CN102703351B

CN102703351B - 一株芽孢杆菌utm03及其应用

Info

Publication number: CN102703351B
Application number: CN2012101776472A
Authority: CN
Inventors: 刘永跃; 周顺桂; 许宜北; 汪涌
Original assignee: DADI LVYUAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY (BEIJING) CO LTD
Current assignee: Hainan Lvyuan Kechuang Environmental Technology Co., Ltd
Priority date: 2012-01-21
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN102703351A

Abstract

本发明提供了一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株UTM03，其保藏编号为CGMCC No.5643。本发明提供的菌株UTM03在70℃下能快速增殖。本发明还提供了菌株UTM03在污泥堆肥中的应用。利用本发明提供的菌株UTM03制备的种子堆肥及其污泥堆肥应用方法，可避免了污泥堆肥中因盐分或重金属浓缩，所带来的使微生物失活或堆肥产品对植物带来伤害或重金属超标的问题，可广泛应用于污泥堆肥，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一株芽孢杆菌UTM03及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体地，涉及一种芽孢杆菌菌株UTM03及其应用。

背景技术

污泥是污水厂处理废水所产生的固态废弃物。随着现有污水处理厂数量的不断增多与处理工艺的不断革新，污水处理量和处理程度的不断提高，污泥产量明显增加。目前，多数污水处理厂处置污泥的方法主要有：焚烧、填埋、投海以及堆肥。相对而言，污泥高温堆肥是通过好氧微生物的生物代谢作用，放出热量，使有机物转化成稳定的腐殖质的过程，其处理成本低廉、可有效杀灭病原菌、寄生虫卵和杂草种籽，并能使水分蒸发，实现污泥稳定化、无害化、减量化。污泥高温堆肥处理工艺既可作为土地利用的前处理手段，又可作为降低污泥含水率，提高污泥热值的预处理手段，是一种积极有效的污泥处理方式。

在污泥高温堆肥过程中，由于微生物的代谢作用，堆体的温度会上升，先后经历中温阶段、高温阶段和降温阶段。堆肥高温期，堆体最高温度可达60-70℃以上，堆体中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死，是保证堆肥无害化的最重要阶段。然而，此时由于微生物有机体的重要组成物质如蛋白质、核酸等对温度敏感，将随着温度的升高遭受不可逆的破坏而导致机体的死亡，使微生物种群活性受到很大的抑制，表现为种类单一，数量减少，比中温阶段要少1～2个数量级，这无疑限制了有机物质的快速降解。研究表明，芽孢杆菌属微生物是污泥堆肥高温期的主要优势菌之一，但大多以孢子的形式存在，致使原有物料中有效菌数量不足，如能从污泥高温期堆肥中将这些有效菌筛选出来，并接种至污泥堆肥中，增加污泥高温期堆肥的有效活菌数，无疑对于促进污泥堆肥进程及其无害化将具有重要的现实意义。

目前，将芽孢杆菌应用于堆肥的菌种主要为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，但这些菌株均为中温菌，在促进堆肥进入高温期后，由于无法忍受高温的环境，将失去菌体活性。如专利(申请号：200910035641.X)中所用的高温微生物菌种土芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的筛选温度是50℃，并不能保证在70℃以上的污泥堆肥高温期中仍具活性。因此，此类的常规堆肥接种剂所得堆肥产品缺乏足够的有效嗜热微生物种群，每次进行堆肥时都需重新制备菌剂，这大大增加了污泥堆肥的工作量和成本，也忽视了堆肥返料作为湿污泥的优良调理剂的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)及其应用。

本发明提供的菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株，是以高温期污泥堆肥作为分离源，在70℃下经富集分离纯化得到的，命名为Bacillus sp.UTM 03。采用形态观察法和16S rRNA序列测定相结合的方法，将该菌鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，并将其命名为芽孢杆菌UTM03。该菌株已于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，保藏号为CGMCC No.5643。

嗜热芽孢杆菌菌株UTM03在LB固体培养基平板上的培养1天后特征是：单菌落为淡黄色，圆形，直径约3mm，表面湿润，中央扁平，边缘波状。其温度生长特性是：在LB固体培养基平板上，挑取单菌落划线在65-70℃下暗箱培养12-24小时，便可形成明显菌落。其菌体细胞特征是：杆菌。所述LB固体培养基的成分是：胰蛋白胨8-10g，酵母提取物4-6g，氯化钠8-12g，琼脂14-18g，植物凝胶8-12g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4。

本发明提供了含有嗜热地芽孢杆菌UTM03的菌剂。

本发明提供了嗜热地芽孢杆菌UTM03或其发酵产物或上述菌剂在堆肥中的应用。

本发明提供了嗜热地芽孢杆菌UTM03或其发酵产物或上述菌剂在制备堆肥接种剂中的应用。

本发明还提供了一种污泥堆肥的方法，包括以下步骤：

1)发酵菌液的制备：取芽孢杆菌菌株UTM03的菌种斜面经活化、扩大培养后，入发酵罐继续培养，制得；

2)原种子堆肥的制备：将辅料与污泥调配后，添加步骤1)制得的发酵菌液，混合均匀，堆肥发酵，得原种子堆肥；

3)将步骤2)制得的原种子堆肥与含水率70％-90％的污泥混合，进行堆肥发酵，得腐熟堆肥，即为一级种子堆肥；

4)将一级种子堆肥，按步骤2)代替原种子堆肥进行发酵，得腐熟堆肥，即为二级种子堆肥，如此传代发酵制备三级种子堆肥和四级污泥种子堆肥。

进一步，步骤1)斜面活化培养的条件为：6-12小时，65-70℃；扩大培养方法与条件：摇床振荡，振荡频率100-200rpm，温度65-75℃，时间1-3天；发酵罐培养，温度65-70℃，间隔4-12小时搅拌10-30分钟，搅拌速率100-250rpm，间隔4-12小时通气10-30分钟，通气量1∶0.5-1.5m³/(v·m³)，发酵时间2-6天；培养液为LB培养基，各级扩培时，其OD₆₀₀在2-4之间，停止培养。

进一步，步骤2)所述辅料为3-5mm长的木屑、稻草和花生壳粉等含水率在20％以下的碳素物料。

进一步，步骤2)所述堆体的碳氮比在20-30∶1，含水率在50％-65％，按物料总干重的0.1％-0.5％添加发酵菌液，并将辅料、发酵种子液与污泥混合均匀进行堆肥，堆肥发酵10-15天。

进一步，步骤2)、步骤3)所述堆肥是采用条垛式堆肥方式，堆体高1.2-3m，宽3-6m，长度6-30m，采用强制翻堆的形式进行供氧，期间堆肥间隔2-5天翻堆一次，中心温度高于75℃时进行翻堆。

进一步，步骤3)所述的将原种子堆肥与污泥混合，堆体含水率在50％-65％，堆肥发酵时间为15-30天。

上述步骤3)中，所述腐熟堆肥可作为第1代污泥种子堆肥，按步骤3)所述进行污泥堆肥，当第4代污泥种子堆肥利用完毕时，需重新利用辅料与发酵菌液，再次制备原种子堆肥。

本发明还提供了上述污泥堆肥的方法在污泥堆肥中的应用。

本发明的优点是提供了一株在70℃下能快速增殖的芽孢杆菌UTM03。本发明还提供了菌株UTM03污泥堆肥中的应用。利用本发明提供的菌株UTM03进行污泥堆肥，其优点在于腐熟堆肥可作为原种子堆肥继续循环使用，降低污泥堆肥调理剂的使用量，降低堆肥成本，质量稳定，且绿色环保，无污染，性能优良。原种子堆肥的使用代数控制在4代以内，避免了污泥堆肥过程中由于盐分或重金属浓缩所带来的次代种子堆肥中盐度过高，使微生物失活或堆肥产品中因盐度过高对植物带来伤害或重金属超标的问题。可广泛应用于污泥堆肥，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为显微镜下嗜热芽孢杆菌菌株UTM03(1000×)

图2为本发明菌株UTM03应用于污泥堆肥的流程示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 芽孢杆菌UTM03的分离与鉴定

在无菌的环境中，称取5g污泥堆肥样品于装有10粒玻璃珠的50ml 无菌水三角瓶中，置于摇床上160r/min振荡30分钟，使样品充分散开，然后放置70℃下，静置培养12小时。

取出以上静置培养的三角瓶，在无菌的环境中，静置3分钟，再用无菌吸管吸取5ml上清液加到装有50ml已灭菌的细菌培养液中，充分摇匀，放置于70℃下，静置富集培养48小时，如此，传代培养4代。细菌液体培养基配方为：牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml，pH7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

取出以上培养4代的富集培养三角瓶，用1ml无菌吸管吸取1ml上清液加到装有9ml无菌水中即得(10^-1)稀释液。依次类推，制得10^-1至10^-6稀释液。取6个无菌平皿，用1ml无菌吸管分别吸取以上稀释液0.2ml，接入平皿；将已融化并冷却至50℃左右的细菌培养基倒入无菌培养皿中，每皿约20ml，前后左右轻轻摇动培养皿，使菌液充分混匀，凝固后，在培养皿上作好稀释度及日期标记.

待平板凝固后，将上述平板置于恒温恒湿培养箱中，在70℃下进行培养24小时。

观察各平板的生长情况，选择菌落分散较好的平板上挑取菌落形态不同的单菌落进行划线培养，如此至4代以后，将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态。多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，用细菌培养基斜面培养至丰厚，于4℃冰箱中保存菌种，备用。细菌固体培养基的成分为：在细菌液体培养基中加入琼脂1.6％，植物凝胶1.0％。

以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为(27f)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和(1492r)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。获得的16SrRNA基因序列测序结果在GenBank中进行Blast 比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现与Bacillus sp.BGSC W9A22(AY608987.1)同源性最高，把该菌株鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，将其命名为UTM03，并于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，保藏号为CGMCC No.5643。

实施例2 发酵种子液的制备

取本发明菌株Bacillus sp.UTM03的斜面在70℃下活化培养8小时，然后接种装有已灭菌的LB培养液的摇瓶中，置于水浴恒温振荡器上进行一级扩培，振荡频率160rpm，时间36小时，温度70℃，经检测培养液OD₆₀₀为2.523；取一级培养液在发酵罐内进行扩培，控制温度65℃，间隔6小时搅拌15分钟，转速150rpm，间隔6小时通气15分钟，通气量1∶1.2(V/V)，发酵时间3天后，检测发酵液OD₆₀₀为3.003，即为发酵种子液。

实施例3 发酵种子液的制备

取本发明菌株Bacillus sp.UTM03的培养斜面在65℃下活化培养12h，然后接种装有已灭菌的LB培养液的摇瓶中，置于水浴恒温振荡器上进行一级扩培，振荡频率180rpm，时间36小时，温度65℃，经检测培养液OD600为2.815；取一级培养液在发酵罐内进行扩培，控制温度65℃，间隔4小时搅拌10分钟，搅拌速度160rpm，间隔4小时通气10分钟，通气量1∶0.8(V/V)，发酵时间4天后，检测发酵液OD600为3.103，即为发酵种子液。

实施例4 种子堆肥的制备及应用

下面以花生壳粉作为辅料，具体说明。

首先对脱水污泥、辅料花生壳粉进行采样检测分析，其基本性质见下表1：

Figure 2012101776472100002DEST_PATH_IMAGE001

根据原料的性质计算得：当物料配比为2∶1，碳氮比为28∶1，含水率为56％。取污泥为8吨，花生壳粉4吨，则物料总干重为5.37吨，按物料总干重的0.2％计算，发酵菌液添加量为10kg。

将空旷地面进行硬化，并建设防雨防水通排风性能优良的堆肥发酵棚，用铲车取4吨花生壳粉于地面上，使花生壳粉堆呈长条状堆置，然后均匀喷洒好热芽孢杆菌发酵菌液于花生壳粉上，再向花生壳粉上添加9吨污泥。用翻抛机进行翻抛，使之初步混合，然后将发酵菌剂用水稀释后，向垛体喷洒，再次进行翻堆，使物料充分混合均匀，之后每隔3天进行翻堆一次，并每天检测堆体温度的变化。在当中心温度达到65℃时，所接种的好热芽孢杆菌开始大量繁殖，并占据优势，在当中心温度达到75℃时进行翻堆，控制堆体中心温度在65-70℃之间，使堆体保持5天的高温期，达到无害化的卫生要求。堆置发酵15天后可制得腐熟的污泥堆肥污泥堆肥已基本稳定腐熟，含水率约为30％，即得原种子堆肥。

将原种子堆肥与脱水污泥混合，使物料含水率降至60％，按以上方法进行堆肥发酵，在第5次翻堆结束时可制得腐熟的污泥堆肥。上述污泥腐熟堆肥可作为第一代种子堆肥与脱水污泥混合进行下次发酵。依次类推，利用上一代的腐熟污泥堆肥作为种子堆肥与脱水污泥混合进行下次发酵，直至第4代种子堆肥结束时，需要利用辅料花生壳粉与脱水污泥重新发酵，制备原种子堆肥。

实施例5 种子堆肥的制备及应用

下面以水稻秸秆和花生壳粉作为辅料，具体说明。

首先对物料进行采样检测分析，其基本性质见下表2：

Figure 2012101776472100002DEST_PATH_IMAGE002

根据原料的性质计算得：当脱水污泥、水稻秸秆、花生壳粉物料重量配比为9∶2∶1时，碳氮比为26∶1，含水率为60％。取污泥为9吨，长度为1-2cm的水稻秸秆2吨和花生壳粉1吨，则物料总干重为4.85吨，按物料总干重的0.3％计算，发酵菌液添加量为15kg。

将空旷地面进行硬化，并建设防雨防水通排风性能优良的堆肥发酵棚，用铲车取辅料水稻秸秆2吨和花生壳粉1吨于地面上，使辅料堆呈长条状堆置，然后均匀喷洒好热芽孢杆菌发酵菌液于混合辅料上，再添加9吨污泥。用翻抛机进行翻抛，使之初步混合，然后将发酵菌剂用水稀释后，向垛体喷洒，再次进行翻堆，使物料充分混合均匀，之后每隔3天进行翻堆一次，并每天检测堆体温度的变化。在当中心温度达到65℃时，所接种的好热芽孢杆菌开始大量繁殖，并占据优势，在当中心温度达到75℃时进行翻堆，控制堆体中心温度在65-70℃之间，使堆体保持5天的高温期，达到无害化的卫生要求。堆置发酵15天后可制得腐熟的污泥堆肥污泥堆肥已基本稳定腐熟，含水率约为30％，即得原种子堆肥。

将原种子堆肥与脱水污泥混合，使物料含水率降至55％，按以上方法进行堆肥发酵，在第5次翻堆结束时可制得腐熟的污泥堆肥。上述污泥腐熟堆肥可作为第一代种子堆肥与脱水污泥混合进行下次发酵。依次类推，利用上一代的腐熟污泥堆肥作为种子堆肥与脱水污泥混合进行下次发酵，直至第4代种子堆肥结束时，需要利用辅料花生壳粉、水稻秸秆与脱水污泥重新发酵，制备原种子堆肥。

实施例6 堆肥效果

下面以实施例4中的原种子堆肥具体说明本发明的应用效果。经检测原种子堆肥的理化性质如下表3：

表3 原种子堆肥的理化性质

含水率(％)

有机碳(％)

全氮(％)

碳氮比

[0058]

20.5	24.6	1.75	14.1∶1
				Cr(mg/kg)	Cu(mg/kg)	Ni(mg/kg)	Pb(mg/kg)
47.7	23.9	16.9	25.8
				Zn(mg/kg)	Cd(mg/kg)	Hg(mg/kg)	As(mg/kg)
155	1.39	1.48	8.53

供试污泥为实施例5中的脱水污泥。取100kg脱水污泥与40kg原种子堆肥混合后在阳光温室内进行堆置发酵，混合后含水率为63％，间隔3天翻堆一次，堆肥后24小时至结束，强制通风，通风量为0.2m³/(min·m³)，通风时间为每小时通风15分钟，堆肥周期为21天，此记为接种处理。另取等量的经121℃、0.12MPa灭菌2小时的灭活种子堆肥同上进行堆肥，此记为灭活处理。同理，以1代种子堆肥继续处理污泥，直至第5代种子堆肥，各代种子堆肥接种结果见表4。

由下表2，接种处理比灭活处理进入高温期的时间提前，且接种处理堆肥高温期持续的时间与最高温度均比灭活处理的长、高，堆肥结束后，全氮含量接种处理明显高于灭活处理。重金属的含量在同代种子堆肥实验中，接种处理比灭活处理偏高，各代种子堆肥传代接种发酵过程中，重金属浓度逐渐升高，但均低于城镇污水厂污泥处置农用泥质标准(CJ/T 309-2009)A级污泥限值。种子发芽指数在同代种子堆肥处理中，接种处理比灭活堆肥高，各代种子堆肥传代接种发酵过程中，种子发芽指数逐渐减低，但均大于80％。

采用本发明的种子堆肥，有利于提高堆体生物活性，缩短堆肥发酵的延滞期，快速启动堆肥进程，加速有机物的降解，提高堆肥温度，减轻植物毒性，明显减少氮素损失，加速物料腐熟，实现污泥的无害化、减量化及稳定化处理处置。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

表4 第1～4代种子堆肥应用结果

Claims

1.一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株UTM03，其保藏编号为CGMCC No.5643。

2.含有权利要求1所述芽孢杆菌菌株UTM03的菌剂。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌菌株UTM03或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在污泥堆肥中的应用。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌菌株UTM03或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在制备堆肥接种剂中的应用。

5.一种污泥堆肥方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）发酵菌液的制备：取权利要求1所述芽孢杆菌菌株UTM03的菌种接种斜面活化培养、扩大培养后，继续发酵培养，制得；

2）原种子堆肥的制备：将辅料与污泥调配后，添加步骤1）制得的发酵菌液，混合均匀，堆肥发酵，得原种子堆肥；

3）将步骤2）制得的原种子堆肥与含水率70%-90%的污泥混合，进行堆肥发酵，得腐熟堆肥，即为一级种子堆肥；

4）将一级种子堆肥，按步骤2）代替原种子堆肥进行发酵，得腐熟堆肥，即为二级种子堆肥，如此传代发酵制备三级种子堆肥和四级污泥种子堆肥。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）斜面活化培养的条件为：6-12小时，65-70℃；扩大培养方法与条件：摇床振荡，振荡频率100-200rpm，温度65-75℃，时间1-3天；发酵培养，温度65-70℃，间隔4-12小时搅拌10-30分钟，搅拌速率100-250rpm，间隔4-12小时通气10-30分钟，通气量1：0.5-1.5m³/(v·m³)，发酵时间2-6天；培养液为LB培养基，各级扩培时，其OD₆₀₀在2-4之间，停止培养。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述辅料为含水率在20%以下的碳素物料，所述辅料选自3-5mm长的木屑、稻草和花生壳粉中的一种或多种。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述堆体的碳氮比在20-30:1，含水率在50%-65%，按物料总干重的0.1%-0.5%添加发酵菌液，并将辅料、发酵种子液与污泥混合均匀进行堆肥，堆肥发酵10-15天。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）、步骤3）所述堆肥是采用条垛式堆肥方式，堆体高1.2-3m，宽3-6m，长度6-30m，采用强制翻堆的形式进行供氧，期间堆肥间隔2-5天翻堆一次，中心温度高于75℃时进行翻堆。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤3）所述的将原种子堆肥与污泥混合，堆体含水率在50-65%，堆肥发酵时间为15-30天。