CN104498408B - 一株产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌utm104 及其应用 - Google Patents

一株产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌utm104 及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)UTM104菌株及其应用。该菌生物保藏编号为CGMCC No.9509。UTM104菌株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵，在有机物料中形成稳定的菌落生态系统，大量快速繁殖，有效地降解有机固体废弃物中的有机物，使其快速达到减量化、无害化；同时应用本发明所制备的微生物菌剂可将有机固体废弃物转化成生物肥料。UTM104菌株还能降解土壤和植株上的菊酯类农药残留，进而保障食品安全，本发明菌株性能优良，具有较好的社会效益和经济效益。

Description

一株产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌UTM104及其应用
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体地，涉及一种携带拟除虫菊酯水解酶基因的地衣芽孢杆菌UTM104菌株及其降解城乡有机固体废弃物以及制备生物肥料的应用。
背景技术
目前农业畜牧业生产所产生的有机固体废弃物已经成为城乡环境污染的重要来源，每年大量产生的作物秸秆及畜禽粪便等废弃物不但造成农田占用、土壤及地下水污染，其臭气的产生污染空气。另一方面农药的使用在提高农作物产量的同时，也造成了粮食及土壤的农药残留，引发多种食品安全问题，给人们的健康带来巨大威胁。如何有效去除农产品以及土壤中农药残留已成为人们广泛关注的问题。生物降解是有机物分解代谢的一个最重途径，其通过生物氧化及转化，将有毒物质变成无害物。且生物降解成本低、效率高、又无二次污染。
木质纤维素是由纤维素、半纤维素与木质素组成的晶体状结构，利用木质纤维素高温堆肥发酵生产生物肥料是高效利用农业生产废弃物的有效方法。利用多种微生物的作用，使各种复杂的有机态养分，转化为可溶性易吸收的养分和腐殖质。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种常见的土壤微生物类群，能分泌多种酶并运用于生化反应过程中。将地衣芽孢杆菌应用于有机固体废弃物的处理，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产拟除虫菊酯水解酶地衣芽孢杆菌UTM104菌株及其应用。
本发明从采自云南腾冲温泉的底泥，利用驯化培养基(牛肉膏3g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml)在40℃经多代富集驯化，筛选到一株具有拟除虫菊酯水解酶等多种酶活性的UTM104菌株。菌株UTM104已于2014年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCC No.9509。
本发明提供的UTM104菌株为革兰氏阳性、细胞0.8×2.5μm、直杆状、单生、产生近中生椭圆芽孢，孢囊稍膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0)上菌落光滑正园、扁平微突、蛋壳黄色、生长迅速，35～45℃培养24小时后菌落直径约2～3mm，最适生长温度40～70℃。
利用引物为(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3′经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，测序后获得的序列见序列表SEQID No:1。将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM104菌株的该基因与Bacillus licheniformis的相似性最高，为99.72％，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序后的基因序列见序列表SEQ ID No:2，将获得的序列提交到NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM104菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高，结合所述菌株的生理生化特性为鉴别该菌株的次要特征，确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株UTM104，其保藏编号为CGMCC No.9509。
本发明提供的地衣芽孢杆菌UTM104具有几丁质酶、β-葡聚糖内切酶、纤维二糖酶及拟除虫菊酯水解酶活性，其编码基因见序列表SEQ ID No:3～SEQ ID No:6。
本发明提供了含有地衣芽孢杆菌UTM104的菌剂。
本发明提供了地衣芽孢杆菌UTM104或其菌剂在有机固体废弃物的生物降解过程中的应用，以及地衣芽孢杆菌UTM104或其菌剂在有机固体废弃物堆肥发酵中的应用。
本发明提供了一种制备含地衣芽孢杆菌UTM104的堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：
(1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM104活化菌种接种于葡萄糖蛋白胨的液体培养基中，进行发酵生产；
(2)发酵液分装成为液体菌剂或经脱水干燥得到粉剂。
上述方法中，步骤(1)将地衣芽孢杆菌UTM104接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，培养温度35～45℃，搅拌速度60～400转/分钟，通气量1:0.1～0.5(v/v)，当OD600≥2.0时停止培养，得到发酵液。
优选地，步骤(1)将地衣芽孢杆菌UTM104接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，培养温度35～45℃，搅拌速度100～300转/分钟，通气量1:0.3～0.5(v/v)，当OD600≥2.0时停止培养，得到发酵液。
更优选地，步骤(1)将地衣芽孢杆菌UTM104接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，培养温度40℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1:0.5(v/v)，当OD600≥2.0时停止培养，得到发酵液。
本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM104或含有其的菌剂在有机固体废弃物堆肥中的应用。
所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸秆、动物尸体或畜禽粪便中的一种或多种。
用地衣芽孢杆菌菌株UTM104或含有其的菌剂对有机固体废弃物进行堆肥的方法，包括以下步骤：
(1)将相当于总物料湿重0.1％～0.5％的UTM104或其菌剂接种于有机固体废弃物中，混合拌匀后进行好氧堆肥发酵；
(2)用水分调理剂将物料的水分调至含水率为45％～65％，此物料的碳氮比为10～50:1，堆体保持氧气含量约为8％～15％，间隔4～5天翻抛1次；
(3)堆体发酵12-20天，发酵终止；剩余物料或填埋或焚烧或过筛分装得到生物肥料。
上述堆肥方法中，步骤(2)的发酵进程中最高温达到103～105℃；步骤(3)经12-20天的好氧发酵物料水分降至30～35％，废弃物中的大部分有机物被分解，终止发酵。
本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM104或含有其的菌剂在制备有机肥料中的应用。
本发明从高温污泥中分离到一株具有拟除虫菊酯水解酶、几丁质酶、β-葡聚糖内切酶、纤维二糖酶等活性的菌株，为有机固体废弃物的生物降解及制备环保型生物肥料提供了一种能降解农药残留及其它有机物的微生物。UTM104菌株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵，在有机物料中形成稳定的菌落生态系统，大量快速繁殖，有效地降解有机固体废弃物中的有机物，使其快速达到减量化、无害化；同时应用本发明所制备的微生物菌剂可将有机固体废弃物转化成生物肥料。UTM104菌株还能降解土壤和植株上的菊酯类农药残留，进而保障食品安全，本发明菌株性能优良，具有较好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1菌株UTM104的显微镜下照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1地衣芽孢杆菌UTM104的分离与鉴定
取约1克腾冲温泉底泥样品置于装有多粒小玻璃珠及100ml无菌水的250ml三角瓶中，40℃震荡培养1小时,转速160转/分钟后，静置30分钟。在无菌条件下吸取上清液1ml，接入装有100ml已灭菌的富集培养基(胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH4)2SO41.0g、MgSO4·5H2O 0.3g、KH2PO41.36g、水1000ml，pH4.5)中，40℃振荡培养3天，转速160转/分钟。取培养3天的菌液1ml，加入到装有9ml无菌水的试管中，以10倍稀释法配制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的稀释度。分别取0.1ml涂布在3个含有胶状几丁质的固体培养基平板上(胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH4)2SO41.0g、MgSO4·5H2O 0.3g、KH2PO41.36g、琼脂粉15g、水1000ml，pH4.5)。在菌落分散较好的平板上随机挑取具有明显透明圈的单菌落并采用平板划线进行纯化。纯化后的菌株接种于含联苯菊酯100ppm的富集培养基中，37℃、振荡培养2天(180转/分钟)。取培养2天的菌液，离心(7500转/分钟、10分钟)收集菌体。收集的菌体用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤3次后，按3ml缓冲液加1g菌体的比例配成菌悬液。菌悬液用超声波细胞粉碎机(400W)破碎处理99次，每次5秒，间隔5秒。处理液在4℃下离心(10000转/分钟、10分钟),取上清液，得无细胞胞内粗酶液。反应体系统一为:预热温度37℃、pH6.8～7.0。在含100ppm拟除虫菊酯(联苯菊酯或甲氰菊酯或氯氰菊酯)的18ml磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)中，加入预热过粗酶液2ml；37℃恒温水槽水浴中反应2小时后加入0.5ml HCl溶液(1.0mo1/L)终止酶反应，以不加酶液的拟除虫菊酯农药的缓冲液为照。反应结束后，吸取2ml反应液，依次加入4ml、4ml和2ml的石油醚萃取3次。萃取液加入无水硫酸钠除水，并用石油醚定容至10ml。用气相色谱检测残留农药及计算农药的降解率。筛选出具拟除虫菊酯水解酶活性的菌株。
以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为(27f)：5′-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No:1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacillus licheniformis的相似性最高，同源性为99.73％。
利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序结果见序列表SEQ IDNo:2获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库，运用Blast程序进行序列比对。结果显示UTM104菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高。
结合菌株的形态特征(图1)生理生化特征，把该菌株鉴定为Bacilluslicheniformis，命名为UTM104。并于2014年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCC No.9509。
实施例2菌株UTM104几丁质酶活性检测及其基因序列
将UTM104菌株接种于实施例1的胶状几丁质的固体培养基平板上，37℃培养3天。观察到其具有透明的几丁质酶水解圈。根据几丁质酶基因设计的引物chitinase-f:5’-TCATCG GCT ACT ATC C-3’和chitinase-r:5’-TCA CCG GAT TGA TCA G-3’，并以本发明菌株UTM104DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约1.7kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码几丁质酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:3。
实施例3菌株UTM104纤维素酶活性检测及其相关基因序列
将UTM104菌株采用点种法点种在羧甲基纤维素钠培养基(羧甲基纤维素钠5g、KH2PO4lg、琼脂17g、NaNO33g、KCL 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蒸馏水1000ml，pH 5.5～6.0)上，40℃培养48小时后用0.2％刚果红染色30分钟，用蒸馏水洗去染液，再用浓度为1mol/L的NaC1浸泡1小时，最后用5％的醋酸液固定颜色。在菌落周围形成无色透明圈表明此菌分泌纤维素酶。纤维素酶为多酶混合物，其由纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶等组成。
根据β-葡聚糖内切酶基因设计引物betaglu-f:5’-AAC GGT CCG CAT CAT C-3’与betaglu-r:5’-CGA GGA AGA TGC CGA T-3’,以本发明菌株UTM104DNA为模板进行PCR反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸120秒，30个循环，72℃延伸10分钟，获得约2.7kb的片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，该基因片段编码β-葡聚糖内切酶。其基因序列见序列表SEQ ID No:4。根据纤维二糖酶基因设计的简并引物Cellobiase-f:5’-CGA CAT CTG AAG CGT ACA GC-3’和Cellobiase-r:5’-CGG TCA TAC TCA GCA TAA GC-3’，并以本发明菌株UTM104DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约2kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，该序列片段编码纤维二糖酶基因。其基因序列见序列表SEQ ID No:5。
实施例4菌株UTM104拟除虫菊酯水解酶活性检测及其基因序列
将活化过的菌株UTM104接种在含有100mg/L甲氰菊酯的富集培养基(见实施例1)中，37℃、振荡培养3天(180转/分钟)，此培养液用离心(7500转/分钟、10分钟)收集菌体。收集的菌体用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤3次，按1g菌体加3ml缓冲液的比例配成菌悬液，用超声波细胞粉碎机(400W)破碎处理99次，每次5秒，间隔5秒。4℃下离心(10 000转/分钟、10分钟)。取上清液，得无细胞胞内粗酶液。反应体系统一为：预热温度37℃、pH6.8～7.0。在含甲氰菊酯100ppm的18ml磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)中，加入预热过粗酶液2ml；37℃，恒温水槽水浴中反应2小时后加入0.5ml HCl溶液(1.0mo1/L)终止酶反应，以不加酶液的甲氰菊酯农药的缓冲液为对照。反应结束后，吸取2ml反应液，依次加入4ml、4ml和2ml的石油醚，萃取3次。萃取液加入无水硫酸钠除水，并用石油醚定容至10ml。用气相色谱检测残留农药并计算农药的降解率以计算UTM104菌株的甲氰菊酯水解酶活性。气相色谱检测以磷酸三苯酯或二十二烷为内标物，使用3％OV-101/Chromosorb W-HP为填充物的玻璃柱和氢火焰离子化检测器，对试样中的甲氰菊酯进行气相色谱分离和测定。在检测结果中未鉴定出含有甲氰菊酯。根据测定结果，UTM104菌株具有水解甲氰菊酯的能力。证实UTM104菌株具有拟除虫菊酯水解酶的活性。
根据拟除虫菊酯水解酶基因设计的简并引物JZM-f:5’-ACG CAGACG TAC GAA C-3’和JZM-r:5’-CAA GCA GGC TTT GAA C-3’，并以本发明菌株UTM104DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.6kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码拟除虫菊酯水解酶基因。其基因序列见序列表SEQ ID No:6。
实施例5菌株UTM104菌剂的制备(1)
从4℃保存的UTM104菌株斜面上括菌苔接种至装有30ml葡萄糖蛋白胨的液体培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、水1000ml，pH7.0)的250ml三角瓶中，35℃培养40小时。摇床转速100转/分钟。当OD600≥2时，停止培养，此为摇瓶种子液。
将摇瓶种子液按0.1％体积比接种量接种至含上述液体培养基的种子罐中培养。培养温度35℃、通气量为1：0.1(v/v)、搅拌速度100转/分钟。培养40小时，当OD600≥2，停止培养，此为种子罐种子液。
将种子液按1％接种量接种至含上述液体培养基的发酵罐培养。培养温度35℃，通气量为1：0.3(v/v)，搅拌速度200转/分钟。培养24小时。当OD600≥2时停止培养，此为UTM104的发酵液。
发酵液直接分装成为液体菌剂，发酵液脱水干燥得到粉剂。
实施例6菌株UTM104菌剂的制备(2)
从4℃保存的UTM104菌株斜面上括菌苔接种至装有30ml葡萄糖蛋白胨的液体培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、水1000ml，pH7.0)的250ml三角瓶中，35～45℃培养28～40小时。摇床转速100～250转/分钟。当OD600≥2时，停止培养，此为摇瓶种子液。
将摇瓶种子液按1％体积比接种量接种至含上述液体培养基的种子罐中培养。培养温度40℃、通气量为1：0.5(v/v)、搅拌速度200转/分钟。培养30小时，当OD600≥2，停止培养，此为种子罐种子液。
将种子液按1％接种量接种至含上述液体培养基的发酵罐培养。培养温度40℃，通气量为1：0.5(v/v)，搅拌速度200转/分钟，培养24～30小时。当OD600≥2时停止培养，得到UTM104的发酵液。
发酵液直接分装成为液体菌剂，发酵液脱水干燥得到粉剂。
实施例7利用菌株UTM104堆肥发酵处理含甲氰菊酯生活污泥
在生活污泥中添加甲氰菊酯100ppm。按0.1％重量比的接种量将实施例6制得的UTM104液体菌剂与30吨生活污泥、20吨水分调理剂充分混合后进行好氧堆肥发酵。其中，生活污泥含水量82.3％，水分调理剂含水量30.1％，混合后物料的含水量约61.4％。添加实施例6制得的UTM104菌剂为实验组，同时以不添加UTM104菌剂为对照组，进行实验。堆肥好氧发酵时间为20天。20天后取1克发酵样品，加入9ml无菌水中，充分混匀，然后静置沉淀，吸取2ml上清液，依次加入4ml、4ml和2ml的石油醚，萃取3次。萃取液加入无水硫酸钠除水，并用石油醚定容至10ml。用气相色谱法检测残留农药并计算农药的降解率以检测物料中甲氰菊酯含量，气相色谱检测以磷酸三苯酯或二十二烷为内标物，使用3％OV-101/Chromosorb W-HP为填充物的玻璃柱和氢火焰离子化检测器，对试样中的甲氰菊酯进行气相色谱分离和测定。结果如下表1，结果表明UTM104菌株能有效清除物料中的甲氰菊酯。
表1UTM104菌剂对甲氰菊酯的降解
实施例8利用UTM104菌剂堆肥发酵制备生物肥料
约1000kg猪粪便(水分含量89.2％)与500kg粉碎的玉米秸秆(水分含量20.4％)及加入2kg实施例6制得的UTM104菌剂粉剂，充分混合拌匀。混合物的含水率为64.3％。将拌混好的物料置于发酵槽中进行好氧堆肥发酵。发酵过程中，用鼓风机供气使堆体中氧气含量约为8～15％之间，并每隔4～5天以倒槽的形式进行翻抛一次。在发酵的第2天堆体温度从室温升至80～90℃，在该温度下维持发酵4天。第6天用倒槽的方式将物料搅拌即翻抛一次。由于物料经搅拌堆体温度下降至60～70℃，并于20～30小时内回升至90～100℃以上。此温度维持5～6天。当倒槽后温度降低至40℃以下，并不再回升，发酵中止，得到棕黄色发酵粉末。此物料经过筛分装得用作生物肥料。此肥料的检测结果见表2。
表2肥料检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株UTM104，其保藏编号为CGMCC No.9509。
2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌菌株UTM104的菌剂。
3.一种制备含地衣芽孢杆菌UTM104的堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM104活化菌种接种于葡萄糖蛋白胨的液体培养基中，进行发酵生产；
（2）发酵液分装成为液体菌剂或经脱水干燥得到粉剂；
所述地衣芽孢杆菌菌株UTM104的保藏编号为CGMCC No. 9509。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）将地衣芽孢杆菌UTM104接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，培养温度35~45℃，搅拌速度60~400转/分钟，通气量1:0.1~0.5（v/v），当OD600≥2.0时停止培养，得到发酵液。
5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM104或权利要求2所述的菌剂在有机固体废弃物堆肥发酵中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸秆、动物尸体或畜禽粪便中的一种或多种。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将相当于总物料湿重0.1%~0.5%的UTM104或其菌剂接种于有机固体废弃物中，混合拌匀后进行好氧堆肥发酵；
（2）用水分调理剂将物料的水分调至含水率为45%~65%，此物料的碳氮比为10~50:1，堆体保持氧气含量为8%~15%，间隔4~5天翻抛1次；
（3）堆体发酵12-20天，发酵终止；剩余物料或填埋或焚烧或过筛分装得到生物肥料。
8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM104或权利要求2所述的菌剂在制备有机肥料中的应用。
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