CN104498372B - 尖孢镰刀菌bm201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备方法和应用 - Google Patents

尖孢镰刀菌bm201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种尖孢镰刀菌BM201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备方法和应用，其中尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌BM201，尖孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No.9108。本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201能同时产聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶、半纤维素酶等多种果胶酶，形成复合果胶酶。由于所产复合果胶酶中各种酶的比例协调，相互作用因而将其用于去除植物果实表皮时，能提高对果实表皮去除率，提高生产效率。该菌株还能用于分解果皮等废渣，减轻环境污染，变废为宝。

Description

尖孢镰刀菌BM201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及产果胶酶菌领域，特别地，涉及一种尖孢镰刀菌BM201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备方法和应用。
背景技术
果胶类物质是由多个D-乳糖醛酸通过α-1,4糖苷键相互连接形成的直链状聚合物。果胶类物质广泛存在于植物初生壁和细胞间隙中，构成相邻细胞中间层黏结物。同时果胶类物质还能与纤维素和半纤维素等非淀粉多糖交织在一起形成细胞壁。
果胶酶是一种能够分解果胶质类物质的复合酶，由于果胶类物质广泛存在于植物细胞的各个部位中，现有技术多通过果胶酶对植物细胞中的果胶进行分解，以破坏植物细胞结构和植物组织结构。果胶酶可用于植物中生物活性物提取的前处理过程中，广泛应用于果汁澄清、麻类脱胶、纺织行、造纸、饲料、环境保护及污水处理等行业。另外，果胶酶在果实脱皮方面的应用也有较好的前景，它能够降低脱皮过程中对果肉的能耗，减少废水的排放，提高产品的安全性。
基于果胶酶的特性及广泛用途，目前有关产果胶酶微生物的筛选、发酵条件优化等的研究异常活跃，成为生物酶制剂领域中的一个新的研究热点。目前能够生产微生物果胶酶的菌种很多，来源极其广泛，主要包括细菌、真菌、放线菌，其中以曲霉和杆菌研究报道为多。
脐橙加工中脱囊衣工艺目前主要采用传统柑橘罐头酸碱处理的工艺，需人工剥皮、分瓣，生产效率低；酸碱囊衣用水量大，环境污染严重；脱除囊衣后的橙汁胞易受污染，降低了产品的安全性；现有脱囊衣工艺不适合处理具有囊衣厚、囊衣与果实结合紧密结构的脐橙去皮果球。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种尖孢镰刀菌种新菌株。
本发明的第二个目的在于提供上述菌株在生产复合菌剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供上述菌株产生的复合果胶酶。
本发明的第四个目的在于提供上述复合果胶酶在分解植物果实外皮中的应用。
本发明的第五个目的在于提供上述复合果胶酶在含果肉饮料和/或罐头中的应用。
本发明的第六个目的在于提供上述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果实中囊衣的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌为尖镰孢BM201，尖孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No.9108。
根据本发明的另一方面还提供了一种上述菌株的发酵培养方法，培养基：包括脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物；发酵条件：28～32℃，pH5.0～6.0，压力为0.06MPa～0.08MPa，搅拌速度50～70r/分钟，通空气量8L/分钟，发酵72～120小时产酶量达到峰值。
根据本发明的另一方面还提供了一种由上述尖孢镰刀菌菌株产生的复合果胶酶。
进一步地，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶中任一或其中任意种的混合物。
进一步地，聚半乳糖醛酸酶的平均酶活为10300U/mL以上，果胶裂解酶的平均酶活为320U/mL以上，果胶酯酶的平均酶活为11400U/mL以上，纤维素酶的平均酶活为5300U/mL以上，半纤维素酶的平均酶活为198U/mL以上。
根据本发明的另一方面还提供了一种含上述尖孢镰刀菌菌株和/或上述复合果胶酶的果胶分解剂。
根据本发明的另一方面还提供了一种含有上述的果胶分解剂的含果肉饮料或食品罐头。
根据本发明的另一方面还提供了一种复合果胶酶的制备方法，包括以下步骤：1)制备发酵液：发酵培养权利要求1菌株，得到发酵液；2)分离复合果胶酶粗品：将所得发酵液离心取上清，加硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为75～80g/mL，离心后对沉淀进行半透膜透析处理取袋内物为复合果胶酶粗品；3)提纯：对复合果胶酶粗品进行干燥浓缩后再过滤除菌，得到复合果胶酶。
进一步地制备发酵液步骤包括活化步骤、种子培养步骤和发酵步骤，活化步骤中所用活化培养基包括8～10g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物、1.5～2.0g/L(NH4)2SO4、1.0～1.5g/L K2HPO4、0.5～1.0g/L KCl、0.5～0.8g/LMgSO4、0.1～0.2g/LFeSO4、0.01～0.02g/L EDTA铁钠盐、0.5～0.8g/L牛胆盐和1.5～2％琼脂，活化培养基pH 5.0～6.5；种子培养步骤中所用种子培养基和液体发酵步骤中所用发酵培养基包括15g/L～20g/L脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物、2g/L～2.5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L～1g/L MgSO4、1g/L～2g/L K2HPO4和1g/L～2g/L KCl；发酵培养基和种子培养基灭菌条件为121℃下灭菌30分钟；活化步骤：将菌种接种至活化培养基上，在28℃～32℃下培养2～3天，将所得孢子配成1.5×105～2×106个/mL的孢子悬浮液；种子培养步骤：将装瓶量3～5％的孢子悬浮液接种至种子培养基在28～32℃，120～150r/分钟下培养36小时，得到种子菌液；发酵步骤：将装罐量10～15％的种子菌液接入发酵培养基中，在28～32℃，pH 5.0～6.0，压力0.06～0.08MPa，搅拌速度50～70r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下发酵72～120小时，得到发酵液。
进一步地，分离复合果胶酶粗品步骤包括以下步骤：1)对发酵液在5000～7000r/分钟下离心15～20分钟，取上清进行超滤，取滤液加无水硫酸铵，得到硫酸铵酶液；2)对硫酸铵酶液在8000～10000r/分钟下离心25～30分钟，取沉淀，用pH 6～6.5的0.01mol/L柠檬酸缓冲液对所得沉淀进行半透膜透析，4℃下处理18～24小时，每隔3～4小时更换一次柠檬酸缓冲液，取袋内物为复合果胶酶粗品。
根据本发明的另一方面还提供了一种将上述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果实中囊衣的方法，包括以下步骤：含囊衣植物果实去皮后得到囊衣果球；将经过保温激活后的复合果胶酶溶液加入囊衣果球中，得到果球混合物，在40～50℃，pH3.5～5.5下恒温果球混合物得到果球；保温激活为将复合果胶酶溶液置于40～50℃水浴中保温30分钟，以提高酶活性。
进一步地，植物果实为脐橙和/或柑橘时，按料液体积比为1:3将10～15％的复合果胶酶溶液加入囊衣果球中，恒温时间为1.5～2.5小时；恒温步骤中每隔30分钟对果球混合物进行搅拌。
根据本发明的另一方面还提供了一种按上述方法到的果球，果球表面囊衣覆盖面积小于果球表面积5％，果球出汁率为57％以上，透光率为36％以上。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201能同时产聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶、半纤维素酶等多种果胶酶，形成复合果胶酶。由于所产复合果胶酶中各种酶的比例协调，相互作用因而将其用于去除植物果实表皮时，能提高对果实表皮去除率，提高生产效率。该菌株还能用于分解果皮等废渣，减轻环境污染，变废为宝。
本发明提供的方法将该菌株所产复合果胶酶能用于柑橘类果实脱囊衣生产，提供囊衣去除效率，提高生产效率。
本发明提供的复合果胶酶发酵方法以廉价的脐橙、柑橘及柚皮果渣废弃物作为BM201的碳源和诱导物，采用液态深层发酵方式生产复合果胶酶，工艺简单、稳定、产量高、成本低。所得复合果胶酶不仅可避免柑橘传统酸碱去囊衣法存在的生产效率低、重金属残留、产品质量不稳定，还可用于对加工副产物进行资源综合利用，降低生产成本。
本发明中所用尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201菌株于2014年4月22日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称，CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，邮编100101。保藏编号为CGMCCNo.9108，该菌的分类命名为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1从左至右是本发明优选实施例的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201菌株的在活化培养基上28℃～32℃下培养2～3天的菌落示意图、菌落局部放大示意图和菌丝形态示意图；
图2从左至右是本发明优选实施例的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201菌株产生的分生孢子、分生孢子梗、孢子囊的形态示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。(注意可选和优选混合使用)
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本文中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100mL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。
本发明提供了一种尖孢镰刀菌，该尖孢镰刀菌为保藏证明上的建议分类命名为尖镰孢，鉴定参据的生物材料样品为BM201。尖孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No.9108(Fusarium oxysporum)BM201，该菌株通过以下手段获得：
1、菌株的初筛
菌株初筛所用土壤样品采集于邵阳市武冈县级市某处常年种植(种植脐橙时间大于10年)脐橙的果园。将土壤样品用无菌水进行10倍梯度稀释，取稀释度为10-3的菌悬液，接种于筛选培养基上，在30℃下培养3天后，分别测量水解圈、菌落直径的大小，选择水解圈直径/菌落直径相对较大的菌株进行复筛。
其中所用筛选培养基配方为8～10g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物，1.5～2.0g/L(NH4)2SO4，1.0～1.5g/L K2HPO4，0.5～1.0g/L KCl，0.5～0.8g/LMgSO4，0.1～0.2g/L FeSO4，0.01～0.02g/L EDTA铁钠盐，0.5～0.8g/L牛胆盐，0.01～0.02g/L刚果红；1.5-2％琼脂，pH5.0～6.5。
2、菌株的复筛
将保存的水解圈直径/菌落直径相对较大的菌株接种于种子培养基中，在30℃下120r/分钟振荡培养2～3天，得到发酵液，分别测定所得发酵液中聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶中的酶活，对同时产聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶酶活最高的菌株进行平板划线分离，得到尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201。
种子培养基的配方：15g/L～20g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物、2g/L～2.5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L～1g/L MgSO4、1g/L～2g/LK2HPO4、1g/L～2g/L KCl。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201的鉴定
1、菌落形态、菌体及孢子显微镜观察
参见图1和图2，在活化培养基上28℃～32℃下培养2～3天后所得菌落形态。所形成的菌落的菌丝高为3～5mm，菌落中产生大量呈棉絮状的气生菌丝，气生菌丝为白色，菌丝质密。从培养基顶面俯视观察所得菌丝，菌丝呈浅粉色，营养菌丝呈辐射状。分生孢子梗单生、细长，所产生的孢子中较小的分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞形成卵形、梨形或肾形。
其中活化培养基由干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物8～10g/L，(NH4)2SO41.5～2.0g/L，K2HPO41.0～1.5g/L，KCl0.5～1.0g/L，MgSO40.5～0.8g/L，FeSO40.1～0.2g/L，EDTA铁钠盐0.01～0.02g/L，牛胆盐0.5～0.8g/L，琼脂1.5～2％，pH5.0～6.5。
2、pH值及3％NaCl耐受性
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201的生长pH范围为3.0～8.5，在含3％NaCl的条件下不能生长。
3、18SrDNA序列分析
(1)DNA的提取
提取尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201的DNA。
提取DNA的方法可以为常规方法，例如离心收集菌丝，液氮研磨充分后，加入400μLDNA提取buffer，充分混匀。65℃水浴，15分钟。加入130μL3MKAC，冰浴5分钟。加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，充分混匀。4℃下13000rpm离心10分钟。上清转入新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，4℃下12000rpm离心15分钟，收集沉淀，用75％乙醇漂洗3次，晾干后溶于50μLddH2O，即得到尖孢镰刀菌BM201的DNA。
(2)18SrDNA序列的PCR扩增
以提取的尖孢镰刀菌BM201DNA作为模板,用真菌通用引物(f63～GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；lr3～GGTCCGTGTTTCAAGACGG)扩增BM201菌株的18SrDNA序列。PCR反应体系为50μL，体系：基因组DNA2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，10PCRbuffer5μL，dNTP1μL，Taq酶0.5μL，ddH2O32.5μL。
PCR反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸10分钟。PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA纯化试剂盒回收目的DNA片段。回收方法及步骤见DNA纯化试剂盒说明书，将回收的18SrDNA片段送测序公司测序。
(3)18SrDNA序列分析
所得18SrDNA片段通过在美国国立生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)的BLASTS搜索比对获得同源性分析结果列于表1中。
表1尖孢镰刀菌BM201的18S rDNA BLASTS搜索比对同源性结果表
BLASTS搜索比对菌株 登录号 覆盖率 相似度
FusariumoxysporumstrainNig KM246761.1 99％ 100％
FusariumoxysporumstrainC～2 KJ623246.1 99％ 100％
FusariumoxysporumstrainF345 JX045827.1 99％ 100％
FusariumoxysporumstrainFoD2A8 KC202938.1 99％ 100％
FusariumoxysporumisolateFoxySIN9 KC577181.1 99％ 100％
由表1可知，BM201的18SrDNA序列比对结果显示尖孢镰刀菌BM201与多株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的同源性达到100％，结合该菌株的菌落形态、菌体及孢子显微镜观察结果，鉴定BM201为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。BM201的18S rRNA gene提交到美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)，获得登录号(Accession)为KF857541。
4、BM201为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201发酵过程OD及发酵液颜色变化
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201发酵培养过程OD值的总体变化趋势都是随着培养发酵时间的延长而增加。在发酵初期(1～2d)的发酵液颜色与培养基配置时的颜色相同，没有明显的变化；在发酵中期(3～5d)，BM201发酵液的颜色发生明显变化，3d时淡奶红色，在5d颜色加深，转变为浅红色。
本文中植物残渣是指植物的根茎叶、花、果实等不可食用或可选择为不可食用的部分。
本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201至少能够产生一种复合果胶酶，该复合果胶酶可以通过聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶中总计酶活来表征。由于该菌可以产生复合果胶酶，而果胶与纤维素、半纤维素等非淀粉多糖又交织在一起形成植物细胞壁。高等植物细胞壁中含约35％的果胶物质、30％的纤维素、30％的半纤维素。因而采用该菌的酶产物可以将各种植物果实的表皮或细胞壁中的果胶分解，从而将交织的细胞壁结构打散，以利于其他酶进入细胞中或进入果实中。
发酵所得发酵液经过提纯、浓缩后，测定其中各酶的平均酶活聚半乳糖醛酸酶的平均酶活为10300U/mL以上，果胶裂解酶的平均酶活为320U/mL以上，果胶酯酶的平均酶活为11400U/mL以上，纤维素酶的平均酶活为5300U/mL以上，半纤维素酶的平均酶活为198U/mL以上。当然所得发酵液中所含酶的种类并不限于此。但至少包括这些酶。
本发明另一发明还提供了一种含有BM201菌株的复合菌剂。该复合菌剂中可以包括各种细菌。该复合菌剂至少具有分解果胶酶的作用。当BM201菌株作为复合菌剂使用时，其加入量可以根据所处理物料的质量进行选择。当加入BM201菌株较多时，分解果胶时间缩短，分解果胶的量增加。该复合菌剂中至少含有1cfu/mL的BM201菌株干粉。
本发明另一方面还提供了一种含有该菌株的果胶分解剂。该果胶分解剂至少具有分解果胶的作用。果胶分解剂中至少含有1cfu/mL的BM201菌株干粉。为了保证含有该菌株的果胶分解剂的使用效果，在使用过程中至少包括将果胶分解剂加入待分解物料中，搅拌均匀，堆肥发酵至少1周的操作。该果胶分解剂至少可以用于发酵植物残渣以获取具有肥田效果的肥料，此时加入量可根据所处理植物残渣的量进行选择，至少加入植物残渣质量千分之一以上的果胶分解剂。
本发明另一方面还提供了一种由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201发酵产生的复合果胶酶。产生复合果胶酶的发酵方法可以采用本领域常用方法，如固体发酵、液体发酵均可。优选为液体深层发酵。所得复合果胶酶至少包括聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶。同时复合果胶酶中各酶的比例达到最高果胶分解速度。这是由于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201所产复合果胶酶中各果胶分解酶可以分别作用于植物各部分结构中的相应果胶上，将果胶与纤维素、植酸等物质分离。还能用于促进植物中的纤维素、淀粉等物质的分离。从而有效降解植物中的果胶。该复合果胶酶可用于医药、食品、营养菌剂等各个领域中，发挥分解果胶的作用。复合果胶酶中各酶酶活的具体值为聚半乳糖醛酸酶10300U/mL、果胶裂解酶320U/mL、果胶酯酶11400U/mL、纤维素酶5300U/mL、半纤维素酶198U/mL。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201所用培养基至少包含脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物。可以在培养尖孢镰刀菌的常用培养基中加入脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物即可，加入量以脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物发挥碳源和诱导物作用为限，即所加入该混合物即要能发挥碳源和诱导物的作用，又不能浪费物料。优选该混合物以干粉状加入时，菌株对该混合物的利用率达到最高。该混合物的干粉可以通过干燥、制粉步骤获得。
BM201的活化培养基可以为包括干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物8～10g/L，(NH4)2SO41.5～2.0g/L，K2HPO41.0～1.5g/L，KCl0.5～1.0g/L，MgSO40.5～0.8g/L，FeSO40.1～0.2g/L，EDTA铁钠盐0.01～0.02g/L，牛胆盐0.5～0.8g/L，琼脂1.5～2％，pH5.0～6.5。此时菌株的活化效果达到最优，活化所需时间最短，能将菌株最大限度的活化。
BM201的种子培养基和发酵培养基可以为包括脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物15g/L～20g/L、(NH4)2SO42g/L～2.5g/L、MgSO40.6g/L～1g/L、K2HPO41g/L～2g/L、KCl1g/L～2g/L。采用该培养基菌株的发酵产酶量能快速达到峰值，并持续最长时间的峰值，并使菌株在有限的生命过程中，生产出最大量的酶。
本发明另一方面还提供了一种含有该复合果胶酶的果胶分解剂。该果胶分解剂至少具有分解果胶的作用。该果胶分解剂中至少含有该果胶分解剂质量千分之一的复合果胶酶浓缩物，复合果胶酶浓缩物中复合果胶酶含量为100％。该果胶分解剂至少可以用于发酵植物残渣以获取具有肥田效果的肥料，此时加入量可根据所处理植物残渣的量进行选择，至少加入植物残渣质量千分之一以上的果胶分解剂。该果胶分解酶使用过程中至少包括将该果胶分解酶加入待分解物料中搅拌发酵至少半小时的操作。
本发明另一方面还提供了一种包含复合果胶酶和BM201菌株的果胶分解剂。该果胶分解剂中复合果胶酶含量和BM201菌株的加入量与其分别加入量相同。使用方法也可以参照分别加入时的使用方法。该果胶分解剂至少具有分解果胶的作用。
上述任一果胶分解剂可以用于发酵肥料、去除植物果实非果肉部分、分解植物果实非果肉部分残渣的应用中。
本发明另一方面还提供了一种含有上述任一种或多种果胶分解剂的含果肉饮料或食品罐头。果胶分解剂至少可以用于生产含果肉饮料过程中，除去果肉表面非可食用部分的过程中。如用于处理柑、橘、橙等水果，以制取饮料中均匀悬浮分散多颗果肉粒的饮料。果胶分解剂至少可以用于生产食品罐头过程中，除去非可食用部分，留下可食用的果肉部分。此处的食品罐头中所用食品包括黄桃、荔枝、桂圆、梨。果胶分解剂在含果肉饮料或食品罐头中的质量含量至少大于0.0001％。
本发明另一方面提供了一种复合果胶酶的制备方法1)制备发酵液：发酵培养上述BM201菌株，得到发酵液；2)分离复合果胶酶粗品：将得到的发酵液离心取上清，加硫酸铵至浓度为75～80g/mL，离心后对沉淀进行半透膜透析处理弃去上清，得到复合果胶酶粗品；3)干燥：对复合果胶酶粗品进行干燥浓缩后再过滤除菌，得到复合果胶酶。
该制备方法中制备发酵液可以按常规方法进行。优选制备发酵液步骤包括活化步骤、种子培养步骤和发酵步骤。
优选其中活化步骤为将菌种接种至活化培养基上，在28℃～32℃下培养2～3天，将所得孢子配成1.5×105～2×106个/mL的孢子悬浮液。在此条件下进行活化能将菌种中菌株最大程度的激活，提高其产酶活性。活化步骤中所用培养基与前述活化培养基相同。
优选其中种子培养步骤将装瓶量3～5％的孢子悬浮液接种至种子培养基在28～32℃，120～150r/分钟下培养36小时，得到种子菌液。此处的装瓶量是指所加孢子悬浮液占种子培养步骤中所用培养器皿总容积的体积比。培养器皿可以为三角瓶、摇瓶等常用培养容器。在此条件下培养，能提高提高菌株的活性，保证后续液体发酵工程中种子的活力。
优选其中发酵步骤：将装罐量10～15％的种子菌液接入发酵培养基中，在28～32℃，pH5.0～6.0，0.06～0.08MPa，搅拌速度50～70r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下发酵72～120小时，得到发酵液。装罐量是指所加种子菌液占发酵步骤中所用发酵器皿总容积的体积比。发酵器皿可以为发酵罐、发酵桶等体积较大的容器。在该条件下发酵，能提高菌株的产酶活力，延长菌株处于产酶峰值的时间，提高酶产量。
优选发酵步骤和种子培养步骤中所用培养基配方相同，均为前述种子培养、发酵培养基。为了减少杂菌的污染，而影响种子培养和发酵过程中，菌株的长势还需对种子培养和发酵培养步骤中所用培养基进行灭菌处理。优选灭菌条件为121℃下灭菌30分钟。在此条件下灭菌效率最高，还能防止培养基中所用脐橙废弃混合物物失效。
为了获得具有较高酶活的复合果胶酶，还需对发酵后所得发酵液进行分离和提纯。分离可以按以下步骤进行：将所得发酵液离心取上清，向所得上清液中加入硫酸铵，至所得溶液中硫酸铵的浓度为75～80g/mL时止。对所得溶液进行离心处理。对离心后所得沉淀进行半透膜透析处理，取袋内物为复合果胶酶粗品。按此条件处理发酵液能使复合果胶酶在硫酸铵的作用下形成沉淀于其他杂质分开，便于后续处理。加入硫酸铵后溶液的硫酸铵浓度为75～80g/mL时，能保证分离后的沉淀中酶活保留最全面，最高。优选所加硫酸铵为无水的，减少杂质加入量，加快溶液中硫酸铵浓度的升高速度，提高生产效率。
优选对发酵液的离心处理条件为在5000～7000r/分钟下离心15～20分钟。此时能降低菌体的破碎程度，使得部分菌体可以再次进入发酵步骤中进行发酵。按此条件离心后得到的上清优选经过超滤除杂，能提高杂质的去除率。在对所得滤液中加入无水硫酸铵或硫酸铵。当溶液中硫酸铵浓度达到预设值后，得到硫酸铵酶液。
优选对所得硫酸铵酶液在8000～10000r/分钟下离心25～30分钟，取沉淀加入由半透明制成的透析袋中，将透析袋浸入pH6～6.5的0.01mol/L柠檬酸缓冲液中，4℃下处理18～24小时，每隔3～4小时更换一次柠檬酸缓冲液，取袋内物为复合果胶酶粗品。按此条件进行离心后半透析处理，能减少所得粗品中酶活损失。保证酶活竟可能高。透析过程中，半透析袋口需密封。
所得复合果胶酶粗品还需置于旋转蒸发仪中浓缩或置于冷冻干燥机中干燥浓缩，浓缩液经过过滤除菌后即得到复合果胶酶制剂。
本发明另一方面还提供了一种上述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果实中囊衣的方法，含囊衣植物果实去皮后得到囊衣果球，将复合果胶酶溶液加入囊衣果球中，得到果球混合物，在40～50℃，pH3.5～5.5下恒温果球混合物得到果球。
此处的含囊衣植物果实是指如柚子、柑、橘、橙类植物果实中所含，处于果肉与外皮之间，包覆果实果肉部分的物质。也是通常意义上植物果实所特有的结构。由于橙的果肉更易破碎，因而该方法用于处理橙果肉效果较现有方法为好。当然也可以用于处理其他更加容易出去囊衣的果实。由于囊衣位于果实外皮与果肉之间，因而在使用该方法或使用该复合果胶酶除去囊衣时，首先要将果实的外皮去除。可以通过人工、机械设备去除。得到囊衣果球。将复合果胶酶溶液加入囊衣果球中，搅拌均匀，得到果球混合物。复合果胶酶溶液为复合果胶酶溶于水。复合果胶酶溶液的质量百分比可以根据待处理果球上囊衣的厚度进行调整。优选用于处理脐橙时，按料液体积比为1:3将10～15％的复合果胶酶溶液加入囊衣果球中。此时脐橙表面的囊衣能最大程度的去除，同时能避免果胶酶对果肉的分解作用，提高所得果肉颗粒的完整度。
复合果胶酶溶液酶活最高的条件为40～50℃，pH3.5～5.5。在此条件下，复合果胶酶能充分发挥分解果胶的作用，酶活能长期维持在较高的程度，缩短分解时间，提高分解深度和效率。优选用于处理脐橙和/或柑橘时恒温果球混合物1.5～2.5小时得到果球。此时脐橙和/或柑橘果球表面的囊衣去除较完整，生产效率较高。更优选处理脐橙时pH值为4.0～5.5，恒温时间为1.5小时。此时除去脐橙囊衣效率达到最高。为了提高复合果胶酶的酶活，还需在使用前对复合果胶酶溶液进行保温激活，此处的保温激活指的是将复合果胶酶溶液置于40～50℃水浴中保温30分钟，以提高酶活性。
在恒温过程中，为了提高酶反应活性，防止局部酶浓度过高导致果肉受损，还可在恒温期间每隔30分钟对果球混合物进行搅拌，提高反应活性。
本发明另一方面还提供了一种按上述方法处理后得到的果球，该果球表面的囊衣覆盖面积小于果球表面积5％，果球出汁率为57％以上，透光率为36％以上。该果球仅为饮料生产过程中的中间产物，经过后续处理，果球可被加工成分散的果肉颗粒，此时果球表面囊衣的覆盖率越低，则所得果肉颗粒的完整性，悬浮能力都得到提高。
实施例
下述实施例和对比例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
所得复合果胶酶制剂酶活测定：根据相关文献报道及国标的方法进行测定，所用方法可以参考以下文献：
测定其中聚半乳糖醛酸酶的酶活：Panda T,Naidu G,Sinha J.Multiresponseanalysis of microbiological parameters aff ecting the production ofpectolytic enzymes by Aspergillus niger:a statistical view.ProcessBiochem.1999,35:187-195.
测定其中果胶裂解酶的酶活：Maller A.,da Silva T.,Damásio A.,et al.,Production of pectin lyase by Aspergillus niveus under submerged and solidstate fermentations using agro-industrial residues as carbon sources[J].Int.Res.J.Microbiol.2012,3:029-035.
测定其中果胶酯酶的酶活：分钟gqiang T.,Purification and properties ofpectinesterase produced by Aspergillus niger SL2-111[J].Food and FermentationIndustries.2010,1:015.
测定其中纤维素酶的酶活：GB/T 23881-2009饲用纤维素酶活性的测定：滤纸法
测定其中半纤维素酶的酶活：Dhillon G.S.,Kaur S.,Brar S.K.,et al.,Potential of apple pomace as a solid substrate for fungal cellulase andhemicellulase bioproduction through solid-state fermentation[J].IndustrialCrops and Products.2012,38:6-13.
复合果胶酶的制备方法
实施例1
(1)活化：将冷冻保藏的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)BM201菌株经过固体斜面活化培养基后，用灭菌的去离子水配成1.5×105个/mL的孢子悬浮液。活化温度28℃，活化时间为2天。
活化培养基：干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物8g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L，EDTA铁钠盐0.01g/L，牛胆盐0.5g/L，琼脂1.5％，pH5.0。
(2)种子培养：取摇瓶装瓶量3％的孢子悬浮液接入到种子培养基中，在28℃，120r/分钟，培养36h后作为大规模发酵生产的种子菌液；
种子培养所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物15g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO40.6g/L、K2HPO41g/L、KCl1g/L。
(3)液态深层发酵培养：取发酵罐装液量的10％的种子液接入发酵产酶培养基中，在28℃，pH5.0，压力为0.06MPa，搅拌速度50r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下连续发酵72小时，收集发酵液。
发酵所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物15g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO40.6g/L、K2HPO41g/L、KCl1g/L。
(4)发酵液在5000r/分钟离心15分钟，上清超滤除杂后，取滤液加入无水硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为75g/mL后，在8000r/分钟下离心25分钟，将所得沉淀装入透析袋中，夹好袋口置于pH6的0.01mol/L柠檬酸缓冲液中，4℃半透膜透析处理18小时，期间3小时更换一次柠檬酸缓冲液。收集透析袋中物质，置于旋转蒸发仪中浓缩或置于冷冻干燥机中干燥浓缩，浓缩液经过过滤除菌后即得到复合果胶酶制剂，根据需要可制作成不同的剂型。
结果：所得复合果胶酶制剂酶活为：聚半乳糖醛酸酶10300U/mL、果胶裂解酶320U/mL、果胶酯酶11400U/mL、纤维素酶5300U/mL、半纤维素酶198U/mL。
实施例2
(1)活化：将冷冻保藏的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201菌株经过固体斜面活化培养基后，用灭菌的去离子水配成2×106个/mL的孢子悬浮液。活化温度32℃，活化时间为3天。
活化培养基：干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合10g/L，(NH4)2SO42.0g/L，K2HPO41.5g/L，KCl1.0g/L，MgSO40.8g/L，FeSO40.2g/L，EDTA铁钠盐0.02g/L，牛胆盐0.8g/L，琼脂2％，pH6.5。
(2)种子培养：取摇瓶装瓶量5％的孢子悬浮液接入到种子培养基中，在32℃，150r/分钟，培养36h后作为大规模发酵生产的种子菌液；
种子培养所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物20g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO41g/L、K2HPO42g/L、KCl2g/L。
(3)液态深层发酵培养：取发酵罐装液量的15％的种子液接入发酵产酶培养基中，在32℃，pH6.0，压力为0.08MPa，搅拌速度70r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下连续发酵120小时，收集发酵液。
发酵所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物20g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO41g/L、K2HPO42g/L、KCl2g/L。
(4)发酵液在7000r/分钟离心20分钟，上清超滤除杂后，取滤液加入无水硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为80g/mL后，在10000r/分钟下离心30分钟，将所得沉淀装入透析袋中，夹好袋口置于6.5的0.01mol/L柠檬酸缓冲液中，4℃半透膜透析处理24小时，期间4小时更换一次柠檬酸缓冲液。收集透析袋中物质，置于旋转蒸发仪中浓缩或置于冷冻干燥机中干燥浓缩，浓缩液经过过滤除菌后即得到复合果胶酶制剂，根据需要可制作成不同的剂型。
结果：所得复合果胶酶制剂酶活为：聚半乳糖醛酸酶10300U/mL、果胶裂解酶320U/mL、果胶酯酶11400U/mL、纤维素酶5300U/mL、半纤维素酶198U/mL。
实施例3
(1)活化：将冷冻保藏的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201菌株经过固体斜面活化培养基后，用灭菌的去离子水配成2×105个/mL的孢子悬浮液。活化温度30℃活化时间为2.5天。
活化培养基：干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物9g/L，(NH4)2SO41.7g/L，K2HPO41.6g/L，KCl0.7g/L，MgSO40.6g/L，FeSO40.15g/L，EDTA铁钠盐0.015g/L，牛胆盐0.7g/L，琼脂1.7％，pH5.5。
(2)种子培养：取摇瓶装瓶量4％的孢子悬浮液接入到种子培养基中，在30℃，125r/分钟，培养36h后作为大规模发酵生产的种子菌液；
种子培养所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物18g/L、(NH4)2SO42.4g/L、MgSO40.7g/L、K2HPO41.6g/L、KCl1.5g/L。
(3)液态深层发酵培养：取发酵罐装液量的14％的种子液接入发酵产酶培养基中，在30℃，pH 5.5，压力为0.07MPa，搅拌速度60r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下连续发酵100小时，收集发酵液。
发酵所用培养基：脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物18g/L、(NH4)2SO4 2.3g/L、MgSO4 0.8g/L、K2HPO4 1.7g/L、KCl 1.2g/L。
(4)发酵液在6000r/分钟离心17分钟，上清超滤除杂后，取滤液加入无水硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为79g/mL后，在9000r/分钟下离心28分钟，将所得沉淀装入透析袋中，夹好袋口置于pH6的0.01mol/L柠檬酸缓冲液中，4℃半透膜透析处理20小时，期间3小时更换一次柠檬酸缓冲液。收集透析袋中物质，置于旋转蒸发仪中浓缩或置于冷冻干燥机中干燥浓缩，浓缩液经过过滤除菌后即得到复合果胶酶制剂，根据需要可制作成不同的剂型。
结果：所得复合果胶酶制剂酶活为：聚半乳糖醛酸酶10300U/mL、果胶裂解酶320U/mL、果胶酯酶11400U/mL、纤维素酶5300U/mL、半纤维素酶198U/mL。
含复合果胶酶和/BM201菌株的果胶分解剂
实施例1
促进芦笋浆液中纤维素沉降的复合菌剂，由20份植物乳杆菌、20份乳酸乳球菌、20份枯草芽抱杆菌、4份α～淀粉酶、2份复合果胶酶和10份斛皮素组成。其中复合果胶酶按复合果胶酶制备方法中实施例1的方法制备得到。
实施例2
促进芦笋浆液中纤维素沉降的复合菌剂，由30份植物乳杆菌、30份乳酸乳球菌、30份尖孢镰刀BM201菌、7份α～淀粉酶、5份复合果胶酶和15份斛皮素组成。其中复合果胶酶按复合果胶酶制备方法中实施例1的方法制备得到。
将以上实施例1～2中所得复合菌剂用于中国发明申请公布号为104041765A专利公开文件中，用于对芦荟进行处理，并对产物进行检测，能再现该专利中的实验结果。同时由于使用了本申请中的复合果胶酶，能提高沉淀率1％。
实施例3
促进红薯淀粉浆液沉降的复合菌剂，由植物乳杆菌CICC21790 20～30份、德氏乳杆菌乳酸亚种CICC607720～30份、尖孢镰刀BM201菌20～30份、木瓜蛋白酶4～7份、纤维素酶2～5份、半纤维素酶2～5份、果胶酶2～5份、五倍子蹂酸10-15份组成。
将以上实施例3中所得复合菌剂用于中国发明申请申请号为201410101106.0公开文件中，用于对红薯进行处理，并对所得产物进行检测，能再现该专利中的实验结果。同时由于使用了本申请中的复合果胶酶，能提高沉淀率1％。
取复合果胶酶制备方法中实施例3中所得复合果胶酶，将其用于除去含囊衣植物果实中囊衣的方法
实施例1
称取脐橙果径65mm及以下果实5kg，经全自动削皮机削皮及两端打孔后，得到约4kg脐橙的囊衣果球，备用。将浓缩的复合果胶酶制剂以10的比例稀释后并搅拌均匀，放入恒温水浴锅中并保持在40℃，然后倒入囊衣果球(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到4.0，恒温2小时，期间每30分钟搅拌一次，即得到脐橙果球。所得果球表面囊衣残留覆盖率为5％。橙汁胞完整，无破碎情况出现。
实施例2
称取柑橘5kg，剥皮分瓣后得到约3.8kg橘瓣，备用。将浓缩的复合果胶酶制剂以15％的比例稀释后并搅拌均匀，放入恒温水浴锅中并保持在50℃，然后倒入备用的橘瓣(料液比1:3)，用柠檬酸调pH值到5.5，恒温处理1.5小时，期间每30分钟轻轻搅拌一次，即得到脱囊衣的橘瓣，橘瓣所得果球表面囊衣残留覆盖率为1％。橙汁胞完整，无破碎情况出现。
实施例3
柑橘或脐橙剥皮，得到囊衣果球备用。将浓缩的复合果胶酶制剂以4％的比例稀释后并搅拌均匀，放入恒温水浴锅中并保持在45℃，然后加入囊衣果球，用柠檬酸调pH值到4，处理2.2小时，期间每30分钟轻轻搅拌一次，得到果球。对果球采用榨汁机榨汁，榨汁率为60％，所得果汁的透光率为38％。
实施例4
与实施例1的区别在于处理对象为去皮柚子果球。果球表面囊衣残留覆盖率为4％。橙汁胞完整，无破碎情况出现。
含果胶分解剂的含果肉饮料或食品罐头
实施例1
将除去含囊衣植物果实中囊衣的方法中实施例3所得果汁，在100℃下保温10分钟杀菌后制成饮料。
实施例2
将除去含囊衣植物果实中囊衣的方法中实施例2所得果球，经过分散、果汁调配，在在100℃下保温10分钟杀菌后制成含果肉饮料。
由以上实施例可见，本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)BM201所产复合果胶酶一方面能用于分解含囊衣植物果实果球表面的囊衣，同时还能在榨汁过程中降解其中规定囊衣，提高出汁率和果汁透光率。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种尖孢镰刀菌，其特征在于，所述尖孢镰刀菌为尖镰孢BM201，所述尖孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No.9108。
2.权利要求1所述尖孢镰刀菌菌株的发酵培养方法，其特征在于，
培养基：包括脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中的一种或多种；
发酵条件：28～32℃，pH5.0～6.0，压力为0.06MPa～0.08MPa，搅拌速度50～70r/分钟，通空气量8L/分钟，发酵72～120小时产酶量达到峰值。
3.由权利要求1所述尖孢镰刀菌菌株产生的复合果胶酶。
4.根据权利要求3所述的复合果胶酶，其特征在于，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的复合果胶酶，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸酶的平均酶活为10300U/mL以上，所述果胶裂解酶的平均酶活为320U/mL以上，所述果胶酯酶的平均酶活为11400U/mL以上，所述纤维素酶的平均酶活为5300U/mL以上，所述半纤维素酶的平均酶活为198U/mL以上。
6.含权利要求1所述尖孢镰刀菌菌株和/或权利要求3所述复合果胶酶的果胶分解剂。
7.一种含有权利要求6所述的果胶分解剂的含果肉饮料或食品罐头。
8.一种复合果胶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备发酵液：发酵培养权利要求1所述尖孢镰刀菌，得到发酵液；
2)分离复合果胶酶粗品：将所得所述发酵液离心取上清，加硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为75～80g/mL，离心后对沉淀进行半透膜透析处理取袋内物为复合果胶酶粗品；
3)提纯：对所述复合果胶酶粗品进行干燥浓缩后再过滤除菌，得到复合果胶酶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备发酵液步骤包括活化步骤、种子培养步骤和发酵步骤，
所述活化步骤中所用活化培养基包括8～10g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中的一种或多种、1.5～2.0g/L(NH4)2SO4、1.0～1.5g/L K2HPO4、0.5～1.0g/L KCl、0.5～0.8g/L MgSO4、0.1～0.2g/L FeSO4、0.01～0.02g/L EDTA铁钠盐、0.5～0.8g/L牛胆盐和1.5～2％琼脂，所述活化培养基pH 5.0～6.5；
所述种子培养步骤中所用种子培养基和所述发酵步骤中所用发酵培养基包括15g/L～20g/L脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中的一种或多种、2g/L～2.5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L～1g/L MgSO4、1g/L～2g/L K2HPO4和1g/L～2g/L KCl；
所述发酵培养基和所述种子培养基灭菌条件为121℃下灭菌30分钟；
所述活化步骤：将所述尖孢镰刀菌接种至所述活化培养基上，在28℃～32℃下培养2～3天，将所得孢子配成1.5×105～2×106个/mL的孢子悬浮液；
所述种子培养步骤：将装瓶量3～5％的所述孢子悬浮液接种至种子培养基在28～32℃，120～150r/分钟下培养36小时，得到种子菌液；
所述发酵步骤：将装罐量10～15％的所述种子菌液接入所述发酵培养基中，在28～32℃，pH 5.0～6.0，压力0.06～0.08MPa，搅拌速度50～70r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下发酵72～120小时，得到所述发酵液。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述分离复合果胶酶粗品步骤包括以下步骤：
1)对所述发酵液在5000～7000r/分钟下离心15～20分钟，取上清进行超滤，取滤液加无水硫酸铵，得到硫酸铵酶液；
2)对所述硫酸铵酶液在8000～10000r/分钟下离心25～30分钟，取沉淀，用pH 6～6.5的0.01mol/L柠檬酸缓冲液对所得沉淀进行半透膜透析，4℃下处理18～24小时，每隔3～4小时更换一次柠檬酸缓冲液，取袋内物为复合果胶酶粗品。
11.一种将权利要求3所述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果实中囊衣的方法，其特征在于，包括以下步骤：
所述含囊衣植物果实去皮后得到囊衣果球；
将经过保温激活后的所述复合果胶酶溶液加入所述囊衣果球中，得到果球混合物，在40～50℃，pH3.5～5.5下恒温所述果球混合物得到果球；
所述保温激活为将所述复合果胶酶溶液置于40～50℃水浴中保温30分钟，以提高酶活性。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述植物果实为脐橙和/或柑橘时，按料液体积比为1:3将10～15％的所述复合果胶酶溶液加入所述囊衣果球中，恒温时间为1.5～2.5小时；
所述恒温步骤中每隔30分钟对所述果球混合物进行搅拌。
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