BR0017570B1 - Composição e método para proteger ou tratar uma planta, raiz ou fruto - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA PROTEGER OU TRATAR UMA PLANTA, RAIZ OU FRUTO".

Dividido do PI 0009430-7, depositado em 21.03.2000.

Referência a Pedidos de Patentes Correlacionados O presente Pedido de Patente é uma Continuação do Pedido de Patente N° de Série 09/281.360, depositado em 30 de Março de 1999 e uma continuação do Pedido de Patente N° de Série 09/461.700, depositado em 14 de Dezembro de 1999, cujos conteúdos são aqui incorporados por essas referências à presente descrição.

Campo da Invenção A presente invenção pertence ao campo dos biopesticidas. Mais particularmente a presente invenção refere-se à descoberta de uma nova cepa de Bacillus pumilus, NRRL Número de acesso B-30087, que pode inibir uma ampla faixa de doenças de plantas, originárias de fungos, in vivo. A in- venção também refere-se a composições fungicidas compreendendo essa nova cepa de Bacillus e aos antibióticos e frações purificadas e não-purifica- das dessa cepa, individualmente ou em combinação com outros pesticidas químicos e biológicos. A invenção refere-se ainda ao efeito fungicida siner- gístico da utilização NRRL N° B-30087, junto com NRRL N° de acesso B- 21661 (CCRC 910106).

Fundamentos da Invenção É geralmente conhecido que diversos microorganismos exibem atividade biológica de utilidade para o controle de doenças de plantas. Em- bora tenham sido feito progressos no campo da identificação e desenvolvi- mento de pesticidas biológicos para o controle de diversas doenças de plan- tas de importância para a agricultura e horticultura, a maioria dos pesticidas em uso são ainda compostos sintéticos. Muitos desses fungicidas químicos são classificados como carcinogênicos pela Agência de Proteção Ambiental (EPA), os mesmos são tóxicos para a vida selvagem e outras espécies não consideradas como alvo. Além disso, os patógenos podem desenvolver re- sistência aos pesticidas químicos. Ver, por exemplo, Schwinn e outros, na publicação: Advances In Plant Pathology: Phytopathora infestans, The Cau- se of Late Blight of Potato, página 244, Academic Press, San Diego, Califór- nia (1991). O controle biológico oferece uma alternativa atrativa para os fun- gicidas químicos sintéticos. Os biopesticidas (organismos vivos e os com- postos produzidos naturalmente por esses organismos) podem ser mais se- guros, mais biodegradáveis e menos dispendiosos de desenvolvimento.

Um biopesticida usado comumente é a bactéria gram-positiva Bacillus thuringiensis. As cepas pesticidas do B. thuringiensis são conheci- das como produtoras de proteínas na forma de cristal durante a esporulação, que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos e nematódios (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.999.192 e Patente U.S. N° 5.208.017). As endotoxinas proteináceas produzidas pelo B. thuringiensis também atuam como agentes inseticidas contra lagartas de raiz do milho e outros tipos de besouros (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.187.09 e Johnson, T.J. e outros (1993), J. Econ. Entomol., 86:330-333). As endotoxi- nas do B. thuringiensis têm sido mostradas como sendo eficazes como cris- tais purificados, péletes de células lavadas e proteínas expressas. Warren e outros, documento de patente WO 96/10083, descrevem proteínas isentas de endotoxinas produzidas durante o estágio vegetativo do Bacillus cereus e B. thuringiensis. Essas proteínas vegetativas, chamadas de Vip1 e Vip2 pos- suem potente atividade contra lagartas da raiz do milho (do norte e do oes- te). Ver, Estruch e outros (1997), Nature-Biotechnology 15:137-141.

Um metabólito termoestável do B. thuringiensis, denominado de beta-exotoxina, foi também mostrado como tendo propriedades pesticidas.

Burgjeron e Biache (1979), Entomophaga, 11:279-284, relatam uma beta- exotoxina que é ativa contra o besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata). Além disso, as beta-exotoxinas do B. thuringiensis exibem atividade pesticida não-específica, matando não apenas nematódios, mas também moscas, lagartas de cereais, acarinos e lagartas da raiz do milho. A sigma-exotoxina apresenta uma estrutura similar à beta-exotoxina, sendo ativa contra o besouro da batata do Colorado. Ver Argauer e outros (1991), J. Entomol. Sei. 26: 206-213. A alfa-exotoxina é tóxica para a larva da Musca domestica (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7). As gama-exotoxinas são diversas enzimas proteolíticas, quitinases e proteases. Os efeitos tóxi- cos das gama-exotoxinas são apenas expressos em combinação com a be- ta-exotoxina ou a delta-exotoxina. Ver, Forsberg, C., "Bacillus thuringiensis.

Its Effects on Environmental Quality", Nacional Research Council of Canada, Publicação N° NRCC 15385, páginas 91-109 (1976). Stonard e outros (1994), ACS Symposium Series 551:25, relatam um metabólito secundário, solúvel em água, ativo contra a lagarta da raiz do milho no sobrenadante de uma cepa de Bacillus cereus.

Zwittermicina A é uma molécula de um ácido aminopoliol linear, solúvel em água (ver, He e outros (1994), Tetrahedron Lett., 35(16):2499- 2502) com atividade de amplo espectro contra diversos patógenos de plan- tas de origem bacteriana e de fungos. A zwittermicina A é também conheci- da como um agente para intensificar a atividade do B. thuringiensis. Manker e outros (documento de patente WO N° 96/39037) foram os primeiros a de- terminar a capacidade e propriedade do composto de zwittermicina A em in- tensificar a atividade do B. thuringiensis. Subseqüentemente, Schnepf e ou- tros também relataram que a zwittermicina A também intensificou a atividade do B. thuringiensis (Patente U.S. N° 5.702.703).

Os bacilos são conhecidos por produzirem metabólitos secundá- rios antifungos e antibacterianos. Ver Korzybski e outros, "Antibiotics isolated from the genus Bacillus (Bacillaceae)" in: Antibiotics - Origin, Nature and Properties, American Society for Microbiology, Washington D.C. Vol. III

(1978) e Berdy, CRC Handbook of Antibiotics Compounds, Vols. I-XIV, CRC

Press, Inc., Boca Raton, FL (1980-87). Os compostos produzidos pelo B. pu- milus incluem micrococcina P, pumilina e tetaína.

Kawaguchi e outros, na Patente U.S. N° 4.250.170, isolaram um novo antibiótico solúvel em água do Bacillus, com atividade contra uma am- pla faixa de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Stabb e outros (1990) Applied Environ. Microbiol. 60:4404-4412, identificaram determinadas cepas de Bacillus spp. (Bacillus spp. inclui B. subtilis, B. cereus, B. mycoi- des, B. thuringiensis) que exibem atividade antifungo. Essas cepas mostra- ram produzir zwittermicina A e/ou canosamina. Ver, Milner e outros, Appl.

Environ. Microb. 62: 3061-3066 (1996). Esses são agentes antibióticos que são eficazes contra o apodrecimento causado por doença do solo, provoca- do pela Phytopathora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum ou S- clerotinia minor (Ver, Stabb e outros, supramencionado). A zwittermicina A é uma molécula de um ácido aminopoliol linear, solúvel em água. Ver, He e outros (1994), Tetrahedron Lett., 35(16):2499-2502). Apresentando um am- plo espectro de atividade contra diversos patógenos de plantas, de origem de fungo e de origem bacteriana. A canosamina (Milner e outros, 1996), tam- bém inibe uma ampla faixa de patógenos de plantas de origem de fungos e de poucas espécies de bactérias.

Handelsman e outros, na Patente U.S. N° 5.049.379, descrevem como a zwittermicina A, produzida pelo B. cereus, controla o apodrecimento em alfafa e soja. Quando a semente foi revestida com B. cereus ATCC 53522, a atividade patogênica do fungo apodrecido da raiz foi inibida. Simi- larmente, a aplicação de formulações baseadas em esporos de determina- das cepas de B. cereus em sementes de soja ou no solo que envolve as se- mentes, mostrou aumentar o rendimento da soja no campo. Ver, Osburne e outros (1995), Am. Phytopathol. Soc. 79(6):551-556. Os métodos de aplica- ção de biopesticidas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, pós umectáveis, fluidização a seco, microencapsulamento e formulações lí- quidas do micróbio, caldos integrais ou frações de antibióticos de culturas adequadas. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.061.495. de Rossall e Pa- tente U.S. N° 5.049.379, de Handelsman e outros.

Tsuno e outros (1986) J. Antibiotics XXXIX(7): 1001-1003, rela- tam um novo antibiótico à base de amino-açúcar de P. pumilus, com ativida- de contra uma ampla faixa de bactérias, in vitro.

Khmel e outros (1995), no documento de patente SU 1.817.875 descrevem uma nova cepa de Bacillus pumilus VKM CR-333D, que é usada para controlar fito-patógenos de fungos e bactérias.

Leifert e outros, J. Appl. Bacteriol. 78:97-108 (1995), relatam a produção de antibióticos anti-fíof/yü's e an\\-Alternaria pelas duas cepas de Bacillus, B. subtilis CL27 e B. pumilus CL-45. O caldo integral e os filtrados livres de célula são ativos contra Botrytis e Alternaria nos testes in vitro e são ativos contra Botrytis em testes in vivo de pequenas plantas de Astilbe. Lei- fer e outros (1997), Patente U.S. N° 5.597.565, descrevem B. subtilis, B. pu- milus e B. polymyxa que são particularmente eficazes em inibir fungos que provocam doenças de pós colheitas, Alternaria brassicicola e Botrytis cine- rea. Eles também descrevem a presença de antibióticos produzidos no filtra- do da cultura livre de células e sua atividade em diferentes valores de pH, mas não identificam esses compostos. Os compostos de B. subtilis perdem atividade com baixo pH enquanto a atividade do extrato de B. pumilus ocorre apenas com valores de pH abaixo de 5,6. Leifert e outros, (1998), Patente U.S. N° 5.780.080, descrevem repolhos que podem ser tratados com cepas de B. subtilis, B. pumilus e B. polymyxa que inibem a Alternaria brassicicola e Botrytis cinerea.

Loeffler e outros (1986), J. Phytopathology 115: 204-213, des- crevem cepas de B. subtilis, B. pumilus e B. licheniformis e B. coagulans que produzem diversos antibióticos com atividade antifungo e antibacteriana. B. pumilus produziu bacilisina e iturina A. A bacilisina é um composto bastante pequeno, com um peso molecular de 270, que inibe apenas a levedura. As iturinas, que são solúveis em solventes polares, possuem ampla atividade antifungo e antibacteriana.

Na Patente U.S. N° 5.344.647, Rossall descreve as cepas de Bacillus subtilis com ampla atividade antifungo. Adicionalmente, a Patente U.S. N° 5.061.495, de Rossall, fornece um novo antibiótico de B. subtilis que apresenta um peso molecular de 63.500 dáltons, precipita a um pH abaixo de 5 e apresenta atividade contra bactérias gram-positivas e fungos (Botrytis e Erysiphe). Sholberg e outros (1995), Can. J. Microbiol. 41:247-252, Swin- burne e outros (1975), Trans. Brit. Mycol. Soc. 65:211-217, Singh e Deverall (1984), Trans. Br. Mycol. Soc. 83:487-490, Ferreira e outros (1991), Phyto- pathology 81:283-287 e Baker e outros (1983) Phytopathology 73:1148- 1152. Todas essas publicações descrevem o uso de Bacillus spp. e Bacillus subtilis como agentes de biocontrole de patógenos de plantas de origem de fungos. Pusey e outros (1988), Plant Dis. 72:622-626, Pusey e outros, Pa- tente U.S. N° 5.047.239 e McKeen e outros (1986) Phytopathology 76:136- 139, descrevem o controle do apodrecimento de frutos após a colheita usan- do B. subtilis. McKeen e outros, supramencionado, mostraram que os an- tibióticos similares aos polipetídios cíclicos de iturina de baixo peso molecu- lar, contribuem para essa atividade fungicida do B. subtilis.

Liu e outros, na Patente U.S. N° 5.403.583, descrevem um fíac/7- lus sp. (ATCC 55000) e um método de controle do patógeno de planta de origem de fungo, Rhizoctonia solani. Islam e Nandi (1985), J. Plant Dis. Pro- tect. 92(3):241-246, descrevem um Bacillus sp, com antagonismo a Drech- slera oryzae, o agente provocador de pontos marrons no arroz. Os mesmos autores, Islam e Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92(3):233-240, também descrevem antagonismo in vitro do Bacillus sp. contra Drechslera oryzae, Al- ternaria alternata e Fusarium roseum. Eles discutem três componentes no fil- trado da cultura. O antibiótico mais ativo foi altamente solúvel em água e me- tanol, com um pico de UV em 255 nm, e um rebaixo em 260 nm, o que pro- vou ser um lipopetídio do tipo polioxina. Cook e outros (1987), Beltwide Cot- ton Production Research Conferences, Dallas, TX, páginas 43-45, descre- vem o uso de uma suspensão de Bacillus sp. para reduzir o número de plan- tas de algodão mortas pelo Phymatotrichum omnivorum, um causador do apodrecimento da raiz do algodão. B’Chir e Namouchi (1988), Revue Nématologique 11(2):263-266, relatam sobre um Bacillus pumilus que estimula a captura de fungo de ne- matódio para aumentar sua capacidade de capturar nematódios. BOhir e Belkadhi (1986), Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent 51/3b:1295-1310, discutem as interações celulares de um fungo (Fusarium) e nematódios que provocam infecção em frutos cítricos. O fungo é associado com B. pumilus (eles ocorrem juntos) e quando o nematódio também se apresenta, o fungo é mais severo. O B. pumilus se dispõe como fornecedor de alimento aos nematódios. Gokte e Swarup (1988), Indian J. Nematol. 18(2):313-318, rela- tam sobre o B. pumilus tem ação nematicida, mas não relatam qualquer ati- vidade antifungo. Slabospitskaya e outros (1992), Mikrobiol Zh (Kiev) 54(6):16-22, comparam diversos Bacillus diferentes, incluindo B. pumilus, quanto a sua capacidade de produzir quitinases, mas não relatam qualquer atividade sobre patógenos de plantas. O B. pumilus produz os níveis mais baixos de quitinase. Mclnroy e outros (1995), Plant and Soil 173(2):337-342, realizaram um levantamento de diversos tipos de bactérias, incluindo diver- sos Bacillus e B. pumilus, que são endófitos dentro dos caules e raízes das plantas. Entretanto, não mostraram nenhuma evidência de que essas cepas endofíticas são antifungos. Chernin e outros (1995), Molecular Genetics, descobriram um Bacillus pumilus que apresenta um largo espectro de ativi- dade contra bactérias (por exemplo, Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia) e fungos que provocam doenças em plantas. Fey e outros (1991), Akad.

Landwirts Kart, relatam sobre a cepa do B. pumilus que fornece alguma pro- teção de sementes de batata a partir de Rhizoctonia solani.

Descrição da Invenção É fornecido um novo Bacillus sp. produtor de antibiótico, que exibe atividade antifungo apenas em certos patógenos específicos de plan- tas e nenhuma atividade antibacteriana. Também é fornecido um método de tratamento e proteção de plantas, frutos e raízes de infecções de provenien- tes de fungos, compreendendo a etapa de aplicação de uma quantidade efi- caz de um Bacillus sp. produtor de antibiótico. O Bacillus sp. produtor de an- tibiótico pode ser fornecido como uma suspensão em um caldo de cultura integral ou como um sobrenadante contendo antibiótico parcialmente purifi- cado, obtido de uma cultura de caldo integral de um Bacillus sp. produtor de antibiótico. É também fornecido um novo antibiótico solúvel em água que exibe específica atividade antifungo e nenhuma atividade antibacteriana. A presente invenção também fornece um novo composto que intensifica a atividade inseticida do B. thuringiensis. O composto é isolado da cultura de caldo integral ou sobrenadante de B. pumilus sp., que quando combinado com B. thuringiensis, aumenta sua atividade inseticida. A inven- ção também inclui métodos de tratamento de plantas para controlar infesta- ções de insetos sobre ou dentro de plantas com uma suspensão bacteriana de um Bacillus ou um sobrenadante contendo metabólito de uma cultura de um Bacillus ou de metabólitos purificados. A presente invenção fornece ainda a combinação de uma cepa B-30087 com a cepa B-21661 (AQ 713) para uso como fungicida, em que o uso das cepas juntas também fornece uma maior eficácia do que usadas individualmente.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é um espectro (RMN), registrado em 400 MHz em D20, de uma fração de fungicida parcialmente purificada de Bacillus sp. de- positada sob o NRRL Número de acesso B-30087. A figura 2 mostra o espectro de 1H RMN de zwittermicina A, re- gistrado em 400 MHz, em D20.

As figuras 3A a 3C são eletroferogramas capilares de sobrena- dante isolado de Bacillus, conforme descrito no Exemplo 9. Condições para eletroforese: um capilar não revestido de 56 cm foi usado a 40°C, 30 kV, po- laridade positiva, 100 μΑ, com pH de 5,8 de um tampão de fosfato de sódio, detecção de UV em 200 nm. A figura 3A representa o eletroferograma capi- lar do caldo integral do Bacillus pumilus B-30087. A figura 3B representa o eletroferograma capilar do caldo integral do Bacillus pumilus B-30087, blo- queado com um padrão de zwittermicina A. O pico de zwittermicina A mostra seu topo em torno de um tempo de processamento de 3,25 minutos; não eluindo junto com qualquer pico do caldo integral. A figura 3C mostra o pa- drão de zwittermicina A com um tempo de processamento de cerca de 3,28 minutos. A figura 4 compara três eletroferogramas de uma análise de ele- troforese capilar (CE) de uma fração parcialmente purificada em NRRL N° de acesso B-30087 tomada individualmente (figura 4A), uma fração parcialmen- te purificada NRRL N° B-30087 com zwittermicina A (figura 4B) e zwittermi- cina A tomada individualmente (figura 4C). A figura 5 mostra o espectro da fração ativa parcialmente purifi- cada com atividade como um intensificador B+, isolado de B-30087, regis- trado em 400 MHz em D20.

Modos de Realização da Invenção A presente invenção fornece uma cultura biologicamente pura de uma cepa tendo todas as características de identificação de uma nova cepa de Bacillus sp. e mutantes ou variações da mesma, com atividade antifungo apenas em patógenos de plantas específicas, tais como ferrugem (no trigo), míldios pulverulentos e míldios moles. Essa nova cepa de B. pumiius foi de- positada em 14 de Janeiro de 1999, no Centro de Coleta de Cultura de Pes- quisa da Agricultura (NRRL), localizado à Rua North University 1815, Peoria, III., 61604, USA e registrado sob NRRL N° de acesso B-30087, sob as provi- sões do Tratado de Budapest, tendo o Reconhecimento Internacional de Depósito de Microorganismos para Finalidade de Procedimento de Patentea- mento. A cepa, designada de NRRL B-21661, foi depositada na mesma Insti- tuição em 7 de Março de 1997, tendo sido subseqüentemente identificada como Bacillus subtilis pelo Centro Americano de Coleta de Tipos de Cultura (ATCC). A invenção também inclui métodos de prevenção e tratamento de doenças de origem de fungos em plantas, incluindo as raízes das plantas, usando tais cepas bacterianas ou sobrenadantes contendo antibióticos ou antibióticos puros obtidos de tais cepas bacterianas. A invenção também in- clui um antibiótico antifungo solúvel em água com um peso molecular menor que 10.000 dáltons, ligeiramente instável ao calor, carregado positivamente e com um pico de HPLC com absorção de UV em um máximo de 280 nm e um rebaixo de 230 nm. O antibiótico utilizado não é zwittermicina A.

Aspectos adicionais da invenção incluem uma cultura ou sobre- nadante de caldo integral de B. pumiius, que quando combinado com B. thu- ringiensis intensifica a atividade inseticida do B. thuringiensis. A invenção também inclui métodos de tratamento de plantas para controlar infestações de insetos sobre ou dentro de plantas, com uma suspensão bacteriana de um Bacillus ou de um sobrenadante contendo metabólito de uma cultura de Bacillus ou metabólitos purificados.

Um adicional aspecto da invenção compreende o inesperado efeito sinergístico da utilização da combinação de uma cepa de B. pumiius (NRRL B-30087) com B. subtilis (NRRL B-21661), como um fungicida. A in- venção inclui as composições e métodos de utilização das mesmas como fungicidas.

Definições Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, as formas de artigo escritas no singular "um" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o ter- mo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas das mesmas.

Conforme aqui usado, o termo "compreendendo" é idealizado com o significado de que as composições e métodos incluem os elementos indicados, não excluindo outros elementos. O termo "consistindo essencial- mente de" quando usado para definir composições e métodos, deve signifi- car a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação. Portanto, uma composição consistindo essencialmente dos ele- mentos conforme aqui definido, não irá excluir os traços de contaminantes do método de isolamento e purificação e de veículos farmaceuticamente a- ceitáveis, como solução salina tampão de fosfato, conservantes, e similares. O termo "consistindo em" deve significar a exclusão de mais que traços de elementos de outros ingredientes e de etapas de métodos substanciais para administração das composições da presente invenção. As modalidades defi- nidas por cada um desses termos de transição se encontram dentro do es- copo da presente invenção. O termo "isolado" é usado permutavelmente com "biologicamen- te puro" e significa separado dos constituintes, células e outros, em que a cepa ou metabólito é normalmente associada à natureza.

Conforme aqui usado, o termo "controle biológico" é definido co- mo controle de um patógeno ou inseto, mediante uso de um segundo orga- nismo. Mecanismos conhecidos de controle biológico incluem a bactéria em- térica que controla o apodrecimento da raiz mediante fungos competidores externos para ocupar o espaço da superfície da raiz. As toxinas bacterianas, como os antibióticos, têm sido usadas para controlar os patógenos. A toxina pode ser isolada e aplicada diretamente à planta ou as espécies bacterianas podem ser administradas de modo a produzir a toxina no local. O termo "fungo" ou "fungos" inclui uma variedade de organismos nucleados suportadores de esporos que são desprovidos de clorofila. Exem- plos de fungos incluem leveduras, mofo, míldios, ferrugem e cogumelos. O termo "bactéria" inclui qualquer organismo procariótico que não apresenta um núcleo separado. O termo "fungicida" significa a capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a velocidade de crescimento dos fungos. O termo "antibiótico" inclui qualquer substância que seja capaz de matar ou inibir um microorganismo. Os antibióticos podem ser produzidos por meio de um microorganismo ou por um processo sintético ou processo semi-sintético. O termo, portanto, inclui uma substância que inibe ou mata fungos, por exemplo, zwittermicina A ou canosamina. O termo "antifungo" inclui qualquer substância que é capaz de matar ou inibir o crescimento de fungos. O termo "cultura" refere-se à propagação de organismos em um meio de diversos tipos. O termo "cultura de caldo integral" refere-se a uma cultura líqui- da contendo as células e o meio. O termo "sobrenadante" refere-se ao caldo líquido restante quando as células crescidas no caldo são removidas mediante centrifuga- ção, filtração, sedimentação ou outros meios bem conhecidos na técnica.

Conforme aqui usado, o termo "insetos" inclui todos os organis- mos da classe "Insecta". Insetos "Pre-adultos" refere-se a qualquer forma de organismo antes do estágio adulto, incluindo, por exemplo, ovos, larvas e ninfas. "Inseticida" refere-se à capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a velocidade de crescimento dos insetos. "Nematicida" refere-se à capacidade de uma substância de aumentar a mortalidade ou inibir a velocidade de crescimento de nematódios. "Pesticida" refere-se à capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a velocida- de de crescimento de insetos, nematódios e acarinos. "Controle positivo" significa um composto conhecido que apre- senta atividade pesticida. "Controle positivo" inclui, mas sem ser limitado a isso, pesticidas químicos comercialmente disponíveis. O termo "controle negativo" significa um composto conhecido que não apresenta atividade pesticida. Exemplos de controle negativo incluem água ou acetato de etila. O termo "solvente" inclui qualquer líquido que mantém uma outra substância em solução. O termo "solvente extraível" refere-se a qualquer composto que se dissolve em um solvente e que depois pode ser isolado do solvente. Exemplos de solventes incluem, mas sem ser limitado a isso, sol- ventes orgânicos, tal como acetato de etila. O termo "metabólito" refere-se a qualquer composto, substância ou subproduto de uma fermentação de um microorganismo que apresenta atividade pesticida. O antibiótico conforme definido acima, é um metabólito especificamente ativo contra um microorganismo.

Uma "composição" é idealizada para ter o significado de uma combinação de agente ativo e um outro composto ou composição inerte (por exemplo, um agente detectável ou de rotulação) ou um composto ativo, co- mo um coauxiliar.

Uma "fração" é idealizada para ter o significado de uma alíquota de um teste de fracionamento usado para separar as moléculas do sobrena- dante por tamanho, polaridade ou carga.

Uma "fração parcialmente purificada" é uma das alíquotas cole- tadas no teste de fracionamento que é capaz de inibir a germinação em um bioensaio ou aumentar a atividade B+ contra lepioloplaus.

Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efe- tuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser aplicada em uma ou mais aplicações. Em termos de tratamento e proteção, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para melhorar, estabili- zar, inverter, diminuir ou retardar a progressão da infestação do inseto. A presente invenção descreve uma cultura bilogicamente pura de uma cepa tendo todas as características de identificação de uma nova cepa de Bacillus sp. produtora de antibióticos, depositada sob NRRL N° de acesso B-30087, e mutantes da mesma, que possui atividade fungicida ape- nas em patógenos específicos de plantas e nenhuma atividade antibacteria- na. Em um aspecto, a cepa é Bacillus pumllus, depositada sob NRRL N° de acesso B-30087 e mutantes da cepa.

Em outros aspectos, a cepa é um mutante ou uma variante NRRL N° de acesso B-30087 que apresenta todas as características de i- dentificação (conforme fornecido abaixo) da cepa depositada sob NRLL N° de acesso B-30087. Os mutantes ou variantes são usados permutavelmente através da presente descrição e ainda podem ser identificados como tendo urn genoma que se hibridiza sob condições de alta severidade ao genoma NRLL N° de acesso B-30087. A "hibridização" refere-se a uma reação em que um ou mais polinucleotídios reagem para formar um complexo que é es- tabilizado através da ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídio. A ligação de hidrogênio pode ocorrer mediante emparelhamento da base de Watson-Crick, ligação de Hoogstein ou em qualquer outra manei- ra de seqüência específica. O complexo pode compreender duas espirala- ções formando uma estrutura dupla, três ou mais espiralações formando um complexo multi-espiralado, uma única espiralação auto-hibridizante ou qual- quer combinação destas. As reações de hibridização podem ser executadas sob condições de diferente "severidade". Em geral, uma reação de hibridiza- ção de baixa severidade é realizada a cerca de 40°C em 10 X SSC ou em uma solução de temperatura/resistência iônica equivalentes. Uma hibridiza- ção de severidade moderada é tipicamente realizada a cerca de 50°C em 6 X SSC e uma reação de hibridização de alta severidade é geralmente reali- zada a cerca de 60°C em 1 X SSC.

Um mutante ou variante NRRL N° de acesso B-30087 pode tam- bém ser definido como uma cepa tendo uma seqüência genômica que é maior que 85%, mais preferencialmente maior que 90% ou mais ainda prefe- rencialmente maior que 95% da identidade de seqüência do genoma NRRL N° de acesso B-30087. Um polinucleotídio ou região de polinucleotídio (ou um polipeptídio ou região de polipeptídio) que apresenta uma certa percenta- gem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) da "identidade de seqüência" com outra seqüência, significa que, quando alinhada, essa percentagem das bases (ou aminoácidos) é a mesma em comparação com as duas seqüên- cias. Esse alinhamento e o percentual de homologia ou identidade de se- qüência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos nos CURRENTS PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel e outros, eds. 1987), Suplemento 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. Preferencialmente, parâmetros padrões são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é BLAST, usando parâmetros padrões. Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrões: Código ge- nético = padrão; filtro = nenhum; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 seqüências; classificado por = HIGH SCORE;

Base de dados = não-redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + trans- lações de CDS GenBank + SwissProtein + Spupdate + PIR. Detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cai-bin/BLAST· A presente invenção fornece ainda os sobrenadantes obtidos das culturas observadas acima. O sobrenadante pode ser obtido por méto- dos bem conhecidos na técnica, incluindo: centrifugação, filtração, sedimen- tação e similares.

Em outro aspecto a invenção abrange um metabólito isolado que é um antibiótico antifungo solúvel em água. O metabólito é isolado das ce- pas da presente invenção, conforme descrito acima. Apresenta as caracte- rísticas químicas de ter peso molecular menor que 10.000 dáltons, pico de absorção de UV em 280 nm e rebaixo em 230 nm, estável em meio ácido e básico, ligeiramente instável ao calor acima de 80°C e positivamente carre- gado com atividade em patógenos específicos de plantas, mas nenhuma ati- vidade em bactérias. A presente invenção fornece ainda um processo para produção desse metabólito, o método compreendendo a cultura de uma ce- pa da presente invenção, com isolamento do metabólito ativo usando os mé- todos descritos abaixo.

Um aspecto adicional da invenção é uma fração ativa parcial- mente purificada NRLL N° de acesso B-30087, que apresenta atividade fun- gicida. A função ativa não é idêntica à zwittermicina A. A presente invenção fornece ainda composições compreenden- do quaisquer das cepas acima (incluindo os mutantes ou suas variantes), so- brenadantes, frações e metabólitos, individualmente ou em combinação em- tre si e um veículo. Essas composições podem ainda ser suplementadas pe- la adição de pelo menos um pesticida químico ou biológico. Essas composi- ções podem tomar a forma de diversas formulações, que incluem, mas sem ser limitado a isso, um pó umectável, uma formulação em grânulos, uma suspensão aquosa, um concentrado emulsificáve! ou um microencapsula- mento. A fim de alcançar uma boa dispersão e adesão das composições incluídas dentro da presente invenção, pode ser vantajoso formular a cultura de caldo integral, o sobrenadante, a fração e/ou metabólito/antibiótico com componentes que auxiliam a dispersão e adesão. Conseqüentemente, for- mulações adequadas se tornarão conhecidas para os versados na técnica (pós umectáveis, grânulos e similares ou podem ser microencapsuladas em um meio adequado e similar, líquidos tais como meios circulantes aquosos e suspensões aquosas e concentrados emulsificáveis). Outras formulações adequadas serão conhecidas para os versados na técnica.

Quaisquer das cepas observadas acima, metabólitos, frações, sobrenadantes e composições contendo esses ingredientes ativos podem ser usados para fornecer um método de tratamento ou proteção de plantas, raízes ou frutos de infecções provenientes de fungos. O método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de uma cepa, metabólito, fração, so- brenadante ou composições contendo esses ingredientes ativos, individual- mente ou em combinação entre si e/ou outro pesticida biológico ou químico, à raiz, planta ou fruto infectados. As quantidades eficazes dessas composi- ções podem também ser aplicadas a uma planta, raiz ou fruto, para evitar tal infestação.

Em um aspecto adicional, a invenção abrange um método de tratamento ou proteção de plantas, raízes ou frutos de doenças de origem de fungos, compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz do antibiótico produzido por uma cepa, uma variante da mesma, tendo todas as caracterís- ticas de identificação da nova cepa Bacillus sp., NRRL N° de acesso B- 30087. Em uma modalidade, a cepa é Bacillus sp. NRRL N° de acesso B- 30087. A invenção fornece ainda um composto solúvel em água que aumenta a atividade inseticida do Bacillus thuringiensis, em que o composto apresenta o peso molecular menor que 10.000 dáltons e o composto não é zwittermicina A. O composto também não é beta-exotoxina ou outra exotoxi- na produzida pelo Bacillus thuringiensis. O composto é isolado por meio de uma resina trocadora de ani- on, precipitação de acetonitrila e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A presente invenção também fornece uma fração parcialmente purifi- cada do sobrenadante de um Bacillus que contém o composto novo. O com- posto novo e a fração ativa podem ser isolados de um Bacillus selecionado do grupo que consiste em Bacillus spp., incluindo, mas sem ser limitado a is- so, o B. subtilis, B. cereus, B. mycoides e B. pumilus. A fração ativa parcialmente purificada pode ser identificada por seu espectro de 1H RMN ou (RMN de próton) que permite a um químico ver- sado na técnica determinar se um composto foi totalmente purificado. Quan- do um composto é puro, um pico representando um próton, será integrado a um valor arbitrário de um. Os picos representando dois prótons, por exem- plo, um grupo metileno, será depois integrado a um valor de dois. Os picos representando três prótons, por exemplo, um grupo metila, será então inte- grado para três. Este é o caso da figura 3, o padrão de zwittermicina A puro.

Emtretanto, o espectro de 1H RMN do intensificador parcialmente ativo e purificado de Bacillus thuringiensis, apresenta um grupo de picos que inte- gram o valor menor que um e, portanto, pertencem a um composto separado de picos maiores no espectro.

No isolamento, o composto não exibe atividade inseticida. A combinação com o Bacillus thuringiensis aumenta o efeito inseticida do Ba- cillus thuringiensis quando aplicado à plantas e raízes de plantas. O Bacillus thuringiensis pode se encontrar na forma de uma cepa microbiana, um pro- duto comercial, uma planta construída geneticamente, um metabólito inseti- cida ativo, um sobrenadante inseticida ativo ou uma delta-exotoxina. O Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva, formadora de esporos, caracterizada por inclusões de proteína parasporal cristalinas.

As proteínas podem ser altamente tóxicas às pestes e específicas quanto à sua atividade tóxica. Conforme usado nas reivindicações, o termo "Bacillus thuringiensis" inclui cepas microbianas, produtos comerciais contendo tais cepas ou isolados contendo metabólitos ativos ou frações isoladas das ce- pas, geneticamente modificadas ou plantas construídas que expressam um gene codificador da proteína inseticida de Bacillus thuringiensis ou um pro- duto de gene ou uma delta-exotoxina. Os genes da toxina foram isolados e seqüenciados e os produtos de Bacillus thuringiensis baseados em DNA re- combinante foram produzidos e aprovados para uso. As técnicas de enge- nharia genética e novas abordagens para liberação dessas endotoxinas de Bacillus thuringiensis para ambientes da agricultura, se encontram sob de- senvolvimento e produção comercial. Isso inclui o uso de plantas construídas geneticamente com genes de endotoxina para resistência à peste e o uso de células microbianas estabilizadas intactas, como veículos de liberação de endotoxina de Bacillus thuringiensis (Gaertner e outros (1988), TIBTECH 6:S4-S7). O Bacillus thuringiensis pode ser tornado disponível ao alvo da peste mediante exposição do alvo da peste ao Bacillus thuringiensis do tipo selvagem, que naturalmente expressa a toxina. Alternativamente, um gene codificador de uma toxina desejada pode ser transformado e expresso em um hospedeiro recombinante adequado. Podem também ser usados frag- mentos das toxinas de Bacillus thuringiensis que mantêm a atividade insetici- da.

As seguintes Patentes dos Estados Unidos descrevem isolados pesticidas de Bacillus thuringiensis ou micróbio recombinantes que expres- sam uma toxina de Bacillus thuringiensis: Patentes U.S. Nos. 5.006.335; 5.106.620; 5.045.469; 5.135.867; 4.990.332; 5.164.180; 5.126.133; 5.093.119; 5.208.017; 5.186.934; 5.185.148; 5.211.946; 4.948.734; 4.849.217; 4.996.155; 4.999.192; 4.966.765; 5.073.632; 5.196.342; 5.063.055; 5.080.897; 5.024.837; 5.147.640; 5.173.409 e 5.186.934.

Preparações dos esporos e cristais de Bddllus thuringiensis subsp. Kurstaki foram usadas por muitos anos como inseticidas comerciais contra a peste de lepidoptéranos. Por exemplo, o Bacillus thuringiensis de var. kurstaki HD-1 produz um cristal denominado -delta-endotoxina, que é tóxico às larvas de um determinado número de insetos lepidoptéranos. Es- pécies adicionais de Bacillus thuringiensis denominados de israelensis e te- nebrionis foram usados comercialmente para controlar insetos. A clonagem e expressão de um gene de proteína de cristal de Bacillus thuringiensis em Escherichia coli foi descrito por Schnepf, H. e ou- tros (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2893-2897. A Patente U.S. N° 4.448.885 e Patente U.S. N° 4.467.036, ambas descrevem a expressão de uma proteína de cristal em E. coli. Os genes híbridos de proteína de cristal de Bacillus thuringiensis foram construídos de modo a exibir um aumento de toxicidade e uma expansão de faixa hospedeira para uma peste alvo. Ver as Patentes U.S. Nos. 5.128.130 e 5.055.294. As Patentes U.S. Nos. 4.797.276 e 4.853.331 descrevem a cepa de Bacillus thuringiensis San Diego (a.k.a. B.t. tenebrionis, a.k.a. M-7), que pode ser usada para controlar peste de co- leoptéranos em diversos ambientes. A Patente U.S. N° 4.918.006 descreve o Bacillus thuringiensis como tendo atividade contra diptéranos. A Patente U.S. N° 4.829.217, descreve isolados de Bacillus thuringiensis que apresen- tam atividade contra gorgulho de alfafa. A Patente U.S. N° 5.151.363 e Pa- tente U.S. N° 4.948.734 descrevem determinados isolados de Bacillus thurin- giensis que apresentam atividade contra nematódios.

As culturas de Bacillus thuringiensis podem também ser disponí- veis do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) em Brow- nsville, Texas. As solicitações devem ser feitas para USDA, ARS, Unidade de Pesquisa de Insetos de Algodão, P.O. Box 1033, Brownsville, Texas, 78520, USA; ou para o Laboratório de Pesquisas do Norte, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, 1815 North University Street, Peoria, III., USA.

Portanto, o composto e a fração eficaz intensificam a atividade inseticida do Bacillus thuringiensis contra insetos, incluindo, mas sem qual- quer limitação, nematódios, moscas, lagartas, acarinos, besouro da batata do Colorado e lagarta da raiz do milho.

Como é bem conhecido para os especialistas na técnica, o com- posto ativo pode ser aplicado na forma de uma composição. Conseqüente- mente, a presente invenção também fornece uma composição compreen- dendo o novo composto e um veículo, tal como um solvente ou um veículo de agricultura adequado. Numa modalidade adicional, a composição ainda inclui uma quantidade eficaz de Bacillus thuringiensis, conforme descrito aci- ma. Numa modalidade adicional, a composição inclui pelo menos um pestici- da químico ou biológico, conforme convencionalmente usado na técnica. A fim de alcançar uma boa dispersão e adesão das composições dentro da presente invenção, pode ser vantajoso formular a cultura de caldo integral, o sobrenadante e/ou o metabólito, com componentes que ajudam a dispersão e a adesão. Para facilidade de aplicação em plantas ou raízes de plantas, as formulações podem ser processadas em uma formulação selecionada do grupo que consiste em um pó umectável, uma suspensão aquosa, um con- centrado emulsificável e uma formulação microencapsulada. O composto novo, a fração ativa ou composições contendo os mesmos, podem ser usados para aumentar a atividade inseticida do Bacillus thuringiensis. Portanto, a presente invenção também fornece um método pa- ra aumentar a atividade inseticida do Bacillus thuringiensis mediante combi- nação de uma quantidade eficaz e intensificadora do novo composto, da fra- ção ativa ou da composição contendo os mesmos com Bacillus thuringiensis.

Em um aspecto adicional, é adicionado à formulação, pelo menos uma quan- tidade eficaz de um biopesticida ou um pesticida químico.

A invenção compreende ainda o uso do novo composto, NRRL N° de acesso B-30087, em combinação com o composto de NRRL N° de acesso B-21661, aplicado como uma cultura de caldo integral sobre uma planta, raiz ou fruto, para uso como fungicida, dito fungicida tendo um efeito mais potente como resultado do efeito sinergístico inesperado da combina- ção dos compostos. Mais preferencialmente, a combinação é aplicada em uma proporção de 1:2 (B-21661 :B-30087) para Botrytis cinerea ou Peronos- pora parasitica. Ainda mais preferencialmente, a combinação é aplicada ao Botrytis cinerea ou Peronospora parasitica em uma proporção de 1:4. Numa modalidade ainda adicional, a composição inclui pelo menos um pesticida químico ou biológico, conforme convencionalmente usado na técnica. A fim de alcançar uma boa dispersão e adesão das composições dentro da pre- sente invenção, pode ser vantajoso formular a cultura de caldo integral, o so- brenadante e/ou o metabólito, com componentes que ajudam a dispersão e a adesão. Para facilidade de aplicação em plantas ou raízes de plantas, as formulações podem ser processadas em uma formulação selecionada do grupo que consiste em um pó umectável, uma suspensão aquosa, um con- centrado emulsificável e uma formulação microencapsulada.

No decorrer da presente descrição, diversas publicações, paten- tes e especificações de patentes publicadas são referenciados por uma cita- ção de identificação. A descrição dessas publicações, patentes e especifica- ções de patentes publicadas são aqui incorporadas por meio dessas referên- cias, de modo a descrever totalmente o estado da técnica ao qual a presente invenção pertence.

Exemplos Os exemplos seguintes são idealizados para ilustrar a invenção, sem qualquer caráter de limitação.

Exemplo 1 - Caracterização da Cepa NRRL N° de acesso B-30087. A cepa de NRRL N° de acesso B-30087 foi identificada com ba- se em ácidos graxos celulares de célula integral, derivatizados de metil éste- res - FAMEs (Miller, L.T. (1982) "Single derivatization method for routine a- nalysis of bacterial whole cell wall fatty acid methyl esters, including hydroxy acids", J. Clin. Microbiol. 16:584-586) e analisado por cromatografia de gás usando o sistema MIDI (Microbial Identification System, Inc., Newark, DE). O procedimento e protocolos usados para crescimento das culturas bacteria- nas e especificações dos instrumentos são descritos por MIDI (identificação de bactérias por meio de cromatografia de gás de ácidos graxos celulares.

Nota técnica #101; MIDI Inc., 115 Barksdale Professional Center, Newark, DE). Os isolados foram crescidos em placas de TSA (BBL) a 28°C durante 24 horas e as células foram colhidas. Foi adicionado um ml de NaOH meta- nólico (15% [peso/volume] de NaOH em 50% [volume/volume] de metanol) e as células foram saponificadas a 100°C durante 30 minutos. A esterificação de ácidos graxos foi executada com 2 ml de HCI 3,25 N em 46% (vol/vol) de metanol a 80°C, durante 10 minutos. Os FAMEs foram extraídos em 1,25 ml de 1:1 (vol/vol) de metil-terc-butil éter - hexano e o extrato orgânico foi lava- do com 3 ml de 1,2% (peso/vol) de NaOH antes da análise por cromatografia de gás. O cromatógrafo de gás (Hewlett-Packard 5890A) foi equipado com um detetor de ionização de chama e uma coluna capilar (Hewlett-Packard 19091B-102, reticulada com 5% de fenil-metil silicone; 25 m X 0,22 mm ID; espessura da película, 0,33 1Lm; proporção de fase de 150) com hidrogênio como gás veículo. Um integrador automático da Hewlett-Packard 3392, inte- grou os picos FAME e isolou as bactérias indicadas usando o Software de Identificação Microbiana MIDI (Sherlock TSBA Library, versão 3.80). O perfil de FAME de Xanthomonas maltophila ATCC 13637 foi usado como verifica- ção de referência para determinações de MIDI.

Os resultados de três corridas separadas do perfil de MIDI identi- ficaram o NRRL N° de acesso B-30087 como um Bacillus pumilus com um marcador de índice de similaridade de 0,875.

Exemplo 2 - Atividade de NRRL N° de acesso B-30087 contra Patógenos de Plantas numa Cultura in vitro (zona de ensaio) Para determinar se NRRL N° de acesso B-30087 é eficaz contra uma ampla variedade de fungos patogênicos de plantas, foi realizado o se- guinte experimento usando os patógenos de plantas indicados a seguir: Bo- trytis cinerea, Alternaria brassicicola Colletotrichum acutatum, Cladosporium carophylum, Monilinia fructicola, Venturia inaequalis, Rhizoctonia solani, S- clerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Taphrina deformans e Verticilli- um dahliae.

Para determinar a atividade NRLL N° de acesso B-30087 em um ensaio de difusão de ágar (zona), os esporos dos patógenos das plantas (os esporos foram raspados da superfície das placas de Petri e diluídos a apro- ximadamente 1 x 105 esporos/ml (dependendo do patógeno)) foram espalha- dos sobre a superfície do ágar de dextrose de batata em 10 cm de placas de Petri. Para o Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum, fragmentos miceli- ais, ao invés de esporos, foram espalhados sobre as placas. Cavidades cir- culares, aproximadamente de 7,0 mm foram removidos do ágar e 125 I de amostra do sobrenadante NRRL N° de acesso B-30087 crescido em um meio de extrato de levedura de soja, foram colocados no cavidade em fras- cos com agitação de 250 ml, durante 72 horas. O sobrenadante foi preparado mediante centrifugação a 12.000 rpm durante 10 minutos. Resultados típicos podem consistir em uma zona de nenhum crescimento e/ou crescimento reduzido do patógeno em torno da cavidade ou nenhuma zona em absoluto. O tamanho da zona em milímetros foi medido e registrado, caso tenha existido uma zona. Os resultados são mostrados na Tabela 1, abaixo.

Tabela 1 ___________________________________________________________ O sobrenadante NRRL N° de acesso B-30087 não mostrou ne- nhuma atividade contra a maioria dos patógenos de plantas de origem de fungos nas zonas de teste.

Exemplo 3 - Atividade NRRL N° de acesso B-30087 contra Patógenos de Plantas de origem Bacteriana Foi estabelecido um ensaio de difusão de ágar padrão conforme estabelecido no Exemplo 2. Uma camada de cada patógeno bacteriano foi espalhada sobre a superfície de ágar de dextrose de batata. Uma amostra de 125 I do sobrenadante de NRRL N° de acesso B-30087 foi colocada em cada cavidade, conforme descrito previamente. A presença de uma zona ou tamanho da zona foi medido em milímetros.

Tabela 2- Inibição in vitro de Patógenos de Plantas de origem Bacteriana (teste de zona) Sobrenadante NRRL N° B-300-87 Zona de Inibição (mm) Pseudomonas syringae pv. Tomato Nenhuma zona Xanthomonacampestris pv. Campestris Nenhuma zona Erwinia carotovora subsp. Carotovora Nenhuma zona NRRL N° de acesso B-30087 não foi ativa contra quaisquer es- pécies de patógenos de plantas de origem bacteriana restados in vitro.

Exemplo 4 - Atividade de NRRL N° de acesso B-30087 contra patógenos de plantas em testes de plantas. A atividade de NRRL N° de acesso B-30087 foi testada contra a doença de ferrugem de feijão, Uromyces phaseoli em feijões de cozimento rápido, e mofo cinzento, Botrytis cinerea em pimenteiras, Alternaria solani em tomateiros, e míldio mole de alface, Bremia Lactucae\ míldio mole de Brassica, Peronospora parasitica, doença de ferrugem tardia do tomate, Phi- tophthora infestans e míldio em pó de videira, Uncinula necator.

Alternaria solani O patógeno, Alternaria solani, foi cultivado em placa de Petri pa- drão (10 cm) com PDA. As colônias de fungo foram cortadas da placa e co- locadas em um meio de esporulação (20 g de sacarose, 30 g de carbonato de cálcio e 20 g de ágar por litro de água esterilizada). É adicionado água esterilizada à placa de modo a cobrir parcialmente os blocos miceliais e as placas são então incubadas a uma temperatura entre 22 e 26°C, com um ío- toperíodo de 14 horas, durante dois dias. Os esporos são colhidos mediante raspagem dos blocos miceliais em um bécher de água esterilizada. A sus- pensão de esporos é ajustada para 2 x 104 esporos/ml.

Mudas de tomate (UC82-B) no estágio de 3-4 folhas, plantadas em vasos de 5,08 cm (duas polegadas) e colocadas em locais planos, foram pulverizadas com uma escova de ar para limpar o caldo integral da cepa NRRL N° de acesso B-30087 cultivada em um meio de extração de levedura de farinha de soja, durante 72 horas, em frascos agitados de 250 ml. Após a pulverização, as mudas foram deixadas secar no mínimo por duas horas. As mudas inoculadas foram colocadas em uma câmara de umedecimento de Percival a 22°C sem nenhuma iluminação pelas primeiras 40 horas. As plan- tas em cada plano foram cobertas com uma cobertura de plástico e mantidas a 20-22°C durante 48 horas na incubadora de Percival em um fotoperíodo de 14 horas. Como controle negativo e controle positivo do patógeno foi usado água sem a cepa de protocolo NRRL N° B-30087, com e sem esporos do patógeno Também, foi usado um fungicida químico (por exemplo, Azoxystro- bin, Abound®) para comparação em taxas de 100 a 250 ppm. As plantas fo- ram classificadas em uma escala de 0 a 5, onde 5 representa 100% infecta- da e 0 representa a ausência de sintomas. Na água de controle de A. solani, havia lesões uniformes sobre todas as folhas e os cotilédones foram desta- cados e gravemente infectados (classificação 5 = total infecção, nenhum controle). As plantas tratadas com a cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087 não pareceram diferentes do controle de água. Não aconteceu ne- nhum controle do patógeno pela cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B- 30087. O controle negativo não foi infectado. As plantas tratadas quimica- mente apresentaram uma classificação entre 0 e 1.

Botrvtis cinerea O patógeno, Botrytis cinerea, foi cultivado em uma placa de Petri padrão (10 cm) com PDA e foram coletados os esporos usando caldo de dextrose de batata (PDB), suplementado com malte (0,5 g/l) e extrato de le- vedura (0,5 g/l) e ajustado para 1 x 106 esporos/ml. As plantas usadas foram pimenteiras (Yolo Wonder) cultivadas em vasos de 5,08 cm (duas polega- das), no estágio de 3-5 folhas reais. A aplicação da cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087 e o patógeno foram os mesmos que no exemplo aci- ma. Os planos com os potes foram incubados a uma temperatura constante de 20°C sem qualquer iluminação. Eles foram cobertos com coberturas de plástico e deixados por 2,5 dias (60 a 65 horas) até serem classificados.

Foi usado um fungicida químico (por exemplo, Iprodione, Ro- vral®) para comparação em taxas de 20 a 100 ppm. As plantas foram classi- ficadas em uma escala de 0 a 5, onde 5 representa 100% infectada e 0 re- presenta a ausência de sintomas. Na água de controle de B. cinerea, havia lesões uniformes sobre todas as folhas (classificação 5 = total infecção, ne- nhum controle). As plantas tratadas com NRRL N° de acesso B-30087 não mostraram nenhuma diferença da água de controle. Não aconteceu nenhum controle do patógeno pela cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087 (também uma classificação 5). O controle negativo não foi infectado. As plantas tratadas quimicamente apresentaram uma classificação entre 0 e 1.

Bremia lactucae Para o teste da Bremia, sementes de alface foram plantadas em uma camada de uma mistura de material de cultura esterilizado contendo turfa, perlita e vermiculita em pequenas caixas de plástico transparentes pa- ra plantas, medindo cerca de 8 centímetros de altura e sendo de formato quadrado. Uma semana após o plantio, as mudas de alface foram pulveriza- das com uma amostra de caldo ou sobrenadante de NRRL N° de acesso 30087. As plantas foram deixadas secar e em seguida foi pulverizada sobre as mudas uma suspensão de esporos de míldio mole (2 x 104 esporos /ml), coletada das mudas de alface infectadas. Padrões químicos consistindo em Aliette (fosetil-al) e Ridomil (metalaxila), foram também aplicados. Entretan- to, o material isolado de Bremia lactucae usado nesses testes foi previamen- te demonstrado como sendo insensível a esses dois padrões químicos que são usados comercialmente. As caixas de plástico foram cobertas com tam- pas de encaixe de pressão e incubadas a 15-16°C em uma incubadora Per- cival durante 16 horas, sem qualquer iluminação. Em seguida, as caixas de plástico foram colocadas à temperatura ambiente (20-26°C) sob iluminação durante seis dias. As mudas foram descobertas, pulverizadas com água, re- cuperadas e retornadas à incubadora a 15-16°C para ocorrer a esporulação durante a noite. O efeito de NRRL N° de acesso B-30087 contra uma cepa de míldio mole de alface resistente quimicamente é mostrado abaixo na Ta- bela 3.

Tabela 3 NRRL N° de acesso B-30087 apresentou excelente atividade contra o míldio mole da alface, com pouca ou nenhuma esporulação do pa- tógeno sobre as mudas, enquanto as plantas de controle (com controle de água), foram completamente esporuladas com o míldio mole. Os padrões químicos não controlaram eficazmente o patógeno.

Peronosoora parasitica A cepa do Bacillus de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087 foi cultivada conforme exposto acima, em frascos de 250 ml sob agitação. A cultura de caldo integral na extensão 1X foi pulverizada sobre plantas de couve-flor ou couve-de-bruxelas de uma semana de idade no estágio inte- gral de cotilédone com uma escova a ar acionada por ar comprimido. Três réplicas de 15-25 mudas/vaso foram pulverizadas por tratamento. Uma sus- pensão de esporo de míldio mole, Peronospora parasitica com 1-5x10 es- poros/ml foi pulverizada sobre as plantas de Brassica após a primeira aplica- ção da cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087. Padrões químicos consistindo em Aliette (fosetil-al) e Ridomil (metalaxila) foram também aplica- dos. Entretanto, o material isolado de Peronospora parasitica usado nesses testes foi previamente demonstrado como sendo insensível a esses dois pa- drões químicos que são usados comercialmente.

As plantas foram mantidas a 15-17°C durante 16 horas para in- fecção e a seguir as mudas foram incubadas a 20-24°C durante 6 dias. Os vasos foram retornados à temperatura de 15-17°C durante a noite para ocor- rer a esporulação do patógeno Cada planta foi avaliada mediante estimativa do percentual de controle de doença, baseado em uma escala de 0 a 5. Uma classificação zero representa uma planta sem quaisquer lesões de esporula- ção. Os resultados médios conseguidos com os vasos replicados são mos- trados abaixo na Tabela 4.

Tabela 4 NRRL N° de acesso B-30087 controlou o míldio mole de Brassi- ca mais eficazmente do que quando comparado aos não tratados com con- trole de água e padrões químicos.

Uncinula necator Mudas de videiras (Chardonnay) foram cultivadas em vasos de 5,08 cm (duas polegadas) até o estágio real de 6-9 folhas. A cultura do míl- dio pulverulento foi mantida nas mudas de videira a 22-26°C sob um fotope- ríodo de 14 horas. Todas as folhas mais novas (2-4) foram removidas. NRRL N° de acesso B-30087, o fungicida químico (Rally®, miclobutanil em 25 ppm) e a água de controle foram aplicados para eliminar, conforme exposto acima, os outros patógenos testados. Quatro de cinco replicações são usa- das em cada tratamento. Para inoculação com míldio em pó, folhas com míl- dio em mudas de manutenção são removidas com tesouras e cada planta é inoculada individualmente. A superfície da muda de manutenção é suave- mente escovada com uma escova de tinta de modo que os esporos são de- positados sobre a superfície superior das plantas de teste. O procedimento é executado usando uma lente de ampliação de 3 X luminosidade, para garan- tir que todas as plantas obtenham inóculos equivalentes. Dispositivos planos com os vasos são colocados no escuro durante 16-24 horas a 20-24°C. Os dispositivos planos são mantidos a 22-26°C por um fotoperíodo de 14 horas, em um adicionai de 9-11 dias até que o teste seja lido. Como acima, as plan- tas são fornecidas com uma classificação de 0 a 5. O resultado, usando NRRL N° de acesso B-30087 é mostrado na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5 NRRL N° de acesso B-30087 controlou o míldio pulverulento de Uncinula mais eficazmente do que quando comparado aos não tratados com controle de água, bem como com padrão químico Rally.

Phvtoohthora infestans O teste da ferrugem de tomate maduro, P. infestans, foi conduzi- do usando mudas de tomateiro (UC82-B) no estágio real de 4-6 folhas, culti- vadas em vasos de plástico quadrados de 5,08 cm (duas polegadas). Aplica- ções de NRRL N° de acesso B-30087 cultivada conforme descrito anterior- mente, foram feitas nas mudas de tomateiro. A inoculação do P. Infestans foi produzida mediante raspagem de uma colônia de esporulação cultivada em ágar de semente de centeio e ajuste da concentração do inóculo entre 0,7 a 1,0 X 104 esporângios/ml. As mudas inoculadas foram colocadas em disposi- tivos planos e incubadas exatamente como descrito no teste de A. solani. As mudas foram avaliadas em uma escala de 0-5. Quadris® (azoxystrobin) foi usado para comparação a uma taxa de 62,5 a 125 ppm. O resultado usando NRRL N° de acesso B-30087 é mostrado abaixo na Tabela 6.

Tabela 6 NRRL N° de acesso B-30087 praticamente controlou a ferrugem madura, assim como também o fez o padrão químico Quadris, após quatro dias de incubação.

Uromvces phaseoli O teste da ferrugem do feijão, U. phaseoli, foi conduzido usando mudas de feijão de rápido cozimento (variedade Provider) até que as primei- ras folhas primárias fossem expandidas numa proporção de %. Aplicações da cepa de Protocolo NRRL N° de acesso B-30087 foram feitas conforme previamente descrito para as outras combinações de hospedeiro/patógeno A inoculação do patógeno da ferrugem foi armazenada como esporos secos do patógeno ferrugem em frascos, a -20°C. A inoculação foi preparada me- diante adição de esporos secos do patógeno ferrugem à água, com 0,01% de Tween 20 e agitada vigorosamente em um agitador magnético durante pelo menos uma hora. O inóculo foi ajustado para 2-4 X 105 esporos/ml. As folhas principais são inoculadas e as mudas são colocadas em dispositivos planos e incubadas durante a noite a 20ÔC em uma câmara de orvalho de Percival. As mudas são depois incubadas à temperatura ambiente (20-26°C) por um adicional de 8-10 dias. As mudas são classificadas em uma escala de 0 a 5, baseada na incidência e gravidade da esporulação das pústulas de ferrugem presentes. O fungicida químico Break® (propiconazol) foi usado como com- paração a uma concentração de 40 ppm. O resultado usando o caldo inte- gral de NRRL N° de acesso B-30087 é mostrado abaixo na Tabela 7.

Tabela 7 NRRL N° de acesso B-30087 praticamente controlou a ferrugem de feijão, assim como também o fez o padrão químico Break®.

Exemplo 5 - Metabólito antifunao produzido por NRRL N° de acesso B- 30087 O caldo integral de NRRL N° de acesso 30087 foi dividido em acetato de etila, butanol e frações aquosas. Cada fração foi testada contra a ferrugem tipo "snapdragon" em um ensaio de germinação de esporos. Os esporos da ferrugem tipo "snapdragon" foram germinados na presença de cada amostra em lâminas de microscópio com depressão contendo 40 I da amostra e 20 I dos esporos do patógeno Aproximadamente 16 horas depois, os esporos são observados sob microscópio, para verificar se os mesmos fo- ram germinados. Nenhuma germinação (classificação 0) comparado ao con- trole de água (100% de germinação e crescimento - classificação 5) indica atividade da amostra que está sendo testada. Os resultados do ensaio de germinação da ferrugem com diferentes frações de NRRL N° de acesso B- 30087 são mostrados abaixo (classificação em uma escala de 0 a 5, como acima) na Tabela 8.

Tabela 8 O metabólito é completamente transparente na fração de água solúvel e não é facilmente extraível em butanol ou acetato de etila.

Outras características do metabólito foram determinadas. A mo- lécula foi mostrada como passando através de um filtro de separação de mo- léculas, de peso molecular 10.000, indicando que o metabólito é menor que 10.000 dáltons. A atividade não foi perdida após o tratamento com proteases nem quando tratada com ácido ou base. A atividade foi ligeiramente perdida após aquecimento a 80°C por uma hora (a classificação referente à ferrugem do tipo "snapdragon" aumentou de 0 para 1,5). A atividade foi absorvida em uma resina de cátion, ao contrário de uma resina de ânion (o metabólito é positivamente carregado).

Exemplo 6 - Purificação Parcial da Fração Fungicida de NRRL N° de acesso B-30087 A cultura do caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087 (850 ml) foi centrifugada a 4200 rpm durante 15 minutos e foi coletado o sobrena- dante. Foi adicionado carvão ativado (30 g) ao sobrenadante e o mesmo foi apropriadamente agitado antes da centrifugação por 20 minutos a 11.500 rpm. O sobrenadante foi seco em um evaporador rotativo e depois novamen- te dissolvido em 15 ml de água. A amostra foi posteriormente purificada por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), para separar os componentes por peso molecular. A resina P-2 (130 g, BioRad) foi expandida com água deionizada milliQ para empacotar uma coluna de 2,5 cm x 80 cm. Os 15 ml de concen- trado foram carregados sobre a coluna P-2, a coluna foi eluída com água por gravidade e frações de 10 ml foram coletadas. Os parâmetros para a coluna P-2 foram: variação = 2; nm = 226 nm, 16 mv.

As frações eluídas foram testadas usando o ensaio de germina- ção da ferrugem tipo "snapdragon" descrito no Exemplo 5. As frações 18-24 foram encontradas como sendo completamente inibidoras da germinação.

Essas frações foram combinadas e secas em um evaporador rotativo, depois novamente dissolvidas em 8 ml de água e filtradas através de um filtro de 0,2 m. Este foi carregado sobre uma segunda coluna P-2 e processado co- mo descrito acima, com exceção de que foram coletadas frações de 7 ml.

Verificou-se que as frações 29-38 são inibidoras da germinação no bioensaio. Essas frações foram secas e depois novamente dissolvidas em água. Uma pequena alíquota (5 mg) foi posteriormente separada por HPLC usando uma coluna de amina (4,6 mm x 15 cm, 5 m, 100 angstrõm). A coluna foi neutralizada em KH2P04 0,01 M e foi processado um gradiente de 4% a 44% de acetonitrila/KH2P04 0,01 M por 30 minutos, 1 ml/min, detecta- do por UV a 200 nm.

Três picos foram coletados e o pico 1 foi desalinificado em uma coluna de HPLC de exclusão de tamanho (Todo Haas, G1000 PW, 7,5 mm x 30 cm, 10 m), eluído com água em 1 ml/min e detectado por UV a 200 nm.

Um dos picos foi coletado da coluna de exclusão de tamanho e verificou-se ser ativo no ensaio de germinação. Um espectro de 1H RMN foi registrado em 400 MHz em D20 desse material semipuro ativo, conforme mostrado na figura 1.

Exemplo 7 - Características Químicas do Componente Fungicida são dife- rentes da Zwittermicina A A fração ativa fungicida da presente invenção foi mostrada como diferente da zwittermicina A em eletroforese capilar. O caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087 foi cultivado em um meio de cultura de Bacillus contendo farinha de soja, extrato de levedura, KH2P04, K2HP04, NaCI e MgS04 x 7 H20. Foram usadas culturas em camadas para inocular frascos de 250 ml com agitação. Os frascos foram agitados a 210 rpm, a 30°C, du- rante 4 dias. O caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087 foi injetado com zwittermicina A purificada e processado em eletroforese capilar (CE).

Em seguida, 30 μΙ do caldo integral de NRRL N° B-30087 foi injetado com 10 μΙ de zwittermicina A. Uma amostra de cada caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087, caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087 com zwitter- micina A e zwittermicina A sozinha foram processados em CE usando tam- pão de fosfato de sódio em pH 8. Os eletroferogramas gerados para cada amostra são mostrados na figura 3.

As frações parcialmente purificadas foram depois comparadas à zwittermicina A usando eletroforese capilar (CE). A figura 4 mostra os eletro- ferogramas do componente fungicida parcialmente purificado do B-30087, o componente fungicida parcialmente purificado do B-30087 injetado com 25 μΙ de zwittermicina A e zwittermicina A individualmente. O espectro de 1H RMN de zwittermicina A mostrado na figura 2 e o metabólito fungicida parcialmente purificado do B-30087 mostrado na figu- ra 1 foram registrados em D2O com freqüência de 400 MHz. O espectro, conforme mostrado nas figuras 1 e 2, demonstra que 0 metabólito fungicida de NRRL N° B-30087 é diferente da zwittermicina A. O metabólito fungicida de NRRL N° de acesso B-30087 pode ser também distinguido da -exotoxina por meio de teste de 1H RMN. O espectro de 1H RMN da -exotoxina apresenta sete ressonâncias acima de 5 ppm, conforme mostrado na publicação "Analvtical Chemistry of Bacillus thuringi- ensis", L.A. Hickle e W.L. Fitch, eds., ACS Symposium Series 432, p. 131 (1990). Ao contrário, a figura 1 mostra que para a amostra de NRRL N° de acesso B-30087, nenhuma ressonância de próton aparece acima de 5 ppm.

Exemplo 8 - Purificação do Intensificador O intensificador foi semipurificado a partir do caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087, conforme exposto a seguir. O procedimento foi realizado mediante tratamento de 435 ml do caldo integral com uma resi- na trocadora de ânion, precipitação de acetonitrila e cromatografia de exclu- são de tamanho. O caldo integral foi centrifugado para remoção das células e foi adicionado 14,5 g de uma resina de ânion (AG 1-X8, 100-200 mesh, na forma de acetato) ao sobrenadante e a mistura foi agitada durante um minu- to. A seguir, a mistura foi centrifugada a 5000 rpm, durante 20 minutos e o sobrenadante foi decantado e usado na etapa seguinte. Foi adicionado ace- tonitrila ao sobrenadante para proporcionar uma solução a 50% e foi agitada por um minuto e centrifugada a 5000 rpm por 20 minutos. A camada inferior marrom-escura continha o intensificador de Bacillus thuringiensis. A camada marrom da parte de cima foi depois purificada por meio de cromatografia de exclusão de tamanho em duas etapas. Na primei- ra, 130 g de resina P-2 (BioRad) foram expandidos com água deionizada milliQ para empacotar uma coluna de 2,5 cm x 80 cm. A camada marrom foi concentrada usando aproximadamente quatro vezes um evaporador rotativo e 15 ml do concentrado foram colocados sobre a coluna P-2. A coluna foi eluída com água MQ sob gravidade e dez frações mínimas foram coletadas durante 12 horas (detecção por UV em 280 nm, faixa de absorbância 2,0,10 mV). A purificação posterior das frações 26-28 foi realizada mediante três vezes concentração das frações, usando um evaporador rotativo e aplicando as mesmas à coluna P-2 original. A coluna foi eluída com água MQ e dez frações mínimas foram coletadas nos primeiros 80 minutos, depois, 2 fra- ções mínimas foram coletadas nas próximas duas horas. A atividade do in- tensificador Bacillus thuringiensis eluiu nas frações 16-20 (detecção por UV em 220 nm, faixa de absorbância 2,0, 10 mV).

Exemplo 9 - Características Químicas do Intensificador são diferentes da zwittermicina A. O intensificador da presente invenção foi mostrado como sendo diferente da zwittermicina A na eletroforese capilar. O caldo integral de NRRL N° de acesso B-30087 foi cultivado em um meio de cultura de Bacil- lus, contendo farinha de soja, dextrose, extrato de levedura, KH2PO4, K2HPO4, NaCI e MgS04 x 7 H20. Foram usadas culturas em camadas para inocular frascos de agitação de 250 ml. Os frascos foram agitados a 210 rpm, a 30°C, durante 4 dias. O caldo integral de Bacillus thuringiensis B- 30087 foi injetado com zwittermicina A purificada e processado em eletrofo- rese capilar (CE). Em seguida, 30 μΙ do caldo integral de B-30087 foram inje- tados com 10 μΙ de zwittermicina A. O caldo integral de B-30087 (figura 3A), caldo integral de B-30087 com zwittermicina A (figura 3B) e zwittermicina A sozinha (figura 3C) foram processados em CE usando tampão de fosfato de sódio em pH 5,8. Os eletroferogramas gerados da CE são mostrados na fi- gura 4.

Os espectros de 1H RMN de zwittermicina A e do intensificador semipurificado de B-30087 foram registrados em D2O, com freqüência de 400 MHz. O espectro indica que 0 intensificador é diferente da zwittermicina A.

Exemplo 10 - Determinação do intensificador inseticida com Bacillus thurin- giensis. A atividade intensificadora do B. thuringiensis foi demonstrada usando o caldo integral do B.pumilus, Protocolo NRRL N° de acesso B- 30087, através de teste com ensaio de sinergia da lagarta de beterraba (Spodoptera exígua). Os ensaios foram realizados em microplacas de 96 cavidades. Cada cavidade continha um substrato de ágar sólido. Foram tes- tados 20 μΙ do caldo integral de B-30087 com uma preparação comercial de B. thuringiensis, Javelin (0,25-1,50 pg/cavidade) no bioensaio. Uma diluição em série apenas das concentrações de Javelin também foi processada.

Para testar a atividade inseticida foi preparado um substrato de ágar para as cavidades da microplaca de acordo com Marrone e outros (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293. Como controle negativo foi usado água deionizada. Duas réplicas de uma amostra de teste ou controle foram usadas para cada ensaio. As placas foram depois colocadas em uma coifa, aproximadamente de 2-3 horas para secar.

De uma a três larvas Spodoptera exigua recém-nascidas foram adicionadas a cada cavidade. A microplaca foi selada com uma substância à prova de ar, tal como Mylar® e cada cavidade ventilado com uma prensa de piN° As placas foram incubadas a 27°C por até 7 dias.

Após incubação, as cavidades foram classificadas através de notificação da mortalidade dos neonatos ou grau de desenvolvimento larval. O número de larvas mortas foi registrado. As larvas atrofiadas foram classifi- cadas com uma variação de 1 a 4. A classificação da atrofia é como segue: 4 = tamanho de controle; 3 = 75% do tamanho de controle; 2 = 50% do ta- manho de controle; 1 = 25% do tamanho de controle. Os resultados são re- sumidos na Tabela 9, abaixo.

Tabela 9 Um segundo teste foi processado usando os procedimentos aci- ma. Os resultados são resumidos abaixo, na Tabela 10.

Tabela 10 Para determinar as propriedades de intensificação inseticidas da fração semipurificada, a amostra foi testada conforme acima, usando 0,1 μg/cavidade de frações testadas. Os resultados são mostrados na Tabela 11, abaixo.

Tabela 11 Exemplo 11 - B. oumilus (B-30087) e B. subtilis (B-21661) usados como fun- gicida.

Uma cepa de B. pumilus, Protocolo NRRL N° B-30087, foi testa- da com B. subtilis, Protocolo NRRL N° B-21661, para determinar se o efeito fungicida foi maior se usado junto do que se cada cepa fosse usada individu- almente. Cada cepa foi cultivada em um fermentador de 10 litros ou 5000 li- tros, em um meio à base de farinha de soja durante aproximadamente 50 horas. Cada cepa foi testada como uma cultura de caldo integral contra o fungo cinzento de Botrytis cinerea em pimenta e míldio mole de Peronospora parasitica em Brassica. Os caldos integrais foram testados em 1X, 1/2X e 1/8X. As duas cepas foram então testadas em várias combinações umas com as outras 1/2X, 1/4X e 1/8X. Um controle de água (controle) e um fungi- cida químico (BREAK® a 20 ppm) foram também testados para compara- ção. As plantas foram classificadas baseado em uma escala de 0 a 5 (onde 5 = 100% de doença, sem nenhum controle; e 0 = 100% de controle, sem nenhuma doença). Os resultados são mostrados na Tabela 12, abaixo.

Tabela 12 Os resultados do teste de Botrytis cinerea mostram diferenças estatísticas quando as cepas são usadas em combinação, quando compara- do com as cepas sendo usadas individualmente. Por exemplo, a classifica- ção de 0,7 para B-21661 1/4X e B-30087 1/2X é estatiscamente diferente da classificação de 1,2 para B-21661 1/£X usado individualmente. Igualmente, a classificação de 1,4 para B-21661 1/8X e B-30087 1/2X é estatisticamente diferente da classificação de 1,7 para B-21661 1/8X individualmente ou 2,3 para B-30087 1/2X individualmente e a classificação tomada em conjunto é inferior à média esperada para cada cepa usada individualmente. Isso mos- tra o efeito sinergístico da utilização de cepas em conjunto para aumento da eficácia como um fungicida.

Os resultados do teste de Peronospora parasitica mostram a classificação para a combinação de B-21661 1/8X e B-30087 1/2X foram bastante melhores do que seria esperado de um efeito aditivo. Uma classifi- cação de 2,05 seria esperada se houvesse apenas um efeito aditivo da com- binação de cepas. No entanto, a classificação real foi de 0,3 mostrando que existe um efeito sinergístico definido mediante uso da combinação de cepas.

Outras classificações também mostram melhores resultados que os espera- dos, por exemplo, o B-21661 1/4X e B-30087 1/4X apresentam uma classifi- cação de 0,5, que é muito melhor do que seria esperado de apenas um efei- to aditivo (classificação estimada de 2,35) das cepas individuais. Essa mes- ma sinergia é também mostrada nas combinações de B-21661 1/2X e B- 30087 1/2X (classificação de 0,3), B-21661 1/2 X e B-30087 1/4X (escore de 0,3) e B-21661 1/2X e B-30087 1/8X (classificação de 0,5). Esses testes provam que existe um efeito sinergístico quando se utilizam as cepas em combinação e isso é um resultado inesperado.

Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades acima, que a descrição e exemplos anteri- ores são idealizados para ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da invenção se torna- rão evidentes para os versados na técnica a qual a presente invenção per- tence.

Claims (6)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma cultura de caldo integral compreendendo uma cepa de Bacillus pumilus depositada no NRRL sob o número de acesso B-30087; e (b) uma cultura de caldo integral compreendendo uma cepa de Bacillus subtilis depositada no NRRL sob o número de acesso B-21661.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o veículo compreende componentes que auxiliam a disper- são e adesão.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um pesticida químico ou biológico.

5. Método para proteger ou tratar uma planta, raiz ou fruto de uma infecção por fungos, caracterizado pelo fato de que compreende a apli- cação de uma quantidade eficaz da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, à planta, raiz ou fruto.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a infecção por fungos é causada por pelo menos um microorga- nismo selecionado do grupo que consiste em Botrytis cinerea e Peronospora parasitica.