CN113980837A - 一种高氮复合微生物肥料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物肥料领域，特别是涉及一种高氮复合微生物肥料及其制备方法和用途，所述高氮复合微生物肥料包括微生物发酵菌剂和钾肥，所述微生物发酵菌剂通过如下步骤制备：将多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌接种至所述微生物发酵培养基中发酵培养，发酵结束后即获得所述微生物发酵菌剂，其中以培养基的总质量为基准，所述微生物发酵培养基中包括以下质量百分比的物质：尿素50～80g/L；豆粕210～300g/L；玉米粉30～50g/L；氯化钙0.5～30g/L；磷酸氢二钾3～5g/L；硫酸镁0.1～10g/L；硫酸锰0.1～10g/L；水。本发明的高氮复合微生物肥料多种微生物混合发酵不仅无拮抗作用，还能明显提高单一菌株的活性，发酵周期缩短至2d，同时提高了尿素和豆粕的转化率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物肥料领域，特别是涉及一种高氮复合微生物肥料及其制备方法和用途。
背景技术
尿素又称脲、碳酰胺或碳酰二胺，由氨和二氧化碳在高压下合成，是最常用的脱水氮肥产品。尿素是人工合成的第一个中性有机化合物，施入土壤后以分子态存在于土壤中，但利用率低，只有一小部分氮素被土壤胶体吸附。尿素在土壤中受脲酶作用而转化成碳酸铵，形成NH4+-N，其归宿同铵态氮肥。目前我国尿素肥效一般为20％～35％，通常情况下低于30％，其重要原因之一是土壤脲酶过多或者活性过高导致尿素分解过快，致使其利用率降低。尿素吸潮性强，宜作基肥和追肥，不宜作种肥。尿素的肥效期为2～10d(受温度影响)，需在作物需肥期之前4～8d施用。一次施肥量过高，不仅容易引起徒长、倒伏、病虫害严重发生，造成减产，降低肥料利用率，而且多余的肥料会随雨水或灌溉水流入河中，污染水源；由于氨易挥发或反硝化作用引起的N2O排放，导致大气污染等。但少量施用，又不能满足作物整个生育期的需要，必须分次追肥，花费劳力，作物封行以后，追肥又很困难。
豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品，有机质和氮含量较高，是中国国内现货市场上流通的主要品种。豆粕中粗蛋白含量为45％～55％，其来源广，价格低廉，易储存、营养较均衡，是主要植物源蛋白之一。豆粕中的蛋白转化为多肽、小肽和游离氨基酸主要通过酸、碱或酶水解方式来实现。酸碱水解虽简单方便，但其在生产过程中不能按规定的水解测定进行水解，且因其生产条件苛刻，氨基酸会受到损害而降低其营养价值，因此目前采用此法的较少。目前被应用最广的是酶水解法，蛋白质的酶水解包括直接酶解法和间接酶解。直接酶解法由于商品酶制剂成本高，代价大，限制了其工业化生产。目前豆粕主要用于禽畜饲料的生产，市面上的豆粕有机肥以固体发酵的方式来增加其有机质含量为主。通过液体发酵将其蛋白转化为多肽和游离氨基酸的形式存在的肥料比较少见。
21世纪以来国内尿素市场实现快速发展，尿素的下游需求主要涵盖农业需求和工业需求两个方面，在农用领域中，尿素通常作为肥料使用，农用氮肥是尿素下游需求量最大的领域，占比高达50％，复合肥需求占比25％。化肥行业转型升级促进农业绿色发展成必然趋势，在未来5～10年我国农用常规尿素、磷铵、复合肥将大面积转型升级为有效养分高效转化的绿色产品。
微生物肥料是指使用有益微生物为主体制成的具有改善作物和土壤营养条件、刺激作物生长的活体制品。中华人民共和国农业行业标准最新版(NY/T798-2015)对复合微生物肥料的定义为：指特定微生物与营养物质复合而成，既能提供、保持或者改善植物营养，提高农产品质量或者改善农产品品质的活体微生物制品。复合微生物肥料可提高对化学肥料的利用率，高达10～30％，肥效可持续3～4个月。据不完全统计，目前在发达国家农业生产中，生物肥料的使用量占总肥料用量的20％以上，世界范围内开发和应用生物肥料的国家达到80多个，且生物肥料的使用量和使用范围都呈现上升的趋势。
微生物肥料施入土壤后，通过功能性有益微生物的作用，可对土壤及作物产生有益的影响。新型生物肥料中的有益微生物对植物生长的直接作用表现在可固氮、溶磷、解钾，增加土壤中的有效养分，利于植物生长。同时，有益菌能分泌生长促生物质促进植物根系生长，间接作用表现在病原菌拮抗、营养与根际空间竞争、植物抗性诱导、土壤改良等方面。
现有技术中有公开高含氮复合微生物肥料及其制备方法，肥料制备方法中采用乳酸菌、酵母菌和霉菌作为复合菌剂。但该发明未明确具体的配比，若选择不当，各菌种之间可能会发生拮抗导致菌种无法共存或难以发挥其自身的作用。而且细菌的培养温度一般为28～37℃、酵母菌的培养温度为25～30℃和霉菌的培养温度为25～28℃，不同的菌其培养温度和培养时间很难统一，且大部分真菌都是霉菌，而霉菌过于宽泛，对培养温度和培养周期较难统一协调，因此制备时较为复杂，菌种间的协同性较难保证，难以达到稳定固氮的效果。也有文献公开了另一种高含氮复合微生物肥料及其制备方法，该技术将微生物固氮、腐植酸活化、氨基酸合成和有机肥发酵在生化反应过程中一步完成，大幅度降低了生产成本，但该肥料中尿素用量较高(10～33％)，原料中还含有鱼粉和黄豆粉，且发酵时间长达15～25d。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高氮复合微生物肥料及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种微生物发酵培养基，以培养基的总体积为基准，所述微生物发酵培养基中包括以下物质：
本发明还提供一种微生物发酵菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌接种至所述微生物发酵培养基中发酵培养，发酵结束后即获得所述微生物发酵菌剂。
所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为nlsy017，保藏编号为CGMCC No.22938。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号为hlj158，保藏编号为CGMCCNo.13026，。
所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)，菌株编号为nlsy016，保藏编号为CGMCC No.21869。
本发明还提供所述微生物发酵菌剂的制备方法获得的微生物发酵菌剂。
本发明还提供所述微生物发酵菌剂在制备复合微生物肥料中的用途。
本发明还提供一种复合微生物肥料，所述复合微生物肥料包括所述微生物发酵菌剂和钾肥。
本发明还提供所述复合微生物肥料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：向所述微生物发酵菌剂中加入钾肥，混合后即得所述复合微生物肥料。
本发明还提供所述复合微生物肥料在农作物增产中的用途。
如上所述，本发明的高氮复合微生物肥料及其制备方法和用途，具有以下有益效果：与现有技术相比，本发明通过多种微生物混合发酵，混合培养时不仅无拮抗作用，还能明显提高单一菌株的活性，原单一菌株的蛋白酶活力由1810～2580U/mL提高到2981～3120U/mL，使得发酵周期大幅度缩短至2d，节约生产成本。鱼粉蛋白含量在60％左右，有咸腥味，为动物蛋白，价格较高，发酵过程中会产生难闻的气味。黄豆粉的蛋白含量为36％～40％，而豆粕的蛋白含量在45～55％，豆粕和黄豆粉均为植物蛋白，但豆粕价格更为低廉。本发明使用豆粕替代黄豆粉和鱼粉，同时对尿素使用量进行减半处理，原料成本降低了75.9％左右，同时提高了尿素和豆粕的转化率。此外，通过本发明研制的肥料具有解磷、解钾和固氮效果；可作基肥和追肥，对大田作物、果树以及叶菜类蔬菜施用本发明的肥料，均有明显的提质增产作用，如大田作物可增产10～19％；果树类果实品质提高5～8％；叶菜类增产3～5％。豆粕、玉米粉和无机盐等原料来源广，价格低廉，易储存、营养较均衡，利于产业化。复合微生物肥料富含多肽以及游离氨基酸、还具有解磷解钾固氮菌，可减少化肥的使用，发酵代谢产物可被植物吸收利用，对环境无污染、绿色、安全。
附图说明
图1显示为本发明的多粘类芽孢杆菌(阿须贝(Ashby)培养基)。
图2显示为本发明的枯草芽孢杆菌，左图为有机磷培养基，右图为无机磷培养基。
图3显示为本发明的胶冻样类芽孢杆菌(钾细菌培养基)。
图4显示为本发明的多粘类芽孢杆菌(左图)和枯草芽孢杆菌(右图)在酪蛋白培养基上的产透明圈情况。
图5显示为本发明的多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的拮抗试验。
具体实施方式
本发明提供一种微生物发酵培养基，以培养基的总体积为基准，所述微生物发酵培养基中包括以下物质：
本发明还提供一种微生物发酵菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌接种至所述微生物发酵培养基中发酵培养，发酵结束后即获得所述微生物发酵菌剂。
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类产芽胞的革兰氏阳性细菌，对植物非致病性同时具有防病作用和促生作用。多粘类芽孢杆菌厌氧条件下所测定的大多数菌株可以固氮，可防治卵菌门2个属、真菌门24个属、细菌门6个属的病原菌引起的多种土传病害和叶面病害。多粘类芽孢杆菌产生的多粘菌素破坏革兰氏阴性细菌细胞质膜的通透性，致使胞内物质泄漏从而起到杀菌作用。多粘类芽孢杆菌产生细胞壁降解酶类，如β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等，另外产生杀镰孢菌素，共同作用抑制植物病原真菌的生长与增殖，还产生吲哚乙酸、生长素、赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸甲酯等植物激素，这些植物激素可以促进植物生长及增强植物免疫力。
芽孢杆菌属(Bacillus)细菌可在胞外产生多种消化酶和抑菌物质，可将大分子蛋白转化为小分子肽，降解抗营养因子，其耐受温度和酸性环境，便于生产和加工，极具开发潜力。
胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)使土壤中难溶性的磷元素转变为可溶性的，对于增加土壤养分的有效性，提高作物产量和品质都具有非常重要的意义。它的代谢产物如生长刺激素、多糖、有机酸和多种酶等，能抑制病原菌生长、改善土壤肥力，以增强农作物对一些病害的抵抗能力。胶冻样类芽孢杆菌还具有促使土壤结晶构造破坏的作用，从而有利于农作物的营养吸收，以达到促进作物生长、增产等效应。
所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为nlsy017，保藏编号为CGMCC No.22938，保藏日期为2021年7月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号为hlj158，保藏编号为CGMCCNo.13026，保藏日期为2016年9月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)，菌株编号为nlsy016，保藏编号为CGMCC No.21869，保藏日期为2021年3月4日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
所述微生物发酵菌剂中多粘类芽孢杆菌作为固氮菌，同时具有产蛋白酶特性；枯草芽孢杆菌作为解磷菌，同时具有产蛋白酶特性和脲酶阳性，从而可分解尿素，提高尿素的转化率；胶冻样类芽孢杆菌作为解钾菌。枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌产生的蛋白酶可将豆粕中的大分子蛋白转化为多肽、小肽和游离氨基酸。
在一种实施方式中，所述多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌的混合比例为1：1：2。
在一种实施方式中，所述多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌的总接种量为5～20％。总接种量是按照培养基体积的5-20％计算的，即按照发酵罐实际装液量来计算的，例如50L发酵罐装液量25L，表示25L/50L，接种量1％，即接种25L*1％＝250mL。
在一种实施方式中，发酵培养的条件包括以下中的一项或多项：温度为28～37℃、搅拌转速为150～250rpm，通气量1：0.3～0.5、罐压0.03～0.05MPa、pH6.8～7.5、培养时间为40～56h。
在一种实施方式中，所述微生物发酵菌剂的尿素含量小于0.5％、多肽含量为8.45％以上、铵态氮(NH4 +)质量百分比小于3％时停止发酵。停止发酵后收集的发酵液即为液体微生物发酵菌剂。
三种微生物培养的温度和时间比较接近，便于发酵过程中的控制。三种微生物进行混菌发酵，对尿素的转化率达到90％以上。
在一种实施方式中，所述制备方法还包括向液体微生物发酵菌剂中加入吸附剂，过滤后收集滤饼、干燥，获得固体微生物发酵菌剂。所述固体微生物发酵菌剂或液体微生物发酵菌剂可分别用于制备固体复合微生物肥料或液体复合微生物肥料。
在一种实施方式中，所述吸附剂选自硅藻土和/或白炭黑。
在一种实施方式中，所述干燥为60℃以下热风干燥5～7h。
本发明还提供所述微生物发酵菌剂的制备方法获得的微生物发酵菌剂。
所述微生物发酵菌剂的尿素含量小于0.5％、多肽含量为8.45％以上、铵态氮质量百分比小于3％。
在一种实施方式中，所述微生物发酵菌剂的总有效活菌数≥30亿/mL。
所述固体微生物菌剂的水分含量为35％以下。
本发明还提供所述微生物发酵菌剂在制备复合微生物肥料中的用途。
本发明还提供一种复合微生物肥料，所述复合微生物肥料包括所述微生物发酵菌剂和钾肥。
所述复合微生物肥料为固体复合微生物肥料或液体复合微生物肥料。所述固体复合微生物肥料可为粉剂或颗粒剂。在一种实施方式中，所述钾肥选自硫酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾或硝酸钾中的任一种或多种。
在一种实施方式中，所述复合微生物肥料中钾肥的含量为8.5～15％。
所述复合微生物肥料中有效活菌数≥30亿个/g。以质量分数计，所述复合微生物肥料的总N含量为14～18％；P2O5含量为3～4.5％；K2O含量为3～4.5％。所述复合微生物肥料符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。
本发明的高氮复合微生物肥料在总氮含量高达14～18％的情况下，成功地将由尿素水解出的铵态氮(NH4+)浓度控制在3％以下，既提高了复合微生物肥料中氮素养分的含量又保证了微生物的活性和数量；且提高了尿素的转化率，减少了其因氮素易损失对自然环境造成的污染，从而具有长效、环保的优点。
本发明还提供所述复合微生物肥料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：向所述微生物发酵菌剂中加入钾肥，混合后即得所述复合微生物肥料。
在一种实施方式中，所述钾肥选自硫酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾或硝酸钾中的任一种或多种。
具体的，当制备固体复合微生物肥料时，使用固体微生物发酵菌剂；当制备液体复合微生物肥料时，使用液体微生物发酵菌剂。
在一种实施方式中，所述钾肥选自磷酸二氢钾和硫酸钾，磷酸二氢钾和硫酸钾的加入至符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。
当制备复合微生物肥料颗粒时，所述制备方法还包括在加入钾肥后进行造粒。
所述复合微生物肥料符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。
本发明还提供所述复合微生物肥料在农作物增产中的用途。
具体的，所述复合微生物肥料作为基肥或追肥在农作物增产中的用途。
所述农作物选自大田作物、果树或蔬菜。
所述大田作物是指田间进行大面积栽培的农艺作物，如粮、棉、油、麻、丝、茶、糖、烟和饲料等作物。
所述蔬菜选自叶菜类蔬菜。
所述复合微生物肥料可使大田作物增产10～19％；果树类果实品质提高5～8％；叶菜类增产3～5％。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1微生物菌种剂的筛选
通过对申请人现有的细菌菌株进行固氮解磷解钾的筛选实验，筛选出效果较好的固氮解磷解钾菌株。
1.1固氮菌的初筛
固氮菌的初筛采用生长速率法，将分离所得的固氮菌在营养琼脂培养基上活化，然后用接种环移植一环活化菌到装有Ashby液体培养基的试管(18*180mm)内，每管装培养液5mL，对照为不接菌株的培养液，重复3次。30℃，120r/min振荡培养36h后，测各菌液OD600值，并根据OD600值大小选取菌株。
1.2固氮菌的复筛
在盛有50mL含1％葡萄糖的Ashby培养液三角瓶中加入待测固氮菌菌悬液(OD600≈0.100)2.5mL，以加入2.5mL无菌水为对照，重复3次，放置于恒温振荡摇床(30℃，120rpm)上培养5d后取出测氮、定糖，计算其固氮效能。其中定糖采用蒽酮光电比色法，测氮采用半微量光电比色法。
1.3解磷菌的初筛
通过平板法进行初筛，将活化菌株分别点接于无/有机磷固体培养基平板上，30℃培养3～5d，观察解磷圈大小并测定解磷圈直径(D)和菌落直径(d)，计算D/d值大小来确定各初筛解磷菌的解磷能力。
1.4解磷菌的复筛
根据D/d值对初筛得到的解磷菌进行复筛，挑选单菌落接种于100mL无/有机磷液体培养基中，置于30℃、200rpm恒温振荡培养箱振荡培养，培养7d后，将发酵液8000r/min离心机低温离心20min后取上清液，将离心上清液用钼锑抗比色法测定其中的可溶性磷含量，以不接菌的无/有机磷液体培养基为对照。从而进一步确定该菌株的解磷能力。
1.5解钾菌的初筛
通过平板法进行初筛，将活化菌株分别点接于钾细菌固体培养基平板上，30℃培养3～5d，观察解钾圈大小并测定解钾圈直径(D)和菌落直径(d)，计算D/d值大小来确定各初筛解钾菌的解钾能力。
1.6解钾菌的复筛
根据D/d值对初筛得到的解钾菌进行复筛，挑选单菌落接种于100mL钾细菌液体培养基中，置于35℃、200rpm恒温振荡培养箱振荡培养，培养7d后，将发酵液8000r/min离心机低温离心20min后取上清液，将离心上清液用四苯硼钠法测定其中的可溶性钾含量，以不接菌的钾细菌液体培养基为对照。
1.7固氮解磷解钾菌的产蛋白酶能力
将筛选出来的固氮解磷解钾菌分别点接于酪蛋白培养基平板上，28～37℃培养16～24h，测量菌落直径(d)及菌落周围透明圈直径(D)。通过比较D/d值初步筛选出水解蛋白质的能力较强的菌株。对初步筛出水解圈较大的菌株，以蛋白酶活力为复筛指标，通过对初筛菌株进行摇瓶发酵筛选出酶活力强的菌株。
上述所涉及的培养基及其组分如下(单位为g/L)：
(1)无机磷培养基：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、Ca3(PO4)2 5.0g、蒸馏水1000mL，pH7.2。
(2)有机磷培养基：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、CaCO3 5.0g、蛋黄液10mL(蛋黄液：无菌生理盐水与蛋黄1：1配制)、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
(3)钾细菌培养基：蔗糖5.0g、Na2HPO4 2.0g、MgSO7·H2O 0.5g、CaCO3 0.1g、FeCl30.005g、钾长石粉1.0g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5；
(4)阿须贝(Ashby)培养基：KH2PO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.2g、CaCO35.0g、甘露醇10.0g、蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0。
(5)酪蛋白培养基：牛肉浸粉5g、酪蛋白5g、(NH4)2SO4 2g、K2HPO4 5g，MgSO4·7H2O0.2g、CaCl2 0.1g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL，pH7.5。
以上均为液体培养基配制，若配制固体培养基，再另外加琼脂粉13～20g/L即可。
通过固氮解磷解钾菌以及蛋白酶产生菌试验，结果选定多粘类芽孢杆菌为固氮菌，且产蛋白酶，其酶活力为2580U/mL(图1、图4和表1)；枯草芽孢杆菌为解磷菌，且产蛋白酶，其酶活力为1810U/mL(图2、图4和表2)；胶冻样类芽孢杆菌为解钾菌(图3和表3)。
表1发酵上清液中有效氮
表2发酵上清液中有效磷
表3发酵上清液中速效钾
实施例2菌株的拮抗试验
将已活化的解磷菌、解钾菌和固氮菌分别接种于已灭菌的液体培养基中(100mL/250mL)，在30℃恒温箱中培养5d，吸取发酵液在高倍显微镜观察菌株的生长是否有排异情况。试验结果表明，各单一菌株生长良好并无排异现象，可以共生，未发生无拮抗反应(图5)，说明这三种菌可以进行混合培养。上述所涉及的液体培养基以质量百分比含量的组分组成为：牛肉浸膏粉0.5％、蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.3～20％，pH7.0。
实施例3复合菌种最佳配比的筛选
以解磷菌、解钾菌和固氮菌制作不同配比的复合菌种，在Hz超声波下作用1.5min，使其充分混匀后，再加入到装液量为100mL/250mL的液体种子培养基中，接种量为5％，200rpm、30℃培养5d。分离培养测定菌株数，菌株活菌计数采用稀释平板法。上述涉及的液体种子培养基及其组分为：蛋白胨0.12％、酵母粉0.12％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.02％、碳酸钙0.2％、豆粕2.88％、玉米粉1.46％，pH6.8～7.5。
比较不同配比复合菌种中各单一菌种生长情况，从而筛选出解磷解钾固氮综合能力较强的复合菌种组合为固氮菌：解磷菌：解钾菌＝1：1：2。在该处理中各单一菌株生长量均较高；混合培养可显著提高菌株活性，单一菌株间存在协同作用，复合菌株中固氮菌、解磷菌和解钾菌数量比单独培养分别高出14.56％、8.35％和14.95％。混合培养可显著提高菌株活性，即菌株间存在协同作用。
表4不同配比的复合菌种的生长情况
注：LSD多重比较法，不同处理间不同小写字母(即表格中a、b、c)表示差异达显著水平(P＜0.05)，不同处理间相同小写字母表示差异不显著。
实施例4复合微生物肥料的制备
本实施例中使用的多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌按照如下方法制备：取斜面保藏的多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌分别进行活化，活化后将固氮菌(多粘类芽孢杆菌)、解磷菌(枯草芽孢杆菌)、和解钾菌(胶冻样类芽孢杆菌)分别接种至固体培养基中，28～37℃培养10～24h培养，培养结束后分别用无菌水进行洗种，按固氮菌：解磷菌：解钾菌＝1：1：2混合后，备用。上述所用的固体培养基，以质量百分比含量的组分组成为：蛋白胨0.12％、酵母粉0.12％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.02％、碳酸钙0.2％、豆粕2.88％、玉米粉1.46％、琼脂1.3％，pH6.8～7.5。
4.1一种高氮复合微生物肥料的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)高氮微生物发酵菌剂的制备
按发酵培养基组分为尿素6％、豆粕22％、玉米粉3％、氯化钙1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.03％进行配料，装液量按发酵罐体积的50％投料至发酵罐中，搅拌均匀后作无菌化处理。以5％接种量接种复合菌液(固氮菌：解磷菌：解钾菌＝1：1：2)，其中复合菌液的有效活菌数≥30亿/mL。搅拌转速为200rpm、通气量1：0.3～0.5，罐压0.03～0.05MPa，pH6.8～7.5发酵培养48h。发酵结束后测定发酵液中的总氮含量14.0％、多肽含量8.05％、尿素残留量0.61％、铵态氮2.62％，获得液体微生物发酵菌剂。
(2)高氮复合微生物肥料(液剂)的制备
计量液体微生物发酵菌剂的体积，加入磷酸二氢钾和硫酸钾至符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。取样按NY/T798-2015复合微生物肥料标准进行检测。结果表明，该样品中的活菌有枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌，有效活菌数≥30亿个/g；氮含量为14.0％，有效磷(P2O5)为3.0％，速效钾(K2O)为3.0％。即得液剂型高氮复合微生物肥料，最后将其称重、包装即可。
4.2一种高氮复合微生物肥料的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)高氮微生物发酵菌剂的制备
按发酵培养基组分为尿素8％、豆粕25％、玉米粉3％、氯化钙1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.03％进行配料，装液量按发酵罐体积的50％投料至发酵罐中，搅拌均匀后作无菌化处理。以15％接种量接种复合菌液(固氮菌：解磷菌：解钾菌＝1：1：2)，其中复合菌液的有效活菌数≥30亿/mL。搅拌转速为200rpm、通气量1：0.3～0.5，罐压0.03～0.05MPa，pH6.8～7.5发酵培养48h。发酵结束后测定发酵液中的总氮含量16.35％、多肽含量8.25％、尿素残留量0.5％、铵态氮2.53％。发酵终止后，计量发酵液体积，加入体积重量比为8％硅藻土(100目以上)和8％白炭黑(100目以上)，板框过滤(板框和滤布预先清洁消毒)，收集滤饼，60℃以下热风干燥6h左右，水分控制35％以下，粉碎，得到固体微生物发酵菌剂。
(2)高氮复合微生物肥料(粉剂)的制备
向固体微生物发酵菌剂中加入磷酸二氢钾和硫酸钾至符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。取样按NY/T798-2015复合微生物肥料标准进行检测。结果表明，该样品中的活菌有枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌，有效活菌数≥30亿个/g；氮含量为16.35％，有效磷(P2O5)为4.17％，速效钾(K2O)为4.39％，有机质≥21％。即得粉剂型高氮复合微生物肥料，最后将其称重、包装即可。
4.3一种高氮复合微生物肥料的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)高氮微生物发酵菌剂的制备
按发酵培养基组分为尿素8％、豆粕28％，玉米粉3％、氯化钙1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.03％进行配料，装液量按发酵罐体积的50％投料至发酵罐中，搅拌均匀后作无菌化处理。以15％接种量接种复合菌液(固氮菌：解磷菌：解钾菌＝1：1：2)，其中复合菌液的有效活菌数≥30亿/mL。搅拌转速为200rpm、通气量1：0.3～0.5，罐压0.03MPa，pH6.8～7.5发酵培养48h。发酵结束后测定发酵液中的总氮含量：17.15％、多肽含量8.76％、尿素残留量0.43％、铵态氮2.46％。发酵终止后，计量发酵液体积，加入体积重量比为8％硅藻土(100目以上)和8％白炭黑(100目以上)，板框过滤(板框和滤布预先清洁消毒)，收集滤饼，60℃以下热风干燥6h左右，水分控制35％以下，粉碎，得到固体微生物发酵菌剂。
(2)高氮复合微生物肥料(颗粒剂)的制备
向固体微生物发酵菌剂中加入磷酸二氢钾和硫酸钾至符合NY/T798-2015复合微生物肥料标准。通过造粒设备进行喷雾、造粒、低温烘干制得成品，取样按NY/T798-2015复合微生物肥料标准进行检测。结果表明，该样品中的活菌有枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌，有效活菌数≥30亿个/g；氮含量为17.15％，有效磷(P2O5)为3.92％，速效钾(K2O)为3.88％；有机质≥25％。即得颗粒剂型高氮复合微生物肥料，最后将其称重、包装即可。
对上述4.1至4.3中配制的高氮复合微生物肥料成品以及申请号为201310123315.0的专利中的实施例2制成的高氮复合微生物肥料，进行相关指标检测，结果如下：
表5
实施例5
选用实施例4中4.3制备的高氮复合微生物肥料，以市场购买的42％(24-8-10)BB肥，(上海惠尔利农资有限公司)、市售复合微生物肥(安徽瑞驰兰德生物科技有限公司，技术指标：有效活菌数≥0.2亿个/g，有机质≥20％，N+P2O5+K2O＝25％；形态：颗粒；菌种：枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌。)以及申请号为201310123315.0的中国专利中的实施例2中提到的高氮复合微生物肥料作为对照肥料进行水稻田间试验。
结果如表6，处理2、3和4的水稻增产依次为11.6％、15.9％和18.6％。因此，采用本发明研制的高氮复合微生物肥料作为基肥可提高水稻产量，且高达18.6％，与其他几组相比，对水稻产量提升最为显著。
表6不同肥料水稻田间试验结果
实施例6
选用本发明实施例4中4.3制备的高氮复合微生物肥料、市场购买的史丹利复合肥(15-15-15)、市售复合微生物肥(安徽瑞驰兰德生物科技有限公司，技术指标：有效活菌数≥0.2亿个/g，有机质≥20％，N+P2O5+K2O＝25％；形态：颗粒；菌种：枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌。)以及申请号为201310123315.0的中国专利中的实施例2中提到的高氮复合微生物肥料作为对照肥料，通过30％的肥料同等养分替代量替代30％复合肥，对进行盆栽青菜试验。
结果如表7：用本发明研制的30％高氮复合微生物肥料同等养分替代量替代30％复合肥，其不仅对盆栽青菜的生长无毒害作用，还能促进青菜的生长且增产3.68％；而申请专利201310123315.0(实施例2)的增产仅为0.19％。
表7不同肥料盆栽青菜试验
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (17)
1.一种微生物发酵培养基，其特征在于，以培养基的总体积为基准，所述微生物发酵培养基中包括以下物质：
水。
2.一种微生物发酵菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌接种至权利要求1所述的微生物发酵培养基中发酵培养，发酵结束后即获得所述微生物发酵菌剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为nlsy017，保藏编号为CGMCC No.22938；
2)所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号为hlj158，保藏编号为CGMCCNo.13026；
3)所述胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)，菌株编号为nlsy016，保藏编号为CGMCC No.21869。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶冻样类芽孢杆菌的接种量高于多粘类芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌的混合比例为1：1：2。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌的总接种量为5～20％。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件包括以下中的一项或多项：温度为28～37℃；搅拌转速为150～250rpm；通气量1：0.3～0.5；罐压0.03～0.05MPa；pH6.8～7.5；培养时间为40～56h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述微生物发酵菌剂的尿素含量小于0.5％、多肽含量为8.45％以上、铵态氮质量百分比小于3％时停止发酵，停止发酵后收集的发酵液即为液体微生物发酵菌剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括向液体微生物发酵菌剂中加入吸附剂，过滤后收集滤饼、干燥，获得固体微生物发酵菌剂。
10.权利要求2-9任一所述的制备方法获得的微生物发酵菌剂。
11.权利要求10所述的微生物发酵菌剂在制备复合微生物肥料中的用途。
12.一种复合微生物肥料，其特征在于，所述复合微生物肥料包括权利要求10所述的微生物发酵菌剂和钾肥。
13.根据权利要求12所述的复合微生物肥料，其特征在于，所述复合微生物肥料为固体复合微生物肥料或液体复合微生物肥料。
14.根据权利要求13所述的复合微生物肥料，其特征在于，所述固体复合微生物肥料为粉剂或颗粒剂。
15.权利要求12-14任一所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：向权利要求10所述的微生物发酵菌剂中加入钾肥，混合后即得所述复合微生物肥料。
16.权利要求12-15任一所述的复合微生物肥料在农作物增产中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述农作物选自大田作物、果树或蔬菜。
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