CN111394273B - 一株产黄腐酸的贝莱斯芽孢杆菌cz1及其在畜禽粪便二次发酵中的应用 - Google Patents

一株产黄腐酸的贝莱斯芽孢杆菌cz1及其在畜禽粪便二次发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产黄腐酸的贝莱斯芽胞杆菌CZ1及其在畜禽粪便二次发酵中的应用。本发明的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)CZ1，于2020年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(CGMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为CGMCC No.15958。本发明分离出的贝莱斯芽胞杆菌CZ1，该具有纤维素水解能力和产黄腐酸的能力，因此可以在畜禽粪便发酵产堆肥中应用。

Description

一株产黄腐酸的贝莱斯芽孢杆菌CZ1及其在畜禽粪便二次发 酵中的应用
技术领域：
本发明属于农业固体废弃物综合利用领域，具体涉及一株具有产黄腐酸的贝莱斯芽胞杆菌CZ1和其在畜禽粪便二次发酵中的应用方法。
背景技术：
我国是畜禽养殖大国，每年产生大量的畜禽粪便。好氧堆肥是畜禽粪便资源化的重要途径。不同于其他农业有机固废，畜禽粪便中存在大量致病菌和寄生虫，因此，畜禽粪便堆肥需要提高堆体温度或增加高温阶段的持续时间，保证其达到无害化的要求。然而，提高堆体温度或增加高温阶段的持续时间会增加有机物的降解率，从而降低肥效，影响堆肥产品的价值。因此，行业内一般通过二次发酵提高堆肥产品的肥力和腐熟度以适应种植业需求。
堆肥过程实际上是有机质腐殖化过程，产生的腐殖质类物质对植物生长有促进作用。黄腐酸是腐殖质中分子量较小且活性较大的组分，因其分子量较低、易溶于多种溶剂，其对土壤的理化性状和肥力保持起着重要的作用，并作为一种植物生长调节剂，能促进植物生长，增强作物的抗旱抗寒等抗逆性。因此，提高堆肥中黄腐酸的含量对于提高堆肥产品肥力有这重要意义。
一般而言高温堆肥后期，黄腐酸占腐殖质的比例下降。二次发酵是提高黄腐酸含量的契机。因此，通过接种产黄腐酸的高效菌种启动肥料二次发酵，将外部添加的植物源纤维素或将粪便中难降解的纤维素等定向转化为黄腐酸类物质，既能提高粪便利用率，又能提高有机肥的肥效，能有效解决畜禽粪便堆肥肥力低的瓶颈问题。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)CZ1，其于2020 年1月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No. 60946。
本发明提供的贝莱斯芽胞杆菌菌株CZ1，分离自广东省佛山市某河涌底泥，其形态学和生理生化特征：该菌24h平板培养物菌落圆形、白色，突出培养基，不透明，直径 0.5～1.0mm。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长pH 4.0～9.0。
本发明实验发现，贝莱斯芽胞杆菌CZ1具有纤维素水解能力和产黄腐酸的能力，因此可以在畜禽粪便发酵产堆肥中应用。
本发明的第二个目的是提供贝莱斯芽胞杆菌CZ1在水解纤维素中的应用。
本发明的第三个目的是提供贝莱斯芽胞杆菌CZ1在产黄腐酸中的应用。
本发明的第四个目的是提供贝莱斯芽胞杆菌CZ1在畜禽粪便发酵中的应用。
优选是在畜禽粪便二次发酵中的应用。
优选为添加玉米秸秆的鸡粪有机肥的发酵体系中的应用。
本发明分离出的贝莱斯芽胞杆菌CZ1，该具有纤维素水解能力和产黄腐酸的能力，因此可以在畜禽粪便发酵产堆肥中应用。
本发明的Bacillus velezensis CZ1，于2020年1月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为GDMCC No.60946。
附图说明
图1是贝莱斯芽胞杆菌CZ1在平板上的菌落形态；
图2是贝莱斯芽胞杆菌CZ1在纤维素培养基中的水解圈。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)CZ1的分离和鉴定
样品采集：从广东省佛山市南海区大基尾涌采集表层底泥(0～10cm)。称取广东佛山某河涌底泥10g，装入盛有90mL灭菌水的250mL三角瓶中，置于摇床中，30℃，150r/min 振荡20min，静置10min，得到底泥悬浮液。取上层清液，用无菌水按10-3～10-7梯度稀释获得五个稀释接种物。各取200μL稀释接种物于刚果红纤维素固体培养基((NH4)2SO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 0.5g/L，羧甲基纤维素钠2g/L，刚果红0.4g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，配制方法是将各成分混合均匀，然后灭菌即得)平板上涂布，放于 30℃恒温箱中培养3天至长出菌落。周边出现明显水解圈的菌落为潜在目标菌落。选择潜在目标菌落进一步划线纯化，获得菌株CZ1。
菌株CZ1的鉴定：划线纯化后的菌株CZ1在LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌即得)上划线培养24h后菌落形态(图1)，单菌落边缘不规则，有隆起，表面褶皱，白色，不透明，干燥。进一步利用16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，送生工生物工程股份有限公司测序，测得16S rDNA序列，序列如SEQ ID No.1所示。所得序列与NCBI的GenBank序列进行比对，结果发现与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)的序列最为接近(相似性为99％)。根据《伯杰细菌鉴定手册》对菌落形态特征和培养特征，确定菌株CZ1为贝莱斯芽胞杆菌 (Bacillusvelezensis)，命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)CZ1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号，邮编：510070，保藏日期为2020年1月7日，保藏编号为GDMCC No.60946。
实施例2：贝莱斯芽胞杆菌CZ1的纤维素水解能力
用刚果红纤维素固体培养基检测菌株纤维素水解能力。从平板中挑取菌株，稀释涂布于刚果红纤维素固体培养基上，放于30℃恒温箱中培养3天至长出菌落。测得菌落直径、水解圈直径，并用水解圈与菌落直径比值确定水解能力。经测定，贝莱斯芽胞杆菌 CZ1的菌落直径为6.5mm、水解圈直径为10.5mm(图2)，水解圈与菌落直径比达1.62，高于同批筛选的其他菌株。
实施例3：贝莱斯芽胞杆菌CZ1在鸡粪堆肥二次发酵中的产黄腐酸应用试验
贝莱斯芽胞杆菌CZ1菌液制备：从平板中挑取贝莱斯芽胞杆菌CZ1，接种到LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L)中，30℃恒温箱中150r/min 振荡培养，当菌液浓度达到OD600为0.5时可供使用，即获得贝莱斯芽胞杆菌CZ1菌液。
(1)10g体系二次发酵验证：取好氧堆肥100天(一次发酵)的鸡粪堆肥10g，加入1g高温灭菌后的玉米秸秆，接种1.1mL的贝莱斯芽胞杆菌CZ1菌液，加无菌水于肥料中至其含水率为56％，放于30℃恒温箱中进行二次发酵7天，以不接贝莱斯芽胞杆菌 CZ1的作为空白对照(其他步骤相同)。接种贝莱斯芽胞杆菌CZ1的二次发酵产物黄腐酸含量达50.49mg/g，相比空白(未加贝莱斯芽胞杆菌CZ1)的19.12mg/g，提高了164.2％ (表1)。
(2)200g体系二次发酵验证：取好氧堆肥100天(一次发酵)的鸡粪堆肥10g，加入20g高温灭菌后的玉米秸秆，接种22mL的贝莱斯芽胞杆菌CZ1菌液，加无菌水于肥料中至其含水率为56％，放于30℃恒温箱中进行二次发酵7天，以不接贝莱斯芽胞杆菌CZ1 的作为空白对照(其他步骤相同)。接种贝莱斯芽胞杆菌CZ1的二次发酵产物黄腐酸含量达 40.47mg/g，相比空白(未加贝莱斯芽胞杆菌CZ1)的22.32mg/g，提高了81.3％(表1)。
表1鸡粪堆肥二次发酵产黄腐酸含量变化
Figure BDA0002387129440000051
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一株产黄腐酸的贝莱斯芽胞杆菌CZ1及其在畜禽粪便二次发酵中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽胞杆菌CZ1(Bacillus velezensis)
<400> 1
aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120
acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac 180
ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300
agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420
aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa 600
ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc 720
cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac 780
tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 840
ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa 900
cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960
aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020
ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080
cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140
gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa 1200
ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt ttatgtctga 1260
accatgcggt tcagacaacc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320
tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc 1380
ccat 1384

Claims (6)

1.贝莱斯芽孢 杆菌(Bacillus velezensis)CZ1，保藏编号为GDMCC No.60946。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢 杆菌CZ1在水解纤维素中的应用。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢 杆菌CZ1在产黄腐酸中的应用。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢 杆菌CZ1在畜禽粪便发酵中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在畜禽粪便二次发酵中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，是在添加玉米秸秆的鸡粪有机肥的发酵体系中的应用。
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