CN104560818B - 一株产耐高温酸性α‑淀粉酶的地衣芽孢杆菌UTM118 及其应用 - Google Patents

一株产耐高温酸性α‑淀粉酶的地衣芽孢杆菌UTM118 及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株产耐高温酸性α‑淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)UTM118及其应用。该菌生物保藏编号为CGMCC No.9681。UTM118菌株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵。采用本发明的菌株制备的生物肥料绿色环保、性能优良，用其处理有机固体废弃物可做到无害化、减量化、资源化。应用本发明所制备的生物肥料绿色环保、性能优良，具有较好的社会效益和经济效益。

Description

一株产耐高温酸性α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌UTM118及其应用
技术领域
本发明涉及城乡有机固体废弃物治理领域，涉及一种产耐高温酸性α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌UTM118菌株及其在有机固体废弃物处理中的应用。
背景技术
污泥是污水处理过程所产生的固体沉淀物质，由有机物残渣、细菌菌体、无机颗粒、胶体等组成的极其复杂的有机混合体。污泥的主要特性是含水率高(可高达80％以上)，有机物含量高，容易腐化发臭。并且含有大量的絮凝剂，污泥颗粒较细，比重较小，呈胶状液态，很难通过沉降进行固液分离。中国每年污泥产量大于8000万吨，并以5％的速度增长。污泥的处理方式目以脱水后填埋为主，在消耗大量能源的同时占用大量的土地，并可能会造成周边环境与地下水源的二次污染。
餐厨垃圾是居民在生活消费过程中形成的生活废物，极易腐烂变质，散发恶臭，传播细菌和病毒，是环境污染的重要源。餐厨垃圾主要成分包括米和面粉类食物残余、蔬菜、动植物油、肉骨等。从化学组成上，有淀粉、纤维素、蛋白质、脂类和无机盐。
高温腐熟堆肥是目前公认的处理有机固废物的有效方法。好氧堆肥发酵通过微生物菌群将有机固废物中的有机物转化成可有效再利用物质的过程，是微生物菌群所产生的多种酶通过多种生物氧化及其他生物转化方式将有机大分子变成更小更简单分子过程。一般认为，加快堆肥进程、缩短堆肥时间可通过①改变堆肥底物的物理和化学特性，如水分、酸碱度、碳氮比等；②添加微生物菌剂。外源微生物的接入有明显的促进堆肥腐熟的功能，其关键是接入的外源微生物的数量及功能特性如能否在底物中形成优势群落等。微生物处理有机固废弃物成本低、易推广，被认为是有机固废物再利用的绿色技术。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种常见的土壤微生物类群，能分泌多种酶并运用于生化反应过程中。将地衣芽孢杆菌应用于有机固体废弃物的处理，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产耐高温酸性α-淀粉酶地衣芽孢杆菌UTM118菌株及其应用。
本发明将采自云南腾冲温泉的底泥，利用驯化培养基(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml)在40℃下，经多代富集驯化、定向筛选出UTM118菌株。菌株UTM118已于2014年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCCNo.9681。
在本发明提供的UTM118菌株为革兰氏阳性、细胞0.8×(2.0～3.5)μm、直杆状、单生、产生近中生椭圆形芽孢、孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH7.0)上菌落光滑正园、微突、蛋壳黄色、生长迅速，40～50℃培养24小时后菌落直径约2～3mm，适量生长温度40～70℃；VP实验阳性、接触酶阳性、氧化酶阳性。
利用引物为(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3′经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，测序后的基因序列见序列表SEQID No:1，将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM118菌株的该基因与Bacillus licheniformis的相似性最高，为99.3％，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序后的基因序列见序列表SEQ ID No:2，获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM118菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高，结合所述菌株的形态及生理生化特性为鉴别该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株UTM118，其保藏编号为CGMCC No.9681。
本发明提供的地衣芽孢杆菌UTM118具有耐高温酸性α-淀粉酶、脂肪酶、纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶、β-(1,4)-木糖苷酶活性，其编码基因见序列表SEQ ID No:3～SEQ IDNo:7。
本发明提供了含有地衣芽孢杆菌UTM118的菌剂。
本发明提供了地衣芽孢杆菌UTM118或其菌剂在有机固体废弃物的生物降解过程中的应用，以及地衣芽孢杆菌UTM118或其菌剂在有机固体废弃物堆肥发酵中的应用。
本发明还提供一种制备含地衣芽孢杆菌UTM118的堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：
(1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM118接种于LB液体培养基中，进行发酵；
(2)发酵液经脱水干燥得到粉末状菌剂。
上述方法中，步骤(1)是将菌株UTM118接种至LB液体培养基的中，35～45℃，摇床转速100～250转/分钟，培养1～2天，为摇瓶种子液；
将摇瓶种子液按0.2～1％接种量接种于含有LB培养基的种子罐中。培养温度35～45℃，通气量为1:0.2～0.6(v/v)，搅拌速度为60～300转/分钟，为种子罐种子液；
将种子罐种子液按0.2～1％接种量接种至含有LB培养基的发酵罐中，培养温度35～45℃，通气量为1:0.2～0.6(v/v)，搅拌速度为60～300转/分钟。当OD600≥1.8时停止培养，此为发酵菌液。
本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM118或含有其的菌剂在有机固体废弃物堆肥中的应用。
所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸秆、动物尸体或畜禽粪便中的一种或多种。
用地衣芽孢杆菌菌株UTM118或含有其的菌剂对有机固体废弃物进行堆肥的方法，包括以下步骤：
(1)将相当于总物料湿重0.1％～1％的UTM118菌种或其菌剂接种于有机固体废弃物中，混合拌匀，进行堆肥好氧发酵；所述有机固体废弃物物按碳氮比为12～50：1，含水率为45％～65％，保持氧气含量为8％～15％，进行堆肥发酵，间隔4～5天翻抛1次；
(2)堆肥12-20天，发酵终止。
上述堆肥方法中，步骤(2)经12-20天的好氧发酵物料水分降至28～35％，废弃物中的大部分有机物被分解，终止发酵。剩余物或被填埋或被焚烧或过筛分装得生物肥料。
本发明从温泉的底泥中分离到一株具有耐高温酸性α-淀粉酶、脂肪酶、纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶、β-(1,4)-木糖苷酶等活性的菌株，为高温环境下有机固体废弃物的处理或利用其制备生物肥料提供了一种有用微生物。本发明菌株UTM118在一定条件下能在有机固态物料中迅速增殖，与发酵物料形成稳定的菌落系统。其降解效率快、减量化程度高、堆肥发酵周期短等优点。
附图说明
图1菌株UTM118系统进化树。
图2菌株UTM118的显微镜下照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1地衣芽孢杆菌UTM118的分离与鉴定
取约1g云南腾冲温泉底泥样品置于装有多粒小玻璃珠的50ml无菌水的250ml三角瓶中，40℃、恒温摇床上震荡1小时，静置30分钟。在无菌条件下，吸取上清液1ml，接入装有50ml已灭菌的富集培养基(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml)的250ml三角瓶中，40℃、摇床上培养3天，转速160转/分钟。取培养3天后的菌悬液1ml，加入到含9ml无菌水试管中，以梯度稀释法制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的稀释系列。分别各取0.1ml涂布于筛选培养基平板上(蛋白胨0.5％、可溶性淀粉1％、KH2PO40.2％、MgSO40.05％、FeSO40.01％、CaCl20.02％、锥虫蓝0.001％、琼脂1.5％，自然pH)。40℃培养2天，选择有水解圈的菌落，并测量菌落直径及透明圈直径，计算透明圈与菌落直径比值作为初筛指标。并挑取具有最大比值的的单菌落进行纯化。
以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为(27f)：5′-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No:1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacillus licheniformis的相似性最高，同源性为99.3％。图1为基于UTM118菌株及其相关菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega5.0系统进化软件构建的系统进化树(最大似然法)，说明其系统进化关系与地衣芽孢杆菌最近。利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACCGTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGC AGGGTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序结果见序列表SEQ ID No:2获得的序列提交到NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM118菌株的gyrB基因序列与Bacilluslicheniformis相似性最高，结合菌株的形态特征(图2)和生理生化特征，把该菌株鉴定为Bacillus licheniformis，命名为UTM118，并于2014年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCCNo.9681。
实施例2菌株UTM118耐高温酸性α-淀粉酶活性检测及其基因序列
将UTM118菌株接种于筛选培养基平板上(蛋白胨0.5％、可溶性淀粉1％、KH2PO40.2％、MgSO40.05％、FeSO40.01％、CaCl20.02％、锥虫蓝0.001％、琼脂1.5％，pH5.5)，50℃培养2天，观察到其具有透明的淀粉酶水解圈，证实UTM118菌株具有淀粉水解酶活性。
根据高温α-淀粉酶基因设计的引物amy-f:5’-CGA TTG CTG CCG CTG TTA TT-3’和amy-r:5’-TGA AAC TCT CCC CAG CCT TC-3’，并以本发明菌株UTM118DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约1.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码α-淀粉酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:3。
实施例3菌株UTM118脂肪酶活性检测及其相关基因序列
将UTM118菌株接种至发酵培养基(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml)，40℃、160转/分钟培养2天，然后6000转/分钟离心获得上清液即为粗酶液。脂肪酶活性检测需要配制底物溶液溶液A：20mM硝基苯基乙酸酯(pNPA)乙腈溶液(精确称量0.3623g pNPA溶解于乙腈中，定容至100ml)；溶液B：50mM Tris-HCl(pH8.0称取12.1gTris碱，加50ml蒸馏水，缓慢加浓盐酸至pH8.0，待冷却后，加蒸馏水至终体积100ml)。测定脂肪酶活性时将4.8ml溶液B与0.1ml溶液A混合均匀，37℃预加热10分钟，然后加入0.1ml UTM118菌液制备的粗酶液反应10分钟；反应液即刻在波长410nm处测定OD值。根据OD值计算出所释放的对硝基苯酚的量从而确定脂肪酶活性的大小。经测定UTM118菌株能够水解酯键，具有脂肪酶活性。
根据芽孢杆菌脂肪酶基因设计的简并引物lipase-f:5’-ATG CGT CGC CAT TCAT-3’和lipase-r:5’-ACT TCC CGT TGA CGG T-3’，并以本发明菌株UTM118DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.6kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码脂肪酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:4。
实施例4菌株UTM118纤维素酶活性检测及其相关基因序列
将芽胞杆菌UTM118点种法点种在羧甲基纤维素钠培养基(羧甲基纤维素钠5g、KH2PO4lg、琼脂17g、NaNO33g、KCL 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蒸馏水1000ml，pH 5.5～6.0)上，40℃培养48小时。采用0.2％刚果红染色30分钟，然后用蒸馏水洗去染液，再用浓度为1mol/L的NaC1浸泡1小时，最后用5％的醋酸液固定颜色。在菌落周围形成无色透明圈证明此菌分泌纤维素酶，具有纤维素酶活性。维素酶为多酶混合物，其由纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶等组成。
根据纤维二糖酶基因设计的简并引物Cellobiase-f:5’-GAA GGC ATT CCT TATCAT TC-3’和Cellobiase-r:5’-ACG GTC ATA CTC AGC GTA AG-3’，并以本发明菌株UTM118DNA为模板，进行PCR扩增反应。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约2kb大小的核苷酸片段。测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，该序列片段编码纤维二糖酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:5。根据β-葡聚糖内切酶基因设计引物betaglu-f:5’-CGA TGT TGT TCA TGC CGG CT-3’与betaglu-r:5’-TTG CCA GCG TGT GTGACA GC-3’,以本发明菌株UTM118DNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟，获得约2.0kb的片段。测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，该基因片段编码β-葡聚糖内切酶，其基因序列见序列表SEQ ID No:6。
实施例5菌株UTM118β-(1,4)-木糖苷酶活性检测及其基因序列
地衣芽孢杆菌UTM118菌株在含木聚糖发酵培养基(蛋白胨5g、燕麦木聚糖5g、葡萄糖5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH7.2)中，40℃培养两天，离心(6000转/分钟10分钟)收集菌体。菌体置于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，用超声波破碎仪(600W)，工作时间5秒，间隔时间5秒，连续20次进行细胞破碎。离心获得上清液，即获得粗酶液。β-(1,4)-木糖苷酶活性测定反应体系为200μl，内含10μl 20mmol/L底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX，Sigma)、185μl 100mmol/L pH6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪哇缓冲液、5μl适量稀释粗酶液；于65℃反应5分钟，然后加入600μl 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，用分光光度计测定其在410nm下的吸收值。经测定UTM118能够水解燕麦木聚糖，其具有β-(1,4)-木糖苷酶活性。
根据β-(1,4)-木糖苷酶基因保守序列设计的简并引物xylo-f:5’-ATC CGG TGCTTA AAG G-3’和xylo-r:5’-TCG GCA TGT TGA TGT G-3’，并以本发明菌株UTM118DNA为模板，进行PCR扩增反应。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约1.5kb大小的核苷酸片段。测序并将在NCBI GenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码β-(1,4)-木糖苷酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:7。
实施例6菌株UTM118菌剂的制备
将4℃保存的本发明菌株UTM118的斜面上刮菌苔接种至装有40ml LB液体培养基的250ml的摇瓶中，37℃，摇床转速150转/分钟，培养1～2天，为摇瓶种子液。
将摇瓶种子液按0.2～1％接种量接种于含有LB培养基的种子罐中。培养温度35℃，通气量为1:0.5(v/v)，搅拌速度为200转/分钟。为种子罐种子液。
将种子罐种子液按0.2～1％接种量接种至含有LB培养基的发酵罐中。培养温度38℃，通气量为1:0.3(v/v)，搅拌速度为150转/分钟。当OD600≥1.8时停止培养，此为发酵菌液。
发酵液直接分装成为液体菌剂，发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。
实施例7利用UTM118的菌剂堆肥好氧发酵处理生活污泥
城镇生活污泥50吨(含水量约82％)，加入适量的水分调理剂33吨(含水量约27.6％)及实施例6制得的UTM118菌剂50升，混合拌均，此混合物的水分约60.4％。然后将此物料移入发酵槽中，进行好氧堆肥发酵。在发酵第3天堆体温度约70～75℃，当温度上升变慢时用翻抛机或装载机翻抛1次。堆肥发酵约20～30天，共约翻抛4～5次。发酵进程中最高温达到103～105℃。当翻抛后温度不再升高时，不再供气，终止发酵。此时物料水分下降至30～35％，堆体容积下降60％。
实施例8利用UTM118菌剂堆肥好氧发酵制备生物肥料
500公斤畜禽粪便(水量约98.6％)与500公斤碎粉玉米秸秆(水量约21.3％)拌均，含水率约60％。接种实施例6制得的UTM118菌剂1升，混合拌均。置于小型发酵槽中进行好氧发酵，堆体高度不低于2m。发酵约30天，其中翻抛4～5次。发酵第2天堆体温度从室温升80～90℃，发酵第5天翻抛一次。因翻抛(搅拌)堆体温度降低至60～65℃，并随后上升至90～105℃。在此温度下维持发酵4～5天。发酵第10天再翻抛一次，堆体温度因翻抛下降低至50～55℃，并随后上升至70～75℃。如此重复操作3～5次。当翻抛后来温度下降至35～40℃时，终止发酵。得到棕色粉末经过筛分装得到生物肥料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株UTM118，其保藏编号为CGMCCNo.9681。
2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM118，其特征在于，其能够产生耐高温酸性α-淀粉酶，脂肪酶、纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶、β-(1,4)-木糖苷酶。
3.如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM118，其特征在于，所述耐高温酸性α-淀粉酶编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:3所述的的核苷酸序列或其互补核苷酸序列；脂肪酶编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:4所述的的核苷酸序列或其互补核苷酸序列；纤维二糖酶编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:5所述的的核苷酸序列或其互补核苷酸序列；β-葡聚糖内切酶编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:6所述的的核苷酸序列或其互补核苷酸序列；β-(1,4)-木糖苷酶编码核苷酸序列含有SEQ ID NO:7所述的的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
4.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌菌株UTM118的菌剂。
5.一种制备含地衣芽孢杆菌UTM118的堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM118接种于LB液体培养基中，进行发酵；
(2)发酵液经脱水干燥得到粉末状菌剂；
所述地衣芽孢杆菌UTM118的保藏编号为CGMCC No.9681。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将菌株UTM118接种至LB液体培养基的中，35～45℃，摇床转速100～250转/分钟，培养1～2天，为摇瓶种子液；
将摇瓶种子液按0.2～1％接种量接种于含有LB培养基的种子罐中，培养温度35～45℃，通气量为1:0.2～0.6(v/v)，搅拌速度为60～300转/分钟，为种子罐种子液；
将种子罐种子液按0.2～1％接种量接种至含有LB培养基的发酵罐中，培养温度35～45℃，通气量为1:0.2～0.6(v/v)，搅拌速度为60～300转/分钟，当OD600≥1.8时停止培养，此为发酵菌液。
7.权利要求1-3任一所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM118或权利要求4所述的菌剂在有机固体废弃物堆肥发酵中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸秆、动物尸体或畜禽粪便中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将相当于总物料湿重0.1％～1％的UTM118菌种或其菌剂接种于有机固体废弃物中，混合拌匀，进行堆肥好氧发酵；所述有机固体废弃物物按碳氮比为12～50：1，含水率为45％～65％，保持氧气含量为8％～15％，进行堆肥发酵，间隔4～5天翻抛1次；
(2)堆肥12-20天，发酵终止。
10.权利要求1-3任一所述的地衣芽孢杆菌菌株UTM118或权利要求4所述的菌剂在制备有机肥料中的应用。
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