CN105018369B - 一种高温细菌地衣芽孢杆菌及其防治烟叶霉变应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高温细菌地衣芽孢杆菌及其防治烟叶霉变应用。本发明属于农业微生物技术领域，也涉及防治仓储陈化烟叶霉变的技术领域。所述的防治烟叶霉变菌株命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）B‑3，已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2014年10月20日，保藏编号为CCTCC NO：M 2014499。本发明的地衣芽孢杆菌B‑3是一种分离于玉溪烟厂陈化烟叶的高温细菌，防治仓储烟叶霉变效果显著，具有对人、畜安全，环境友好，提高仓储烟叶品质等优点。

Description

一种高温细菌地衣芽孢杆菌及其防治烟叶霉变应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域和防治仓储陈化烟叶霉变的技术领域，具体地说，本发明涉及利用一种人工分离的高温微生物菌株，该微生物适用于防治仓储陈化烟叶霉变。所述的高温微生物是高温细菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）B-3。本发明还包括该微生物防治仓储陈化烟叶霉变的应用。
背景技术
仓储烟叶霉变是个全球性的问题，在烟叶仓储损耗中占很大的比例，每年损失巨大。目前，在防治仓储烟叶霉变方面的技术措施主要有控制烟叶入库水分含量、控制仓库空气相对湿度、仓库喷洒化学药剂消毒、改善烟叶包装条件等。这些措施虽然对减少烟叶霉变起到一定作用，但在实际生产中，很难达到理想的仓储环境条件，烟叶中的霉菌一旦遇到适宜的温湿度条件，烟叶就会发生霉变，并迅速蔓延。
据报道，引起仓储烟叶霉变的微生物类群有130属231种，类群十分复杂，这可能也是烟叶霉变防治难的原因。目前利用生物方法防治烟叶霉变的研究不多，使用化学药剂预防烟叶霉变有较好的效果，但随着吸烟与健康问题的引入，化学药剂污染环境以及残留问题急需解决，最好的防治方法就是进行生物防治，研究表明微生物防治方法是一种比较有效环保的方法，利用生物之间产生拮抗的机理，可以通过拮抗菌株抑制烟叶霉变。
目前国内相关研究还比较少，朱大恒等研究证明烤烟叶面优势菌种混合配制成生物制剂(TFA)具有抑制烟叶霉变的作用，韩锦峰等将分离筛选到的几株优势菌混合配制成生物制剂(TFA)用于烟叶发酵，结果发现TFA既可加速烤烟发酵，提高烟叶品质，同时具有抑制烟叶霉变的作用。李梅云等利用烟叶上的优势菌来抑制烟叶霉变菌株，但效果不稳定。
烟叶的储藏阶段会“发热出汗”，它是烟叶的陈化阶段，也是烟叶极易发生霉变的时期。仓储阶段是在一个相对较高温度下进行的，关于高温细菌防治烟叶霉变的研究鲜见报道，高温细菌可以在高温环境中仍有很好的活力，可望获得较好的烟叶防霉变效果。来源于陈化烟叶的高温细菌，在仓储陈化烟叶上生长有更强的适应性优势，抑制烟叶霉变有很好的前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对目前仓储烟叶霉变不易得到很好控制，提供一株适用于防治仓储陈化烟叶霉变的高温微生物即地衣芽胞杆菌的新菌株，利用该微生物地衣芽孢杆菌B-3菌株能够防治仓储烟叶霉变，提高仓储陈化烟叶品质。
本发明所述地衣芽孢杆菌B-3系从云南玉溪烟厂陈化烟叶中分离获得，为一种防治仓储陈化烟叶霉变的高温细菌菌株，已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2014年10月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2014499。
本发明所述高温细菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）B-3应用于防治仓储陈化烟叶霉变。
本发明所述的地衣芽孢杆菌B-3菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16SrDNA序列由1430个碱基组成。
用BLAST程序对B-3菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）(登录号FJ641025)的16S rDNA序列同源性达到99.9％ 。
构建了B-3菌株的系统发育进化树，B-3菌株与Bacillus licheniformisFJ641025聚在一起，鉴定菌株B-3为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）B-3。
本发明的优点在于地衣芽孢杆菌B-3具有对人体安全健康和环境友好的特点，而且在环境温度25℃～55℃对防治仓储陈化烟叶霉变有显著效果，特别在环境温度高温时也对仓储陈化烟叶霉变有明显防治效果。
附图说明
图1为本发明所述的地衣芽孢杆菌B-3在固体培养基上培养特征（正面）。
图2为本发明所述的地衣芽孢杆菌B-3菌体特征（扫描电镜4000倍）。
图3为本发明所述的地衣芽孢杆菌B-3菌株的系统发育进化树，分支节点上的数字表示经过1000次bootstrap分析所支持的结果，线段标尺0.005表示0.5%的序列差异的分支长度。
具体实施例
本发明是采用从云南烟叶上分离到的高温细菌—地衣芽孢杆菌B-3作为发酵菌株，来防治仓储陈化烟叶霉变的效果测定。
地衣芽孢杆菌B-3以烟叶液体培养基为原料，通过液态发酵方式，获得菌液，配制适宜比列，对烘烤烟叶进行喷洒，菌液的细胞浓度108CFU/mL ，按5-15%质量比的用量对烘烤烟叶喷洒，可以达到防治仓储陈化烟叶霉变的作用，也缩短了烟叶陈化时间。
本发明的地衣芽孢杆菌分类命名为地衣芽孢杆菌B-3（Bacillus licheniformis）B-3，已在保藏单位保藏.
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年10月20日，保藏编号为CCTCC NO： M 2014499。
1.地衣芽孢杆菌芽胞杆菌B-3的鉴定
地衣芽孢杆菌B-3（CCTCC M 2014499）的菌落形态特征：在烟叶粉末培养基上，菌落表面粗糙皱褶，扁平不透明，边缘不整齐，粘着，扩展，褐色，24h后菌落直径为4mm，如图1所示。
地衣芽孢杆菌B-3菌株的细胞形态特征：
革兰氏染色呈阳性，杆状，大小为0.5μm～0.9μm×1.70μm～3.1μm，芽孢近中生，能运动。如图2所示。
地衣芽孢杆菌芽胞杆菌B-3的生理生化特征：生长温度20～70℃，适宜生长温度25～55℃，pH4～9， 明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、蛋白水解、甲基红试验、V.P试验、接触酶试验、氧化酶试验均为阳性，柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用甘露糖、阿拉伯糖、木糖产酸，不能利用麦芽糖、鼠李糖产酸。
本发明所述的地衣芽孢杆菌B-3菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16SrDNA序列由1430个碱基组成。用BLAST程序对B-3菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的地衣芽孢杆菌( Bacillus_ licheniformis登录号：FJ641025)的16S rDNA序列同源性达到99％ ，构建了B-3菌株的系统发育进化树，如图3所示。鉴定其为地衣芽孢杆菌。
所述的地衣芽胞杆菌B-3 菌株的16S rRNA 的核苷酸序列，如序列表所示。
本发明的地衣芽胞杆菌B-3 菌株的应用方法是：菌种活化→种子液制备→发酵培养→配制菌液适宜浓度→喷洒烟叶→仓储（人工陈化）→卷烟。
地衣芽胞杆菌B-3 菌株的种子液体培养基(g/L)：烟叶粉末1，酵母粉3，蛋白胨5，NaCl 3，pH自然。
发酵培养基(g/L)：烟叶粉末1，酵母粉3，蛋白胨5，NaCl 3，pH自然。
稀释液 (g/L)：烟叶粉末1.5，pH自然。
地衣芽胞杆菌B-3 菌株的发酵培养的条件为180rpm，37℃，12h。
2. 分子生物学特征：16SrDNA基因序列测定
对地衣芽胞杆菌B-3 细胞进行DNA提取，对菌株的16SrDNA片段进行PCR并测序，在NCBI上进行比对，确定各菌株种类。
PCR体系具体如表1：
表1 PCR体系（50μL）：
总体积 50.0ul
Template DNA 1.5ul
Forward primer（PA） 1.0 ul
Reverse primer（PB） 1.0 ul
10×Easytaq Buffer 5.0 ul
dNTPs(2.5mM) 4.0 ul
Easytaq DNA Polymerase 0.5 ul
ddH2O 37.0 ul
表1中，Forward primer（PA）序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。Reverse primer（PB）序列为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
PCR扩增条件：
1. 94℃ 5min
2. 95℃ 1min
3. 56℃ 1min
4. 72℃ 2min
5. 循环2---4 步骤 33次
6. 72℃ 10min
7. 16℃ 恒温。
16SrDNA 测序结果：
GCTATACATGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTGCAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAA。
3. 地衣芽胞杆菌B-3 菌株Meg5.1建树
对地衣芽胞杆菌B-3 菌株的16S rDNA序列图谱校正，提交GenBank，并在GenBank，EMBL，DDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，比较测试菌株与模式菌株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。
菌株间的序列比较用Clustal.x软件完成。用Neighbor—Joining方法进行分子系统学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树，见图3。
4. 发酵菌剂制备
取地衣芽胞杆菌B-3菌种，在无菌条件下（超净工作台），用灭菌竹签挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体LB培养基试管（15×150mm）中，置培养箱内38℃活化培养1～2天。
取出活化1～2天的斜面菌种，在无菌条件下，以同样方式接入菌种到已灭菌的种子液体培养基中，在35℃，转速180rpm下摇床培养1～2天，即为地衣芽胞杆菌B-3菌株发酵种子菌液。如图1所示。
发酵采用250ml玻璃三角瓶，装入种子液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，取出冷却后放置35℃培养箱过夜，无杂菌污染即可确认灭菌彻底，可用于后续发酵培养。
在无菌条件下，取地衣芽胞杆菌B-3种子液，接种于装有100ml发酵液体培养基的250ml玻璃三角瓶中，接种量为5～15%（v/w），置35℃通气培养2～3天。在发酵期间，注意发酵室温度变化，检查有无染菌现象。
发酵完毕，收集发酵液，以8000r/min ～ 11000r/min ，离心5min ～ 15min，弃上清液得到湿菌体，或进一步将湿菌体制备成粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。将保存的湿菌剂用稀释液按1：100稀释，稀释好的菌液浓度为109 cfu/mL，对烤烟烟叶喷洒。
上述用于防治仓储陈化烟叶霉变的发酵工艺应用工艺步骤是：用5mL稀释液将湿菌体重悬后，获得浓度为109 cfu/mL的菌液，均匀喷洒到50g 烟叶上，以等量无菌去离子水为对照。
将喷好的烟叶置于28℃～ 45℃，相对湿度30％～ 90％条件下储藏陈化36h ～480h，烟叶储藏陈化温度范围为：28℃～ 45℃，相对湿度范围为30％～ 90％，储藏陈化时间为48～480h，36h后每天观察烟叶变化，记录烟叶霉变情况，确定生防菌株对烟叶霉变的防效。
具体步骤如下：
取保藏号为CCTCC NO ：M201499 的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）B-3菌株的发酵液离心，收集菌体弃上清，取湿菌体，用稀释液将其稀释至109 cfu/mL 制备成菌液，采用无菌去离子水作对照。
将制备好的地衣芽孢杆菌B-3的菌液按8%比重均匀喷洒到烟叶上，烟叶样品为云南玉溪烟厂打叶复烤好准备入库仓储陈化的K326中部烟叶，将处理好的烟叶放置于人工气候箱，气候箱温度35℃，湿度80％，在人工气候箱储藏陈化20天。
36h后开始每天观察烟叶变化，记录烟叶霉变情况，确定生防菌株对烟叶霉变的防效。
地衣芽孢杆菌B-3菌剂对抑制烟叶霉变效果很明显。加入地衣芽孢杆菌B-3菌剂的烟叶到第17天出现霉菌白色菌丝，之前16天未观察到霉菌菌丝。而对照CK（清水）却在第5天就出现霉菌菌丝了，第11天烟叶上布满了霉菌菌丝及一些孢子。
同时，加入B-3菌剂的比没有加的对照CK（清水）的陈化烟叶颜色变深的速度慢。地衣芽孢杆菌B-3菌剂能够较好的抑制仓储烟叶霉变，提高烟叶品质。
本发明得到的防治仓储陈化烟叶霉烂的高温菌地衣芽孢杆菌B-3，具有易培养，发酵速度快，防治效果好，是一株新的防治陈化烟叶霉变的高温菌菌株。烟叶经该微生物处理后，防治陈化烟叶霉变效果明显。
地衣芽孢杆菌B-3（Bacillus licheniformis）16SrDNA基因序列：
gctatacatgcaagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaa

Claims (3)

1.一种用于防治仓储烟草霉变的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B-3，其已在保藏单位CCTCC保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014499。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌防治仓储烟草霉变的应用，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B-3是一株高温菌，应用于防治仓储烟草霉变，提高仓储烟叶品质。
3.如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌防治仓储烟草霉变的应用，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌B-3制备成菌剂后加入稀释液中，获得终浓度为108cfu/mL～1011cfu/mL菌液，稀释液为烟叶粉末1.5g/L和水混合组成；混合均匀后按5-15％质量比对烘烤烟叶喷洒，用于防治仓储烟草霉变。
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