CN111621432A - 一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用。本发明使用的地衣芽孢杆菌株筛选于白酒丢糟，该菌株的保藏编号为CGMCC No.18747，保藏日期为2019年10月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。菌株易培养，酶活较高。通过该菌株发酵白酒丢糟制备的生物有机肥，有机质(以干基计)含量超过90％，有效活菌数(CFU)达0.7～1.1亿/g；经过发酵后pH为5.5～6.5，含水量在15％～20％，均在国标范围内(国标要求有机质(以干基计)含量≧40.0％，有效活菌数(CFU)≧0.20亿/g，水分≦30.0％，pH为5.5～8.5)，具有较高的应用价值。

Description

一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及利用白酒丢糟制备生物有机肥中的应用。
背景技术
丢糟是白酒制造最主要的副产物之一，随着白酒产量的增加，丢糟的产量也在增加，生产1千升白酒，会产生8吨左右的丢糟，若处理不当或直接丢弃必定造成环境污染。也有用来直接做堆肥和饲料，却利用率不高，造成资源浪费。如何利用好丢糟成为白酒行业亟待解决的问题。丢糟含有丰富的营养成分，主要含有纤维素、蛋白质和淀粉等，其中纤维素占17～21％，纤维素含量很高。
生物有机肥有机质含量高，能够改良土壤，改善土壤理化性状，增强土壤保水、保肥、供肥的能力，缓解长期使用化肥造成的土壤板结。丢糟作为有机肥料的好原料，具有供肥、改土、刺激、拮抗和灭草等作用。但纤维素不易直接被利用，丢糟中又含有大量纤维素，将丢糟中纤维素降解对白酒丢糟制备生物有机肥具有十分重要的意义。
地衣芽孢杆菌是一种生长速度快、营养需求简单的革兰氏阳性杆状细菌。其不但能够抑制植物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。当它作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。同时，我们发现地衣芽孢杆菌具备降解纤维素的能力。
地衣芽孢杆菌在木薯渣、银杏叶渣、醋糟以及菠萝皮渣等废物资源化方面有所研究，2012年，史经略报道了一篇混菌固态发酵生物饲料的研究，他以玉米粉、豆粕、酒糟为主要原料，通过混料设计确定主要原料的最佳配比，探索混菌固态发酵生物饲料(史经略，张安宁，薛祥明.混菌固态发酵生物饲料的研究[J].安徽农业科学，2012，40(03):1493-1496.)。其中地衣芽孢杆菌是混菌的一种，且其中的一种原料是酒糟。虽然都来源于酒厂，但丢糟并不等同于酒糟，酒糟指在酿酒过程中将谷物如高粱和大麦等发酵蒸出酒精后剩余的物料的总称，其可细分为酒醅糟、红糟和丢糟。酒醅糟和红糟会继续下窖进行再次发酵，而丢糟则直接丢弃。实际上，地衣芽孢杆菌并未运用于丢糟。目前也未见用地衣芽孢杆菌利用白酒丢糟制备生物有机肥的报道。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用，菌株易培养，生产安全性高，且纤维素酶活较高；实现白酒丢糟资源化利用，通过该菌株发酵白酒丢糟制备的生物有机肥，有机质(以干基计)含量超过90％，有效活菌数(CFU)达0.7～1.1亿/g，远远高于国标NY884-2012(国标要求有机质(以干基计)含量≧40.0％，有效活菌数(CFU)≧0.20亿/g)；经过发酵后pH为5.5～6.5，含水量在15％～20％，均在国标范围内(国标要求水分≦30.0％，pH为5.5～8.5)。
解决以上技术问题的本发明中的一种地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis JZLGZ-1)，保藏编号为CGMCC No.18747，保藏日期为2019年10月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
白酒丢糟酸度很高，本发明菌筛选于白酒丢糟，因此对酸环境耐受性较强。同时白酒丢糟中纤维素占17～21％，本发明菌具备降解纤维素的能力。本发明菌经多次传代，菌株依旧稳定遗传。目前在传代过程中，并未出现明显的变异菌株。
本发明中地衣芽孢杆菌纤维素酶的酶活可为0.02～0.3mmol·mL-1·min-1。
本发明中一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)采样：在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中；
(2)初筛：取白酒丢糟接种于刚果红培养基，挑选产生水解圈的菌株并纯化；其中接种纯化后于35-38℃恒温培养箱中培养2-3d，反复步骤直至菌为纯菌落。
(3)复筛：将上述菌株接种于发酵产酶培养基；
(4)收集发酵液测定其酶活，选择纤维素酶活较高的菌株。
优选方案中，所述刚果红培养基包括以下重量份的组份及配制方法为：KH2PO4 0.2～0.6份，MgSO4 0.15～0.4份，琼脂14～20份，明胶1.0～4.0份，纤维素粉1～3份，刚果红0.1～0.2份，蒸馏水1000mL，pH调至5.5～7.5。
所述步骤(4)中酶活测定具体如下：
A、将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于34～38℃、120～180r/min摇床培养24～48h后，即得种子液；
B、取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入2～6％的种子液，然后置于34～38℃、120～180r/min摇床培养2～5天；接种量太小，造成发酵前期菌体总量太小，菌株短期内不能达到一定的菌种浓度；接种量太大，造成菌株初始浓度过高，菌体的生长繁殖需消耗培养基中大量的营养物质。这些都可能都对菌株发酵产纤维素酶产生影响。
C、培养后6000～8000r/min常温离心8～12min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。
所述种子液培养基配方包括以下重量份的组份：牛肉膏8～13份，蛋白胨2～5份，NaCl 4～8份，蒸馏水1000mL，pH值为5.5～7.5。
所述发酵产酶培养基包括以下重量份的组份及配制方法为：(NH4)2SO4 2～4份，K2HPO4 2～4份，MgSO4·7H2O 0.2～0.6份，CMC～Na 4～8份，葡萄糖3～6份，蒸馏水1000mL，pH值调至5.5～7.5。
培养基均采用121℃灭菌20分钟。
本发明中一种地衣芽孢杆菌菌株的应用，为在制备生物有机肥料中的应用。
进一步，为在再利用白酒丢糟制备生物有机肥料中的应用。使白酒丢糟得到二次利用，减小环境污染，增加效益。
本发明利用白酒丢糟制备生物有机肥，需先从白酒丢糟中筛选出纤维素降解菌，再将纤维素降解菌扩培发酵白酒丢糟。利用地衣芽孢杆菌发酵白酒丢糟制备生物有机肥具有很大现实意义。
应用具体步骤如下：
取适量新鲜丢糟，按照丢糟：0.25mol/L NaOH＝3:7(W(g):V(mL))的比例添加NaOH溶液。于121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后在灭菌后的实验室中分装于无菌塑料盒，填充量为1/4～1/3。再接入5～25％复筛得到的菌株种子液，搅拌混匀，最后盖上保鲜膜。于室温进行发酵，发酵5～7天，每天定期洒水，确保丢糟整体湿润。发酵结束后，置于40～80℃烘箱中6～12小时，即得生物有机肥。测定生物有机肥的pH、含水量、有机质、有效活菌数。
本发明对白酒丢糟采用半开放式发酵的方法，以降低生产成本及减少实际生产中不确定因素的影响。
所述地衣芽孢杆菌核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明从白酒丢糟中筛选出的地衣芽孢杆菌菌株易培养，生产安全性高，且其代谢产物纤维素酶的酶活较高。通过该菌株发酵白酒丢糟制备的生物有机肥，有机质(以干基计)含量超过90％，有效活菌数(CFU)达0.7～1.1亿/g，远远高于国标NY884-2012(国标要求有机质(以干基计)含量≧40.0％，有效活菌数(CFU)≧0.20亿/g)；经过发酵后pH为5.5～6.5，含水量在15％～20％，均在国标范围内(国标要求水分≦30.0％，pH为5.5～8.5)，具有较高的应用价值。本发明不仅避免了丢弃的白酒丢糟污染环境，而且实现了白酒丢糟的资源化利用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，所用原料及试剂均可由市场购得：
实施例1
本发明中一种地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis JZLGZ-1)，保藏编号为CGMCC No.18747，保藏日期为2019年10月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
所述地衣芽孢杆菌核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，筛选步骤如下：
(1)在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中。
(2)称取10g白酒丢糟置于100mL的锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水，摇匀；
(3)取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液；
(4)用无菌移液枪分别移取100μL各稀释液涂布于装有30mL刚果红培养基中，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；接种量太大，涂布后培养基表面不易干，倒置时容易造成染菌；
(5)置于35℃恒温培养箱中培养3d；
(6)选取上述培养基中呈单菌落的菌，分别挑取产生水解圈的菌落于刚果红培养基中进行分离纯化；
(7)放置于35℃恒温培养箱中培养3d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。当培养的菌纯化后，将菌株保藏于-20℃冰箱中备用。上述刚果红培养基配方为：KH2PO4 0.3g，MgSO40.2g，琼脂15g，明胶1.0g，纤维素粉1g，刚果红0.15g，蒸馏水1000mL，pH调至6。培养基采用121℃灭菌20分钟。
(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中(勾取三环初筛得到的菌株于100mL于种子液培养基中)，置于35℃、150r/min摇床培养36h后，即得种子液。种子液培养基配方为：牛肉膏10g，蛋白胨3g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH调至6；接种量太小，培养基前期菌体总量太小。
(9)取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入2％的种子液，然后置于35℃、150r/min摇床培养2天。培养后8000r/min常温离心10min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。菌所产纤维素酶酶活为0.112mmol·mL-1·min-1。
发酵产酶培养基配方为：(NH4)2SO4 2g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，CMC～Na5g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL，pH调至6。培养基均采用121℃灭菌20分钟。
实施例3
地衣芽孢杆菌株的筛选步骤如下：
(1)在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中。
(2)称取10g白酒丢糟置于100mL的锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水，摇匀；
(3)取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液；
(4)用无菌移液枪分别移取100μL各稀释液于刚果红培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；
(5)置于37℃恒温培养箱中培养2d；
(6)选取上述培养基中呈单菌落的菌，分别挑取产生水解圈的菌落于刚果红培养基中进行分离纯化；
(7)放置于37℃恒温培养箱中培养2d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。当培养的菌纯化后，将菌株保藏于-20℃冰箱中备用。刚果红培养基配方为：KH2PO4 0.2g，MgSO40.15g，琼脂14g，明胶1.0g，纤维素粉1g，刚果红0.1g，蒸馏水1000mL，pH调至7。培养基采用121℃灭菌20分钟。
(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于34℃、120r/min摇床培养24h后，即得种子液。种子液培养基配方为：牛肉膏9g，蛋白胨3g，NaCl 6g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0；
(9)取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入4％的种子液，然后置于34℃、120r/min摇床培养5天。培养后6000r/min常温离心12min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。菌所产纤维素酶酶活为0.123mmol·mL-1·min-1。
发酵产酶培养基配方为：(NH4)2SO4 2.5g，K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，CMC～Na 5g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL，pH调至7.5。培养基均采用121℃灭菌20分钟。
实施例4
地衣芽孢杆菌株的筛选步骤如下：
(1)在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中。
(2)称取10g白酒丢糟置于100mL的锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水，摇匀；
(3)取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液；
(4)用无菌移液枪分别移取100μL各稀释液于刚果红培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；刚果红培养基配方为：KH2PO4 0.5g，MgSO4 0.35g，琼脂17g，明胶3.0g，纤维素粉2g，刚果红0.2g，蒸馏水1000mL，pH调至6.5。培养基采用121℃灭菌20分钟。
(5)置于35℃恒温培养箱中培养3d；
(6)选取上述培养基中呈单菌落的菌，分别挑取产生水解圈的菌落于刚果红培养基中进行分离纯化；刚果红培养基配方与上面相同。
(7)放置于35℃恒温培养箱中培养3d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。当培养的菌纯化后，将菌株保藏于-20℃冰箱中备用。
(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于35℃、130r/min摇床培养48h后，即得种子液。种子液培养基配方为：牛肉膏8g，蛋白胨2g，NaCl 4g，蒸馏水1000mL，pH调至6.5。
(9)取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入4％的种子液，然后置于35℃、130r/min摇床培养5天。培养后7000r/min常温离心11min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。菌所产纤维素酶酶活为0.119mmol·mL-1·min-1。
发酵产酶培养基配方为：(NH4)2SO4 2g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，CMC～Na4g，葡萄糖3g，蒸馏水1000mL，pH调至6.5。培养基均采用121℃灭菌20分钟。
实施例5
地衣芽孢杆菌株的筛选步骤如下：
(1)在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中。
(2)称取10g白酒丢糟置于100mL的锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水，摇匀；
(3)取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液；
(4)用无菌移液枪分别移取100μL各稀释液于刚果红培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；
(5)置于38℃恒温培养箱中培养2d；
(6)选取上述培养基中呈单菌落的菌，分别挑取产生水解圈的菌落于刚果红培养基中进行分离纯化；
(7)放置于38℃恒温培养箱中培养2d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。当培养的菌纯化后，将菌株保藏于-20℃冰箱中备用。上述刚果红培养基配方为：KH2PO4 0.6g，MgSO40.4g，琼脂20g，明胶4.0g，纤维素粉3g，刚果红0.2g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5。培养基采用121℃灭菌20分钟。
(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于38℃、180r/min摇床培养24h后，即得种子液。种子液培养基配方为：牛肉膏13g，蛋白胨5g，NaCl 8g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5。
(9)取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入5％的种子液，然后置于38℃、180r/min摇床培养5天。培养后6000r/min常温离心12min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。菌所产纤维素酶酶活为0.135mmol·mL-1·min-1。
发酵产酶培养基配方为：(NH4)2SO4 4g，K2HPO4 4g，MgSO4·7H2O 0.6g，CMC～Na8g，葡萄糖6g，蒸馏水1000mL，pH调至5.5。培养基均采用121℃灭菌20分钟。
实施例6
(1)采样：在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的丢糟，装入无菌取样袋中。
(2)称取10g白酒丢糟置于100mL的锥形瓶中，加入90mL无菌生理盐水，摇匀；
(3)取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液；
(4)用无菌移液枪分别移取100μL各稀释液于刚果红培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面；
(5)置于37℃恒温培养箱中培养2d；
(6)选取上述培养基中呈单菌落的菌，分别挑取产生水解圈的菌落于刚果红培养基中进行分离纯化；
(7)放置于37℃恒温培养箱中培养2d，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。当培养的菌纯化后，将菌株保藏于-20℃冰箱中备用。上述刚果红培养基配方为：KH2PO4 0.5g，MgSO40.25g，琼脂14g，明胶2.0g，纤维素粉1.88g，刚果红0.10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。培养基采用121℃灭菌20分钟。
(8)将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于36℃、150r/min摇床培养36h后，即得种子液。种子液培养基配方为：牛肉膏10g，蛋白胨3g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
(9)取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入6％的种子液，然后置于36℃、150r/min摇床培养2天。培养后8000r/min常温离心10min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力。选择纤维素酶活较高的菌株。菌所产纤维素酶酶活为0.128mmol·mL-1·min-1。
发酵产酶培养基配方为：(NH4)2SO4 2.5g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CMC～Na6g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。培养基均采用121℃灭菌20分钟。
本发明中生物有机肥的制备：取适量新鲜丢糟，按照丢糟：0.25mol/L NaOH＝3:7(W(g):V(mL))的比例添加NaOH溶液，于121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后在灭菌后的实验室中分装于无菌塑料盒，填充量为1/4～1/3，再接入10％复筛得到的菌株种子液，搅拌混匀，最后盖上保鲜膜。于室温进行发酵，发酵7天，每天定期洒水，确保丢糟整体湿润。发酵结束后，置于60℃烘箱中8小时，即得生物有机肥。测定生物有机肥的pH、含水量、有机质、有效活菌数。其中，灭菌后的实验室为较密闭的一间实验室，采用紫外灯灭菌2～6h，无菌塑料盒为经过100℃沸水浸泡1h的塑料盒，洒水为实验室自来水。
pH指标测定具体方法为：称取10g制备的生物有机肥于250mL锥形瓶，再加100mL蒸馏水。在室温下，以150r/min摇床振荡60min，过滤，然后用酸度计测定滤液的pH值。测定结果显示，生物有机肥pH为5.8，空白组pH为5.2。
含水量指标测定具体方法为：将称量瓶放于105℃干燥箱中30min，然后置于干燥器中，冷却后称量并记录称量瓶的质量(精确度0.0001g)。再向称量瓶中加入4～6g制备的生物有机肥，称量并记录称量瓶和生物有机肥的总质量(精确度0.0001g)，置于105℃干燥箱中4～6h，然后置于干燥器中，冷却后再次称量并记录称量瓶和生物有机肥的总质量(精确度0.0001g)。计算生物有机肥的含水量。测定结果显示，生物有机肥的含水量为16.1％。
有机质指标测定具体方法为：先将制备的生物有机肥进行预处理，然后采用国标NY525-2012测定有机质。测定结果显示，生物有机肥的有机质(以干基计)为90.7％，空白组的有机质(以干基计)为81.6％。
预处理具体方法为：将生物有机肥经粉碎机粉碎，再过18目孔筛，即得。
有效活菌数指标测定具体方法为：先采用上述的预处理方法，对制备的生物有机肥进行预处理。然后采用国标NYT2321-2013测定有效活菌数。测定结果显示，生物有机肥的有效活菌数(CFU)达0.9亿/g。
鉴定：选取上述菌株进行鉴定。经16sRNA鉴定，得到核苷酸序列，序列SEQ ID No：1所示。经NBCI比对，本发明提供的地衣芽孢杆菌株与标准株同源性为99％，可为同种类不同菌株的地衣芽孢杆菌株。
具体步骤可为：配制100mL种子液培养基，于121℃灭菌20分钟。冷却后，用接种环刮取纯化后的菌株，接种于种子液培养基中，置于37℃100～180r/min的摇床中培养12～48h，将所得的种子液以体积比为6％的接种量转入到发酵培养基中，置于37℃100～200r/min的摇床中培养12-54h，用移液枪取3～4mL发酵液放入已经灭菌的ep管中，用封口胶封好，专门检测公司完成测序。所得序列如SEQ ID No：1所示。将序列在NBCI上进行比对，结果显示：与已知的地衣芽孢杆菌16SrRNA序列的同源性＞99％，可为同种类不同菌株的地衣芽孢杆菌。
保藏：将筛选出的地衣芽孢杆菌用试管斜面进行保藏，斜面为种子液固体培养基。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Figure BDA0002445100550000081
Figure BDA0002445100550000091
Figure BDA0002445100550000101
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 　四川轻化工大学
<120> 　一种地衣芽孢杆菌及筛选方法及应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1433
<212>　 16S rRNA
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 1
1 gcggctggct ccaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga
61 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact
121 agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg
181 tgggattggc ttagcctcgc ggcttcgctg ccctttgttc tgcccattgt agcacgtgtg
241 tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc
301 accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct
361 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg
421 tcactctgcc cccgaaaggg aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg
481 gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc
541 gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc acgcggagtg cttaatgcgt
601 ttgctgcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg
661 gactaccagg gtatataaac cctgttcgct ccccacgctt tcgcgcatca gcgtcagtta
721 cagaccagag agtcgctttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct
781 acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc
841 ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgcgc gctttacgcc
901 caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag
961 ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta ttcgaacggt acttgttctt
1021 ccctaacaac agagttttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc
1081 agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg
1141 tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga
1201 gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagctaaaag
1261 ccacctttta tgattgaacc atgcggttca atcaagcatc cggtattagc cccggtttcc
1321 cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctga
1381 cctaagggag caagctcccg tcggtccgct cgacttgcat tataaaacac gc 1433

Claims (9)

1.一种地衣芽孢杆菌株，其特征在于：所述分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus
licheniformis JZLGZ-1)，保藏编号为CGMCC No.18747，保藏日期为2019年10月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采样：在白酒厂酿造车间取样，挑选蒸馏后废弃的白酒丢糟，装入无菌取样袋中；
(2)初筛：取白酒丢糟接种于刚果红培养基，挑选产生水解圈的菌株并纯化；
(3)复筛：将上述菌株接种于发酵产酶培养基；
(4)收集发酵液测定其酶活，选择纤维素酶活较高的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述刚果红培养基包括以下重量份的组份及用量：KH2PO4 0.2～0.6份，MgSO4 0.15～0.4份，琼脂14～20份，明胶1.0～4.0份，纤维素粉1～3份，刚果红0.1～0.2份，蒸馏水1000mL，pH＝5.5～7.5。
4.根据权利要求2所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中酶活测定具体如下：
A、将初筛得到的菌株接种于种子液培养基中，置于34～38℃、120～180r/min摇床培养24～48h后，即得种子液；
B、取一定量的发酵产酶培养基于锥形瓶，灭菌冷却后，在无菌操作台上接入2～6％的种子液，然后置于34～38℃、120～180r/min摇床培养2～5天；
C、培养后6000～8000r/min常温离心8～12min，上清液为粗酶液并测其纤维素酶活力，选择纤维素酶活较高的菌株。
5.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述种子液培养基配方中包括以下重量份的组份及用量：牛肉膏8～13份，蛋白胨2～5份，NaCl 4～8份，蒸馏水1000mL，pH值为5.5～7.5。
6.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述发酵产酶培养基包括以下重量份的组份及用量：(NH4)2SO4 2～4份，K2HPO4 2～4份，MgSO4·7H2O0.2～0.6份，CMC～Na 4～8份，葡萄糖3～6份，蒸馏水1000mL，pH值为5.5～7.5。
7.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：为在制备生物有机肥料中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：为在再利用白酒丢糟制备生物有机肥料中的应用。
9.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
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