CN114480201A - 一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其制备有机肥的应用 - Google Patents

一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其制备有机肥的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其制备有机肥的应用。本发明自山东省青岛市黄岛区海水浴场采集含腐烂浒苔水样分离菌株，通过降解实验筛选到对浒苔有降解作用的菌株需钠弧菌(Vibrio natriegens)HT‑7，该菌株保藏编号为CGMCC NO.23444。由于该菌株能够高效降解浒苔粗蛋白，可充分降解浒苔制备有机肥，所制成的有机肥均能促进不同科属多种植物生长，具有促生广谱性。同时，该菌株菌剂生产成本低，设备简单，反应温和，适合大规模工业生产，在浒苔的有效处置方面表现出良好应用潜力。

Description

一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其制备有机肥的应用
技术领域
本发明涉及一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其制备有机肥的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
浒苔(Enteromorpha prolifera)是一种大型绿藻，俗称苔条、海苔，为绿藻门石莼目石莼科植物。近年来，浒苔等藻类大量繁殖导致的海水富营养化现象已成为海洋环境污染的重要表现，而在治理过程中打捞上来的大量藻体难于处置。目前，临时堆存和填埋是常用的浒苔快速处置方式，但该过程会产生次生污染，主要包括滤渗滤液和恶臭气体对环境的影响。因此，如何实现浒苔无害化综合利用成为当前的研究热点。
由于浒苔中含有丰富的粗蛋白、多糖和粗纤维，浒苔可作为多种资源化利用的有效原料，如生物堆肥，包括生产液体肥和固体肥、饲料生产、食品加工进而能源利用等。但是，浒苔的高效降解成为制约浒苔资源化的重要因素。目前，降解浒苔方法主要包括物理法和化学法，但这两种方式存在一定弊端，如化学法中的酸降，由于作用条件剧烈，对底物专一性差，而且在降解过程中硫酸多糖的硫酸基易被水解脱落，增加了分离纯化的难度且成本高；物理降解方式像自然发酵效率低且不灵活。因此，通过筛选微生物降解菌去解决浒苔降解过程中低效、成本高等问题成为行之有效的途径。
但目前对于浒苔高效降解菌研究少之又少。专利CN108239613 B公开了一种饲料类芽孢杆菌、其培养基及在制备浒苔多糖降解酶中的应用，其微生物保藏编号为CGMCCNO.12912，该菌株产生的浒苔多糖降解酶具有良好的酶活性，但未见将该菌株应用于工业生产。专利 CN103695344 A公开了一种芽抱杆菌菌株及其筛选方法和应用，其微生物保藏编号为 CGMCC NO.8269，该菌株具有产纤维素酶的能力，能有效地将浒苔中的纤维素类物质降解为还原糖，同样缺少浒苔综合利用工艺。由此可见，目前在浒苔高效降解菌利用方面菌株种类极少，也未见需钠弧菌降解浒苔的报道，更未见需钠弧菌对浒苔降解生产有机肥进行资源化利用的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌及其应用，本发明首先筛选到一株具有显著降解浒苔粗蛋白能力的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HT-7，采用该菌株降解浒苔制备的浒苔降解蛋白有机肥原浆能促进不同科属多种植物生长，具有促生广谱性。
本发明所提供的菌株HT-7分离自山东省青岛市黄岛区海水浴场采集的含腐烂浒苔的水样，是通过降解实验筛选到的对浒苔有降解作用的高效菌株，结合形态学及基因序列测定结果，鉴定该菌株为需钠弧菌(Vibrio natriegens)。该菌株已于2021年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23444，保藏单位地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经实验证明：该菌株具有显著降解浒苔粗蛋白的能力，在浒苔处理及有机肥的制备领域具有广阔前景。
上述需钠弧菌HT-7的菌株特征是：在NA培养基上呈不规则圆形，颜色为淡黄色，表面光滑、湿润，边缘整齐，直径为1～2mm。
本发明还提供了上述需钠弧菌HT-7的发酵方法，其特征是，将需钠弧菌HT-7的种子液按照1％～2％接种量接种到发酵培养基中，恒温20±2℃发酵培养24±4h，得到其发酵液(发酵菌剂)，其发酵培养基为(重量比)：葡萄糖1.5～2％、淀粉1.8～2％、酵母浸粉1.3～1.5％、鱼蛋白胨0.3～0.5％、硫酸镁0.04～0.06％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、碳酸钙0.5～0.8％，pH值 7.2±0.1。
本发明还提供了上述需钠弧菌HT-7在降解浒苔制备有机肥方面的应用，上述的降解浒苔包括降解浒苔的粗蛋白、多糖、粗脂肪和干物质，尤其是粗蛋白。
本发明还提供了一种采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，包括以下步骤：
①浒苔前处理：将收集的浒苔进行淡水冲泡漂洗，去除盐分；然后充分粉碎；
②将粉碎的浒苔与水充分混合(质量比1.5～2.5:1)，然后送入发酵罐；
③按照1.0～5.0％(质量比)的接种量接入需钠弧菌HT-7发酵液，接种完成后维持罐温 20±2℃发酵5～6天，发酵完成后出罐，过滤。液体即为浒苔降解蛋白有机肥原浆，可搭配其余中微量元素生产多品种有机肥；剩余固体可作为畜禽饲料生产原料。
进一步的，接种需钠弧菌HT-7发酵液的过程中不通气；接种完成后充分搅拌发酵，仅少量通气(通气量为0.2:1M.M/V)，发酵3天；此后大量通气(通气量为1:1M.M/V)继续充分搅拌发酵2～3天。
本发明的技术效果是：
1、本发明提供的需钠弧菌HT-7，该菌株的发酵菌剂处理浒苔后，在降解浒苔粗蛋白中展现出其高效性，其粗蛋白降低12.3％，干物质、多糖类、粗脂肪含量也有不同程度的降低。
2、需钠弧菌HT-7发酵菌剂与充分粉碎的浒苔有效混合后，发酵5d后浒苔即被充分降解，所产液体可作为有机水溶肥生产原料，所制成的有机肥均能促进不同科属多种植物生长，具有促生广谱性。
3、需钠弧菌HT-7易于发酵生产，生产成本低，设备简单，反应温和，适合大规模工业生产，在浒苔的有效处置方面表现出良好应用潜力。
附图说明
图1为需钠弧菌HT-7的菌落形态；
图2为在试管内需钠弧菌HT-7处理不同天数后浒苔外观状态；
图3为在密封袋中需钠弧菌HT-7菌剂处理浒苔9d后的外观状态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：菌株的分离与鉴定
1.菌株HT-7分离
利用稀释涂布法在NA培养基上进行分离，样品是从山东省青岛市黄岛区海水浴场采集的含腐烂浒苔的水样。具体分离方法如下：
(1)灭菌：所用培养皿、枪头、无菌水等实验用品在0.1MPa，121℃条件下高压灭菌30min，备用；
(2)菌样稀释：按9:1比例将水样与打碎腐烂浒苔混合，置于含玻璃珠的无菌三角瓶中， 120r/min条件下振荡30min，四层无菌纱布过滤即得菌样；取6支含9mL无菌水的试管，依次编号10-1～10-6；从三角瓶中吸取1mL菌样放入标有10-1试管中，即为10-1稀释度；再从标有10-1稀释度的菌液中取1mL放入放入标有10-2试管中，即为10-2稀释度；运用相同的方法依次制成10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的菌样；
(4)培养基制备
分离培养基，即NA培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、NaCl 5g、琼脂15g、水1000mL， pH值7.3±0.1；
纯化培养基同分离培养基；
(5)涂布：将稀释菌样10-3、10-4、10-5、10-6分别涂布于分离培养基平板上，每个梯度3皿，并在皿底做上标记；
(6)培养：涂布完成后，于20℃条件下恒温倒置培养3d左右，观察；
(8)菌株纯化：利用接种钩挑取单菌落，在含有纯化培养基的平板上划线，于20℃条件下恒温倒置培养3d，挑单菌。
结果显示，共计分离得到8株细菌，并分别编号HT-1～HT-8。
2.菌株HT-7筛选
将上述分离得到的不同编号菌株利用摇瓶培养的方法(参见实施例2)培养24h分别制备各个菌株摇瓶培养液；称取5g新鲜浒苔置于试管中，保持紧实度一致；在各试管中加入1 mL不同菌株摇瓶菌剂，塞紧塞子，提供厌氧环境；置于20℃条件下，5d后进行观察。
结果显示，处理5d后接种HT-7菌剂的浒苔开始变黑；接种HT-1和HT-3菌剂的浒苔颜色由绿色变浅。以上结果初步说明，HT-1、HT-3和HT-7具有降解浒苔的功能，HT-7的效果要优于其他菌株。接下来，我们以HT-7为研究对象进行后续研究。
表1不同菌株对浒苔降解情况汇总
Figure BDA0003505054180000041
判断活性级别的标准为：“浒苔开始发黑”为“+++”级，“浒苔变褐色，且水化”为“++”级，“浒苔由绿色变浅”为“+”级，“浒苔不变色”为“－”级。
3.菌株HT-7形态学及分子生物学鉴定
(1)形态学特性：该菌株在NA培养基上呈不规则圆形，颜色为淡黄色，表面光滑、湿润，边缘整齐，直径为1～2mm(参照图1)。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
AGTAATGGTTAAACTACCTACTTCTTTTGCAGCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGG TGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATT CCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTTTGGGAT TCGCTCACTTTCGCAAGTTGGCCGCCCTCTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCC TACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGC AGTCTCCCTGGAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAAACAAGGATAAGGGTTGCGCTCGT TGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTC TCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGG TAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCATTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTAACGCGTTA GCTCCGAAAGCCACGGCTCAAGGCCACAACCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGG ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCATCTGAGTGTCAGTATCTG TCCAGGGGGCCGCCGTTCGCCACCGGTATTCCTTCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTAC ACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAGTACTCTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCTATTCCGA GGTTGAGCCCCGGGCTTTCACATCTGACTTAACAAACCACCTGCATGCGCTTTACGCCC AGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGC CGGTGCTTCTTCTGTCGCTAACGTCAAATAAAGCATCTATTAAACCCAAAACCTTCCTCA CGACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCA GGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGT CTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCCTTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTAGGCATATCCTGACGCGAGAGGCCCGA AGGTCCCCCTCTTTGGCCCGTAGGCATCATGCGGTATTAGCCATCGTTTCCAATGGTTATC CCCCACATCAGGGCAATTTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGACGCCGTTAAC GTCCCCCGAAGGTTCAGTTAACTCGTTTCCGCTCGACTGCATGGTAGTCAGCGCCAGC
菌株HT-7经形态学及分子生物学鉴定为需钠弧菌(Vibrio natriegens)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年9月18日，保藏编号为CGMCC NO.23444。
实施例2：需钠弧菌HT-7发酵菌剂制备
(1)用接种环沾取少量纯化好的菌株于盛有10mL种子液培养基的50mL三角瓶中，120r/min、20℃条件下恒温培养24h，即为种子液；
种子液培养基，即含NB培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、NaCl 5g、水1000mL，pH 值7.3±0.1；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到发酵培养基中，接种量为1.5％，恒温20℃发酵培养24h，得到需钠弧菌HT-7的发酵液(摇瓶菌剂)，其活菌数2～5×1010cfu/g。在摇瓶中进行各菌株的发酵可得到各菌株的摇瓶菌剂。
发酵培养基(质量比)：葡萄糖2％、淀粉1.8％、酵母浸粉1.5％、鱼蛋白胨0.4％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、碳酸钙0.6％，水1L，pH7.2±0.1。
实施例3：需钠弧菌HT-7降解功能研究
(1)需钠弧菌HT-7降解浒苔功能验证
参见实施例2制成需钠弧菌HT-7的发酵菌剂；称取5g新鲜浒苔置于试管中，保持紧实度一致；在试管中加入1mL需钠弧菌HT-7菌剂，对照组加入1mL发酵培养基；每一处理重复3次；均塞紧塞子，提供厌氧环境；置于20℃条件下，分别在3d、5d、7d和9d观察，记录浒苔外观状态。
结果发现，与对照相比，在施加需钠弧菌HT-7菌剂3d后，浒苔颜色由绿色变为浅色；处理5d后，浒苔变褐颜色加深，开始水化；处理7d后，浒苔开始发黑；处理9d后，浒苔全部发黑(参照图2)。综上研究结果，初步证明我们筛选得到的HT-7具有优良的降解浒苔能力，此结果与筛选结果相一致；同时说明需钠弧菌HT-7菌剂降解功能稳定。
(2)需钠弧菌HT-7降解能力检测
参照实施例2制成需钠弧菌HT-7的发酵菌剂；称取1Kg新鲜浒苔置于密封袋中；在密封袋中加入200mL需钠弧菌HT-7菌剂，对照组加入200mL发酵培养基；每一处理重复3 次；密封，提供厌氧环境；置于20℃条件下，在9d观察，记录浒苔外观状态。
通过烘干称重法、苯酚-硫酸法、凯氏半微量定氮法和索氏提取法分别检测了处理前后浒苔干物质含量、多糖含量、粗蛋白含量以及粗脂肪含量，并统计了四个指标含量变化，如表 2所示。
结果分析显示，经需钠弧菌HT-7菌剂处理9d后，浒苔已部分发黑且已水化(参照图3)；对照组浒苔部分颜色开始变浅；这初步说明需钠弧菌HT-7具有很强的降解浒苔能力。通过对处理前后浒苔干物质、多糖、粗蛋白及脂肪的含量检测发现，经需钠弧菌HT-7菌剂处理后，干物质降低25.5％，多糖类物质降低9.7％，粗蛋白降低12.3％，粗脂肪降低3.1％(参照表2)，其降解粗蛋白能力显著。
表2需钠弧菌HT-7处理后浒苔相关成分含量变化
Figure BDA0003505054180000061
同时，我们将浒苔充分发酵降解后的降解物送至苏州斯坦德实验室科技有限公司上机检测，对其葡萄糖、氨基酸及多肽总量和脂肪酸含量进行检测。结果显示，经需钠弧菌HT-7 降解后，浒苔降解物主要成分为小分子葡萄糖、氨基酸、多肽及脂肪酸，含量分别为39.6％、 18.5％和0.1％，其降解粗蛋白能力显著。
表3需钠弧菌HT-7处理后浒苔降解物主要成分
Figure BDA0003505054180000062
实施例4：浒苔降解蛋白有机肥原浆效果研究
(1)工艺路线
在筛选需钠弧菌HT-7及功能初步验证基础上，我们将HT-7处理浒苔工艺路线进行了研究。
①浒苔前处理：将收集的浒苔进行淡水冲泡漂洗，去除盐分，重复3～5次；通过粉碎机进行充分粉碎。
②将粉碎浒苔与水充分混合(质量比2:1)，进入10吨的发酵罐，罐装80％；
③按照1.5％接种量接入需钠弧菌HT-7发酵菌剂(实施例2制备)，边进料边接入需钠弧菌HT-7发酵菌剂；维持转速60～80r/min，此时不通气。
④接种完成后，维持罐温20℃，100r/min充分搅拌发酵，仅少量通气(通气量为0.2:1 M.M/V)，发酵3d。
⑤发酵3d后大量通气(通气量为1:1M.M/V)，维持罐温20℃，120r/min充分搅拌发酵 2d。
⑥发酵完成后出罐，过滤，液体即为浒苔降解蛋白有机肥原浆，可搭配其余中微量元素生产多品种有机肥；剩余固体可作为畜禽饲料生产原料。
(2)浒苔降解蛋白有机肥原浆对不同作物生长的作用
为了验证浒苔降解蛋白有机肥原浆促生性，选取不同的科属(葫芦科、十字花科、豆科以及茄科)中的有一定经济价值的材料进行相关促生性实验。
实验组：取移栽后长势一致植物材料，将生产的浒苔降解蛋白有机肥原浆稀释500倍进行灌根实验，接种量75mL/棵；对照组：每棵接种75mL水；每周浇水两次。接种15d后，比较对照组与实验组植物长势，对相关生长指标进行检测。结果发现，接种了浒苔降解蛋白有机肥原浆对不同科属的材料具备不同程度的促进生长作用，尤其是对茄科作物具有更为明显的促进作用；其中辣椒株高提高25％，西红柿株高提高22.24％，叶面积及干重均在一定程度上提高。这说明，利用HT-7处理后浒苔得到浒苔降解蛋白有机肥原浆可作为有机水溶肥制作的原材料，可搭配其余元素制作新型有机肥。
表4浒苔降解蛋白有机肥原浆对不同作物生长的影响
Figure BDA0003505054180000071
Figure BDA0003505054180000081
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛中尚奇生物科技有限公司
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cgattaacgc tcgcaccctc cgtattaccg cggctgctgg cacggagtta gccggtgctt 960
cttctgtcgc taacgtcaaa taaagcatct attaaaccca aaaccttcct cacgactgaa 1020
agtgctttac aacccgaagg ccttcttcac acacgcggca tggctgcatc aggcttgcgc 1080
ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg tctcagttcc 1140
agtgtggctg atcatcctct cagaccagct agggatcgtc gccttggtga gcccttacct 1200
caccaactag ctaatcccac ctaggcatat cctgacgcga gaggcccgaa ggtccccctc 1260
tttggcccgt aggcatcatg cggtattagc catcgtttcc aatggttatc ccccacatca 1320
gggcaatttc ctaggcatta ctcacccgtc cgccgctcga cgccgttaac gtcccccgaa 1380
ggttcagtta actcgtttcc gctcgactgc atggtagtca gcgccagc 1428

Claims (10)

1.一株强力降解浒苔蛋白的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HT-7，所述菌株保藏编号为CGMCC NO.23444。
2.权利要求1所述的需钠弧菌HT-7在降解浒苔制备有机肥方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述降解浒苔包括降解浒苔的粗蛋白、多糖、粗脂肪和干物质。
4.权利要求1所述的需钠弧菌HT-7的发酵方法，其特征是，将需钠弧菌HT-7的种子液接种到发酵培养基中，恒温20±2℃发酵培养24±4h，得到发酵液。
5.如权利要求4所述的发酵方法，其特征是，发酵培养基按重量比计为：葡萄糖1.5～2％、淀粉1.8～2％、酵母浸粉1.3～1.5％、鱼蛋白胨0.3～0.5％、硫酸镁0.04～0.06％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、碳酸钙0.5～0.8％，pH值7.2±0.1。
6.一种采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，包括以下步骤：
①浒苔前处理：将收集的浒苔进行淡水冲泡漂洗，去除盐分；然后充分粉碎；
②将粉碎的浒苔与水充分混合，然后送入发酵罐；
③按照1.0～5.0％的接种量接入权利要求4或5所述方法制备的需钠弧菌HT-7发酵液，接种完成后维持罐温20±2℃发酵5～6天，发酵完成后出罐，过滤，液体即为浒苔降解蛋白有机肥原浆。
7.如权利要求6所述的采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，所述步骤②浒苔与水的质量比为1.5～2.5:1。
8.如权利要求6所述的采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，接种需钠弧菌HT-7发酵液的过程中不通气；接种完成后充分搅拌发酵，仅少量通气，发酵3天；此后大量通气，继续充分搅拌发酵2～3天。
9.如权利要求6所述的采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，步骤③制备得到的浒苔降解蛋白有机肥原浆搭配其余中微量元素生产多品种有机肥。
10.如权利要求6所述的采用需钠弧菌HT-7降解浒苔制备有机肥的方法，其特征是，步骤③的剩余固体作为畜禽饲料生产原料。
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