CN111235050B - 一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法 - Google Patents

一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法。涉及微生物应用技术领域。一种厨余垃圾降解菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，株号S‑1，保藏号为CGMCC NO.18651。本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S‑1具有降解蛋白质、脂肪油脂、淀粉及纤维素的活性，由菌株S‑1和载体制成的厨余垃圾处理剂降解厨余垃圾后，能使厨余垃圾减重率可达85％以上，最高达到87.3％。经过处理的残渣经检测各项指标符合标准，残渣可以作为生物有机肥应用。

Description

一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解 方法
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，特别是涉及一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法。
背景技术
厨余垃圾，又称有机垃圾、易腐垃圾，指食材废料、剩菜剩饭、过期食品、瓜皮果核、花卉绿植、中药药渣等易腐的生物质生活废弃物，具有易腐烂、热值低、有机质含量丰富等特点，常规的填埋和焚烧难以妥善处理，更容易引发环境污染，并存在一定的安全隐患。目前，厨余垃圾主要是利用生物降解技术处理，即针对某些具有降解功能的微生物市场繁殖的特性，利用专业的生物发酵设备，进行合适温度下的高速发酵，将厨余垃圾变为较稳定的腐殖质，通过去除二氧化碳及水蒸气，并可最终转化为有机肥。中国的厨余垃圾微生物处理起步较晚，好氧堆肥技术已逐渐成为厨余垃圾资源再生的主要方式，微生物种类和产酶活性是堆肥熟化时间和有机肥品质的主要影响因素，并主要对蛋白质，油脂，淀粉，纤维素产生降解作用。而现有的技术还普遍存在降解效果差的问题，因此开发可高效降解厨余垃圾主要成分的微生物，确定其最优降解条件，可以更好地服务于农业、城市污染治理等多个方面，最大程度上实现资源利用。
公开号为CN106047762A的发明专利申请公开了一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CY-4，保藏编号为：CGMCC NO.12447，保藏日期为2016年5月13日。该枯草芽孢杆菌具有高活性蛋白酶、淀粉酶、油脂水解酶活性，降解葡萄糖产酸，具有高耐盐性、耐酸性的嗜热菌，通过与载体的有效结合，可快速高效地将投入餐厨重量减少量达到85％。
公开号为CN106190900A的发明专利申请公开了一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CY-1，保藏编号为：CGMCC NO.12448，保藏日期为2016年5月13日。该地衣芽孢杆菌具有高活性蛋白酶、淀粉酶、油脂水解酶活性，降解葡萄糖产酸，具有高耐盐性、耐酸性的嗜热菌，通过与载体的有效结合，可快速高效地将投入餐厨重量减少量达到85％。
上述现有技术中公开的菌株主要用于对餐厨垃圾进行减量，处理完的残渣还需要进行填埋或其他手段进行处理。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法。
一种厨余垃圾降解菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，株号S-1，保藏号为CGMCC NO.18651，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2019年10月10日。
本发明又提供了所述的厨余垃圾降解菌株在制备厨余垃圾处理剂中的应用。
本发明又提供了一种厨余垃圾处理剂，包含所述的厨余垃圾降解菌株。所述厨余垃圾降解菌株为活菌冻干粉形式，这样可以存放较长时间。
所述的厨余垃圾处理剂，还包括用于负载厨余垃圾降解菌株活菌冻干粉的载体，所述载体包括木屑、黄豆粉和红糖。所述载体中以质量比计，黄豆粉5～20％，红糖2～10％，其余为木屑。优选的，所述载体中，黄豆粉15％，红糖5％，其余为木屑。厨余垃圾降解菌株活菌冻干粉占总质量的1～6％。优选的，厨余垃圾降解菌株活菌冻干粉占总质量的5％。
本发明还提供了所述厨余垃圾处理剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1发酵培养后收集菌体，添加脱脂乳粉作为保护剂，低温冷冻干燥制备活菌冻干粉；
(2)将木屑、黄豆粉和红糖混匀制备载体；
(3)将步骤(1)制备的活菌冻干粉与步骤(2)制备的载体混合制成所述厨余垃圾处理剂。
所述的制备方法，步骤(1)中脱脂乳粉溶解在水中后，添加量为菌株发酵总体积的10％，并且与菌体混合后脱脂乳粉质量浓度为5～15％。冷冻干燥条件为：4℃环境冷藏25-35min，-20℃1-1.5h，-80℃1-2h，湿菌体和保护剂固态混合物平铺于冷冻干燥机中处理10-16h，所得固体碾成均匀颗粒粉末备用。
本发明还提供了一种厨余垃圾降解方法，包括以下步骤：
(a)将所述厨余垃圾处理剂在30～40℃下预热4～8h；
(b)将厨余垃圾与所述厨余垃圾处理剂混合后进行好氧发酵。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1具有降解蛋白质、脂肪油脂、淀粉及纤维素的活性，由菌株S-1和载体制成的厨余垃圾处理剂降解厨余垃圾后，能使厨余垃圾减重率可达85％以上，最高达到87.3％。经过处理的残渣经检测各项指标符合标准，残渣可以作为生物有机肥应用。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1在LB固体培养基中的菌落形态图。
图2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1的镜检图(放大1000倍)图。
图3为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解蛋白质试验检测结果图。
图4为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解油脂试验检测结果图。
图5为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解淀粉试验检测结果图。
图6为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解纤维素试验检测结果图。
图7为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解厨余垃圾效果测定结果图。
图8为不同厨余垃圾处理剂的降解率测定结果图。
具体实施方式
实施例1
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1的分离筛选。
1.分离源
浙江大学宁波理工学院弘毅园食堂垃圾堆边土样。
2.实验方法
2.1土壤中微生物的富集
将含有去离子水(100mL)和玻璃珠的锥形瓶进行灭菌，称取实验土样5.0g加入其中，摇晃均匀后，吸取5.0mL加入到LB液体培养基中，37℃，恒温培养48h。
2.2土壤中微生物的分离
取适量富集后菌液，按梯度稀释，选择10-6-10-10稀释度分别涂布LB平板培养基上，37℃，恒温培养48h后，挑取单菌落，保存于LB斜面培养基中，并逐一命名。
2.3微生物降解蛋白质、油脂、淀粉及纤维素能力测定
2.3.1蛋白质降解能力测定：将斜面保存的菌种用灭菌的接种棒点接到蛋白质降解分离筛选培养基(酪素0.8g，ZnCl2 0.028g，NaCl 0.032g，CaCl2 0.002g，KH2PO4 0.072g，MgSO4·7H2O 0.1g，Na2HPO4·7H2O 0.214g，酪素水解液0.01mL，琼脂4.0g，H2O 200mL，pH6.5-7.0)中，37℃培养24h后观察，有水解圈的表示该菌有降解蛋白质的能力。
2.3.2油脂降解能力测定：将斜面保存的菌种用灭菌的接种棒点接到油脂降解筛选培养基(蛋白胨2.0g，CaCl2·7H2O 0.02g，NaCl 3.0g，琼脂4.0g，H2O 200mL，pH7.4，121℃灭菌30min，冷却至40-50℃，加入121℃单独灭菌20min的Tween-80至终浓度1％，制成平板)中，37℃培养24h后观察，在菌落周围形成白色沉淀圈的表示该菌有降解油脂的能力。
2.3.3淀粉降解能力测定：将斜面保存的菌种用灭菌的接种棒点接到淀粉降解筛选培养基(蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，可溶性淀粉4.0g，琼脂4.0g，H2O 200mL，pH7.0)中，37℃培养24h后，观察水解圈，并向平板上加入碘液，有水解圈并且不变蓝的表示该菌有降解淀粉的能力。
2.3.4纤维素降解能力测定：将斜面保存的菌种用灭菌的接种棒点接到纤维素降解筛选培养基(羧甲基纤维素钠1.25g，NaCl 0.025g，CaCl2 0.0025g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.075g，NaNO3 0.625g，FeCl3 0.0025g，琼脂4.0g，H2O 200mL，pH7.2-7.4)中，37℃培养24h后观察，在筛选培养基中能生长的表示该菌有降解纤维素的能力。
2.4测序：将斜面保存菌株交与上海派森诺基因科技有限公司，进行16S rDNA测序，得到基因序列后在NCBI上进行BLAST，结合其菌落形态及镜检结果，确定其种属。
3.实验结果
对筛选出的菌株进行降解蛋白质、油脂、淀粉及纤维素能力测定，发现暂命名为S-1的菌株具有降解上述四类物质的能力，具体结果见图3～图6(图3和图4中S1表示本申请菌株S-1，S2～S5为一起进行筛选的其余菌株)，测定其16S rDNA序列后进行BLAST，结果显示与NR075005.2(Bacillus velezensis FZB42)的序列相似度为99.72％，结合该菌株的形态特征(图1和2)，将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
实施例2
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1活菌冻干粉的制作。
1.培养基及保护剂
菌种培养基为LB培养基，用脱脂乳粉作为保护剂。
2.实验方法
2.1从贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1的斜面培养物接种于LB液体培养基，种子培养温度为37℃，培养时间为20h，转速120rpm，发酵罐扩大培养，温度为35℃，培养时间为20h，转速120rpm，溶氧为30％。
2.2无菌条件下用过滤或离心等方法收集菌体，按原来发酵液的10％体积添加脱脂乳粉溶液(高温水浴以杀菌并冷却)作为保护剂，使脱脂奶粉浓度分别达到2％，5％，8％，12％，15％，18％(质量分数)。
2.3 4℃环境冷藏30min，-20℃1h，-80℃1.5h，湿菌体-保护剂固态混合物平铺于冷冻干燥机中处理12h，所得固体碾成均匀颗粒粉末，称取冻干粉重量。
2.4将冻干粉稀释涂平板测定菌体数量，与原菌液菌体数量进行比较，计算存活率，确定最优保护剂(脱脂奶粉)浓度。
3.实验结果
实验测得发酵液中的活菌数为2.3×1012CFU/mL，在不同浓度脱脂奶粉的作用下，菌体经冷冻干燥后存活率见表1。结果显示，12.0％的脱脂奶粉效果最佳，生存率可达70％以上，5.0％-15.0％添加量时效果良好，且200mL发酵液处理后，得到0.8-1.0g冻干粉。
表1不同脱脂奶粉浓度下菌体存活率
Figure BDA0002266051660000051
实施例3
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1降解厨余垃圾的效果测定。
1.实验材料
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1、取自浙江大学宁波理工学院食堂的厨余垃圾(米饭、白菜、鸡肉丁、肥猪肉)。
2.实验方法
2.1按实施例2中实验方法培养贝莱斯芽孢杆菌S-1，将一部分发酵液经离心冷冻干燥制成冻干粉，另一部分发酵液放置4℃环境冷藏，降解厨余垃圾前将发酵液离心，留湿菌体备用。
2.2称取不同成分的厨余垃圾，分别记为米饭(a)、切碎白菜(b)、切碎鸡肉丁(c)、切碎肥猪肉(d)各50g，分别代表主要成分为淀粉、纤维素、蛋白质、油脂的四类物质，将上述四类厨余垃圾分别放置于9寸培养皿为一组，共三组，设为对照组，湿菌体组(1-a、1-b、1-c、1-d)及冻干粉组(2-a、2-b、2-c、2-d)。
2.3湿菌体组样品中分别加入贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1湿菌体(为10mL发酵液菌体量，约为0.5g)混匀，冻干粉组样品中分别加入贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1冻干粉0.05g混匀，使湿菌体和冻干粉的量大致保持在同体积发酵液基础上。
2.4将装三组样品的培养皿上蒙上灭菌后的单层纱布，用皮筋固定，放入37℃培养箱，24h后取出，称量各培养皿中样品重量，将湿菌体组、冻干粉组样品和对照组中相应样品比较，计算降解率。降解率＝添加湿菌体或冻干粉降解后厨余垃圾残重(g)/对照组中相应厨余垃圾重量(g)×100％。
3.实验结果
用湿菌体及冻干粉降解不同成分的厨余垃圾后，降解率见图7，从结果可以看出，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1对四种厨余垃圾都具一定的降解作用，其中对淀粉的降解效果相应较好，降解率达40％以上，对纤维素的降解效果相应较差，且用湿菌体及冻干粉降解后，同一类厨余垃圾的降解率差别不大。
实施例4
含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1厨余垃圾处理剂的制作及降解厨余垃圾减量实验。
1.实验材料
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1，取自浙江大学宁波理工学院食堂的厨余垃圾，杂木木屑，黄豆粉，红糖。
2.实验方法
2.1按实施例2中实验方法将贝莱斯芽孢杆菌S-1经离心冷冻干燥制成冻干粉备用。
2.2取贝莱斯芽孢杆菌S-1冻干粉和不同成分及比例的木屑、黄豆粉及红糖混合(具体成分配比见表2)，制成总重量为500g的处理剂，将处理剂放入同一型号厨余垃圾处理机中，预热4-8h，后7d中每天同一时间加入1000g的厨余垃圾，第8天称量处理机中残渣的重量，计算降解率。降解率＝[加入厨余垃圾重量(g)-残渣重量(g)-处理剂重量(g)]/加入厨余垃圾重量(g)×100％。比较降解率，得出厨余垃圾处理剂的配方。
表2厨余垃圾处理剂配方
编号 S-1冻干粉 木屑(g) 黄豆粉(g) 红糖(g)
对照 0 500 - -
A 5 495 - -
B 5 470 25 -
C 5 445 50 -
D 5 420 75 -
E 5 395 100 -
F 5 370 125 -
G 5 345 150 -
H 5 485 - 10
I 5 470 - 25
J 5 455 - 40
K 5 445 - 50
L 5 435 - 60
M 5 420 - 75
N 0 400 75 25
N1 5 395 75 25
N2 10 390 75 25
N3 15 385 75 25
N4 20 380 75 25
N5 25 375 75 25
N6 30 370 75 25
3.实验结果
按表2所示，测定不同组别的降解率，结果如图8所示。从结果可以看出，加入黄豆粉最适比例15％左右，在5-20％范围内，都有较好的降解效果；加入红糖的最适比例为5％，在2-10％范围内，都有较好的降解效果；在处理剂中同时加入黄豆粉和红糖后，降解率有明显提高，最佳比例为活菌冻干粉5％，黄豆粉15％，红糖5％，此时降解率可达87.3％，冻干粉量对降解率影响不明显。
实施例5
用含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1的厨余垃圾处理剂降解后的残渣作为有机肥的相关指标测定。
1.实验材料
按实施例4方法所得的厨余垃圾处理后的残渣样品。
2.实验方法
按中华人民共和国农业行业标准——生物有机肥(NY884-2012)中所示方法，对残渣样品中的有效活菌数、有机质质量分数、水分、pH值、重金属限量及蛔虫卵死亡率粪大肠杆菌群数、等指标进行测定。
3.实验结果
表3厨余垃圾降解后残渣的生物有机肥相关指标检测
Figure BDA0002266051660000081
样品经检测后，各项指标值和国家农业行业标准对照值见表3。从结果可以看出，残渣的各项指标符合标准，残渣可以作为生物有机肥应用。
序列表
<110> 浙江大学宁波理工学院
<120> 一种厨余垃圾降解菌株、厨余垃圾处理剂及厨余垃圾降解方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 1
tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420
ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960
cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga ag 1422

Claims (5)

1.一种厨余垃圾降解菌株，其特征在于，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，株号S-1，保藏号为CGMCC NO.18651。
2.如权利要求1所述的厨余垃圾降解菌株在制备厨余垃圾处理剂中的应用。
3.一种厨余垃圾处理剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的厨余垃圾降解菌株，所述厨余垃圾降解菌株为活菌冻干粉形式，
所述的厨余垃圾处理剂，还包括用于负载厨余垃圾降解菌株活菌冻干粉的载体，所述载体包括木屑、黄豆粉和红糖，
所述载体中以质量比计，黄豆粉5～20％，红糖2～10％，其余为木屑，
厨余垃圾降解菌株活菌冻干粉占总质量的1～6％。
4.如权利要求3所述厨余垃圾处理剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S-1发酵培养后收集菌体，添加脱脂乳粉作为保护剂，低温冷冻干燥制备活菌冻干粉；
(2)将木屑、黄豆粉和红糖混匀制备载体；
(3)将步骤(1)制备的活菌冻干粉与步骤(2)制备的载体混合制成所述厨余垃圾处理剂，
步骤(1)中脱脂乳粉溶解在水中后，添加量为菌株发酵总体积的10％，并且与菌体混合后脱脂乳粉质量浓度为5～15％。
5.一种厨余垃圾降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将如权利要求3所述厨余垃圾处理剂在30～40℃下预热4～8h；
(b)将厨余垃圾与所述厨余垃圾处理剂混合后进行好氧发酵。
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