CN102250793B

CN102250793B - 一株具有防霉作用的短小芽孢杆菌

Info

Publication number: CN102250793B
Application number: CN 201110166940
Authority: CN
Inventors: 黄建; 张成省; 孔凡玉; 王凤龙; 王静; 冯超; 马强; 林建胜; 周显升; 王新伟; 蒋光伟
Original assignee: China Tobacco Jiangxi Industrial Co Ltd; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: China Tobacco Jiangxi Industrial Co Ltd; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: CN102250793A

Abstract

本发明公开了一株防仓储片烟霉变的细菌菌株，属于植物病害生物防治领域，该菌种已于2010年8月23日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，保藏编号为CGMCC No.4116。本发明的菌株能够抑制片烟霉菌的生长，对霉菌引起的霉变有良好的防治作用，对片烟醇化有一定促进作用。本发明还公开了一种对仓储片烟具有防霉作用的微生物剂，其中有效成分为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus LZ-7的全培养液培养物或短小芽孢杆菌Bacillus pumilus LZ-7的孢子。具有生产使用成本低、使用方便、防霉效果好、促进片烟醇化等优点，克服了化学防霉剂易影响片烟品质、易形成残留等缺点。

Description

一株具有防霉作用的短小芽孢杆菌

技术领域

本发明提供一株对仓储片烟具有防霉作用的短小芽孢杆菌菌株，及其应用，属于生物防治领域。

背景技术

烟叶的自然醇化或人工发酵是提高烟叶燃吸品质和可用性的必要环节之一。片烟醇化贮藏周期长达1-2年，期间极易发生因微生物引起的霉变，使烟叶品质降低或完全失去使用价值。腐败是经细菌生长、繁殖后引起的变软、发臭性劣化。霉变是指由霉菌引起的劣化，在烟叶仓储损耗中占着很大的比例，严重影响烟叶的外观品质和香味品质，降低烟叶的使用价值，是当前储烟重要安全问题之一。2002年我国加入WTO后，储烟逐渐由片烟替代把烟，储烟霉变问题更加突出，据统计，贮烟和卷烟制品每年因霉变造成损失相当惊人，达到烟草商品总额的1％-3％。尤其是当前储烟醇化从自然醇化向人工可控醇化(增温增湿)发展趋势明显，霉变成为亟待解决的首要仓储难题。此外，霉菌能产生霉菌毒素，会严重的影响人体健康，特别是很多霉菌如黄曲霉具有致癌作用。因此，控制储烟霉变损失，除经济上需要外，也是控制微生物污染、保护环境和人类健康的需要。

片烟的防霉非常困难，这主要是由于片烟属于吸食性商品，对片烟外观和感官评吸品质有严格的要求，常规的化学防霉剂对片烟的品吸特性易造成不良影响，易产生残留，应用非常有限。为此，人们研究了密封降氧、辐射防霉、臭氧防霉等技术，均不同程度存在环境安全、影响烟叶醇化和外观品质等问题。近年来，利用植物提取物和微生物代谢产物进行片烟防霉成为研究的热点。利用烟叶表面的有益微生物进行防霉，具有成本低、使用方便、对烟叶影响小等特点。国内报道烟叶生物防霉文献有“陈货发酵期间烤烟叶面微生物活性及其应用研究[J].中国烟草科学，1997，4：13-14.”和“防烟叶霉变菌株对烟叶霉变的影响[J].生命科学研究，2004，8(3)：278-282.”。上述研究表明，烤烟表面有益微生物在仓储烟叶醇化和防霉方面有一定的应用潜力，但对片烟防霉效果以及分离菌株的分类地位等均未作深入研究。

目前，仓储片烟防霉尚无有效方法，在生产中大多通过加强仓储环境的管理(如调节环境温湿度)来避免或减少片烟霉变损失。本发明的发明人在对片烟表面微生物区系开展系统研究的基础上，筛选获得了具有防霉作用、改善片烟品质的优良菌株，在所有已申请的专利文献中均没有涉及本发明主题的文献报道。

发明内容

针对上述现有技术，针对目前片烟仓储过程中防霉的实际问题和需求，本发明筛选出一株抗霉菌活性高、防霉效果好、促进片烟醇化的新型生防细菌菌株，并据此制备出了高效的生物防霉菌剂，可应用于仓储片烟防霉。

本发明的技术方案如下：

本发明分离筛选到的对仓储片烟具有防霉作用的短小芽孢杆菌菌株，经鉴定为，菌株代号为LZ-7，命名为：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日为2010年8月23日，保藏编号为CGMCC No.4116。

所述菌株对仓储片烟具有防霉作用。实际应用时，可以将其制成微生物制剂，其有效成分为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus LZ-7的全培养液培养物或短小芽孢杆菌Bacilluspumilus LZ-7的孢子，或者进一步地，再包括一种或多种制剂学上的载体。

所述微生物制剂的制备工艺为：斜面种→摇瓶种→种子罐→生产罐→压虑→烘培→粉碎→产品(包装剂型为原粉)。

详细实施步骤为：

(1)将本发明的菌株LZ-7斜面试管种接种到肉汤培养基摇瓶中，震荡培养至对数期。

(2)将摇瓶种按种子培养基的体积比12％接种量接种入50L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养剂配方为：玉米粉。

(3)将种子液按生产罐培养基的12％接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。

(4)在种子罐和生产罐的培养过程中溶氧量为12％-18％，搅拌速度为200rpm/min，发酵温度为31℃，全流程培养时间为72h，发酵结束后菌体数量达到10¹⁰cfu/mL以上。

(5)发酵完成后，发酵液经过滤直接分装成液体剂型，或烘培成干粉经气流粉碎后分装成固体剂型。

经试验证明，本发明的菌株LZ-7能有效抑制霉菌的生长，对扩展青霉、黑曲霉、黄曲霉抑制率达70％左右，LZ-7菌悬液与霉菌孢子混合接种，则可延迟片烟发霉时间。室内防霉试验结果表明，LZ-7对仓储片烟具有一定的防霉效果，能显著延迟片烟霉变发生时间，25℃下，片烟含水率32％时，LZ-7菌剂80倍稀释液，能延迟片烟发霉时间5d，稀释40倍，延迟片烟发霉10d，稀释20倍，延迟片烟发霉15d。实仓试验结果表明，LZ-7菌剂80倍液处理片烟较对照能延迟片烟发霉时间27天。感官评吸表明，LZ-7菌剂80倍液处理片烟与对照相比，香气质、余味、杂气、刺激性等主要感官指标差异不大，香气量有一定增加，感官评吸质量有一定提高。

本发明的菌株具有抗霉菌活性强、防霉效果好、改善片烟品质以及环境安全和无污染等特点，具有广阔的应用前景。

本发明的微生物制剂具有生产使用成本低、使用方便、防霉效果好、促进片烟醇化等优点，克服了化学防霉剂易影响片烟品质、易形成残留等缺点，适合仓储片烟的生物防霉。本发明对保护环境以及消费者的身体健康，减少经济损失，提高片烟产品的质量具有重要意义。

附图说明

本发明的短小芽孢杆菌LZ-7命名为Bacillus pumilus，已于2010年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.4116，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

图1：菌株LZ-7对扩展青霉菌丝生长的抑制作用。

图2：菌株LZ-7对黑曲霉菌丝生长的抑制作用。

图3：菌株LZ-7对黄曲霉菌丝生长的抑制作用。

图4：7月23日实仓试验对照片烟霉变情况。

图5：7月23日实仓试验LZ-7的80倍液处理片烟霉变情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1生防细菌的分离与鉴定

准确称量片烟样品10.0g，装入有100mL无菌水的三角瓶中，200rpm/min摇床上震荡30min，用单层纱布过滤，将洗脱液进行4～5次10倍系列稀释，用微量移液器从低浓度到高浓度依次吸取10^-6、10^-5、10^-4各0.1mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀释度3次重复，28℃下培养48～72h。稀释度以每板50-100个单菌落为宜，挑取不同类型菌落于NA平板上纯化3次，然后划线于NA斜面，4℃保存备用。在NA培养基平皿近边缘接种3个细菌菌株，置25℃培养24h，长出菌带后，于培养皿中心点接法接种霉菌菌块

以只接霉变菌的平板为对照，每个处理3个重复，每天观察，待对照菌落长满培养皿时测量霉变菌菌落半径以及对照菌落半径，判断供试菌株抑制霉变菌的作用大小，计算各菌株对霉变菌的抑制率。通过此方法，从片烟表面共筛选出157株细菌，筛选出2个具有较强拮抗活性的菌株。

通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析，其中1株细菌被鉴定为Bacilluspumilus，菌株代号为LZ-7，于2010年8月23日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4116。抑菌试验表明，LZ-7对扩展青霉、黑曲霉、黄曲霉具有较强的拮抗作用(如图1-3所示)，抑菌试验结果如表1所示。

表1LZ-7对部分霉菌的抑制作用

霉菌	处理菌落直径/mm	对照菌落直径/mm	抑制率/％
				黑曲霉	20	70	71.43
黄曲霉	14	71	80.28
				扩展青霉	19	65	70.77

实施例2生防菌株对霉菌致霉力的影响

称取5.0g片烟装入三角瓶中，121℃灭菌20min。将菌悬液与霉菌孢子液分别按0∶1(CK2)、1∶20(v/v)、1∶40、1∶80混合，然后用医用接种器喷雾接种孢子混合液1.0mL，置28℃、85％相对空气湿度下培养，记录烟叶霉变日期，确定生防菌株对烟叶霉变的防效。以接种无菌水作对照(CK1)。结果如表2所示，细菌菌株与霉菌孢子混合接种片烟，对霉菌在片烟上的生长具有一定的抑制作用，可延迟片烟发霉时间与霉变严重程度。

表2LZ-7对部分霉菌的致霉力的影响

*霉变程度划分参照以下标准：无霉变；始霉，霉点分布稀疏，霉菌分布最大量不超过整个表面积的5％；轻度霉变，霉菌分布占整个表面积的5-20％；中度霉变，霉菌分布占整个表面积的20-50％；重度霉变，霉菌分布占整个表面积的50％以上，或整个表面布满菌丝。

实施例3生防菌剂对片烟防霉的室内试验

将LZ-7菌株菌悬液分别稀释至20倍、40倍和80倍，分别用医用接种器喷雾接种20mL至100g片烟上(片烟含水率约32％)，塑料袋密封，以无菌水作对照，每处理重复3次，置28℃下培养，记录烟叶霉变日期，确定生防菌株对烟叶霉变的防效，结果如表3所示，LZ-7对片烟霉变具有一定的防治效果，能显著延迟片烟霉变发生时间，LZ-7菌株稀释80倍，能延迟片烟发霉时间7d，稀释40倍，延迟片烟发霉15d，稀释20倍，延迟片烟发霉21d。

表3生防菌剂对片烟防霉的室内试验

处理	霉变时间(d)
		LZ-7菌株20倍稀释液	28
LZ-7菌株40倍稀释液	22
		LZ-7菌株80倍稀释液	14
无菌水(CK)	7

实施例4生防菌剂实仓实验效果

2007年12月21日处理，处理方法为在复烤线上装箱前对复烤后片烟喷雾，浓度为生防菌剂80倍稀释液，喷雾量为片烟质量的1％左右(喷雾后片烟含水率控制在12.5％以下，复烤后片烟含水率约为10-11％)，以清水喷雾为对照，置于自然仓储条件下，所用片烟产自山东诸城，等级为C3F。处理后半年，于2008年6月21日进行取样感官评吸。2008年7月10日，对照开始发霉，生防细菌处理片烟于7月23日开始发霉，延迟发霉时间13d。7月23日对照和LZ-780倍稀释液处理片烟分别如图4、图5所示。感官评吸结果如表4所示，生防菌剂处理片烟评吸质量有一定程度的改善，与对照相比，香气质、余味、刺激性等主要感官指标差异不大，香气量有一定增加，杂气有一定程度降低，感官评吸质量有一定提高。

表4LZ-7菌剂处理对片烟感官评吸质量的影响

Claims

1.一株具有防霉作用的短小芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），其菌种已于2010年8月23日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4116；所述霉是指黑曲霉、黄曲霉和扩展青霉。

2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌在仓储片烟防霉中的应用。

3.一种对仓储片烟具有防霉作用的微生物制剂，其特征在于：其中有效成分为短小芽孢杆菌CGMCC No.4116的全培养液培养物或短小芽孢杆菌CGMCC No.4116的孢子；所述霉是指黑曲霉、黄曲霉和扩展青霉。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于：还包括制剂学中的常规载体。

5.权利要求3所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将本发明的短小芽孢杆菌CGMCC No.4116斜面试管种接种到肉汤培养基摇瓶中，震荡培养至对数期；

（2）将摇瓶种按种子培养基的体积比12%接种量接种入50L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养剂配方为：玉米粉；

（3）将种子液按生产罐培养基的12%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

（4）在种子罐和生产罐的培养过程中溶氧量为12%-18%，搅拌速度为200rpm/min，发酵温度为31℃，全流程培养时间为72h，发酵结束后菌体数量达到10¹⁰cfu/mL以上；

（5）发酵完成后，发酵液经过滤直接分装成液体剂型，或烘培成干粉经气流粉碎后分装成固体剂型。

6.权利要求3所述的微生物制剂在仓储片烟防霉中的应用。