KR100738007B1

KR100738007B1 - 신규 미생물 바실러스 베레첸시스 ａ-68 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100738007B1
Application number: KR1020050111625A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 조강익; 조혜영
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2005-11-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2007-07-13
Also published as: KR20070053867A

Abstract

본 발명은 신규 미생물 바실러스 베레첸시스 Ａ-68 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 해수로부터 동정한 섬유소 분해효소 생성능을 가진 바실러스 베레첸시스 Ａ-68, 이를 미강, 왕겨, 전분 및 CMC로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소 분해효소 및 다당류의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 미강 또는 왕겨와 같은 농업 부산물을 탄소원으로 사용하여 다당류를 생산할 수 있으므로, 고가의 탄소원을 사용하여 다당류를 생산하는 기존의 방법에 비해 보다 저렴한 비용으로 다당류를 생산할 수 있고, 환경 오염의 원인 중 하나인 미강 및 왕겨를 다당류의 생산에 이용함으로써 환경오염을 감소시키는 친환경적인 다당류 생산 공정을 확립하는데 유용하다.

바실러스 서브틸리스 서브스페시스 서브틸리스, 해양 미생물, 섬유소 분해효소, 다당류, 생산

Description

신규 미생물 바실러스 베레첸시스 Ａ-68 및 그의 용도{Novel Bacillus Velezensis A-68 and Use of the Same}

도 1은 해수에서 분리하여 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 페이퍼 디스크(paper disk)에 점적한 후, 점적한 페이퍼 디스크를 이용하여 검정한 섬유소 분해 능력을 비교하여 나타낸 것이다.

도 2는 16S rDNA 및 자이레이즈 A 유전자의 부분적인 염기서열을 결정한 것을 바탕으로 바실러스 베레첸시스 Ａ-68과 다른 균주들 간의 계통수를 나타낸 것이다.

도 3은 탄소원의 종류에 따른 바실러스 베레첸시스 Ａ-68의 성장을 나타낸 것이다.

도 4는 탄소원의 종류에 따른 바실러스 베레첸시스 Ａ-68의 섬유소 분해효소 생산양을 나타낸 것이다.

도 5는 탄소원의 종류에 따른 바실러스 베레첸시스 Ａ-68의 다당류 생산양을 나타낸 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

섬유소(cellulose)는 고등식물의 세포벽의 주성분으로 목질부의 대부분을 차지하는 다당류이자, 자연계에서 석탄에 이어 다량으로 존재하는 유기화합물이며, 공업적으로 중요한 자원이다. 고등식물 외에도 세균 ·바닷말 ·해산동물인 멍게류의 외피에도 존재하고, 아세트산균의 균체외 분비물에도 함유되어 있으며, 조개류의 점액 속에도 존재한다. 섬유소는 균류·세균·연체동물 등의 섬유소 분해효소(cellulase)에 의하여 분해된 후, 최종적으로 전분(glucose)이 된다.

섬유소 분해효소(cullulase)란 섬유소(cellulose)를 가수분해시키는 효소로서, 섬유소 분해효소에 의해 가수분해된 섬유소는 셀로바이오스(cellobiose)로 변하고, 이는 다시 β-글루코시다아제(β-glucosidase)에 의해 포도당으로 가수분해된다.

섬유소 분해효소는 주로 T. viride , T. reesei 등과 같은 Tricodema 종, Aspergillus niger, Thermomonospora 등과 같은 곰팡이, Clostridium 종에 의해 생산되는 것으로 알려져 있으며, Aspergillus , Penicillium , Clostrium , Sclerotium 속 균주 등에 의해서도 생산되는 것으로 보고된 바 있다.

섬유소 분해효소를 생산하는 종래기술은 Tricoderma 종, Aspergillus 종 등의 곰팡이를 고체배양(solid state fermentation)하는 방법으로, 이는 액체배양에 비하여 비효율적이고, 곰팡이는 세균에 비해 생육속도가 낮기 때문에 생산성이 낮아 섬유소 분해효소의 가격을 높이는 문제점을 가지고 있다.

섬유소 분해효소의 생산을 향상시키는 것을 포함하여 종래기술이 가진 문제점들을 해결하기 위하여, 곰팡이의 섬유소 분해효소 유전자를 E. coli와 같은 세균에 도입하고, 섬유소 분해효소 유전자 함유 변이주를 액체배양하여, 섬유소 분해효소를 생산하려는 연구가 진행되고 있으나, 아직 산업화단계까지 적용되지 못하고 있는 실정이다.

생산된 섬유소 분해효소는 곡류 가공, 생물자원으로부터의 에탄올 발효, 주류 생산, 폐기물 처리, 세탁 혹은 주방용 세제 등으로 다양하게 사용될 수 있다. 기존의 세탁 혹은 주방용 세제는 대부분이 화학물질로서, 물에 녹은 상태에서 미생물에 의해 분해되기 어렵고, 물 위에 거품이 생기게 되어 산소가 물속으로 녹아들어 갈 수 없게 한다. 이는 수중으로 햇빛이 들어오는 것을 차단하여, 플랑크톤의 정상적인 번식을 방해할 뿐 아니라, 수자원의 오염을 증가시키는 여러 문제점을 유발한다. 또한, 기존의 세탁 혹은 주방용 세제는 세척력을 높이기 위한 인을 함유하 고 있어서 부영양화 현상을 유발한다.

다당류는 과실에 함유된 펙틴(pectin), 해조류에 함유된 카라기난(karageenan), 종자에 함유된 Locust Bean Gum, 수액(樹液)에서 얻는 Arabia Gum, 동물의 조직이나 뼈에서 분리한 콜라겐(collagen)을 부분적으로 가수분해하여 생산하는 젤란틴 (gellatin), 식물의 탄소동화작용에 의하여 생산되는 포도당의 축합체인 전분(starch)과 섬유소(cellulose), 해조류에서 추출하는 알긴 및 아가(agar), 미생물이 생산하는 잔탄(xanthan), 젤란(gellan) 및 풀루란(pullulan) 등 많은 종류가 있다. 이들 다당류는 물에 용해되면 점도가 높은 용액이 되거나, 젤리상이 되는 성질을 가지고 있다. 이들 다당류는 식품의 점도를 증가시키거나, 겔을 형성하거나, 유화안정성을 좋게 하는 등 식품의 조직을 형성하거나, 식감을 개량하는 여러 가지 기능을 가지고 있기 때문에, 식품의 품질을 향상시키기 위해 폭 넓게 이용되고 있다.

미생물의 배양에 의한 껌류의 생산에 대한 연구는 1950년대 말과 1960년 대 초에 시작되었다. 잔탄(zanthan), 커드란(curdlan), 미생물 알진(microbial alginate), 풀루란(pullulan)과 미생물의 섬유소(microbial cellulose)와 같은 다당류를 생산하는 많은 종류의 미생물이 발견되고 산업화하기 위한 연구가 진행되었다. 그 결과, 젤란(gellan), 웰란(wellan) 및 람산(rhamsan) 등이 개발되었으며, 이 중에서 잔탄은 식품 산업의 여러 분야에 쓰이고 있는데, 몇 년 전부터 잔탄의 기능을 보완한 젤란이 미국의 Newtrasweet Co.에서 개발하여 잔탄 시장을 대체하고 있다. 커드란은 미생물의 배양하여 생산하는 다당류로서는 잔탄, 젤란에 이어서 세 계에서 세 번째로 미국의 식품의약품 안전청(US FDA)의 승인을 받아 시판되고 있으며, 또한 월란과 람산도 시장에 진입하고 있다.

미생물을 이용하여 기능성 다당류를 생산하기 위한 미생물의 배양 배지는 탄소원으로 포도당, 전분 또는 설탕 등을 사용할 수 있으며 질소원으로 유기 질소원인 효모 추출액, 펩톤 및 트립톤 또는 염화 암모니움(NH₄Cl)과 질산 암모니움 ((NH₄)₂NO₃)과 같은 무기 질소원을 사용한다. 멸균된 배지에 다당류를 생산하는 균주를 접종하고 적당한 조건으로 일정시간 배양하면 미생물에 의하여 생합성된 다당류가 배양액에 축척된다.

산업적인 규모로 미생물을 이용하여 다당류를 생산하는 기존의 방법은 배양 배지의 탄소원으로 원가가 높은 포도당 또는 설탕 등을 과량으로 사용하기 때문에 생산비가 상대적으로 높은 편이다. 따라서, 생산된 다당류의 단가도 비싸고, 이를 이용하여 식품 등의 가격을 상승시키게 된다.

이에 본 발명자들은 섬유소 분해효소의 생성능을 가지고 있어 다당류의 생성능이 우수한 균주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 해수로부터 섬유소 분해효소 및 다당류 생성능을 가진 바실러스 베레첸시스 A-68을 분리·동정하고, 이를 배양하여 섬유소 분해효소를 생성시키면, 생성된 섬유소 분해효소가 배지의 탄소원을 이용하여 다당류를 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 신규 미생물 바실러스 베레첸시스 A-68 및 이를 이용한 섬유소 분해효소 및 다당류의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 섬유소 분해효소 및 다당류 생성능을 가지는 바실러스 베레첸시스(Bacillus velezensis) A-68(기탁번호: KACC 91178P)을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 미생물을 배양하여 섬유소 분해효소를 배양액으로 분비·생성하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 섬유소 분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 섬유소 분해효소의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양액의 탄소원은 미강, 왕겨, 전분 및 CMC(carboxymethyl cellulose)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 상기 미생물을 배양하여 다당류를 배양액으로 분비·생성하는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 다당류를 회수하는 단계를 포함하는 다당류의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양액의 탄소원은 미강, 왕겨, 설탕 및 CMC(carboxymethyl cellulose)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

해수에서 분리한 미생물들을 액체 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 직경 1.0cm의 페이퍼 디스크(paper disc)에 일정량 점적하여 건조시킨 후, 섬유소의 유도체인 카르복시메틸 섬유소(carboxymethyl cellulose)를 첨가한 고체배지 위에 올려놓고, 일정 온도에서 배양하면서 카르복시메틸 섬유소를 분해하는 균주를 분리하였다. 분리한 균주를 16S rDNA 및 gyrase A의 염기서열을 부분적으로 결정하여 보고된 균주들과 염기서열을 비교하는 방법으로 동정한 결과, 세균의 일종인 바실러스 베레첸시스 (Bacillus velezen) 임을 확인하고, 바실러스 베레첸시스 A-68(Bacillus velezensis A-68)이라 명명하였다.

탄소원을 다르게 하여 바실러스 베레첸시스 A-68을 배양한 결과, 미강 또는 왕겨를 탄소원으로 첨가한 배지에서 상기 균주의 성장, 섬유소 분해효소의 생성능 및 다당류의 생성능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 해수에서의 미생물 분리 및 배양

경상도 일대의 동해와 남해에서 채취한 일정한 양의 해수와 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl)를 적절하게 희석한 후, marine agar(하기 marine broth의 조성에 1.5%(w/v)의 agar를 첨가) 배지에 깔고(plating), 30℃에 배양하면서 평판 도말법 으로 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물을 marine broth(배지조성 기재 요망)에 한 백금니 접종하고, 25~35℃에서 150~200rpm으로 55~85시간 동안 배양한 후, 수득된 배양액을 새 배지(marine broth)에 3~5%(v/v)로 접종하고, 25~35℃에서 150~200rpm으로 3~5일 동안 배양하였다. 배양액 및 배양액을 5000~9000xg의 범위에서 10~30분 동안 원심분리하여 균체를 제외한 상등액만을 수득하였다.

상기 marine broth 1L의 조성은 다음과 같다: 5g 펩톤, 1g 효모추출물, 0.1g Ferric clitrate, 19.45 Sodium chloride, 5.9g Magnisium chloride, 3.24g Sodium sulfate, 1.8g Calcilum chloride, 0.55g Potsssium chloride, 0.16g Sodium bicarbonate, 0.08g Potassium bromide, 0.034g Strontium chloride, 0.022g Boric acid, 0.004g Sodium dilicate, 0.0024g Sodium fluoride, 0.0016g Ammonium nitrate 및 0.008g Disodium phosphate.

실시예 2: 섬유소 분해효소 생성능을 가진 균주의 분리

섬유소 분해효소 생성능을 가진 균주를 분리하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 상등액 40㎕를 직경 1cm의 페이퍼 디스크(paper disc)에 점적한 후 건조시켰다. 건조시킨 페이퍼 디스크를 CMC(carboxymethyl cellulose) 2%(w/v)를 첨가한 한천배지 위에 올려놓고 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 해수에서 분리한 미생물의 섬유소 분해효소 생성능을 관찰하였다 (도 1).

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 일부 미생물이 섬유소 분해효소를 생산·분비한다는 것을 확인할 수 있었다. 미생물이 섬유소 분해효소를 생산하여 분비 하면, 배지에 포함된 CMC가 분해되어 미생물이 존재하는 부분 주변으로 옅은 붉은색의 원이 생성된다 (도 1). 이 원의 반경 및 흰색을 나타내는 정도는 미생물의 섬유소 분해효소 생성능에 비례한다.

실시예 3: 바실러스 베레첸시스 A-68 균주의 동정

상기 실시예 2에서 섬유소 분해효소 생성능이 뛰어난 것으로 판별된 균주를 동정하기 위하여, 16S rDNA 및 자이레이즈 A 유전자의 염기서열을 분석하였다.

3-1: 16S rDNA 염기서열 분석에 의한 바실러스 베레첸시스 A-68 균주의 동정

상기 실시예 2에서 섬유소 분해효소 생성능이 뛰어난 것으로 판별된 균주를 배양한 후, 상기 배양액을 균질기(homogenizer)로 파쇄하여 100μl의 TE buffer(pH 8.0)에 녹이고, 리조자임(lysozyme)을 첨가하여 37℃에서 12시간 반응시킴으로써 세포벽을 분해하였다. 세포벽이 분해된 균체에 500ul의 구아니딘-사코실 용액(guanidine-sarcosyl solution: Guanidine thiocyanate(Sigma) 60g, 0.5mM EDTA 20ml, 및 Deionized water 20ml)을 첨가하여 원심분리하고 상등액을 수득하였다.

상기 수득한 상등액에 0.54배 부피의 이소프로파놀(isopropanol)을 첨가하여 염색체 DNA를 침전시켰다. 상등액을 제거하여 침전된 염색체 DNA를 수득하고, 90μl의 TE buffer(pH 8.0)에 녹인 후, 10μl의 RNase A(10 mg/ml, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시킨 다음, 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 염색체 DNA를 침전시켰다. 상기 침전된 염색체 DNA를 30μl의 증류수에 녹여 16S rDNA의 증폭을 위한 주형으로 사용하였다.

서열번호 1로 표시된 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′) 및 서열번호 2로 표시된 1522R(5’-AAG GAG GTG WTC CAR CC-3’)를 프라이머로 사용하고, 다음과 같은 조건하에서 PCR을 수행하여 16S rDNA 유전자를 증폭하였다.

사용기기: GenAmp TM PCR System 9700(Applied Biosystem)

PCR을 위한 반응 혼합물(reaction mixture, 총 부피: 50ul)의 구성: 주형 DNA 10ng, 200uM dNTP, 10mM Tris-HCl(pH 9.0), 40mM KCl, 0.15mM MgCl₂, 3mM MgSO₄, 20ug BSA, 0.005U Vent 중합효소, 1U Taq 중합효소 및 프라이머(27F 및 1522R 각각 0.5uM).

16S rDNA 증폭용 PCR 반응조건: 94℃, 3분 → [94℃, 30초 → 50℃, 30초 → 72℃, 5분] 30회 → post-elongation: 72℃, 10분

증폭된 PCR 산물은 Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)을 이용하여 정제하고, 1% agarose gel에 전기영동하여 16S rDNA의 크기를 확인하였다. 염기서열은 ddNTP에 형광물질을 표지한 BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystem)를 사용하여,다음과 같은 PCR 반응을 수행한 후, ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystem)를 이용하여 분석하였다.

염기서열 분석용 PCR 반응 조건; [96℃ 10초 → 50℃ 5초 → 60℃ 4분] 25회.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 선별된 A-68 균주의 16S rDNA 염기서열을 부분적으로 결정할 수 있었다.

A-68 균주의 16S rDNA 염기서열(874bp): 서열번호 5

5'- AACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTA ACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGAC ATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA ATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCG TTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG CGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCAT TGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTG GCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTC - 3'

3-2: 자이레이즈 A 염기서열 분석에 의한 바실러스 베레첸시스 A-68 균주의 동정

상기 실시예 3-1에서 수득한 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 4로 기재된 p-gyrA-f(5′-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3′) 및 서열번호 5로 기재된 p-gyrA-r(5’-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3’)을 프라이머로 사용하고, 다음과 같은 조건하에서 PCR을 수행하여 자이레이즈 A 유전자를 증폭하였다.

사용기기: GenAmp TM PCR System 9700(Applied Biosystem)

PCR을 위한 반응 혼합물(reaction mixture, 총 부피: 50ul)의 구성: 주형 DNA 10ng, 200uM dNTP, 10mM Tris-HCl(pH 9.0), 40mM KCl, 0.15mM MgCl₂, 3mM MgSO₄, 20ug BSA, 0.005U Vent 중합효소, 1U Taq 중합효소 및 프라이머(p-gyrA-f 및 p-gyrA-r각각 0.5uM).

PCR 반응조건: 94℃, 3분 → [94℃, 30초 → 50℃, 30초 → 72℃, 5분] 30회 → post-elongation: 72℃, 10분

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 선별된 A-68 균주의 자이레이즈 A 염기서열을 부분적으로 결정할 수 있었다.

A-68 균주의 자이레이즈 A 염기서열(963bp): 서열번호 6

5’- ATGCAATGAGCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTC ACAGACGGATTTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTAT CGGTAAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCAGAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTT GACGGACACGGCAACTTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGAATGTCAAAAATCGCAATGG AAATTCTGCGTGACATTACGAAAGACACGATTGACTATCAAGATAACTATGACGGTTCAGAAAGAGAGCCTGCCGTCATGCCTTCGAG ATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGGGCTGCCGGTATTGCGGTCGGAATGGCGACAAACATTCCCCCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATT GAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAG GTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGATCAATCACGATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGA GACTTCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGTCACGGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAAATCGCGGATCTT GTCCGAGACAAAAAAATCGAAGGAATTACCGATCTGCGAGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTCATTGAGATCCGCCGTG ACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGTACAAACAAACGGCCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAATCTGCTGGCGCTCGTTGACGGACAGCCGAAGGTACTAA-3’

상기 실험을 통해 결정한, 선별된 A-68 균주의 16S rDNA 및 자이레이즈 A의 부분적 염기서열을 바탕으로 다른 종의 균주들과의 유사성을 비교하여 표 3과 같이 나타내고, 이를 도 2의 계통도로 정리하였다.

Strain	Accession No.	Similarity	nt differences/ compared
Bacillus velezensis LMG 22478T		98.77	11/896
Bacillus amyloliquefaciens KCTC 1660T	AF272015	95.95	38/938
Bacillus mojavensis NRRL B-14698T	AF272019	84.10	124/780
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049T	AF272020	82.84	139/810
Bacillus subtilis subsp. subtilis KCTC 3135T	AF272021	82.48	133/759
Bacillus atrophaeus KCTC 3701T	AF272016	82.07	156/870
Bacillus vallismortis NRRL B-14890T	AF272025	81.40	168/903
Bacillus licheniformis KCTC 1918T	AF272017	78.25	186/855

이 결과를 토대로 선정된 균주를 세균의 일종인 바실러스 베레첸시스(Bacillus velezensis)로 동정하고, 바실러스 베레첸시스 A-68(Bacillus velezensis A-68)이라 명명하였다. 그리고, 이를 2005년 10월 17일자로 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농용미생물 보존 센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁번호 KACC 91178P로 기탁하였다.

실시예 4: 탄소원에 따른 바실러스 베레첸시스 A-68의 성장

본 발명의 바실러스 베레첸시스 A-68 균주를 Marine broth에 한 백금니 접종하고, 25~35℃에서 150~200rpm으로 55~85시간 동안 배양하였다. 상기 종균 배양액을 다시 배지[0.25%(w/v) 효모추출물, 0.5% K₂HPO₄, 0.1% NaCl, 0.02% MgSO_4·7H₂O(0.02%), 0.06% (NH₄)₂SO₄ 및 탄소원 2%]에 3~5%(v/v)로 접종하고, 25~35℃에서 150~200rpm으로 3~5일 동안 배양하였다. 배양액의 OD를 측정하여 탄소원 및 배양시간에 따른 A-68 균주의 성장을 관찰하였다. 본 발명에서 사용한 탄소원은 포도당(glucose), 과당(furctose), 맥아당(maltose), 설탕(sucrose), 전분(starch), CMC, 미강 및 왕겨이다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 전분, 미강 또는 왕겨를 탄소원으로 첨가한 배지에서 바실러스 베레첸시스 A-68 균주를 배양한 경우, 성장이 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 바실러스 베레첸시스 A-68에 의한 섬유소 분해효소의 생산

상기 실시예 4의 배양액을 5000~9000xg의 범위에서 10~30분 동안 원심분리하여, 균체를 제거하고 상등액만을 수득하였다.

CMC를 기질로 사용하여 상등액 속의 섬유소 분해효소의 양을 측정하였다. 먼저, 0.5ml의 상등액과 0.5ml의 1.0%(w/v) CMC 용액을 혼합하여 50℃에서 20분동안 둔 다음, DNS 방법을 사용하여 환원당의 생성 정도를 측정하였다. 상등액에 존재하는 섬유소 분해효소의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 전분, 미강 또는 왕겨를 탄소원으로 이용하여 바실러스 베레첸시스 A-68 균주를 배양한 경우, 섬유소 분해효소의 생성량이 증가함을 확인하였다.

실시예 6: 바실러스 베레첸시스 A-68에 의한 다당류의 생산

상기 실시예 4의 배양액을 5000~9000xg의 범위에서 10~30분 동안 원심분리하여, 균체를 제거하고 상등액만을 수득하였다. 수득한 상등액과 이소프로필알코올 또는 에탈올을 1:2(v/v)로 혼합하고, 약 4℃의 저온에서 24시간 동안 보관한 후, 5000~9000xg의 범위에서 10~30분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득한 침전물에 적정량의 증류수를 첨가한 다음, 투석하여 염 성분을 제거함으로써, 최종적으로 다당류를 수득하였다. 페놀-설페이트(phenol-sulfate) 방법을 사용하여 다당류의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 미강을 탄소원으로 사용하여 72시간동안 바실러스 베레첸시스 A-68을 배양한 경우 다당류의 생산량(5.99g/l)이 가장 높은 것으로 나타나, 본 발명의 바실러스 베레첸시스 A-68을 이용한 다당류 생산에 있어 미강이 우수한 탄소원이라는 것을 확인할 수 있었다. 미강을 탄소원으로 사용하여 배양한 경우에 다당류의 생산량은 5.99g/l로 가장 높은 다당류의 생산을 나타내었으며, 왕겨 및 설탕를 탄소원으로 사용하여 배양한 경우, 각각의 다당류 생산량은 4.61g/l 및 4.45g/l로, 왕겨 및 설탕 역시 우수한 탄소원이라는 것을 확인할 수 있었다. 이외에도, 포도당, 과당, 맥아당, 전분 및 CMC는 각각 1.63g/l, 1.67g/l, 1.92g/l, 1.61g/l 및 3.55g/l의 생산량을 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 신규 미생물 바실러스 베레첸시스 A-68 및 이를 이용한 섬유소 분해효소 및 다당류의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 미강 또는 왕겨와 같은 농업 부산물을 탄소원으로 사용하여 섬유소 분해효소 및 다당류를 생산할 수 있으므로, 고가의 탄소원을 사용하는 기존의 방법에 비해 보다 저렴한 비용으로 섬유소 분해효소 및 다당류를 생산할 수 있고, 환경 오염의 원인 중 하나인 미강 및 왕겨를 섬유소 분해효소 및 다당류의 생산에 이용함으로써 환경오염을 감소시키는 친환경적인 다당류 생산 공정을 확립하는데 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

섬유소 분해효소 및 다당류 생성능을 가지는 바실러스 베레첸시스(Bacillus velezensis) A-68 (기탁번호: KACC 91178P).
다음 단계를 포함하는 섬유소 분해효소의 제조방법:

(a) 제1항의 미생물을 배양하여 섬유소 분해효소를 배양액으로 분비·생성하는 단계; 및

(b) 상기 배양액으로부터 섬유소 분해효소를 회수하는 단계.
제2항에 있어서, 상기 배양액의 탄소원은 미강, 왕겨, 전분 및 CMC(carboxymethyl cellulose)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 다당류의 제조방법:

(a) 제1항의 미생물을 배양하여 다당류를 배양액으로 분비·생성하는 단계; 및

(b) 상기 배양액으로부터 다당류를 회수하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 배양액의 탄소원은 미강, 왕겨, 설탕 및 CMC(carboxymethyl cellulose)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.