TWI280976B - A novel strain of bacillus for controlling plant diseases and uses thereof - Google Patents

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!28〇976 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7____ 五、發明說明（4 ) 括微球菌素P，pumilin及tetain。
Kawaguchi et al.在 U.S· Pat· No· 4,250，170 自芽孢样菌中 分離出一種新穎的水溶性抗生素，可拮抗大範圍革蘭氏陽 性及陰性細菌。Stabb et al. (1990) Applied Environ， Microbiol. 60 : 4404-4412已鑑定出某些芽孢桿菌（芽孢桿菌 屬包括枯草桿菌，蠟狀芽孢样菌，蕈狀芽孢桿菌，蘇雲金 芽孢桿菌），可呈現抗眞菌活性。這些菌株已示出可產生 Zwittermicin A(兩性霉素A)及/或Kanosamine (卡諾司胺）。 見，Milner et al，Appl· Environ· Microb· 62 : 3061-3066 (1996)。這些是抗生素作用物，可有效拮抗由植物性病原 體，如 Phytopathora medicaginis， P. nicotianae， Ρ· aphanidermatum或Sclerotinia minor所造成腐敗引起的源自 土壤之疾病（見，Stabb，et al ·上文）。Zwittermicin-A (兩性 霉素A)是一種水溶性，酸穩定性線型胺基多元醇分子。 見，He et al· (1994) Tetrahedron Lett. 35(16) : 2499·2502。 其在拮抗許多眞菌及細菌性植物病原體上具廣效活性。 Kanosamine(卡諾司胺）（Milner et al_，1996)也可抑制廣效 的眞菌植物病原體及一些細菌菌株。
Handelsman et al·，於美國專利案ν〇· 5,049,379中描述，可 產製Zwittermicin A(兩性霉素A)之蠟狀芽孢桿菌，可控制 紫花苜蓿及大豆之腐敗。當種子以蠟狀芽孢桿菌ATCC 53522塗佈時，則根腐敗性眞菌之致病活性可被抑制。類似 的，將某些蠟狀芽孢桿菌株以孢子爲基礎之調和物應用至 大豆種子或其四週之土壤中時，已示出可改善大豆在田野 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 _______B7_ _ 五、發明說明（6 ) 样菌萃取物中之活性，僅在pH値低於5.6時才發生。Leifen et al· (I"8)，u.S· Pat. No. 5夕8〇,〇8〇揭示甘藍菜可以枯草 桿菌，短小芽孢桿菌及多黏芽孢桿菌株處理，以抑制芸苔 鏈格孢及灰葡萄孢。
Loeffler et al. (1986) J. Phytopathology 115 : 204-213，揭 示枯草桿菌，短小芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，及凝結芽孢 桿食可產生各種具抗眞菌活性及抗菌活性之抗生素。短小 茅孢桿菌可產生芽孢桿菌溶素及iturin A。芽孢桿菌溶素是 分子量270之極小化合物，僅可抑制酵母。iturins，可溶於 極性溶劑中，具廣效的抗眞菌及抗菌活性。 於U.S. Pat. No. 5,344,647，Rossall揭示具廣效抗眞菌活 性之枯草样菌菌株。另外，U.S· Pat. No. 5,061，495 (Rossall)，提出一種由枯草桿菌來的63,500道爾呑之新穎 的抗生素，在p Η値低於5時可沉澱，且具有拮抗革蘭瓦陽 性菌及眞菌之活性（鏈格孢及白粉菌）。Sholberg et al· (1995) Can. J. Microbiol. 41 : 247-252，Swinburne et al. (1975) Trans· Brit. Mycol. Soc. 65 : 211-217，Singh and Deverall， (1984) Trans. Br. Mycol· Soc· 83 : 487-490，Ferreira et al· (1991) Phytopathology 81 ： 283-287 及 Baker et al. (1983) Phytopathology 73 : 1148-1152。均揭示芽孢桿菌屬及枯草 桿菌可充作眞菌植物病原體之生物性控制劑。Pusey et al. (1988) Plant Dis. 72 ： 622-626 9 Pusey et al.? U.S. Pat. No. 5,047,239，及Mckeen et al. (1986) Phytopathology 76 : 136-139揭示利用枯草桿菌來控制收穫後水果之腐敗。Mckeen -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I Ji I. —--------------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 ___B7_ 五、發明說明（8 ) 物。Gokte and Swarup (1988) Indian J. Nematol. 18(2): 3 13-3 18，報告指出短小芽孢桿菌係可制線蟲的，但其並未 報告有任何的抗眞菌活性。Slabospitskaya et al. (1992) Mikrobiol Zh (Kiev) 54(6) : 16-22，比較許多不同的芽孢桿 菌，包括短小芽抱桿菌產生幾丁酶之能力，但其報告彼對 植物性病原體並無活性。短小芽孢桿菌可產生最少的幾丁 酶水平。Mclnroy et al· (1995) Plant and Soil 173(2) : 337-342，對許多細菌進行檢視，包括許多芽孢样菌及短小芽 孢桿菌，其爲植物莖及根之内生植物。然而，其並無證據 顯示這些内生植物具抗眞菌性。Chernin et al· (1995) Molecular Genetics，發現短小芽孢样菌，對細菌（如黃單胞 菌，假單胞菌，歐文氏菌）及可引起植物疾病之眞菌有廣效 活性。Fey et al· (1991) Akad Landwirts Kart，報告短小芽 孢桿菌，可提供馬鈐薯種籽某些拮抗立枯絲核菌之保護作 用0 本發明揭示 本發明提出新穎的可產製抗生素的芽孢桿菌，其僅在某 些特定的植物病原體上呈現抗眞菌活性，但無抗菌活性。 也提出治療或保護植物，水果及根部免於眞菌感染之方 法，此方法包括施加有效劑量之產製抗生素之芽孢桿菌。 可產製抗生素之芽孢桿菌可以在完全肉汁培養液中之懸浮 液型式提供，或呈部份純化之含抗生素上清液型式，得自 可產製抗生素之芽孢桿菌完全肉汁培養物。本發明也提出 新穎的水溶性抗生素，其呈現特異的抗眞菌活性，且無抗 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L— 訂--------- 1280976 A7 五、發明說明（ 菌活性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發月也提出新穎的化合物，其可加強蘇雲金芽孢桿菌 的殺蟲活性。化合物分離自短小芽孢样菌之完全肉汁培養 物或上清液，其當與蘇雲金芽孢样菌組合時，可加強殺蟲 活[生本發明也包括以芽孢桿菌之細菌懸液，或含代謝物 之芽孢桿菌培養物上清液，或經純化的代謝物，治療植物 以控制植物舄昆蟲侵襲之方法。 本發明進一步提出混合菌株B3〇〇87及Β·2ΐ66ι (aq7i3) 以充作殺眞菌劑，其中菌株之組合應用提供之效率大於任 一者單獨使用時。 附圖説明 圖1是芽孢桿菌邵份純化之殺眞菌部份之NMR光譜，記 錄條件爲400 MHz於D2〇，此菌貯於NRRL，編號B-30087 。 圖2示出Zwittermicin A(兩性霉素A)在400 MHz於D20下 記錄之1 H NMR光譜。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖3 Α至3 C爲自芽孢桿菌中所分離之上清液之毛細電泳 圖，如實例9所述。電泳條件：未塗佈之5 6公分毛細管應 用於40(：，301^，正極，1〇〇/^八加有卩1^.8磷酸鈉緩衝 溶液，UV偵測於200亳微米下。圖3 A是短小芽孢桿菌B-30087完全肉汁之毛細管電泳圖。圖3 B是短小芽孢桿菌B -30087完全肉汁，加上Zwittermicin A(兩性霉素A)標準品 之毛細管電泳圖。Zwittermicin A(兩性霉素A)峰在約3.25 分鐘之流程時間左右示出；在肉汁中並無任何峰被共同溶 12- 本紙張尺度適用中國國家標準（cNS)A4規格（210 x 297公釐） l28〇976
五、發明說明（ 微米下有一個峰肩。此抗生素並非兩性霉素A。 本發明進一步方面包括短小芽孢捍菌之完全肉汁培養物 上清液，其當與蘇雲金芽孢桿菌混合時，可加強彼之制昆 蟲活性。本發明也包括處理植物以控制植物 之侵犯，方法中利用芽抱样菌之細菌懸液或其== 之上清液或經純化的代謝物。 本發明進一步方面是意外的協同作用，此中利用短小芽 孢桿菌（NRRL B-30087)混合以枯草捍菌（NRRL Β·21661)爲 殺眞菌劑。本發明包括應用彼爲殺眞菌劑之組成物及方 如本説明書及申請專利範圍中所使用的，單數型式的冠 詞（a，an及the)除非先前已述，包括複數在内。例如”一個 細胞”包括細胞群，包括其混合物。 如此中所用的，，包括”用以表示包括有所示要件之組成物 及方法，但不排除其他。”基本上含有·.，，當用來定義組成 物及方法時’並表示排除任何與其組合基本上有意義之其 他要件。因此’組成物基本上含有如此中定義之要件，不 應排除由分離及純化方法來的痕量接雜物，及藥物上可接 受之载劑，如磷酸鹽緩衝之食鹽水，保藏劑等。”含有，，應 表示排除的超過其他組份之痕量要件，及投予本發明組成 物之實質方法步驟。由這些轉變術語各自所定義之具體實 例係在本發明範圍之内的。 所謂”經分離的”在此可與”生物學上純的”互換應用，五 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
A7 __ B7____ 五、發明說明（12 ) 表示分離自組成，細胞及其他，其中菌株或代謝物是本質 上相連結的。 如此中所用的”生物學控制，，定義爲經由第二種有機體之 使用以控制病原體或昆蟲。生物學控制之已知機制包括腸 内菌經由與眞菌競爭在根部表面上之空間而可控制根部之 腐敗。細菌性毒素，如抗生素，已被用來控制病原體。毒 素可予以分離並直接應用至植物，或細菌可予以投予如此 可在原位產生毒素。 所謂”眞菌”包括各種有核且有孢子之有機體，其中缺少 葉綠素。眞菌之實例包括酵母，霉菌，霉，銹菌及蕈。 所謂”細菌，，包括任何的原核有機體，其並無明顯的核。 奴眞菌的”表示物質增加眞菌死亡率或抑制其生長速率 之能力。 ’’抗生素”包括可殺死或抑制微生物之物質。抗生素可由 微生物所產生，或以合成方法或半合成方法產生。因此， 此術語包括可抑制或殺死眞菌之物質，如兩性霉素A或康 諾司胺。 ’ ”抗眞菌”包括可殺死或抑制眞菌生長之任何物質。 所明”培養”指在各種培養基上或之中有機體之繁殖。 ”完全肉汁培養物”指含有細胞及培養基之液體培養物。 ，，上清液”指當細胞生長在肉汁中，再以離心，過濾，沉 積或技藝中已知之其他方法移去時留下之液體肉汁。 如此中所用的，所謂"昆蟲"包括在昆蟲綱;;的所有有機 體。"未成年"昆蟲指到成蟲階段前任何型式之有機體，包 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 131280976 五、發明說明（ 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 “I: 殺蟲的”指物質可增加昆蟲死亡率 s Pi生長速率（能力。”殺線蟲的”指物質増 ^ π率或抑制其生長速率之能力。 凃蟲死 蟲，線蟲及蜗死亡率或抑制生長速曰物處増加昆 ""正面控制"表示已知具殺害蟲活性之化合物。” "包括商品化化學殺蟲劑，但不限於此。"負面控制:1 知無殺害蟲活性之化合物。實例如水或乙酸乙酉旨。不 所謂，，溶劑"包括可將另—物質維持在溶液中之任何 體。”溶劑可萃取的"指溶於溶劑中之任何化合物，立其 再自溶劑中分離。落劑之實例包括有機溶劑，如乙酸 酯，但亦不限於此。 所謂"代謝物”指具殺害蟲活性之任何化合物，物質或微 生物發酵之副產物。如上定義之抗生素是可特異地拮抗微 生物之代謝物。 "组成物"表示活性作用物及其他化合物或組成，惰性 (如可偵測之作用物或標幟）或活性的，如佐劑之組合。 "部份"用以表示分級分離分析中的一份，用來分離上 液中之分子，應用大小，極性或電荷來分離。 ”部份純化之部份"是收集於分級分離分析中的一部份 其在生物分析中可抑制發芽或加強Β +活性以拮抗菌環。 "有效劑量”指足以達成有益的或欲求結果之劑量。有 劑量可應用在一處以上。在治療及保護之説法中，”有效 量”爲足以舒緩，穩定，反轉，減缓或延遲昆蟲侵入過程 劑量。 已 液 可 乙 的 清 效 .劑 之 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（21〇 X 297公爱） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 __B7_ 14 五、發明說明（） 吾等描述一種生物學上純的菌株培養物，其具有芽抱桿 菌新穎的可產生抗生素菌株的所有已鑑知特性，其貯置於 NRRL編號No. B-30087，及其突變株，且其僅在特異的植 物病原體上才有抗眞菌活性，且無抗菌活性。在一方面， 此菌株是短小芽孢桿菌，貯於NRRL No. B-30087，及此菌 株之突變株。 在另一方面，本菌株是NRRL No. B-30087之突變株或變 型，具有NRRL No. B-30087菌株所有鑑知之特性（如下文所 提供的）。在本揭示全文中，突變株或變型可互換使用，且 進一步可鑑知爲具有的基因體可在高迫切條件下與NRRL No. B-30087之基因體雜交。”雜交”係指一種反應，其中一 個以上的聚核苷酸可反應形成複合物，其經由核苷酸殘基 鹼基間之氫鍵結而穩定。氫鏈結之發生可經由華森-克里克 驗基配對，Hoogstein鍵結，或其他任何的序列·特異的方 式。複合物含有二股，可形成複式結構，三股以上可形成 多股之複合物，單一的自我·雜交股，或這些的任何組合。 雜交反應可在不同”迫切度’’條件下進行。一般而言，低迫 切度雜交反應進行的溫度是約4 0 °C，於10 X SSC中，或相 同離子強度/溫度之溶液中。中度迫切度雜交進行的溫度爲 約5 0 °C，在6 X SSC中，而高迫切度雜交反應在約6 0 °C， 1 X SSC 中。 NRRL編號No· B-30087之突變株或變型也可鑑知爲其基 因體序列與NRRL No. B-30087基因體序列之同質性大於 85%，較好大於90%或更好大於95 %之菌株。聚核甞酸或 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--------- 1280976 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 15 五、發明說明（） 聚核區域（或多肽或多肽區域）與另一序列具有某些百分率 (如8 0%，85%，90%或95%)之”序列同質性”，表示當排 成列時，鹼基（或胺基酸）之百分率是二序列比較時相同處 之百分率。此排成列及百分同質性或序列同質，可利用技 藝中已知之軟體程式來決定，如述於CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel et al.，eds·，（1987) Supplement 30，section 7.7.18，Table 7.7.1 較好，爲排成列時應用缺席之變數。較佳之排列程式是 BLAST，利用缺席變數。特言之，較佳之程式是BLASTN 及BLASTP，利用以下的缺席變數：基因密碼：標準的； 過濾膜=無；股=二股；截取値=60 ;預期値二10 ;基質 = BLOSUM62 ;説明=50序列；分類=HIGH SCORE ;資料 庫=並未重複；GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 轉譯+SwissProtein + SPupdate + PIR 0 這些程式之詳情可見 以下網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST 〇 本發明進一步提出由上示培養物所得之上清液。上清液 以技藝中熟知之方法獲得，包括：離心，過滤，沉積， 等0 在另一方面，本發明包括經分離之代謝物，其是一種水 溶性抗眞菌性抗生素。代謝物分離自本發明及上述之菌 株。其化學特性爲少於10 000道爾呑，在280毫微米有U V 吸收峰，在230毫微米有峰肩，酸及鹼穩定，8〇°C上略熱 不穩定’且呈正電荷對特殊植物病原體有活性，但對細菌 無活性。本發明進一步提出產製此代謝物之方法，方法包 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L*f 訂--------- 1280976 A7 B7 五、發明說明（ 括培養此菌株，再利用下述方法分離活性代謝物。 、本發明進-步方面是有關NRRL N。B_3嶋7之部份純化 之活性礼，其具有殺眞菌活性。此活性部份和兩性霉素 A不同。 、 由本發明進一步提出的組成物，含有上述菌株（包括突變 株或其變型），上清液，部份及代謝物中任一者，單獨的或 互相組合，並加上載劑。這些組成物經由加入至少一種化 學或生物性殺蟲劑而進一步補充。這些組成物可呈各種調 和物型式，其中包括可沾濕的散劑，顆粒劑調和物，水性 懸浮液，可乳化之濃縮物或微包膠劑，但不限於此。 爲了達到本發明組成物良好之分散及黏附，可有益地調 和元全的肉汁培養物，上清液，部份及/或代謝物及/或抗 生素與有助於分散及黏附之組份。因此，適合的調和物爲 精藝者已知的（可沾濕之散劑，顆粒劑等，或可微包膠在適 合的介質中，液劑如水性可流動劑及水性懸浮劑，及可乳 化之農縮物）。其他適合的調和物爲精藝者熟知的。 上述的菌株，代謝物，部份，上清液任一者及含有這些 活性組份之組成物，可用來提供治療或保護植物，根部或 水果免於眞菌感染之方法。方法包括施加有效劑量之菌 株，代謝物’部份，上清液或含這些活性組份之組成物， 單獨的或組合以其他及/或互相之生物性或化學性殺蟲劑， 施加至受感染的根部，植物或水果。這些組成物之有效劑 量也可施加至植物，根部或水果，以預防此侵襲。 在進一步方面’本發明包括治療或保護植物，根部或水 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂--------- I. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 !28〇976 A7 B7 五、 發明說明（ 果使免於眞菌疾病之方法，此方法包括施加有效劑量之抗 生素’其係由具有新穎芽孢桿菌NRRL No· B-30087所有鐘 知特性之菌株或其變型所產生的。在一個具體實例中，菌 株是芽孢桿菌NRRL No. B-30087。 本發明進一步提出可加強蘇雲金芽孢样菌殺蟲活性之水 溶性化合物，其中化合物分子量少於10,000道爾吞，且化 合物非兩性霉素A。化合物非々外毒素或其他蘇雲金芽孢 桿菌所產生之外毒素。 化合物以陰離子交換樹脂，乙腈沉澱及大小排阻層析 (SEC)分離。本發明也提出含有新穎化合物之芽孢样菌上 清液部份純化部份。新穎化合物及活性部份分離自下列之 $孢桿菌包括：枯草桿菌，蠟狀芽孢桿菌，蕈狀芽孢桿 菌，及短小芽孢捍菌。 部份純化之活性部份可由其lfI NMR(或質子NMR)光譜 來鑑知，精於化學技藝人士應可決定出化合物是否被完全 、’、屯化▲化合物疋純的，代表一個質子之净可針對1之任 意數値積分。代表二個質子之峰，如亞甲基，可再對2積 分。代表3個質子之峰如甲基，再對3積分。此如圖3，以 純的兩性霉素A爲標準品。然而，具活性之部份純化的蘇 雲金芽孢桿菌加強物，其ihnmr光譜具有一群峰是對少 於1來積分，因此屬於光譜中較大峰以外之化合物。 在刀離中，化合物並未呈現殺蟲活性。蘇雲金芽孢样菌 t組合，當應用至植物及植物根部時可加強蘇雲金芽孢桿 菌之殺蟲作用。蘇雲金芽孢桿菌可呈微生物型式，商品化 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -—------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 1280976
產物，經遗傳操作之植物，制昆蟲上之活性代謝物，制昆 蟲上之活性上清液或d内毒素等型式。 蘇雲金芽孢桿菌是革蘭氏陽性之成孢子性細菌，其特徵 在於側孢晶狀蛋白質包涵體。蛋白質對害蟲具高度毒性且 毒性活性具特異性。如下文申請專利範圍中所提及的，所 謂”蘇雲金芽孢桿菌”包括微生物菌株，商品含有此菌株或 分離自菌株含有活性代謝物或部份之分離物，經遺傳修飾 或遺傳工程之植物，其可表現編碼蘇雲金芽孢桿菌制昆蟲 蛋白質之基團’或基因產物或6内毒素。毒性基因已被分 離及定序，且經重組體DNA爲基礎之蘇雲金芽孢桿菌產物 也已產生並許可使用。將這些蘇雲金芽孢样菌内毒素遞送 至農業環境的遺傳工程技術及新途徑，係在發展及商品化 產製之下。此包括使用經遺傳工程之植物，其並有可抗阻 害蟲之内毒素基因，及使用經穩定之完整微生物細胞，如 蘇雲金芽孢桿菌内毒素遞送載體（Gaertner，et al (1988) TIBTECH 6 : S4_S7)。蘇雲金芽孢桿菌可運用至標的害 蟲’係將標的害蟲曝於野生型蘇雲金芽孢桿菌，其在自然 下可表現毒素。另外，編碼欲求毒素之基因可較形入及表 現在適合的重組體宿主中。蘇雲金芽孢样菌毒素之片段， 保有蟲活性，也可使用。 以下專利申請案揭示制昆蟲之蘇雲金芽孢桿菌分離物， 或可表現蘇雲金芽孢桿菌毒素之重組體微生物：美國專利 案 Nos : 5,006,335 ; 5,106,620 ； 5,045,469 ; 5,135,867 ； 4,990,332 ; 5，164，180 ; 5,126,133 ； 5,093,119 ； -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4f 訂---------Am. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 !28〇976 A7 B7 τ 19 五、發明說明（） 5,208,017 ； 5,186,934 ； 5,185,148 ； 5,211,946 ; 4,948,734 ； 4,849,217 ； 4,996,155 ； 4,999,192 ； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4,966,765 ; 5,073,632 ； 5,196,342 ； 5,063,055 ； 5,080,897 ； 5,024,837 ； 5,147,640 ； 5,173,409 ；及 5，186,934。 蘇雲金芽孢桿菌kurstaki亞種之孢子及晶體製劑，多年來 已被應用於針對鱗翅目害蟲作爲商品化制昆蟲劑用。例 如，蘇雲金芽孢样菌kurstaki HD-1變種可產生一種晶體， 稱之爲d _内毒素，其對許多鱗翅目昆蟲之幼蟲有害。另外 的蘇雲金芽孢捍菌，即israelensis及tenebrionis已在商業上 用於控制昆蟲。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 蘇雲金芽孢桿菌晶狀蛋白質基因在大腸样菌中之選殖及 表現已述於Schnepf，H. et al· (1981) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 78 : 2893-2897 U.S. Pat· No. 4,448,885，及 U.S. Pat. No. 4,467,036，二專利案中均揭示在大腸桿菌中表現晶狀 蛋白質。融合的蘇雲金芽孢桿菌晶狀蛋白質基因已被構 築，其呈現增加之毒性且對標的害蟲有擴大的宿主範圍。 是 U.S. Pat. Nos 5，128，130 及 5,055,294。U.S. Pat. Nos 4,797,276及4,853,331揭示蘇雲金芽孢桿菌San Diego株 (a.k.a. B.t. tenebrionis，a.k.a，M-7)其可用來控制各 種環境下之鞘翅目害蟲。U.S· Pat. No. 4,918,006揭示蘇雲 金芽孢桿菌具有拮抗雙翅目之活性。U.S. Pat. No. 4,849,217揭示蘇雲金芽孢桿菌分離物具有拮抗苜蓿葉象甲 之活性。U.S. Pat· No. 5，151，363 及 U.S. Pat. No· 4,948,734 -22- $紙張尺度&用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 1280976 A7 B7 20 五 ___ . . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（） 揭示蘇雲金芽孢桿菌之某些分離物，具有拮抗線蟲之活 性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 蘇雲金芽孢桿菌培養物也可得自美國農業部（USDA)於 Brownsville，Tex.。要求者需寄達到 USDA，ARS，Cotton Insects Research Unit, P.O. Box 1033, Brownsville, Tex. 78520 USA ;或 Northern Research Laboratory，U.S. Department of Agriculture, 1815, North University Street, Peoria, 111.，USA。 因此，化合物及活性部份可加強蘇雲金芽孢样菌拮抗昆 蟲殺蟲活性，其包括下列如線蟲，蒼蠅，黏蟲，蟎，馬鈐 薯甲蟲及南瓜十二星葉甲，但亦不限於此。 如精藝者熟知的，活性化合物可以組成物型式應用。因 此，本發明也提出含有新穎化合物及載劑之組成物，如溶 劑或農業上適合的載劑。在進一步具體實例中，組成物進 一步包括如上述之有效劑量之蘇雲金芽孢样菌。又在進一 步具體實例中，組成物包括至少一種化學或生物學殺蟲 劑，如技藝中傳統所用的。爲了達到本發明中組成物良好 的分散及黏附，可有益地將全肉汁培養物，上清液及/或代 謝物調和以有助分散及黏附之組份。爲可易於施加至植物 或植物根部，調和物可處理成選自下列之調和物如可沾濕 的散劑，水性懸浮劑，可乳化之濃縮物及微包膠調和物。 新穎化合物，活性部份或含彼之組成物，可用來加強蘇 雲金芽孢桿菌之殺蟲活性。因此，本發明也提出加強蘇雲 金芽孢桿菌殺蟲活性之方法，係混合有效劑量之新穎化合 -23-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） !28〇976 A7 '^ ------B7 χ 21 Α、發明說明（） 物’活性邵份或含彼之組成物，與蘇雲金芽孢桿菌。在進 一步方面，在調和物中加入有效劑量的至少一種生物性殺 蟲劑或化學性殺蟲劑。 本發明進一步包括使用新穎化合物，NRRL No. B-30087 混合以NRRL No. B-21661，以完全肉汁培養物型式應用至 植物，根邵或水果’以充作殺眞菌劑，該殺眞菌劑因爲化 合物組合意外之協同作用有更強力之效果。較好的，組合 應用之比例爲1 : 2(B_21661 : Β·3〇〇87)應用至灰葡萄孢或 寄生霜霉。甚至較好的，組合可以i : 4比例應用至上述二 種眞菌。又在進一步具體實例中，組成物包括至少一種化 學或生物學殺蟲劑，如技藝中傳統使用的。爲了達到本發 明組成物良好的分散及黏附，可有益地調和完全肉汁培養 物，上清液及/或代謝物，與有助分散及黏附之組份。爲可 易於應用至植物或植物根部，調和物可處理成下列型式， 包括：可沾濕之散劑，水性懸浮劑，可乳化之濃縮物及微 包膠之調和物。 在本揭示内容中，各種刊物，專利及發表之專利説明書 經由確認引證而參考。這些刊物，專利及發表之專利説明 書之揭示以參考文獻方式納入本發明揭示中，可更詳盡描 述本發明所涉入之技藝。 實例 以下實例用以説明而非限制本發明。 實例1 NRRL編號No· B-30087菌株之鑑定 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------IT--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 B7 22 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NRRL編號No. B-30087之鑑定基礎在於完整細胞的月旨肪 酸，衍生化成甲基酯-FAMEs(Miller，L. T. (1982) ’’Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole cell wall fatty acid methyl esters, including hydroxy acids" J. Clin. Microbiol. 16 : 584-586)並利用MIDI系統行氣相層析 分析（Microbial Identification System，Inc.，Newark, DE)。 用於培養細菌培養物之步驟及策略及儀器説明，述於 MIDI (細菌之鑑定利用細胞脂肪酸行氣相層析。Technical Note#101. MIDI, Inc., 115 Barksdale Professional Center, Newark，DE)。分離物生長在TSA (BBL)盤中，28°C下歷 2 4小時，再回收細胞。加入1毫升甲醇NaOH (15% [wt/vol ] NaOH於5 0%[ vol/vol]甲醇），細胞在100 °C下皂化3 0分 鐘。脂肪酸之酯化以2毫升的3·25NHCl於46%(vol/vol)甲 醇來進行，80 °C下歷10分鐘。FAMES萃取至1.25毫升的 1 ·· 1 (vol/vol)曱基·第三丁酯己烷，且有機萃取物以3毫 升的1.2% (wt/vol)NaOH洗滌，再行氣相層析分析。氣相 層析儀（Hewlett-Packard 5890A)裝置以火焰離子化偵測 器，及毛細管柱（Hewlett-Packard 19091B-102，交叉聯結的 5 %苯基·甲基聚矽氧；25米X 0.22毫米ID ;膜厚度0.33 11m ; 150之相比例）以氫爲載劑氣體。Hewlett-Packard 一 3392積分儀可自動積分FAME峰，且細菌分離物利用MIDI Microbial Identification 軟體命名（Sherlock TSBA Library version 3.80)。以黃單胞菌 xanthomonas maltophila ATCC I3637之FAME概況爲參考，以檢查MIDI決定値。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 128〇976 A7
五、發明說明（23 ) midi概圖三次不同的流程結果，可鑑知NRRL N〇. B_ 30087是一種短小芽孢桿菌，有〇 875之相似性指數分數。 實例2 试管内培養物中，NRRL No· B-30087拮抗植物病原體之活 性（環帶分析） 爲了決定NRRL No· B-30087是否可有效地拮抗各種植物 致病性眞菌’故利用這些植物病原體進行以下實驗：灰葡 萄孢，菜豆鏈格孢，刺盤孢，嗜果枝孢，仁果叢梗孢，蘋 果黑星菌，立枯絲核菌，核盤菌，光鐮孢，畸形外囊菌， 及大麗化輪枝抱。 爲決定NRRL No· B-30087在瓊脂擴散（環帶）分析中之活 性，植物病原體孢子（孢子自巴氏皿表面刮取，再稀釋至約 1X105孢子/毫升（依病原體而定））塗佈在馬鈐薯右旋糖瓊 脂表面，於1 0公分巴氏皿中。於立枯絲核菌及核盤菌，以 菌絲體片段取代孢子塗佈盤中。環狀孔洞，約7 〇亳米自壤 脂中移去，再將125升之NRRL No· B-30087培養在大豆， 酵母浸膏培養基中之上清液，於25〇毫升震盪燒瓶中72小 時，置孔洞内。 上清液之分離利用12,000 rpm離心1 0分鐘。典型的纟士果 包括孔洞四週有病原體未生長及/或生長減少之環帶，或根 本無環帶。此環帶大小按毫米計，在若出現環帶時記錄。 結果示於下表1中。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)
1280976 A7 B7 24 五、發明說明（） 表1 NRRL登記No· B-30087拮抗眞菌植物病原體之試管内試驗 芸苔鏈格孢 無環帶 灰葡萄孢 無環帶 嗜果枝孢 無環帶 刺盤孢 無環帶 尖鐮孢 無環帶 果生鏈核盤菌 無環帶 立枯絲核菌 無環帶 核盤菌 無環帶 畸形外囊菌 無環帶 蘋果黑星菌 無環帶 大麗花輪枝孢 無環帶 腐霉 無環帶 致病疫霉 弱活性(小的膜糊環帶） 辣椒疫霉 無環帶 小隔孢殼 無環帶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) K - 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NRRL No. B-30087上清液於環帶試驗中顯示，在拮抗大 多數眞菌植物病原體上並無活性。 實例3 NRRL No. B-30087拮抗細菌性植物病原體之活性 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976 A7 B7_ 26 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 病原體，茄鏈格孢，培養在有PDA之標準巴氏盤中（10公 分）。自盤中取出眞菌集落，置於孢子生成培養基中（每升 無菌水含20克蔗糖，30克碳酸鈣，及20克瓊脂）。在盤中 加入無菌水，以部份蓋住菌絲體，培養皿再於2 2 - 2 6 °C下 培養，歷二天共1 4小時之光照。孢子之回收是將菌絲體刮 入無菌水之燒杯中。孢子懸液調至2 X 104孢子/毫升。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 蕃茄籽苗（UC82-B)在3-4片葉階段，種入二英寸之盆 中.，再置淺盤，之後以專用空氣刷噴灑，以充滿有NRRL No· B-30087完全肉汁，其係培養在大豆粉，酵母浸膏培養 基中歷72小時，於250毫升之震盪燒瓶中。噴灑後，籽苗 乾燥達至少2小時。經接種之籽苗置22°C之Percival結露室 中，前4 0小時中無照明。各淺盤中之植物蓋上一個塑膠圓 頂，保持在2 0-22°C下48小時，於Percival培育室中，並有 14小時之光照。以無NRRL No. B-30087之水，有及無病原 體孢子分別爲陰性及陽性病原體對照紐。同時，以化學性 殺眞菌劑（如 Azoxystrobin，Abound® )比較，在 100 - 250 ppm下。植物以0至5之分數記分，5爲100 %受侵犯，而0 爲無症狀出現。在有水及茄鏈格孢對照組中，在葉子上有 均勻的傷害，且子葉脱落並嚴重受損（5之分數=完全侵 害，無對照組）。以NRRL No. B-30087處理過之植物與水對 照組比較看似無差別。此中並無NRRL No. B-30087對病原 體之對照（同時也有5之分數）。陰性對照組並無侵害情形。 化學處理過之植物分數在0及1之間。 灰葡萄孢 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） !28〇976 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ^ ______B7____ ^ 27 五、發明說明（） 病原體，灰葡萄孢生長在PDA標準巴氏培養盤中（10公 分），孢子之收集利用馬鈐薯右旋糖肉汁（PDB)，其中添加 有麥芽（0.5克/升）及酵母浸膏（〇·5克/升），並調至1 X 1〇6 孢子/毫升。所使用的植物是胡椒（Yolo Wonder)培養在二 英寸盆中，至3-5個眞葉階段。NRRL No· B-30087及病原 體之應用和上述相同。有盆之淺盤保持20 °C固定下，並且 未光照。其中覆上塑膠圓頂，並置2.5天（6 0 - 6 5小時）直到 記分爲止。 使用化學殺具菌劑（如Iprodione，Rovral® )以作比較，使 用量爲20· 100 ppm。植物以〇·5記分，其5是100%侵害， 而〇是無症狀出現。在水及灰葡萄孢對照組中，整個葉片 上疋均句的害（5之分數=完全侵害，無對照）。經nrrl No· B-30087處理之植物與水對照組比較下看似無差異。此 中無NRRL No· B_30087對病原體之對照組（分數也是5)。 陰性對照組並未有侵害情形。經化學方式處理之植物，有 0至1間之分數。 華苣盤梗霉 關於盤梗霉，萵苣種子種在無菌盆栽混合物層中，其中 含有泥煤，珍珠岩及蛭石於小而透明之塑膠植栽盒内，有 8公分高及四方形。種植達1週後，萵苣籽苗噴上nrrl n〇 B_30087肉汁或上清液樣品。令植物乾燥，再將由受侵害之 萵苣籽苗中收集到之霜霉孢子懸液（2 χ 1〇4孢子/毫升）噴 在籽苗上。也應用化學標準品，包括線批咖邮⑷及 Ridorml (metaiaxyi)。然而，在這些試驗中所用的華苣盤梗 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)
Lf IT---------sw. Ϊ280976 A7 ------------- 28 " ' ----- 五、發明說明（） 霉分離物，先前已證明對此二化學標準品係不敏感的。塑 膠盒上覆以緊密蓋子，並培育在15_16〇c percival培養箱 中，捵光下歷1 6小時。塑膠盤再置室溫（2 〇 _ 2 6。^ )下， 無光照6小時。籽苗未加蓋，噴水，再蓋，再回至15_丨6力 拾同鈿中，使孢子生長歷一夜〇 NRRL Ν〇· B_3〇〇87拮抗萵 苣霜霉之抗化學物質株之作用，示於下表3。 表3
Ret) 1 分數 Rep 2 NRRLNo· B-30087樣品 1 0.0 1.0 1.0 NRRLNo· B-30087樣品2 1.0 1.0 0.0 Aliette 240 ppm 5.0 3.0 Ridomil 125 ppm 3.0 3.0 水 5.0 5.0 5.0 NRRL No· B-30087在拮抗萵苣霜霉上有極佳活性，籽苗 上）有或播病原體之抱子生長，而對照水（水）植物則有霜 霉完全的出孢子。化學標準品並未有效地控制病原體。 寄生霜霉 芽孢桿菌NRRL No. B-3 0087如上述生長在250毫升震靈燒 瓶中。IX強度之完全肉汁培養物，噴灑在1週大之花椰菜 或芽甘藍出芽植物，其在完全子葉階段，並利用以壓縮空 氣動力推進之專用空氣刷。每次15-25籽苗/盆接受噴灑， -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁} -0 I I I n ϋ 11 ϋ J _、 .1 ·ϋ I —Hi ϋ I 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 B7 五、發明說明（ 29 一組二盆。霜霉，寄生霜霉，1_5χ1〇4孢子/毫升於第一 次施加NRRLNo. Β-30087後噴灑在芸苔上。化學標準品包 括 Aliette(f0setyl-al)及 Rid〇mil(metalaxyl)也應用在其中。 然而，用於這些試驗中之寄生霜霉先前已證明對此二種化 學標準品並不敏感。 植物保持在15-17°C下16小時以供侵犯，籽苗再於2〇一 24°C下培育六天。盆子回到15_17χ：下一夜，以令病原體 長出孢子。各植物依〇至5之分數爲準，估計疾病百分率由 此再行評估。〇分之植物表示無孢子生成之侵害。結果爲 重覆盆之平均，示於下表4。 表4 分數 Rep 1 Rep 2 NRRL No. B-30087樣品 1 0.5 1.0 0.5 NRRL No· B_30087樣品2 0.5 0.5 1.0 Aliette 240 ppm 5.0 3.0 Ridomil 125 ppm 4.0 4.0 4.0 水 5.0 3.0 5.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋ emmK am— 11 n·-，a am mm mm I vaa I aa _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NRRL No· B-30087控制芸苔（油菜）霜霉之效率較勝於未 處理之水及化學標準品。 葡萄鉤絲殼 葡萄籽苗（Chardonnay)生長在2英寸盆中，直到6-9眞葉 32- 1280976 A7 B7 30 分數 Rep 2 Rep 3 Rep 4 0.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 5.0 3.0 4.0 五、發明說明（ 階段。粉霉之培養物維持在葡萄籽苗上，於2 2 _ 2 6。。下， 1 4小時光知、。和去取新鮮的2 _ 4葉子外的所有葉子。nrrx No. B-30087，化學殺眞菌劑（Rally@，，25 ppm)及水如上述應用於其他受試病原體般之施加。各處理 中使用4至5個重覆盆。爲了可接種粉霉，以鋸子取下籽苗 中有霉病之葉子，各植物個別地接種。維持籽苗之表面， 以畫筆小心刷，如此孢子可沉積在受試植物之上表面。步 驟之進行利用3X光學放大鏡，以確保所有的植物有相同的 接種。有盆之淺盤置暗處，20-24Ot16-24小時。盤子 保持在22-26°C下，14小時光照歷9_η天直到記錄測試結 果。如上，植物給予〇-5之分數。利用NRRL Ν〇 β_3〇〇87 之結果示於下表5。 表5
Rep NRRL No. B-30087 0 5
Rally 25 ppm 〇 〇 ^ 5.0 NRRL No· B-30087控制葡萄鈎絲殼之效力比得上未處理 之對照組及幾乎還有化學標準品，Rally。 致病疫霉 蕃茄晚疫病，致病疫霉之測試如上進行，利用蕃茄籽苗 丨^-------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -33-
1280976 A7 B7 31五、發明說明（） (UC82-B)4-6個眞葉階段，並生長在2英寸立方塑質盆 中。NRRL No· B_30087如上述般生長，再施加至蕃茄籽 苗。致病疫霉接種物之產生，是刮取生長在裸麥籽瓊脂上 之長出孢子之集落，接種物濃度調至〇·7-ΐ·〇χΐ〇4孢子囊/ 毫升。已接種之籽苗置淺盤，再如上文茄鏈格疯試驗中所 述地確實地培育。籽苗以〇_5分數來評估。以Quadris⑧ (azoxystrobin)做比較用，使用量爲62.5 125 ppm。使用 NRRL No· B-30087之結果示於下表6。 表6 分數 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Rep 5 NRRL No. B-30087 2.0 1.5 1.5 0.5 2.0 Quadris 125 ppm 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Quadris 62.5 ppm 0.0 0.5 0.0 0.5 0.0 水 5.0 5.0 4.0 4.0 5.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NRRL No· Β·3〇〇87控制晚疫病之情況，在4天培育後幾 乎和化學標準品，Quadris，一樣。 豇豆單胞銹菌 菜豆銹菌，紅豆單胞銹菌，之試驗利用snap豆籽苗來進 行（Provider變種），直到第一個初生葉擴大3/4爲止。所應 用之NRRL No· B-30087如上文對其他宿主/病原體組合所述 般製備。銹病病原體之接種物，以乾的銹菌孢子型式野 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------訂---------· 1280976 A7 ___B7 32 五、發明說明（） 放，在小瓶中置-2 0 °C下。接種物之製備是將經乾燥之銹 菌孢子加至有0.01% Tween 20之水中，在磁性攪拌下劇烈 攪拌至少1小時。接種物調至2 - 4 X 1 0 5孢子/毫升。初生葉 子予以接種，籽苗置淺盤中，並以2 0 °C培育在Percival結 露室中一夜。籽苗再於室溫下（20-26 °C)培育再8-10天。 籽苗以0-5分數記之，依長出孢子之銹菌出現疱狀突起之 發生率及嚴重度爲準。 以化學性殺眞菌劑，Break® (propiconazole )爲比較，使 用量40 ppm。利用NRRL No. B-30087完全肉汁之結果示於 下表7中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i 表7 分數 Rep 1 Rep 2 Rep NRRL No. B-30087 0.5 0.5 0.0 Break® 40 ppm 0.0 0.0 0.5 水 5.0 5.0 5.0 訂---------隹. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 NRRL No. B-30〇87控制豆類銹菌幾乎和化學標準品， Break® — 樣。 實例5 由NRRL No. B-30087產生之抗眞菌代謝物 將NRRL No. B-3 0087之完全肉汁，分配至乙酸乙酯，丁 醇及水性部份中。各部份在孢子發芽分析中測試對金魚藻 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976
發明說明（ 銹菌之情形。金魚❹㈣衫於各樣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 含有4:升樣品及2。升病原體抱子之俯角顯微：片I:: 16小時後在顯微鏡下檢視抱子是否發芽。與水對…： 下(_發芽及生長分數，無發芽(。分)顯示夂= 要在不_RL N〇 B_3〇〇87部份所進行之 分析結果，示於下表8(分數如上由〇至5)。 表8
Rep 1 分數 Rep 2 Rep 乙酸乙酯 5.0 2.0 3.0 正丁醇 3.0 5.0 3.0 水性 0.0 0.0 0.0 完全肉汁 0.0 0.0 0.0 水 4.0 5.0 5.0 代謝物清楚地在水溶性部份，且在丁醇或乙酸乙酯中不 容易萃取。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 決足代謝物之其他特性。分子經示出可通過10,000分子 量截去値濾膜，顯示代謝物少於10 000道耳呑。以蛋白酶 處理及以酸或鹼處理後，活性均未喪失。而一旦加熱至8 0 °(：歷1小時，活性略喪失（拮抗金魚藻銹菌之分數是由〇增 加至1.5)。活性可吸收在陽離子樹脂，但陰離子樹脂則否 (代謝物爲正電荷）。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976 Α7 Β7 五、發明說明（ 實例6 NRRL No. B-30087殺眞菌部份之部份純化 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) NRRL No. B-30087之完全肉汁培養物（85〇亳升）在4_ rpm下離心15分鐘，再收集上清液。在上清液中加入活性G 反（30克）’且充伤震I再以11，5〇〇印❿離心2 〇分鐘。上、主 液以旋轉蒸發器乾燥，再溶於15毫升水中。樣品再以大I 排阻層析（SEC )進一步純化’以由分子量分離組份。 P-2樹脂（130克，BioRad)以miliiQ去離子水泡脹以充填 2.5公分X 80公分管柱。15毫升濃縮物填加至p_2管柱，管 柱再以水經重力各離’並收集1 〇毫升流份。p __ 2管柱之變 數爲：範圍=2，毫微米= 226毫微米，16毫伏特。 利用金魚ί釆鐵囷發茅分析，如實例5所述，分析溶離出之 邵份。可見流份1 8 - 2 4可完全抑制發芽。這些流份混合， 再於旋轉蒸發器上乾燥，之後溶於8毫升水，再經由0 2米 濾膜過濾。此再填加至第二根Ρ _ 2管柱，並如上述地進 行，例外之處爲收集7毫升流份。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 流份2 9 - 3 8可抑制生物分析法中之發芽。這些流份乾燥 後再溶於水中。取小流份（5毫克）進一步HPLC純化，利用 胺基管柱（4.6毫米X 15公分，5米，100埃）。管柱以0.01Μ ΚΗ2Ρ04平衡，梯度爲 4%-44% 乙腈/0.01Μ ΚΗ2Ρ〇4，歷 30 分鐘，1毫升/分，以UV在200毫微米下偵測。 可收集到三個峰，第1峰以大小排阻HPLC管柱脱鹽（T〇so Haas，G1000 PW，7·5 毫米 X 3 0 公分，1 〇 米），以水，1 毫 升/分溶離，並以UV 200毫微米偵測。自大小排阻管柱中 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） !28〇976 Α7 Β7 五、發明說明（35) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 收集一峰，可發現其在發芽分析中具有活性。1 H NMR光 譜在400 MHz下記錄，係此半純之活性物質於D 2 0中，結 果示於圖1。 f例7
殺眞菌劑組份之化學特性異於兩性霉素A 本發明殺眞菌劑活性部份，在毛細管電泳中係異於兩性 霉素A。NRRL No. B-30087完全肉汁生長在芽孢桿菌培養 基中，内含有大豆粉，右旋糖，酵母浸膏，kh2po4， K2HP〇4，NaCl及MgS〇4 X 7H20 〇條紋狀培養物可用來接 種250毫升震盪燒瓶。燒瓶在210 rpm，30 °C下震盪4天。 NRRL No. B-30087完全肉汁中加入經純化之兩性霉素 A，再於毛細管電泳中進行（CE)。30微升的NRRL No· B· 30087完全肉汁中加入10微升兩性霉素A。NRRL No. B_ 30087完全肉汁，NRRL No. B-30087完全肉汁加上兩性霉 素A，及單獨的兩性霉素A，各樣品在C E上進行，利用磷 酸鈉緩衝溶液，pH 5.8進行。各樣品產生之電泳圖示於圖 3 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經部份純化之流份再與兩性霉素A利用毛細管電泳（C E) 比較之。圖4顯示出部份純化之B-30087殺眞菌組份，部份 純化之B-30087殺眞菌組份加上25微升兩性霉素A及單獨的 兩性霉素A之電泳圖。 兩性霉素A之1 H-NMR光譜示於圖2，而部份純化的殺眞 菌劑B-30087代謝物，示於圖1，在4〇〇 MHz之D20中記 錄。如圖1及2所示之光譜證明，NRRL Νο· Β·30087之殺眞 -38- $紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（21〇 X 297公釐） 1280976 A7 B7 36 五、發明說明（） 菌劑代謝物異於兩性霉素A。 NRRL No. B-30087之殺眞菌劑代謝物以1 H NMR知與外 毒素有所區別。外毒素之1 H-NMR光譜有七個共振超過5 ppm，如 Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis，L.A. Hickle and W.L. Fitch, eds., ACS Symposium Series 432, p. 131 (1990)所示。相反的，圖1顯示，NRRL No· B-30087樣 品，並無高於5 ppm之質子共振。 實例8 加強物之純化 加強物如下述半純化自B-30087。其半純化是將435毫升 之完全肉汁以陰離子交換樹脂，乙腈沉澱及大小排阻層析 處理。完全肉汁予以離心以移去細胞，再加14.5克陰離子 樹脂（AG 1-X8，100_2〇0孔篩，醋酸鹽型式）至上清液，混 合物再震盪1分鐘。此以5000 rpm離心20分鐘，上清液丟 棄，並應用於下一步驟。加乙腈至上清液中以生成5 0 %溶 液’其再震盛1分鐘，並以5000 rpm離心2 0分鐘。較低之 暗棕色層含有蘇雲金芽孢桿菌加強物。 來自上文之棕色層進一步以二步驟之大小排阻層析純 化。首先’ 130克卩_2樹脂（BioRad)以milliQ去離子水泡 脹，以充填2.5公分X 8 0公分管柱。棕色層利用旋轉蒸發 器濃縮約4X，再取15毫升置入P2管柱。管柱以MQ水在重 力下溶離，再收集1 〇分鐘流份歷i 2小時（u v偵測於280毫 微米，吸光度範圍2.0，1〇 mv)。流份26-28進一步純化， 係利用旋轉蒸發器濃縮流份達3 X，再應用至原先的p 2管 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂----1----· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 B7 v 37 ----- 五、發明說明（） 柱上。管柱以MQ水溶離。收集1〇分鐘流份，前8〇分鐘， 再收集2分鐘流份，於下2 +時中。蘇雲金芽孢桿菌加強物 活性可在流份M-20中溶離出來。（1；¥在22〇毫微米下偵 測，吸光度範圍2 · 0，1 〇 mv)。 實例9
加強物之化學特性異於兩性霉素A 本發明之加強物在毛細管電泳中顯示是異於兩性霉素 A。B-30087完全肉汁生長在芽孢桿菌培養基中，其中含有 大豆粉，右旋糖，酵母浸膏，KH2p〇4，κ2Ηρ〇4，NaCi&
MgSC^x 7H2〇。條狀培養物用於接種25〇毫升之震盪燒 瓶。燒瓶在210 rpm下以30。(：震盪4天。蘇雲金芽孢捍菌b_ 30087完全肉汁中加入經純化的兩性霉素a，再於毛細管電 泳（CE)上進行。3 0微升B-30087完全肉汁加入1〇微升兩性 霉素A。B-30087完全肉汁（圖3 A)，B-30087完全肉汁加兩 性霉素A(圖3B)及單獨的兩性霉素a(圖3C)在€£上進行， 利用p Η 5 · 8之嶙酸鈉缓衝溶液。c E之電泳圖示於圖4。 兩性霉素Α及Β-30087半純化加強物之1 H_NMR光譜記錄 在400 MHz之D2〇。光譜顯示，加強物係異於兩性霉素a。 實例1 0 以蘇雲金芽孢桿菌決定殺蟲加強作用 利用短小芽孢桿菌，NRRL No· B-30087之完全肉汁在甜 菜夜蛾（Spodoptera exigua)協同分析法中，證明蘇雲金芽孢 桿菌之加強作用。分析在9 6孔洞之微量盤中進行。各孔洞 中含有固體瓊脂受質。20微升的B-30087完全肉汁在生物 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------ΜΨ, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 ___B7 38 五、發明說明（） 分析中以蘇雲金芽孢桿菌之商品，Javelin(0.25- 1.50微克/ 孔洞）測試。也測試Javelin濃度連續稀釋液。 爲分析殺蟲活性，準備瓊脂受質於微量盤孔洞，依 Marrone et al· (1985)，J. Econ. Entomol. 78 : 290-293 户斤述。 以去離子水充作陰性對照組。各分析中使用二個一組之試 樣或對照組。盤再置通風侧内歷約2 - 3小時以乾燥。 甜菜夜蛾第一齡幼蟲取一隻加至各孔洞中。微量盤以不 透氣物質封口，如Mylar®，且各孔洞以推針穿孔使可換 氣。盤再置27 °C下多達7天。 培育之後，計數新生幼蟲死亡率或幼蟲發展程度來記 分。記錄死亡幼蟲之數目。生長受阻幼蟲之分數由1至4。 成長受損分數如下：4 =對照組大小；3 =對照組大小之 7 5 % ; 2 =對照組大小的5 0 % ; 1 =對照組大小之2 5 %。結 果综合於下表9。 表9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 樣品 死亡數/總數 受損分數 0.25 微克 Javelin 1/8 4 0.50 微克 Javelin 0/8 4 0.75 微克 Javelin 1/8 2 1.0微克 Javelin 1/8 2 1.50 微克 Javelin 1/8 2 B-30087+0.25微克 Javelin 3/8 2 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 39 五、發明說明（） B-30087+0.50微克 Javelin 0/8 3 B-30087+1.0微克 Javelin 7/8 2 B-30087+1.50微克 Javelin 8/8 1 B_30087單獨的 0/8 4 水 0/8 4 利用上述步驟進行第二次試驗 。結果综合於表1 0。 表10 樣品 死亡數/總數 受損分數 0.0625微克 Javelin 0/8 4 0.125 微克 Javelin 0/8 4 0.187 微克 Javelin 0/8 4 0.250微克 Javelin 0/8 3 0.375微克 Javelin 1/8 2 B-30087+0.0625微克 Javelin 1/8 3 B-30087+0.125微克 Javelin 2/8 3 B-30087+0· 187 微克 Javelin 5/8 2 B-30087+0.250微克 Javelin 8/8 1 B-30087+0.375微克 Javelin 8/8 1 B-30087單獨的 0/8 4 水 0/8 4 -42- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂---------. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976 A7 --------B7_____ 40 五、發明說明（） 爲決定半純化部份加強殺蟲之特性，樣品如上測試，使 用〇· 1微克/孔洞的Javelin及4 0微升/孔洞之受試流份。結果 示於下表1 1中。 樣品 死亡數/總數 受損分數 流份10 0/9 2 流份16 16/16 1 流份18 17/17 1 流份20 14/14 1 流份25 1/10 2 流份30 3/11 2 流份3 5 1/12 3 Javelin 0.1微克/孔洞 0/8 3 水 0/14 4 實例1 1 短小芽孢样菌（B-30087)及枯草桿菌（B-21661) —起充作殺 眞菌劑 短小芽孢桿菌，NRRL B_30087與枯草样菌NRRL B_21661 一起測試，其殺眞菌作用在一起使用時是否大於各菌株單 獨使用時。各菌株生長在1〇升或5〇〇〇升/醱酵槽中，於以 大旦粉爲基礎之培養基中，歷約5 〇小時。各株以完整肉汁 培養物型式測試，以拮抗胡椒上之灰葡萄孢，及芸苔上之 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i 訂— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280976 A7 B7 41 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 寄生霜霉。完全肉汁以IX，1/2X及1/8X測試。二菌株再 於各自爲1/2 X，1/4 X及1/8 X之各種組合下測試。水（對 照組）及化學性殺眞菌劑（BREAK®，20 ppm)也作比較測 試。植物計分基礎爲0 - 5分（其中5 = 100 %有病，無對照 組；且0=100%對照組，無病）。結果示於下表12。 表12 灰葡萄孢 甜菜夜蛾 平均死亡之比例 平均疾病比例 (4株植物） (4株植物） B-21661 IX 0.3 未測試 1/2X 0.3 1.5 1/4X 1.2 1.0 1/8X 1.7 2.0 B-30087 IX 1.7 未測試 1/2X 2.3 1.3 1/4X 未測試 3.7 1/8X 未測試 4.3 B-21661 1/4X 及 B-30087 1/2X 0.7 1.0 B-21661 1/8X 及 B-30087 1/2X 1.4 0.3 B-21661 1/4X 及 B-30087 1/4X N/A 0.5 B-21661 1/2X 及 B-30087 1/2X N/A 0.3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1280976 A7 B7 42 五、發明說明（ N/A 0.3 N/A 0.5 0.2 未測試 4.6 5.0
B-21661 1/2X 及 B-30087 1/4X B-21661 1/2X 及 B-30087 1/8X (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) BREAK®, 20 ppm 水 灰葡萄孢測試結果顯示，當菌株組合使用及單獨使用比 較下，二者有統計上之差異。例如，於Β_21661 ι/4χ&Β_ 30087 1/2Χ中之0.7分和Β-21661 1/4Χ單獨時之ι·2分有 統計上的不同。同時，Β-21661 1/8χ及β_3〇〇87 ι/2χ之 1.4分和Β-21661 1/8Χ單獨時之17分或Β3〇〇87 ι/2χ單 獨時的2.3分也有統計上的不同，且一起時之分數較各株單 獨使用所預期之平均値還少。此點顯示，利用菌株一起時 之協同作用，在充作殺眞菌劑時可增加效率。 寄生袖霉试驗結果顯示，Β-21661 1/8Χ及Β-30087 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1/2Χ組合下之分數較加成作用所預期的更好。若菌株之組 合只有加成作用，則預期的分數是2〇5分。然而，確實的 刀數疋0 · 3，顯示利用菌株之組合有明確的協同作用。其他 刀數也顯示車父預期結果更好’如Β ·21661 1 / 4Χ及Β-30087 1/4X有〇·5分’較個別菌株加成作用（2 35估計分）都更 好。此相同的協同作用也示於Β_21661 1/2Χ及Β-30087 1/2Χ 之組合（〇·3 分）’及β-21661 1/2Χ 及 Β-30087 1/4Χ (〇·3 分）及 Β-21661 1/2Χ 及 Β-30087 1/8Χ (0.5 分）。這些 試驗證明當這些菌株組合使用時也協同作用，且是意外的 -45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 修飾，對參與於本發明之精 1280976 A7 -----B 乙__------ 心 43 五、發明說明（） 結果。 應了解，本發明雖已配合以上具體實例加以説明，但上
文之説明及實例係用以説明而非限制本發明範園。其他在 本發明範圍内之方面，優點 A 藝者而言應是顯而易見的。 I — r—141------- —訂--------- f (社間讀背面之注音？事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐）

Claims (1)

  1. 2 月 9 年 5 案(9 請本 申換 利替 争圍 ^ ί 30利 93·^ 05請 吻申 文 中 ABCD •月 V 正充修補 六、申請專利範圍 1· 一種分離之菌株，其具有寄存於NRRL 編號N0·B-30087((：€1^910 144)之短小芽孢桿菌的所有被鑑知之 特性。 2. —種保護或治療植物、根部或果實免於真菌侵害之方 法’其包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第1項之 菌株。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中真菌感染係由至 少一種選自下列之微生物所，引起，包括：華苣盤梗霉 (Bremia la^ucae);寄生霜霉㈣ parasitica) \ 致病、氣霉〈Phyt〇phthora infestans) ·，葡萄妈 絲殼（¢/如/㈣/α⑽craior)，及菜豆單胞銹菌（〜⑽ phaseoli) ° 4· 一種用於保護或治療受真菌及其他害蟲感染之植物、根 邵或果實之組成物，其包括根據申請專利範圍第丨項之 菌株及至少一種化學或生物性殺蟲劑。 5. —種用於保護或治療受真菌感染之植物、根部或果實之 組成物，其包含： a) 根據申請專利範圍第1項之菌株；及 b) —種分離之菌株，其具有寄存於編號Ν〇· B_ 216 61 (C C R C 9 1 0 1 〇 6 )之枯草桿菌的所有被鑑知之特 性，該菌株具有協同的殺真菌活性。 6. 根據申請專利範圍第5項之組成物，其中的殺真菌活性 係拮抗灰葡萄孢czierea)及寄生霜霉 {Peronospora parasitica) ° 62859-950921.DOC 1280976 as B8 C8 ___ D8_ 六、申請專利範圍 7·根據申請專利範圍第5項之組成物，其中菌株的混合比 例為 1 : 2 之 NRRL No· B-21661 (CCRC 9 10 106)及 B-30087(CCRC 910144) 〇 8.根據申請專利範圍第5項之組成物，其中菌株的混合比 例為 1 : 4 之 NRRL No. B-21661 (CCRC 9 1 0 1 06)及 B-30087(CCRC 910144)。 9·根據申請專利範圍第5項之組成物，其中菌株的混合比 例為 1 : 2 之 NRRL No. B-21661(CCRC 9 10 106)及 B-30087(CCRC 910144)，可拮抗灰葡萄孢或寄生霜霉。 10·根據申請專利範圍第5項之組成物，其中菌株的混合比 例為 1 : 4 之 NRRL No. B-21661(CCRC 9 10 106)及 B-30087(CCRC 910144)，可拮抗灰葡萄孢或寄生霜霉。 11. 一種保護或治療植物、根部或果實，使免於真菌感染之 方法，此方法包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第 5項之組成物。 12. —種保遵或治療植物、根部或果實’使免於真菌感染之 方法，此方法包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第 ό項之組成物。 13. —種保護或治療植物、根部或果實使免於真菌感染之方 法，此方法包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第7 項之組成物。 14· 一種保護或治療植物、根部或果實使免於真菌感染之方 法’此方法包括施加有效劑量之稂據申請專利範圍第8 項之組成物。 -2 - 62859-950921.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1280976 as B8 C8 ____D8 1、申請專利範圍 ^ ^ ^ 15· —種保護或治療植物、根部或果實使免於真菌感染之方 法，此方法包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第9 項之組成物。 16. —種保護或治療植物、根部或果實使免於真菌感染之方 法，此方法包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第1 〇 項之組成物。 17. —種用於保護或治療受真菌感染之植物、根部或果實之 組成物’其包含根據申請專利範圍第5項之組成物之完 全肉汁培養物。 18. 根據申請專利範圍第1 7項之組成物，其係進一步包含至 少一種化學或生物性殺蟲劑。 19· 一種保護或治療植物、根部或果實免於真菌侵害之方 法，其包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第1 7項之 組成物。 20·根據申請專利範圍第1 9項之方法，其中真菌感染係由至 少一種選自灰葡萄孢cz’werea)及寄生霜霉所 引起。 21. 根據申請專利範圍第1 9項之方法，其係進一步包括施加 有效量之至少一種化學或生物性殺蟲劑。 22. —種用於保護或治療受真菌感染之植物、根部或果實之 組成物，其包含如申請專利範圍第1項所定義之菌株之 完全肉汁培養物。 23·根據申請專利範圍第22項之組成物，其係進一步包含至 少一種化學或生物性殺蟲劑。 -3- 62859-950921.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1280976 、申請專利範圍 24. —種保護或治療植物、根部或果實免於真菌侵害之方 法，其包括施加有效劑量之根據申請專利範圍第2 2項之 組成物。 25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中真菌感染係由至 少一種選自下列之微生物所引起，包括：華苣盤梗霉 {Bremia lactucae);寄生霜霉(Peronospora parasitica) ·，致病氣霉[Phytophthora infestans) ·，葡萬鐵 絲殼，及菜豆單胞錄·菌 phaseoli) 0 26. 根據申請專利範圍第2或24項之方法，其係進一步包含 至少一種化學或生物性殺蟲劑。 -4- 62859-950921.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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