 수성 유동성 및 수성 현탁액과 같은 액체, 및 유화성 농축물). 다른 적합한 제조물이 당업자들에게 공지될 것이다.
상기 기재된 균주, 대사물질, 분핵, 상청액 및 이들 활성 성분을 함유하는 조성물 중 어느 것이 진균 감염으로부터 식물, 뿌리 또는 열매를 치료 또는 보호하는 방법을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 단독 또는 서로 조합된, 균주, 대사물질, 부분, 상청액 또는 이들 활성 성분을 함유하는 조성물 중 어느 것 및/또는 다른 생물학적 또는 화학적 살충제를 감염된 뿌리, 식물 또는 열매에 유효량으로 사용하는 것을 포함한다. 또한, 유효량의 이들 조성물은 식물, 뿌리 또는 열매에 사용되어 그러한 감염을 방지할 수 있다.
더 이상의 양태로서, 본 발명은 신규한 균주Bacillus종 NRRL 기탁 번호 B-30087의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 변이체에 의해 생성된 항생물질을 유효량으로 사용하는 것을 포함하는, 진균 질병으로부터 식물, 뿌리 또는 열매를 치료 또는 보호하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 균주는Bacillus종 NRRL 기탁 번호 B-30087이다.
더 이상으로, 본 발명은Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 수용성 화합물을 제공하며, 여기에서 화합물은 10,000 달톤 미만의 분자량을 갖고, 화합물은 쯔위터마이신 A가 아니다. 화합물은 베타 외독소 또는 다른Bacillus thuringiensis-생성된 외독소가 아니다.
화합물은 음이온 교환 수지, 아세토니트릴 침전 및 크기 배재 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리된다. 또한, 본 발명은 신규한 화합물을 함유하는Bacillus의 상청액의 부분적으로 정제된 부분을 제공한다. 신규한 화합물 및 활성 부분은B. subtilis, B. cereus, B. mycoides및 B. pumilus를 제한 없이 포함하는Bacillus중의 군으로부터 선택된Bacillus로부터 분리될 수 있다.
부분적으로 정제된 활성 부분은 본 분야의 화학자들이 화합물이 완전히 정제되었는지의 여부를 측정하도록 허용하는 그것의1H NMR(또는, 양성자 NMR) 스펙트럼에 의해 확인될 수 있다. 화합무이 순수할 때, 1개 양성자를 나타내는 피크는 1개의 임의의 값에 대해 통합될 것이다. 2개 양성자를 나타내는 피크, 예를 들어 메틸렌기는 다음에 2개의 값에 대해 통합될 것이다. 3개 양성자를 나타내는 피크, 예를 들어 메틸기는 다음에 3개에 대해 통합될 것이다. 이것은 순수한 쯔위터마이신 A 표준인 도 3의 경우이다. 그러나, 활성인 분적으로 정제된Bacillus thuringiensis증진제의1H NMR 스펙트럼은 1개 미만에 대해 통합되고, 따라서 스펙트럼에 있는 큰 피크로부터 분리된 화합물에 속하는 피크의 군을 갖는다.
분리시, 화합물은 살충 활성을 나타내지 않는다.Bacillus thuringiensis와의 조합이 식물 또는 식물 뿌리에 사용될 때Bacillus thuringiensis의 살충 효과를 증진시킨다.Bacillus thuringiensis는 미생물 균주, 상업적 제품, 조작된 식물, 살충 활성인 대사물질, 살충 활성인 상청액 또는 델타 내독소의 형태일 수 있다.
Bacillus thuringiensis는 부아포 결정 단백질 봉입체를 특징으로 하는 그램-양성, 포자-형성 박테리아이다. 단백질은 해충에 매우 유독하며, 그것의 독성 활성에 특이적일 수 있다. 아래 청구항에 사용된 바와 같이, 용어 "Bacillus thuringiensis"는 미생물 균주, 그러한 균주를 함유하는 상업적 제품 또는 균주로부터 분리된 활성 대사물질 또는 부분을 함유하는 분리물,Bacillus thuringiensis살충성 단백질 또는 유전자 생성물을 코드화하는 유전자를 발현하는 유전적으로 변형되거나 조작된 식물, 또는 델타 내독소를 포함한다. 독소 유전자는 분리되어 서열화되며, 재조합 DNA-기제Bacillus thuringiensis생성물이 생성되어 사용이 승인되었다. 이들Bacillus thuringiensis내독소를 농업적 환경으로 전달하기 위한 유전공학 기법 및 새로운 접근법이 개발중이며, 상업적으로 생산된다. 이것은 해충 내성에 대해 내독소 유전자를 사용하여 유전적으로 조작된 식물의 사용, 및Bacillus thuringiensis내독소 전달 부형제로서 안정화된 원 미생물 세포의 사용을 포함한다(Gaertner et al., (1998) TIBTECH 6:S4-S7).Bacillus thuringiensis는 자연적으로 독소를 발현하는 야생형Bacillus thuringiensis에 표적 해충을 노출시킴으로써 표적 해충에 대해 이용가능하게 만들 수 있다. 또는 달리, 바람직한 독소를 코드화하는 유전자가 적합한 재조합 숙주로 형질전환되거나, 또는 발현될 수 있다. 살충 활성을 보유하는Bacillus thuringiensis독소의 단편이 또한 사용될 수 있다.
다음의 미국 특허는 살충성Bacillus thuringiensis분리물 또는Bacillus thuringiensis독소를 발현하는 재조합 미생물을 개시한다:
미국특허번호
Bacillus thuringiensis아종 kurstaki의 포자 및 결정의 제조물이 인시류 해충에 대한 상업적 살충제로서 수년동안 사용되었다. 예를 들어,Bacillus thuringiensis var.kurstaki HD-1은 많은 인시류 해충의 애벌레에 유독한 델타 내독소로 명명된 결정을 생성한다.Bacillus thuringiensis의 추가의 종, 즉 이스라엘렌시스 및 테네브리오니스는 곤충의 방제에 상업적으로 사용되고 있다.
대장균에서Bacillus thuringiensis결정 단백질 유전자의 클로닝 및 발현이 Schnepf, H. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897에 설명되었다. 미국 특허 번호 4,448,885 및 미국 특허 번호 4,467,036은 모두 대장균에서 결정 단백질의 발현을 개시한다. 혼성Bacillus thuringiensis결정 단백질 유전자는 표적 해충에 대해 증가된 독성을 나타내고 확장된 숙주 범위를 나타내도록 구성된다. 미국 특허 번호 5,128,130 및 5,055,294 참조. 미국 특허 번호 4,797,276 및 4,853,331은 다양한 환경에서 딱정벌레목 해충을 방제하는데 사용될 수 있는Bacillus thuringiensis균주 San Diego(a.k.a.B.t. tenebrionis, a.k.a. M-7)을 개시한다. 미국 특허 번호 4,849,217은 자주개자리 바구미에 대한 활성을 갖는Bacillus thuringiensis분리물을 개시한다. 미국 특허 번호 5,151,363 및 미국 특허 번호 4,948,734는 선충류에 대한 활성을 갖는Bacillus thuringiensis의 어떤 분리물을 개시한다.
Bacillus thuringiensis배양물은 또한 Brownsville, Tex에 있는 미농무성 (USDA)로부터 입수가능하다. USDA, ARS, Cotton Insects Research Unit. P.O.Box 1033, Brownsvilli, Tex. 78520 USA; 또는 the Northern Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, I11., USA에 요청해야 한다.
따라서, 화합물 및 활성 부분은 선충류, 파리, 멸강충, 진드기, 콜로라도 감자 갑충 및 옥수수 뿌리벌레를 제한 없이 포함하는 곤충에 대한Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시킨다.
당업자들에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 활성 화합물은 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 신규한 화합물 및 용매 또는 농업에 적합한 담체와 같은 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 더 이상의 구체예에서, 조성물은 상술된 바와 같은, 유효량의Bacillus thuringiensis를 더 포함한다. 더 이상의 구체예에서, 조성물은 본 분야에서 통상 사용되는 바와 같은, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 포함한다. 본 발명내의 조성물의 우수한 분산 및 접착을 달성하기 위해, 전체 육즙 배양물, 상청액 및/또는 대사물질을 분산 및 접착을 돕는 성분과 함께 제조하는 것이 유리할 수 있다. 식물 또는 식물 뿌리에 사용하는 경우에 있어서, 제조물은 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물로 가공될 수 있다.
신규한 화합물, 활성 부분 또는 그것들을 함유하는 조성물이Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 신규한 화합물, 활성 부분 또는 그것들을 함유하는 조성물의 효과적인 증진량과Bacillus thuringiensis를 조합함에 의해Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 더 이상의 양태로서, 적어도 하나의 생물살충제 또는 화학적 살충제의 유효량이 제조물에 첨가될 수 있다.
더 이상으로, 본 발명은 살진균제로서 사용되는, 식물, 뿌리 또는 열매상에 전체 육즙 배양물로서 사용되는, NRRL 기탁 번호 B-21661과 조합된 신규한 화합물 NRRL 기탁 번호 B-30087을 사용하는 것을 포함하며, 상기 살진균제는 화합물의 조합의 예기치 못한 상승 효과의 결과로서 더욱 효력있는 효과를 갖는다. 더욱 바람직하게, 조합은Botrytis cinerea또는Peronospora parasitica에 1:2(B-21661:B-10087)의 비로 사용된다. 더욱 더 바람직하게 조합은 1:4 비율로Botrytis cinerea또는Peronospora parasitica에 사용된다. 더 이상의 구체예에서, 조성물은 본 분야에서 통상 사용되는 바와 같은 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 포함한다. 본 발명내의 조성물의 우수한 분산 및 접착을 달성하기 위해, 전체 육즙 배양물, 상청액 및/또는 대사물질은 분산 및 접착을 돕는 성분과 함께 제조되는 것이 유리할 수 있다. 식물 또는 식물 뿌리에 사용하기 쉽게하기 위해서, 제조물은 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물로 가공될 수 있다.
본 명세서 전체를 통하여, 여러가지 공보, 특허 및 공개된 특허 명세서는 인용을 확인함에 의해 참고된다. 이들 공보, 특허 및 공개된 특허 명세서의 명세서는 본 발명이 속하는 분야의 상황을 더욱 완전히 설명하기 위해 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
다음의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이며, 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
균주 NRRL 기탁 번호 B-30087의 특성화
NRRL 기탁 번호 B-30087을 전-세포 세포 지방산을 기초로 확인하고, 메틸에스테르로 유도하여 - FAME(Miller, L. T. (1982) "Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole cell wall fatty acid methyl esters, including hydroxy acids" J. Clin. Microbiol. 16:584-586), MIDI 시스템(Microbial Identification System, Inc., Newark, DE)을 사용하여 기체 크로마토그래피로 분석했다. 박테리아 배양물을 성장시키는데 사용된 과정 및 프로토콜 및 기기 명세서가 MIDI에 의해 설명된다(세포 지방산의 기체 크로마토그래피에 의한 박테리아의 확인. Technical Note #101. MIDI, Inc., 115 Barksdale Professional Center, Newark, DE). 분리물을 28℃에서 24시간 동안 TSA(BBL) 플레이트상에서 성장시키고, 세포를 수집했다. 메탄올 NaOH(50%[vol/vol] 메탄올 중의 15%[wet/vol] NaOH) 1ml를 가하고, 세포를 100℃에서 30분간 감화시켰다. 지방산의 에스테르화를 46%(vol/vol) 메탄올 중의 3.25N HCl 2ml를 사용하여 80℃에서 10분간 수행했다. FAME를 1:1(vol/vol) 메틸-tert-부틸 에테르-헥산 1.25ml로 추출하고, 유기 추출물을 1.2%(wet/vol) NaOH 3ml로 세척한 후, 기체 크로마토그래피에 의해 분석했다. 기체 크로마토그래피(Hewlett-Packard 5890A)를 불꽃 이온화 검출기 및 운반 기체로서 수소를 사용하는 모세관 칼럼(Hewlett- Packard 19091B-102, 교차결합 5% 페닐메틸 실리콘; 25m×0.22mm ID; 필름 두께, 0.33 1lm; 상비율 150)을 구비했다. Hewlett-Packard 3392 인테그레이터는 자동적으로 FAME 피크를 통합했고, MIDI Microbial Identification Software(Sherlock TSBA Library version 3.80)을 사용하여 박테리아 분리물을 명명했다.Xanthomonas maltophilaATCC 13637의 FAME 프로파일을 MIDI 측정에 대한 기준 검사로서 사용했다.
MIDI 프로파일의 3개의 개별적인 작동의 결과 0.875의 유사한 인덱스 점수를 갖는Bacillus pumilus로서 NRRL 기탁 번호 B-30087을 확인했다.
실시예 2
생체내 배양물에서 식물 병원균에 대한 NRRL 기탁 번호 B-30087의 활성 (띠분석)
NRRL 기탁 번호 B-30087가 광범위한 식물 병원성 진균에 대해 효과적인지의 여부를 측정하기 위해서, 다음의 실험을 식물 병원균Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola Colletotrichum acutatum, Cladosporium carophylum, Monilinia fructicola, Venturia inaequalis, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Taphrina deformans및Verticillium dahliae를 사용하여 수행했다.
아가 확산(띠) 분석에서 NRRL 기탁 번호 B-30087의 활성을 측정하기 위해서, 식물 병원균 포자(포자를 페트리 플레이트의 표면으로부터 스크랩했고, 대략 1×105포자/ml(병원균에 따라)로 희석했다)를 10cm 페트리 디쉬에 있는 감자 덱스트로스 아가의 표면 위에 살포했다.Rhizoctonia solani및Sclertinia sclerotiorum에 대해서, 포자 대신 균사체성 단편을 플레이트 위에 살포했다. 대략 7.0mm의 원형 웰을 아가로부터 제거하고, 250ml 쉐이크 플라스크에서 72시간 동안 대두, 효모 추출물 배지에서 성장시킨 NRRL 기탁 번호 B-30087의 상청액 125ℓ 샘플을 웰에 놓았다.
상청액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 제조했다. 전형적인 결과는 웰 근처에서 병원균의 성장이 없는 및/또는 성장이 감소된 띠를 구성하거나, 또는 띠가 전혀 없을 수 있다. 띠가 있다면, mm로 띠 부위를 측정 및 기록했다. 결과를 아래 표 1에 나타낸다.
진균식물병원균에 대한 NRRL기탁번호 B-30087의 생체내 시험
Alternaria brassicicola 띠없음
Botrytis cinerea 띠없음
Cladosporium carpohilum 띠없음
Colletotrichum acutatum 띠없음
Fusarium oxysporum 띠없음
Monilinia fructicola 띠없음
Rhizoctonia solani 띠없음
Sclerotinia sclerotiorum 띠없음
Taphrina deformans 띠없음
Venturia inaequalis 띠없음
Verticillium dahliae 띠없음
Pythium sp. 띠없음
Phytophthora infestans 약한 활성(작고 흐린띠)
Phytophthora capsici 띠없음
Didimella bryonia 띠없음
NRRL 기탁 번호 B-30087 상청액은 띠 시험에서 대부분의 진균 식물 병원균에 대해 활성을 나타내지 않았다.
실시예 3
박테리아 식물 병원균에 대한 NRRL 기탁 번호 B-30087의 활성
표준 아가 확산 분석을 실시예 2에서와 같이 설정했다. 각 박테리아 병원균의 론을 감자 덱스트로스 아가의 표면위에 살포했다. NRRL 기탁 번호 B-30087 상청액 125ℓ 샘플을 이전에 설명된 바와 같이 각 웰에 놓았다. 띠의 존재 및 띠의 크기를 mm로 측정했다.
박테리아식물 병원균의 생체내 억제(띠시험)
NRRL No. B-30087 상청액 억제띠(mm)
Pseudomonas syringae pv. 토마토 띠없음
Xanthomonacampestris pv. Campestris 띠없음
Erwinia carotovora subsp. Carotovora 띠없음
NRRL 기탁 번호 B-30087은 생체내 시험된 박테리아 식물 병원균 중 어떤 종에 대해서도 활성이 없었다.
실시예 4
식물 시험에서 식물 병원균에 대한 NRRL 기탁 번호 B-30087의 활성
NRRL 기탁 번호 B-30087의 활성을 콩 녹병균, 강남콩의Uromyces phaseoli, 및 회색 곰팡이, 후추 식물의Botrytis cinerea, 토마토 식물의Alternaria solani, 및 상추의 노균병,Bremia lactucae;Brassica의 노균병,Peronospora parasitica, 토마토의 늦은 마름병,Phytophthora infestans및 포도 흰분말병곰팡이,Uncinula necator에 대해 시험했다.
Alternaria solani
병원균Alternaria solani를 PDA로 표준 페트리 플레이트(10cm)상에서 성장시켰다. 진균 콜로니를 플레이트로부터 잘라내고, 포자형성 배지(살균수 리터 당 20g 수크로스, 30g 탄산칼슘, 및 20g 아가) 상에 두었다. 살균수를 균사체성 블록으로 부분적으로 덮힌 플레이트에 가하고, 플레이트를 2일 동안 14시간의 광주기로 22 내지 26℃에서 인큐베이션했다. 포자를 살균수의 비이커 안에 균사체성 블록을 스크랩하여 수집했다. 포자 현탁액을 2×104포자/ml로 조정했다.
2 인치 단지에서 재배되고 평판에 놓인 3 내지 4 잎의 단계에 있는 토마토 묘목(UC82-B)을 250ml 쉐이크 플라스크에서 72시간 동안 대두분말, 효모 추출물 배지에서 성장시킨 NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙을 갖는 유거수에 화가의 공기 브러시로 분무했다. 분무한 후, 묘목을 최소 2시간 건조시켰다. 접종된 묘목을 처음 40시간 동안은 조명 없이 22℃에서 Percival 듀 챔버에 두었다. 각 평판에 있는 식물을 플라스틱 돔으로 덮고, 14시간 광주기로 Percival 인큐베이터에서 48시간동안 20 내지 22℃에서 유지했다. 병원균 포자를 가지는 및 가지지 않는 NRRL 기탁 번호 B-30087이 없는 물을 음성 대조군 및 양성 병원균 대조군으로서 사용했다. 또한, 화학적 살진균제(예를 들어, Azoxystrobin, Abound)를 100 내지 250ppm의 비율로서 비교에 사용했다. 식물을 0 내지 5의 스케일로 점수매겼다. 여기에서 5는 100% 감염이고, 0%는 증상이 나타나지 않은 것이다. 물A. solani방제에서, 모든 잎에 대해 장애가 균일했고, 떡잎이 떨어졌고, 심각하게 감염되었다(5로 평가 = 완전한 감염, 방제 없음). NRRL 기탁 번호 B30087 조작된 식물은 물 방제와 차이가 없는 것으로 보였다. NRRL 기탁 번호 B30087에 의한 병원균의 방제는 없었다. 음성 대조군은 감염되지 않았다. 화학적으로 조작된 식물은 0과 1사이의 점수를 가졌다.
Botrytis cinerea
병원균Botrytis cinerea를 PDA를 사용하여 표준 페트리 플레이트(10cm)상에서 성장시키고, 포자를 말트(0.5g/L) 및 효모 추출물(0.5g/L)로 보충된 감자 덱스트로스 육즙(PDB)을 사용하여 수집하고, 1×106포자/ml로 조정했다. 사용된 식물은 2인치 단지에서 3 내지 5개의 잎 단계까지 성장시킨 후추(Yolo Wonder)였다. NRRL 기탁 번호 B-30087 및 병원균의 사용은 상기와 동일했다. 단지와 함께 평판을 조명 없이 20℃에서 인큐베이션했다. 그것들을 플라스틱 돔으로 덮고, 점수매길때까지 2.5일(60 내지 65시간) 동안 내버려 두었다.
화학적 살진균제(예를 들어, Iprodione, Rovral)을 20 내지 100ppm의 비율로 비교에 사용했다. 식물을 0 내지 5의 스케일로 점수매겼다. 여기에서 5는 100% 감염이고, 0은 증상이 나타나지 않은 것이다. 물B. cinerea방제에서, 모든 잎에 대해 장애가 균일했다(5로 평가 = 완전한 감염, 방제 없음). NRRL 기탁 번호 B30087 조작된 식물은 물 방제와 차이가 없는 것으로 보였다. NRRL 기탁 번호 B30087에 의한 병원균의 방제는 없었다. 음성 대조군은 감염되지 않았다. 화학적으로 조작된 식물은 0과 1사이의 점수를 가졌다.
Bremia lactucae
Bremia 시험에 대해서, 상추씨를 약 8cm 높이 및 거리로 측정된 작은 투명한 플라스틱 식물 상자에서 살균된 토탄, 펄라이트 및 질석 함유 혼합 단지의 층에서 재배했다. 재배 1주 후, 상추 묘목을 NRRL 기탁 번호 B-30087 육즙 또는 상청액 샘플과 함께 분무했다. 식물을 건조시키고, 다음에 감염된 상추 묘목(2×104포자/ml)로부터 수집된 노균병 포자 현탁액을 묘목위에 분무했다. Aliette(fosetyl-al) 및 Ridomil(metalaxyl)로 구성된 화학적 표준을 또한 사용했다. 그러나, 이들 시험에 사용된Bremia lactucae의 분리물은 상업적으로 사용되는 이들 2개 화학적 표준에 대해 무감각함이 이미 증명되었다. 플라스틱 상자를 꼭 맞는 뚜껑으로 덮고, 조명 없이 16시간 동안 Percival 인큐베이터에서 15 내지 16℃에서 인큐베이션했다. 다음에, 플라스틱 상자를 6일 동안 빛 하에 실온(20 내지 26℃)에 두었다. 묘목을 벗기고, 물로 분무하고, 회수하고, 하룻밤 포자형성 동안 15 내지 16℃에서 다시 인큐베이션했다. 상추 노병균의 화학적 내성 균주에 대한 NRRL 기탁 번호 B-30087의 영향을 아래 표 3에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3
NRRL No. B-30087샘플 1 0.0 1.0 1.0
NRRL No. B-30087샘플 2 1.0 1.0 0.0
Aliette 240ppm 5.0 3.0 --
Rqdomil 125ppm 3.0 3.0 --
물검사 5.0 5.0 5.0
NRRL 기탁 번호 B-30087은 묘목상에 병원균의 포자가 약간이거나 아주 없는 상추 노병균에 대해 훌륭한 활성을 가졌다. 반면, 대조군(물 검사) 식물은 노병균과 함께 완전하게 포자형성되었다. 화학적 표준은 병원균을 효과적으로 방제하지 않았다.
Peronospora parasitica
Bacillus균주 NRRL 기탁 번호 B-30087을 250ml 쉐이크 플라스크에서 상기와 같이 성장시켰다. 1× 강도로 전체 육즙 배양물을 약하고 늙은 꽃양배추 또는 완전 떡잎 단계에 있는 브뤼셀 싹양배추 식물위에 화가의 공기 브러시로 압축 공기에 의해 분무했다. 15 내지 25묘목/단지의 3개 복제를 처리당 분무했다. 1 내지 5×104포자/ml로 노병균Peronospora parasitica의 포자 현탁액을 먼저 NRRL 기탁 번호 B-30087을 사용한 후, Brassica 식물위에 분무했다. Aliette(fosetyl-al) 및 Ridomil(metalaxyl)로 구성된 화학적 표준을 또한 사용했다. 그러나, 이들 시험에 사용된Peronospora parasitica의 분리물은 상업적으로 사용되는 이들 2개 화학적 표준에 대해 무감각함이 이미 증명되었다.
식물을 감염을 위해 16시간 동안 15 내지 17℃에서 유지했고, 다음에 묘목을 6일 동안 20 내지 24℃에서 인큐베이션했다. 단지를 병원균의 포자형성이 생기도록 하룻밤 15 내지 17℃에서 다시 인큐베이션했다. 각 식물을 0 내지 5 스케일에 기초하여 질병 방제 퍼센트를 추정함에 의해 평가했다. 0으로 평가한 것은 포자형성 장애가 없는 식물이다. 복제된 단지의 평균 결과를 아래 표 4에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3
NRRL No. B-30087샘플 1 0.5 1.0 0.5
NRRL No. B-30087샘플 2 0.5 0.5 1.0
Aliette 240ppm 5.0 3.0 --
Rqdomil 125ppm 4.0 4.0 4.0
물검사 5.0 3.0 5.0
NRRL 기탁 번호 B-30087은 미처리된 검사 및 화학적 표준과 비교하여 더욱 효과적으로Brassica노병균을 방제했다.
Unicinula necotor
포도 묘목(Chardonnay)을 6 내지 9개의 잎 단계까지 2인치 단지에서 성장시켰다. 노병균의 배양물을 14시간 광주기하에서 22 내지 26℃에서 포도 묘목에 대해 유지했다. 가장 어린 2 내지 4개 잎을 제외하고 모두 제거한다. NRRL 기탁 번호 B-30087, 화학적 살진규제(Rally, 25ppm의 마이크로부타닐), 및 물 검사를 다른 시험된 병원균에 대한 것과 마찬가지로 수행했다. 4 내지 5의 복제를 각 처리에 대해 사용했다. 노병균을 접종하기 위해, 보존 묘목상의 곰팡이를 가지는 잎은 가위로 제거하고, 각 식물을 각각 접종했다. 보존 묘목의 표면을 페인트브러시로 부드럽게 빗어, 포자를 시험 식물의 맨위 표면위에 부착시킨다. 모든 식물이 동등한 접종을 가지도록 3× 밝은 확대 렌즈를 사용하여 과정을 수행했다. 단지와 함께 평판을 시험이 판독될때까지 추가의 9 내지 11일 동안 14시간 광주기로 20 내지 24℃에서 16 내지 24시간 동안 어두운 곳에 두었다. 상기와 같이, 식물은 0 내지 5의 스케일로제공된다. NRRL 기탁 번호 B-30087을 사용한 결과를 아래 표 5에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4
NRRL No. B-30087 0.5 0.0 1.0 1.0
Rally 25ppm 0.0 0.0 0.0 0.0
물검사 5.0 5.0 3.0 4.0
NRRL 기탁 번호 B-30087은 미처리된 검사 및 화학적 표준인 Rally와 비교하여 효과적으로Unicinula노병균을 방제한다.
Phytophthora infestans
토마토의 늦은 마름병의 시험을 위해,P. infestans를 2인치 정사각형 플라스틱 단지에 있는 4 내지 6개 잎의 단계에 있는 토마토 묘목(UC82-B)을 사용하여 수행했다. 이미 설명된 바와 같이 성장시킨 NRRL 기탁 번호 B-30087을 토마토 묘목에 대해 사용했다.P. infestans의 접종물을 호밀씨 아가에서 성장시킨 포자형성 콜로니를 스크랩함에 의해 생성했고, 0.7 내지 104포자/ml의 농도로 접종물을 조정했다. 접종된 묘목을 평판 두었고,A. solani시험에 대해 설명된 바와 같이 정확하게 인큐베이션했다. 묘목을 0 내지 5의 스케일로 평가했다. Quadris(아족시스트로빈)을 62.5 내지 125ppm의 비율로 비교로서 사용했다. NRRL 기탁 번호 B-30087을 사용한 결과를 아래 표 6에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Rep 5
NRRL No. B-30087 2.0 01.5 1.5 0.5 2.0
Quadris 125ppm 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Quadris 62.5ppm 0.0 0.5 0.0 0.5 0.0
물검사 5.0 5.0 4.0 4.0 5.0
화학적 표준 뿐만 아니라 NRRL 기탁 번호 B-30087은 인큐베이션 4일 후, 거의 늦은 마름병을 방제했다.
Uromyces phaseoli
콩 녹병균의 시험에 대해서,U. phaseoli를 처음의 제 1 잎이 3/4로 확장할때까지 강남콩 묘목(Provider variety)을 사용하여 수행했다. NRRL 기탁 번호 B-30087을 다른 숙주/병원균 조합에 대해 이미 설명된 바와 같이 사용했다. 녹병균의 접종물을 -20℃에서 바이알에 건조된 녹병균 포자로서 저장했다. 접종물을 0.01% Tween20과 함께 물에 건조된 녹병균 포자를 첨가함으로써 제조하고, 적어도 1시간 동안 자석 교반기로 격렬하게 교반했다. 접종물을 2 내지 4 ×105포자/ml로 조정했다. 먼저, 잎을 접종하고, 묘목을 평판에 두고, Percival 듀 챔버에서 20℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음에, 묘목을 추가로 8 내지 10일 동안 실온(20 내지 26℃)에서 인큐베이션했다. 묘목을 포자형성 녹병균 농포 존재의 발생 및 심각성을 기초로 0 내지5의 스케일로 평가했다.
화학적 살진균제 Break(프로피코나졸)을 40ppm의 비율로 비교로서 사용했다. NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙을 사용한 결과를 아래 표 7에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3
NRRL No. B-30087 0.5 0.5 0.0
Break40ppm 0.0 0.0 0.5
물검사 5.0 5.0 5.0
화학적 표준 Break 뿐만 아니라, NRRL 기탁 번호 B-30087은 콩 녹병균을 거의 방제했다.
실시예 5
NRRL 기탁 번호 B-30087에 의해 생성된 항진균 대사물질
NRRL 기탁 번호 B-30087의 전체 육즙을 에틸 아세테이트, 부탄올 및 수성 부분으로 분배했다. 각 부분을 포자 발아 분석으로 금어초 녹병균에 대해 시험했다. 금어초 녹병균 포자를 샘플 40ℓ 및 병원균 포자 20ℓ를 함유하는 저 현미경 슬라이드에서 각 샘플의 존재하에 발아시켰다. 대략 16 시간 후, 포자를 그것이 발아되었는지의 여부를 보기 위해 현미경하에 관찰한다. 물 방제(100% 발아 및 성장 = 5점)와 비교하여 발아가 없는 것(0점)은 시험되는 샘플의 활성을 나타낸다. 상이한 NRRL 기탁 번호 B-30087 부분을 사용한 녹병균 발아 분석의 결과를 아래(상기와 같이 0 내지 5의 스케일로 평가) 표 8에 나타낸다.
점수
Rep 1 Rep 2 Rep 3
에틸아세테이트 5.0 2.0 3.0
n-부탄올 3.0 5.0 3.0
수성 0.0 0.0 0.0
전체육즙 0.0 0.0 0.0
물검사 4.0 5.0 5.0
대사물질은 분명히 수용성 부분에 있고, 부탄올 또는 에틸 아세테이트에서는 실제로 추출할 수 없었다.
대사물질의 다른 특징을 측정했다. 분자는 대사물이 10,000 달톤 미만이라는 것을 나타내는 10,000 분자량 컷오프 필터를 통과하는 것으로 알려졌다. 활성은 프로테아제로의 처리 후 손실되지 않았고, 산 또는 염기로 처리했을 때도 그렇다. 활성은 1시간 동안 80℃로 가열했을 때 약간 손실되었다(금어초 녹병균에 대한 점수가 1 내지 1.5로 증가됨). 활성은 양이온 수지에 대해 흡수되었고, 음이온 수지에 대해서는 그렇지 않았다(대사물질은 양성으로 하전된다).
실시예 6
NRRL 기탁 번호 B-30087의 살진균성 부분의 부분적 정제
NRRL 기탁 번호 B-30087로부터의 전체 육즙 배양물(850ml)을 15분 동안 4200rpm에서 원심분리하여, 상청액을 수집했다. 활성탄(30g)을 상청액에 가했고, 그것을 잘 흔든 다음 11,500rpm에서 20분간 원심분리했다. 상청액을 로터리 증발기상에서 건조시킨 후, 15ml 물에 재용해했다. 다음에 샘플을 크기 배재 크로마토그래피(SEC)로 더 정제하여 성분을 분자량으로 분리했다.
P-2 수지(130g, BioRad)를 칼럼 2.5cm ×80cm를 충전하기 위해 milliQ 탈이온수로 팽창시켰다. 15ml 농충물을 P-2 칼럼상에 로딩하고, 칼럼을 중력에 의해 물로 용출하고, 10ml 부분을 수집했다. P-2 칼럼에 대한 파라미터: 범위 = 2, nm = 226nm, 16mV.
용출된 부분을 실시예 5에 설명된 금어초 녹병균 발아 분석을 사용하여 분석했다. 부분 18 내지 24는 발아를 완전하게 억제한다고 밝혀졌다. 이들 부분을 조합하고, 로터리 증발기상에서 건조시킨 후, 8ml 물에 재용해하고, 0.2m 필터를 통해 여과했다. 이것을 두번째 P-2 칼럼에 로딩하고, 상술된 바와 같이 수행하여, 7ml 부분을 수집했다.
부분 29 내지 38은 생물학적 분석에서 발아를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 부분을 건조시킨 후, 물에 재용해했다. 작은 알리쿼트(5mg)를 아미노 칼럼(4.6mm ×15cm, 5m, 100옹스트롬)을 사용하는 HPLC에 의해 더 분리했다. 칼럼을 0.01M KH2PO4로 평형화하고, 30분간 4% 내지 44% 아세토니트릴/0.01M KH2PO4의 구배로 작동시켜, 200nm에서 UV에 의해 1ml/분으로 검출했다.
3개의 피크가 수집되었고, 피크 1개는 크기 배재 HPLC(Toso Haas, G1000PW, 7.5mm×30cm, 10m)상에서 탈염했고, 물로 용출하여 200nm에서 UV에 의해 1ml/분으로 검출했다. 1개 피크를 크기 배재 칼럼으로부터 수집했고, 배아 분석에 대해 활성인 것이 밝혀졌다. 1H NMR 스펙트럼을 도 1에 나타낸 바와 같이 이 반-순수 활성 물질에 대해 D2O 중의 400MHz에서 기록했다.
실시예 7
쯔위터마이신 A와는 상이한 살진균성 성분의 화학적 특징
본 발명의 살진균 활성 부분은 모세관 전기영동에 대해 쯔위터마이신 A와는 상이한 것으로 알려졌다. NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙을 대두 분말, 덱스트로스, 효모 추출물, KH2PO4, NaCl 및 MgSO4×7H2O를 함유하는Bacillus배양 배지에서 성장시켰다. 줄을 그은 배양물이 250ml 쉐이크 플라스크에서 접종에 사용되었다. 플라스크를 4일 동안 30℃에서 210rpm에서 흔들었다.
NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙을 정제된 쯔위터마이신 A를 사용하여 스파이크하고, 모세관 전기영동(CE)를 수행했다. NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙 30㎕를 쯔위터마이신 A 10㎕으로 스파이크했다. NRRL 기탁 번호 B-30087, 쯔워터마이신 A을 갖는 NRRL 기탁 번호 B-30087 전체 육즙, 및 쯔위터마이신 A 단독의 각각의 한 샘플을 pH 5.8의 인산나트륨 완충액을 사용하여 CE를 수행했다. 각 샘플에 대해 발생된 일렉트로페로그램을 도 3에 나타낸다.
다음에, 부분적으로 정제된 부분을 모세관 전기영동(CE)를 사용하여 쯔위터마이신 A와 비교했다. 도 4는 B-30087의 부분적으로 정제된 살진균성 성분, 25㎕ 쯔위터마이신 A로 스파이크된 B-30087의 부분적으로 정제된 살진균성 성분, 및 쯔위터마이신 단독의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 2에 나타낸 쯔위터마이신 A, 도 1에 나타낸 부분적으로 정제된 살진균성 대사물질의1H NMR 스펙트럼은 400MHz에서 D2O 중에서 기록되었다. 도 1 및 도 2에 나타낸 스펙트럼은 NRRL 기탁 번호 B-30087로부터의 살진균성 대사물질이 쯔위터마이신 A와는 상이하다는 것을 증명한다.
NRRL 기탁 번호 B-30087로부터의 살진균성 대사물질은 또한1H NMR에 의해 외독소와도 구별될 수 있다. 외독소에 대한 1H NMR은 Analytical of Bacillus thuringiensis, L. A. Hickle and W. L. Fitch, eds., ACS Symposium Series 432, p. 131 (1990)에 나타낸 바와 같이 5ppm 이상에서 7개의 공명을 가진다. 반면, 도 1은 NRRL 기탁 번호 B-30087 샘플에 대해 5ppm 이상에서 양성자 공명을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 8
증진제의 정제
증진제를 다음과 같이 B-30087 전체 육즙으로부터 반정제했다. 그것을 음이온 교환 수지, 아세토니트릴 침전 및 크기 배재 크로마토그래피를 사용하여 435ml 전체 육즙을 처리함으로써 반정제했다. 전체 육즙을 원심분리하여 세포를 제거하고, 14.5g(AG 1-X8, 100-200메시, 아세테이트 형태)를 상청액에 가하고, 혼합물을 1분간 흔들었다. 이것을 5000rpm에서 20분간 원심분리하고, 상청액을 가만히 따라서, 다음 단계에 사용했다. 아세토니트릴을 상청액에 가하여 50% 용액을 제공하고, 그것을 1분간 흔든 후, 5000rpm에서 20분간 원심분리했다. 아래의 어두운 갈색 층이Bacillus thuringiensis증진제를 함유했다.
상기로부터의 갈색층을 크기 배재 크로마토그래피로 2 단계로 더 정제했다. 먼저, P-2 수지(BioRad) 130g을 milliQ 탈이온수로 팽창시켜 칼럼 2.5mm×80cm를 충전했다. 갈색층을 로터리 증발기를 사용하여 대략 4×로 농축하고, 농축물 15ml를 P2 칼럼에 두었다. 칼럼을 중력하에 MQ 물로 용출하고, 10 분 마다 부분을 12시간 동안 수집했다(280nm에서 UV 검출, 흡광 범위 2.0, 10mV). 부분 26 내지 28에 대한 더 이상의 정제를 로터리 증발기를 사용하여 부분을 3×로 농축함으로써 수행하고, 그것들을 원래의 P2 칼럼에 사용했다. 칼럼을 MQ 물로 용출했다. 10분 마다 부분을 최초 80분간 수집하고, 다음에 2분 마다 부분을 다음 2시간 동안 수집했다.Bacillus thuringiensis증진제 활성은 부분 16 내지 20에서 용출되었다(220nm에서 UV 검출, 흡광 범위 2.0, 10mV)
실시예 9
쯔위터마이신 A와는 상이한 증진제의 화학적 특징
본 발명의 증진제는 모세관 전기영동에 대해 쯔위터마이신 A와는 상이한 것으로 알려졌다. B-30087 전체 육즙을 대두 분말, 덱스트로스, 효모 추출물, KH2PO4, NaCl 및 MgSO4×7H2O를 함유하는Bacillus배양 배지에서 성장시켰다. 줄을 그은 배양물이 250ml 쉐이크 플라스크에서 접종에 사용되었다. 플라스크를 4일 동안 30℃에서 210rpm에서 흔들었다.Bacillus thuringiensisB-30087 전체 육즙을 정제된 쯔위터마이신 A를 사용하여 스파이크하고, 모세관 전기영동(CE)를 수행했다. B-30087 전체 육즙 30㎕를 쯔위터마이신 A 10㎕으로 스파이크했다. B-30087 전체 육즙(도 3a), 쯔워터마이신 A가 더해진 B-30087 전체 육즙(도 3b), 및 쯔위터마이신 A 단독(도 3c)을 pH 5.8의 인산나트륨 완충액을 사용하여 CE를 수행했다. CE의 일렉트로페로그램을 도 4에 나타낸다.
쯔위터마이신 A 및 B-30087 반정제 증진제에 대한1H NMR 스펙트럼을 400MHz에서 D2O 중에서 기록했다. 스펙트럼은 증진제가 쯔위터마이신 A와 상이하다는 것을 나타낸다.
실시예 10
Bacillus thuringiensis 를 사용한 살충성 증진의 측정
B. thuringiensis증진을 사탕무 멸강충(Spodoptera exigua) 상승 분석 시험에 의해,B. pumilusNRRL 기탁 번호 B-30087의 전체 육즙을 사용하여 증명했다. 분석을 96-웰 마이크로플레이트에서 수행했다. 각 웰은 고형 아가 기질을 함유했다. B-30087 전체 육즙 20㎕를 생물학적 분석으로B. thuringiensisJavelin(0.25내지 1.50㎍/웰)의 상업적 제조물을 사용하여 시험했다. Javelin 농도의 연속적인 희석을 또한 수행했다.
살충 활성을 분석하기 위해, 아가 기질을 Marrone et al.,(1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293에 따라 마이크로플레이트의 웰에서 제조했다. 탈이온수를 음성 대조군으로 사용했다. 시험 샘플 또는 대조군의 2개 복제를 각 분석에 대해 사용했다. 다음에, 플레이트를 대략 2-3시간 동안 퓸후드에 두어써 건조했다.
1 내지 3개의Spodoptera exigua일차 영 애벌레를 각 웰에 가했다. 마이크로플레이트를 Mylar과 같은 기밀 물질로 밀봉하고, 각 웰을 핀 프레스로 환기시켰다. 플레이트를 7일까지 27℃에서 인큐베이션했다.
인큐베이션 후, 웰을 신생아 사망률 또는 유충 발생의 정도에 따라 점수매겼다. 죽은 유충의 수를 기록했다. 왜소한 유충을 1 내지 4로 평가하여 점수매겼다. 왜소 점수는 다음과 같다. 4=대조군 크기; 3=대조군 크기의 75%; 2=대조군 크기의 50%; 1=대조군 크기의 25%. 결과를 아래 표9에 요약한다.
샘플 죽은 수/총 왜소 점수
0.25㎍Javelin 1/8 4
0.50㎍Javelin 0/8 4
0.75㎍Javelin 1/8 2
1.0㎍Javelin 1/8 2
1.50㎍Javelin 1/8 2
B-30087+0.25㎍Javelin 3/8 2
B-30087+0.50㎍Javelin 0/8 3
B-30087+1.0㎍Javelin 7/8 2
B-30087+1.50㎍Javelin 8/8 1
B-30087만 0/8 4
물검사 0/8 4
2차 시험을 상기 과정을 사용하여 수행했다. 결과를 아래 표 10에 요약한다.
샘플 죽은 수/총 왜소 점수
0.0625㎍Javelin 0/8 4
0.125㎍Javelin 0/8 4
0.187㎍Javelin 0/8 4
0.250㎍Javelin 0/8 3
0.375㎍Javelin 1/8 2
B-30087+0.0625㎍Javelin 1/8 3
B-30087+0.125㎍Javelin 2/8 3
B-30087+0.187㎍Javelin 5/8 2
B-30087+0.250㎍Javelin 8/8 1
B-30087+0.375㎍Javelin 8/8 1
B-30087만 0/8 4
물검사 0/8 4
반정제 부분의 살충 증진성을 측정하기 위해, 샘플을 0.1㎍/웰 Javelin 및 40㎕/웰의 시험된 부분을 사용하여 상기와 같이 시험했다. 결과를 아래 표 11에 나타낸다.
샘픔 죽은 수/총 왜소점수
부분 10 0/9 2
부분 16 16/16 1
부분 18 17/17 1
부분 20 14/14 1
부부 25 1/10 2
부분 30 3/11 2
부분 35 1/12 3
Javelin, 0.1㎍/웰 0/8 3
물검사 0/14 4
실시예 11
살지균제로서 함께 사용된 B. pumilus (B-30087) 및 B. subtilis (B-21661)
B. pumilusNRRL B-30087의 균주를B. subtilisNRRL B-21661과 함께 시험하여, 살진균성 효과가 각 균주를 단독으로 사용한 경우 보다 함께 사용한 경우 더 커지는지 여부를 측정했다. 각 균주를 대두 분말-기제 배지중에서 대략 50시간 동안 10L 또는 5,000L 발효기에서 성장시켰다. 각 균주를 후추의Botrytis cinerea회색 곰팡이, 및 Brassica의Peronospora parasitica노병균에 대해 전체 육즙 배양물로서 시험했다. 전체 육즙을 1×, 1/2× 및 1/8×로 시험했다. 다음에, 2개 균주를 1/2×, 1/4× 및 1/8×로 서로 여러 가지로 조합하여 시험했다. 물 검사(대조군) 및 화학적 살진균제(20ppm으로 BREAK)를 또한 비교로서 시험했다. 식물을 0 내지 5의 스케일에 기초하여 점수매겼다(여기에서 5는 100% 질병, 방제 없음; 그리고 0은 100% 방제, 질병 없음). 결과를 아래 표 12에 나타낸다.
Botrytis cinerea 평균질병비율(4식물) Peronospora parasitica 평균질병비율(4식물)
B-21661 1X 0.3 시험하지 않음
1/2X 0.3 0.5
1/4X 1.2 1.0
1/8X 1.7 2.0
B-30087 1X 1.7 시험하지 않음
1/2X 2.3 1.3
1/4X 시험하지 않음 3.7
1/8X 시험하지 않음 4.3
B-21661 1/4X 및 B-30087 1/2X 0.7 1.0
B-21661 1/8X 및 B-30087 1/2X 1.4 0.3
B-21661 1/4X 및 B-30087 1/4X N/A 0.5
B-21661 1/2X 및 B-30087 1/2X N/A 0.3
B-21661 1/2X 및 B-30087 1/4X N/A 0.3
B-21661 1/2X 및 B-30087 1/8X N/A 0.5
20ppm에서 BREAK 0.2 시험하지 않음
물검사 4.6 5.0
Botrytis cinerea시험 결과는 그것들이 단독으로 사용된 때와 비교하여, 균주가 조합하여 사용된 때 통계적인 차이를 나타낸다. 예를 들어, B-21661 1/4×와 B-30087 1/2×에 대한 점수 0.7은 B-21661이 단독으로 사용된 경우의 점수 1.2 와 통계적으로 차이가 있다. 또한, B-21661 1/8×와 B-30087 1/2×에 대한 점수 1.4은B-21661 1/8× 단독 또는 B-30087 1/2× 단독에 대한 1.7 와 통계적으로 차이가 있고, 점수는 모두 단독으로 사용된 각 균주에 대한 예상 평균 보다 더 낮다. 이것은 살진균제로서의 효능을 증가시키기 위해 균주를 함께 사용하는데 대한 상승 효과를 나타낸다.
Peronospora parasitica시험 결과는 B-21661 1/2×와 B-30087 1/2×의 조합에 대한 점수가 첨가 효과로부터 예상될 수 있는 것 보다 더 좋았음을 나타낸다. 점수 2.05가 균주의 조합으로부터의 첨가 효과만이 있는 경우에 예상될 수 있다. 그러나, 실제 점수는 0.3이었고, 이것은 조합된 균주를 사용함에 의한 명확한 상승 효과를 나타낸다. 또한, 다른 점수들도 예상된 결과 보다 더 좋다. 예를 들어, B-21661 1/4×와 B-30087 1/4×는 점수 0.5를 가지며, 이것은 개개의 균주의 첨가 효과(2.35로 추정됨)만으로부터 예상될 수 있는 것 보다 훨씬 더 좋다. 이런 동일한 상승효과는 또한 B-21661 1/2×와 B-30087 1/2×(점수 0.3), B-21661 1/2×와 B-30087 1/4×(점수 0.3), 및 B-21661 1/2×와 B-30087 1/8×(점수 0.5)의 조합에서도 나타난다. 이들 시험은 조합하여 균주가 사용될 때 예측치 못한 결과인 상승 효과가 있다는 것을 증명한다.
본 발명이 상기 구체예들과 연계하여 설명되지만, 전술한 설명 및 실시예들은 예시로서 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하지 않음이 이해될 것이다. 본 발명의 범위내에 있는 다른 양태, 이점 및 변형이 본 발명이 속하는 분야의 당업자들에게 명백할 것이다.

Claims (78)

  1. 살진균 활성을 갖는, NRRL 번호 B-30087로 표시된Bacillus pumilus균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 생물학적으로 순수한 배양물.
  2. NRRL 번호 B-30087로 표시된Bacillus pumilus균주의 생물학적으로 순수한 배양물.
  3. 제 1 항의 생물학적으로 순수한 배양물 및 담체를 포함하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 살진균 활성을 갖는, NRRL 기탁 번호 B-30087로 표시된Bacillus pumilus균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 생물학적으로 순수한 배양물로부터 분리된, 분리된 대사물질.
  6. 살진균 활성을 갖는, NRRL 기탁 번호 B-30087로 표시된Bacillus pumilus균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 생물학적으로 순수한 배양물로부터 분리된 상청액.
  7. 제 6 항의 상청액으로부터 분리된 부분 정제된 부분.
  8. 제 5 항의 대사물질 및 담체를 포함하는 조성물.
  9. 제 6 항의 상청액 및 담체를 포함하는 조성물.
  10. 제 7 항의 부분적으로 정제된 부분 및 담체를 포함하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항의 대사물질의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  15. 제 6 항의 상청액의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  16. 제 7 항의 부분적으로 정제된 부분의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  17. 제 8 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  18. 제 9 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  19. 제 10 항의 조성물을 유효량으로 사용하는 것을 포함하는, 진균 감염으로부터 식물, 뿌리 또는 열매를 방지 또는 치료하는 방법.
  20. 제 11 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  21. 제 12 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  22. 제 13 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 진균 감염이Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator;및Uromyces phaseoli로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 진균 감염이Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator;및Uromyces phaseoli로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 진균 감염이Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator;및Uromyces phaseoli로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 20 항에 있어서, 진균 감염이Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator;및Uromyces phaseoli로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 진균 감염이Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator;및Uromyces phaseoli로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 미생물에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 7 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 8 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 14 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제의 유효량을 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제의 유효량을 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 17 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제의 유효량을 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. NRRL 기탁 번호 B-30087의 생물학적으로 순수한 배양물을 성장시키는 단계, 및 상청액으로부터 항진균성 대사물질을 분리하는 단계를 포함하는 항진균성 상청액의 제조 방법.
  35. 상청액을 분별하는 단계, 및 항진균성 부분을 확인하기 위해 부분에 대한 생물학적 분석을 수행하는 단계를 포함하는 제 34 항의 상청액의 부분 정제 방법.
  36. 제 34 항의 방법에 의해 제조된 상청액.
  37. 제 7 항에 있어서, 부분이 식물 병원성 진균에 대한 활성을 나타내고, 수성 부분에서 발견되고, 열에 약간 불안정하고, 산/염기 및 프로테아제에 안정하고, 양으로 하전되고, 그리고 10,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 부분 정제된 부분.
  38. 제 5 항에 있어서, 대사물질이 식물 병원성 진균에 대한 활성을 나타내고, 수성 부분에서 발견되고, 열에 약간 불안정하고, 산/염기 및 프로테아제에 안정하고, 양으로 하전되고, 그리고 10,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 대사물질.
  39. Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 수용성 화합물로서, 화합물의 분자량이 10,000 달톤 미만이고, 이 화합물이 쯔위터마이신 A가 아닌 수용성 화합물.
  40. 제 39 항에 있어서,Bacillus thuringiensis를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  41. 제 39 항의 화합물 및 담체를 포함하는 조성물.
  42. 제 40 항의 화합물 및 담체를 포함하는 조성물.
  43. 제 40 항에 있어서,Bacillus thuringiensis가 미생물 균주, 상업적 제품,조작된 식물 또는 델타 내독소의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. Bacillus thuringiensis의 살충 활성을 증진시키고, 쯔위터마이신 A 또는 β-외독소가 아닌Bacillus의 전체 육즙 배양물의 부분 정제된 부분.
  47. 제 46 항에 있어서,Bacillus가Bacillus pumilus인 것을 특징으로 하는 부분 정제된 부분.
  48. 제 47 항에 있어서,Bacillus pumilus가 NRRL 기탁 번호 NRRL B-30087 하에 기탁된Bacillus pumilus인 것을 특징으로 하는 부분 정제된 부분.
  49. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항의 부분 및 담체를 포함하는 조성물.
  50. 제 46 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,Bacillus thuringiensis를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부분.
  51. 제 50 항에 있어서,Bacillus thuringiensis가 미생물 균주, 상업적 제품, 조작된 식물 또는 델타 내독소의 형태인 것을 특징으로 하는 부분.
  52. 제 49 항의 조성물 및Bacillus thuringiensis를 포함하는 조성물.
  53. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부분.
  54. 제 49 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제 52 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및 미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 53 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 수성 현탁액, 유화성 농축물 및미세캡슐 제조물로 구성되는 군으로부터 선택된 제조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 39 항의 화합물의 유효량 및Bacillus thuringiensis의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는,Bacillu thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 방법.
  58. 제 46 항의 부분의 유효량 및Bacillus thuringiensis의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는,Bacillu thuringiensis의 살충 활성을 증진시키는 방법.
  59. 제 40 항의 화합물의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는 식물 또는 뿌리를 곤충 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  60. 제 44 항의 조성물의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는 식물 또는 뿌리를 곤충 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  61. 제 50 항의 부분의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는 식물 또는 뿌리를 곤충 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  62. 제 52 항의 조성물의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는 식물 또는 뿌리를 곤충 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  63. 제 53 항의 부분의 유효량을 식물 또는 뿌리에 사용하는 단계를 포함하는 식물 또는 뿌리를 곤충 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  64. 제 51 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. a) NRRL 기탁 번호 B-30087로 표시된Bacillus pumilus균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 전체 육즙 배양물; 및
    b) NRRL 기탁 번호 B-21661로 표시된Bacillus subtilis균주의 모든 확인된 특징을 갖는 균주, 또는 그것의 돌연변이의 전체 육즙 배양물
    을 포함하고, 상기 균주들이 상승적 항진균 활성을 갖는 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서, 살진균 활성이Botrytis cinerea및Peronospora parasitica에 대한 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 제 66 항에 있어서, 균주가 NRRL 기탁 번호 B-21661 및 B-30087에 대해 1:2의 비로 조합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제 66 항에 있어서, 균주가 NRRL 기탁 번호 B-21661 및 B-30087에 대해 1:4의 비로 조합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제 66 항에 있어서, 균주가Botrytis cinerea또는Peronospora parasitica에 대하여, NRRL 기탁 번호 B-21661 및 B-30087에 대해 1:2의 비로 조합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 제 66 항에 있어서, 균주가Botrytis cinerea또는Peronospora parasitica에 대하여, NRRL 기탁 번호 B-21661 및 B-30087에 대해 1:4의 비로 조합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  72. 제 66 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  73. 제 67 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  74. 제 68 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  75. 제 69 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  76. 제 70 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  77. 제 71 항의 조성물의 유효량을 사용하는 단계를 포함하는 식물, 뿌리 또는 열매를 진균 감염으로부터 방지 또는 치료하는 방법.
  78. 제 66 항의 배양물로부터 분리된 상청액.
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