KR20030015943A

KR20030015943A - 섬유질 분해 효소를 분비하는 유전자, 유전자로부터분비된 효소, 유전자를 포함하는 미생물, 미생물을 이용한유기질 비료

Info

Publication number: KR20030015943A
Application number: KR1020010049794A
Authority: KR
Inventors: 이영한; 윤호종
Original assignee: 한국바이오비료 주식회사
Priority date: 2001-08-18
Filing date: 2001-08-18
Publication date: 2003-02-26

Abstract

개시된 내용은 축분과 톱밥을 혼합, 부숙시켜 유기질 비료를 제조함에 있어, 톱밥에 포함된 난분해성인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 등을 미생물에 의해 빠른 시간내에 분해하여 유기질비료를 빠른 시간내에 제조할 수 있게 함은 물론 악취성분이 발생되지 않도록 하는 섬유질 분해 효소를 분비하는 유전자, 유전자로부터 분비된 효소, 유전자를 포함하는 미생물, 미생물을 이용한 유기질 비료에 관한 것이다.

이러한 본 발명은 1개의 셀룰로오스 분해 유전자(bglC), 2개의 자일랜 분해 유전자(xynA, xynD), 2개의 펙틴 분해 유전자(pelA, pelB)를 가진 신규한 바실러스 서브틸리스 균주로 판명된 미생물을 제공하는 것이며, 그 유전자 중 목질분해 작용을 하는 xynD의 분해효소는 바실러스 서브틸리스에서는 보고되지 않은 최초의 것으로 목질분해 작용을 통해 가축분 퇴비의 부숙을 촉진시킬 수 있는 것이다.

특히, 이러한 균주를 돈분을 이용한 퇴비화에 응용하게 되면 퇴비내의 실제분해율 향상, NH₃가스경감 즉 악취경감, 퇴비의 품질향상에 효과를 가질 수 있는 것이다.

Description

섬유질 분해 효소를 분비하는 유전자, 유전자로부터 분비된 효소, 유전자를 포함하는 미생물, 미생물을 이용한 유기질 비료{Gene secreting enzyme to disjoint cellulose, that enzyme, microbe including that gene, and organic manure using that microbe}

본 발명은 섬유질 분해 효소를 분비하는 유전자, 유전자로부터 분비된 효소, 유전자를 포함하는 미생물, 미생물을 이용한 유기질 비료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 축분과 톱밥을 혼합, 부숙시켜 유기질 비료를 제조함에 있어, 톱밥에 포함된 난분해성인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 등을 미생물에 의해 빠른 시간내에 분해하여 유기질비료를 빠른 시간내에 제조할 수 있게 함은 물론 악취성분이 발생되지 않도록 한 것이다.

주지하다시피, 산업의 발달과 인구증가 등으로 산업부산물이 다량 발생되고, 지구 생태계의 불균형을 초래하고 있어 환경보전 측면에서 산업부산물을 자원화하여 재활용하는 기술이 요구되고 있다. 산업부산물로 발생되는 각종 유기성 물질은 작물에 유용한 영양분을 함유하고 있으나 악취와 중금속 및 병원균의 감염 등의 문제로 농업에 직접 사용하기에는 위험부담이 있었으므로 이러한 산업부산물의 농업적 재활용을 위해서는 퇴비화 과정이 필수적이다. 퇴비화 과정은 고온의 발효과정을 통해 작물이 흡수 가능한 무기물과 부식질을 토양에 공급하고 유해병원균과 병해충, 잡초종자 등을 사멸시키는 효과를 기대할 수 있다.

그런데, 미부숙된 퇴비를 토양에 사용할 경우에는 병해충의 먹이를 제공하여 병해충의 피해를 입을 수 있음은 물론 시설하우스에서 토양중 발효가 일어나 암모니아, 질산 등의 가스발생으로 작물이 피해를 입게 된다. 따라서, 산업부산물의 농업적 재활용과 고품질 퇴비생산을 위해서는 악취경감 및 부숙촉진이 선결되어야 할 문제이며, 이를 위하여 부숙을 촉진하면서도 악취를 경감할 수 있는 미생물에 대한 연구가 절실하게 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 점에 착안하여 안출한 것으로, 축분과 톱밥을 혼합, 부숙시켜 유기질 비료를 제조함에 있어, 톱밥에 포함된 난분해성인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 등을 미생물에 의해 빠른 시간내에 분해하여 유기질비료를 빠른 시간내에 제조할 수 있게 함은 물론 악취성분이 발생되지 않도록 하는 섬유질 분해 효소를 생성하는 유전자, 유전자를 포함하는 미생물, 미생물을 이용한 유기질 비료 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 균주의 확대 사진.

도 2는 본 발명에 따른 섬유소 분해 효소를 분비하는 bglC 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열.

도 3은 본 발명에 따른 자일랜 분해 효소를 분비하는 xynA 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열.

도 4는 본 발명에 따른 섬유질(목재) 분해 효소를 분비하는 xynD 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열.

도 5는 본 발명에 따른 펙틴 분해 효소를 분비하는 pelA 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열.

도 6은 본 발명에 따른 세포벽 분해 효소를 분비하는 pelB 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열.

도 7은 본 발명에 따른 유전자의 위치를 나타내는 지도.

도 8은 본 발명에 따른 균주를 돈분+퇴비에 접종한 것과 그렇지 않은 것의65일 경과후 부숙도를 나타내는 확대 사진.

이하, 본 발명을 제시되는 실시예에 따라 구체화한다.

본 발명은 축분과 톱밥을 혼합하여 일정한 온도를 유지하면 미생물에 의하여 부숙되어 유기질비료가 된다는 점에 착안한 것으로, 부숙에 관여하는 미생물에 대해 하기와 같이 연구하게 되었다.

[실험 1]

가축분 및 음식물 퇴비 132점에서 517균주를 분리하여 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)와 자일랜(xylan) 및 폴리갈락투로닉 산(PGA) 배지상에서 강한 활성을 가지는 10여개의 균주를 선별하고, 배추종자 발아를 이용한 작물 억제 테스트와 오이육묘실험으로 생육시험(growth test)를 거쳐 생육이 가장 양호한 균주를 본 발명의 균주(이하, 본건 균주)로 사용하였다.

(1) 본건 균주의 특성

본건 균주는 그램(Gram) 염색결과 양성으로 나타났으며, 전자현미경으로 관찰하여 본 결과 도 1과 같이 길이가 2.5∼3.0㎛이며, 너비가 0.5∼0.7㎛의 간균이었다. 또한, 본건 균주의 탄소원별 균생육상황은 자당(saccharose)에서 생육이 가장 왕성한 반면 과당(fructose)에서 가장 낮았으며, 베르게이 매뉴얼(Bergey's manual)에 의하여 동정한 결과 내생포자를 형성하고, 옥시다제(oxidase), 카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 자일래나제(xylanase), 카탈라제(catalase), V-P 테스트, 메틸 레드 테스트는 양성이었으며, 인돌(indole)을 생성하고 우레아제(urease), 레시티나제(lecithinase), 다이하이드롤라제 테스트(dihydrolase test)는 음성이었고, 아라비노제(arabinose) 등의 탄소원 이용성은 양성으로 나타났다.

이러한 결과를 토대로 데이터베이스에서 분석한 결과 본건 균주는 베르게이 매뉴얼과 같은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)로 확인되었다.

여기서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 바실러스 그룹 Ⅱ에 속하며 포도당(glucose)을 포함한 다양한 당을 이용하여 산을 생성하고, 특히 질소가 있는 경우 산소가 부족하여도 최소 일주일 정도는 생육이 가능하며, 그 포자는 열, 방사선, 화학약품에 대하여 강한 내성을 나타내며 장기간에 걸쳐서 휴면상태를 유지할 수 있다고 알려져 있다. 또한, 바실러스 서브틸리스는 일찍부터 형질전환의 현상이 발견되었으며 간단한 배지에서 생육이 가능하기 때문에 분자유전학, 재조합DNA실험 등의 연구에 널리 사용되고 있으며, 4,214,814 bp로서 단백질과 클로닝되어 있는 유전자는 4,100개로 알려져 있다. 또한 바실러스 서브틸리스내에 식물세포벽 분해에 관련되는 cel,pel,xyn 등의 유전자를 가지고 있어 이들이 세포외 효소인 카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 자일래나제(xylanase), 펙테이트 리아제(pectate lyase), 아밀라제(amylase)와 프로테아제(protease) 등을 생성함으로 섬유질을 원료로 하는 퇴비화에 유리하며, 최근에는 유전자공학의 재료로서 주목받고 있다.

한편, 본건 균주를 감자배지(PDA)를 사용하여 30℃와 50℃에서 24시간 배양한 결과 생육이 양호한 배양온도는 50℃로 나타났으며, MMY를 이용하여 pH와 온도별 균 생육특성을 측정한 결과 온도는 50℃, pH는 6.0에서 생육이 가장 빠른 것으로 나타났다.

이를 근거로, 한천 확산법에 의하여 50℃에서 본건 균주를 24시간 배양한 후 섬유질 분해효소 생성을 시험한 결과 카르복시메틸셀룰라제(CMCase)와 자일래나제(xylanase) 활성을 나타내는 환을 생성하였으며, 그 활성이 매우 강하였다.

본건 균주를 30℃와 50℃의 다른 온도조건에서 24시간 배양한 후 효소활성을 측정한 결과 카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 알파 아밀라제(α-amylase) 및 프로테아제(protease) 활성은 30℃에서보다 50℃에서 활성이 큰 것으로 나타났다. 따라서 본건 균주는 고온에서 생육뿐만 아니라 분해효소의 분비도 왕성하다는 것을 알 수 있었으며, 퇴비화 과정시 분해미생물로서 이용가능성이 클 것으로 판단되었다.

(2) 본건 균주의 유전자 검출

축분을 이용하여 유기질비료를 제조할 때 톱밥을 첨가하는 것은 미생물이 톱밥을 분해하여 탄소원으로 활용할 수 있도록 하는 것으로, 퇴비의 탄소원인 톱밥 등은 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose)를 비롯하여 리그닌(lignin) 및 펙틴(pectin)과 같은 분해되기 어려운 물질로 되어 있으나 바실러스 서브틸리스 등과 같은 미생물들이 체외분비효소인 카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 자일레나제(xylanase)와 락카제(laccase) 등을 분비하여 난분해성 물질을 분해하고 탄소원으로 이용한다고 알려져 있다. 따라서, 본건 균주는 톱밥을 이루는 셀룰로오스, 자일렌, 펙틴을 분해하는 효소를 생성하는 유전자를 가지고 있을 것으로 판단되어 아래와 같이 각 유전자를 선별하는 실험을 계속하였다.

섬유소 분해효소 유전자를 클로닝하기 위하여 숏건(shotgun)법을 사용하여 토탈 DNA를 Sau3AⅠ로 5,10,15 분간 시간별로 부분 침지(partial digestion)하여 3∼5kb의 사이즈를 용출하고, 인서트 DNA로 벡터인 pBluescript Ⅱ SK⁺의 BamHⅠ 사이트에 결찰하여 구한 약 5,000개의 클론 중 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 배지 상에서 활성을 가지는 클론을 구하여 pLYH7-39(bglC)로 명명하였고, 같은 방법으로 유전자 은행에 의해 구한 약 5,000개의 클론 중 자일랜(xylan) 배지상에서 활성을 가지는 클론을 구하여 pLYH8-49(xynA) 및 pLYH8-62(xynD)로 명명하였으며, 역시 같은 방법으로 유전자 은행에 의해 구한 약 5,000개의 클론 중 폴리갈락투로닉스 산(PGA) 배지 상에서 활성을 가지는 클론을 구하여 pLYH9-24(pelA) 및 pLYH9-46(pelB)으로 명명하였다.

1) 섬유소 분해효소를 분비하는 bglC 유전자의 특성

섬유소 분해 효소를 분비하는 bglC가 클로닝된 DNA를 분리하여 제한효소를 처리한 결과 PvuⅡ, EcoRⅠ, SspⅠ의 제한효소 부위를 가지고 있었으며, 이 제한효소 지도를 기본으로 서브클로닝하여 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 배지 상에서 강한 활성을 나타내는 유전자의 염기서열을 분석하고 단백질로 전환시킨 결과는 도 2와 같다. 즉 ATG 스타트 코돈과 TAG 스톱 코돈을 구하였으며, 시그널 펩티드는 33 아미노산까지였고, 이를 제외한 실제 단백질의 분자량은 약 56,000 Da로 계산되었다.

이러한 bglC는 블라스트 프로그램을 통해 검색한 결과 Pectobacterium carotovorum pv. carotovorum GUNV_ERWCA(Q47096), Clostridium acetobutylicum GUN_CLOAB(P15704), Bacillus sp. N-4 GUN1_BACS4(P06566), Bacillus agaradhaerens GUN_BACAG(085465)와 어느 정도의 상동성을 가지는 것으로 확인되었고, 블라스트를 통하여 얻은 데이터를 컴퓨터를 사용하여 단백질 계통발생도를 통한 유전적인 유연관계를 확인한 결과 bglC는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AAC02536(AF045482)과 유전적 유연관계가 가장 높았다. bglC의 특성을 알아보기 위해 분리정제한 효소를 온도와 pH 별로 활성을 측정하였으며, 그 결과 온도는 50℃에서 가장 높은 활성을 나타내었고, pH는 7에서 활성이 가장 높았다.

2) 자일랜(xylan) 분해효소를 분비하는 xynA 유전자의 특성

자일랜(xylan)을 분해하는 xynA가 클로닝된 DNA를 분리하여 제한효소를 처리한 결과 EcoRⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, PstⅠ, EcoRⅤ의 제한효소 사이트를 가지고 있었고, 제한효소 지도를 바탕으로 서브클로닝하여 자일랜(xylan) 배지상에서 강한 활성을 나타내는 유전자의 염기서열을 분석하고 단백질로 전환시킨 결과는 도 3과 같다. 즉 ATG 스타트 코돈과 TAA 스톱 코돈을 구하였으며, 시그널 펩티드는 23 아미노산까지 였고, 오픈 리딩 프레임은 639개의 DNA염기서열을 가지고 있었으며 213개의 아미노산을 엔코딩하였고, 시그널 펩티드를 제외한 실제 단백질의 분자량은 20,000 Da로 계산되었다.

이러한 xynA는 블라스트 프로그램을 통해 검색한 결과 Aeromonas caviae AEOXYNA(D32065), Bacillus circulans BCXYLAG(X07723), Ruminococcus flavefaciens RFLXYNA(21127)와 어느 정도의 상동성을 가지는 것으로 확인되었고, 블라스트를 통하여 얻은 데이터를 사용하여 단백질 계통발생도를 통한 유전적인 유연관계를 확인한 결과 xynA는 바실러스 서브틸리스 BSXYNS(X59058)와 유전적 유연관계가 가장 높았다.

3) 섬유질 분해효소를 분비하는 xynD 유전자의 특성

섬유질 분해효소를 분비하는 xynD가 클로닝된 DNA를 분리하여 제한효소를 처리한 결과 EcoRⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, SmaⅠ, PstⅠ, EcoRⅤ의 제한효소 사이트를 가지고 있었고, 자일랜(xylan)배지상에서 강한 활성을 나타내는 유전자의 염기서열을 분석하고 단백질로 전환시킨 결과는 도 4와 같다. 즉 ATG 스타트 코돈과 TAG 스톱 코돈을 구하였으며, 시그널 펩티드는 33 아미노산까지였고, 이를 제외한 실제 단백질의 분자량은 51,000 Da로 계산되었다.

이러한 xynD는 블라스트 프로그램을 통해 검색한 결과 지금까지 학계에 보고된 바실러스 서브틸리스에서는 발견되지 않은 신규한 유전자로서 목질 분해에 관여한다고 사료되며, Paenibacillus polymyxa XYND_PAEPO(P45796), Bacillus subtilis XYNA_CLOSR(P10478)과 어느 정도의 상동성을 가지는 것으로 확인되었고, 블라스트를 통하여 얻어진 데이터는 컴퓨터를 사용하여 단백질 계통발생도를 통한 유전적인 유연관계를 확인한 결과 xynD는 Bacillus polymyxa XYND_PAEPO(P45796)와 유전적 유연관계가 가장 높았다.

4) 펙틴 분해효소를 분비하는 pelA 유전자의 특성

카르복시메틸셀룰라제(CMCase) 유전자를 구한 방법과 가찬가지로 숏건법으로 약 5,000개의 클론 중 폴리갈락투로닉 산(PGA) 배지상에서 활성을 가진 pelA 유전자 클론을 구하였는데, 이는 세포벽을 분해하는 효소인 펙테이트 리아제(Pectate lyase)를 생성하는 유전자로서, pelA를 클로닝한 DNA를 분리한 결과 BamHⅠ, EcoRⅤ, EcoRⅠ, BamHⅠ, SacⅠ 그리고 ClaⅠ의 제한효소 사이트를 가지고 있었고, PGA 배지상에서의 강한 활성을 나타내는 유전자의 염기서열을 분석하고 단백질로 전환시킨 결과는 도 5와 같다. 즉 ATG 스타트 코돈과 TAA 스톱 코돈을 구하였으며, 시그널 펩티드는 21개의 아미노산으로 구성되어 있었다.

이러한 pelA는 블라스트 프로그램을 통해 검색한 결과 Pectobacterium chrysanthemi PELA_ERWCH(P29155), Pseudomonas viridiflava PEL_PSEVI(Q60140)와 어느 정도의 상동성을 가지는 것으로 확인되었고, 블라스트를 통하여 얻은 데이터를 사용하여 단백질 계통발생도를 통한 유전적인 유연관계를 확인한 결과 pelA는 Pseudomonas viridiflava PEL_PSEVI(Q60140)와 유전적 유연관계가 가장 높았다.

5) 세포벽 분해효소를 분비하는 pelB 유전자의 특성

세포벽을 분해하는 pelB를 클로닝한 DNA를 분리한 결과 DraⅠ, BamHⅠ, EcoRⅤ 그리고 NdelⅠ의 제한효소 사이트를 가지고 있었고, PGA배지상에서 강한 활성을 나타내는 유전자의 염기서열을 분석하고 단백질로 전환시킨 결과는 도 6과 같다. 즉 ATG 스타트 코돈과 TGA 스톱 코돈을 구하였으며, 시그널 펩티드는 35개의 아미노산으로 구성되어 있었다.

이러한 pelB는 블라스트 프로그램을 통해 검색한 결과 Pseudomonas marginalis PLYD_PSEMA(P27027), Pectobacterium chrysanthemi PLYD_ERWCA(P24112)와 어느 정도의 상동성을 가지는 것으로 확인되었고, 블라스트를 통하여 얻은 데이터를 사용하여 단백질 계통발생도를 통한 유전적인 유연관계를 확인한 결과 pelB는 Pectobacterium chrysanthemi PLYD_ERWCA(P24112)와 유전적 유연관계가 가장 높았다.

상기한 실험결과를 검토해보면, 가축분 퇴비에서 선발한 본건 균주의 섬유질 분해와 관련된 유전자는 기존에 보고된 연구결과와 비교할 때 도 7과 같은 유전자의 위치를 나타내는 것으로 추정되었으며, 특히 목질분해와 관련된 xynD 유전자는 기존의 바실러스 서브틸리스에서는 보고되지 않은 새로운 유전자로서 pelB 유전자에 의해 세포벽 분해효소가 분비되면 연속적으로 목질 분해효소를 생성함으로 부숙촉진에 효과가 있음이 판명되었다.

즉, 이러한 분해관련 유전자는 개별적 작용보다는 각각의 유전자들이 분비하는 펙테이트 리아제(pectate lyase), 셀룰라제(cellulase), 자일래나제(xylanase)의 공역작용으로 분해작용을 가속화시키는 것이다.

[실험 2]

실험1에서 발견된 본건 균주를 산업부산물의 퇴비화에 적용하기 위하여 돈분+톱밥 혼합처리구를 각각 대조구로 설정하고, 돈분+버섯폐상톱밥(팽이버섯 재배후 발생된 폐톱밥) 혼합처리구를 설치한 후 본건 균주를 무처리구와 처리구로 나누어 퇴비화 과정중 물질변화를 조사하였다.

이때, 돈분:톱밥은 1:1(w/w), 돈분:버섯폐상톱밥은 3:7(w/w)의 비율로 혼합하여 C/N율은 25∼30, 수분율은 55∼65% 수준으로 조제하였으며, 본건 균주는 바실러스 선택배지를 이용하여 리팜피신 50ppm으로 항생력을 갖는 변이본건 균주를 만들어 32∼53×10⁷cells/㎖ 수준으로 250㎖/t 접종하였다.

(1) 퇴비화 과정중 이화학적 성분변화

퇴비화 과정 중 본건 균주 처리구는 초기온도 상승기간이 무처리에 비해 3∼4일 정도 단축되었으며, 이러한 결과는 고온성에서 섬유질 분해활성이 높은 본건 균주의 처리에 따른 왕성한 분해작용에 기인된 것으로 판단된다.

돈분+버섯폐상톱밥에 본건 균주를 처리한 시험구는 50℃ 이상을 50일 이상 유지하여 부숙촉진효과가 뛰어난 것으로 판명되었으며, 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 퇴비화 과정 중 돈분+톱밥 혼합구에 비해 2∼5℃정도 낮은 특성을 보였으나 퇴비화 적정 온도인 40∼60℃ 범위내에 포함되었으며, 퇴비화 기간이 60일 경과되면 퇴비의 온도가 40℃이하로 낮아졌다.

퇴비화 기간이 경과할수록 실제 유기물 분해율은 높아지는 경향이 있었으나초기 25일까지 실제 분해율이 50%이상으로 나타나 퇴비화 공정시 초기 반응이 매우 중요한 것으로 판단되었으며, 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구가 돈분+톱밥 혼합구에 비해 초기 실제 분해율이 높은 특징을 나타내어 가축분 퇴비화시 버섯폐상톱밥이 톱밥에 비해 부숙촉진효과가 뛰어난 것으로 판명되었다. 아울러, 돈분+버섯폐상톱밥이나 돈분+톱밥혼합구에서 미생물 처리구가 무처리에 비해 높은 분해율을 보였으며, 특히 돈분+버섯폐상톱밥에 본건 균주를 접종하였을 때 분해기간이 돈분+톱밥 무처리구에 비해 20일 정도 단축할 수 있음을 알 수 있었다.

C/N비는 퇴비화 공정이 진행될수록 감소되는 경향이 있었으며, 초기 25일까지 급격히 낮아졌으나 그 이후로는 서서히 낮아지는 특성을 나타내었다.

부숙기간 65일째 각 처리구의 톱밥 분해정도를 주사전자 현미경으로 단면을 2,000배 확대하여 촬영한 결과 도 8과 같이 돈분+톱밥이나 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구 모두 본건 균주를 접종하였을 때 섬유질 분해가 많이 진전됨을 알 수 있었으며, 버섯폐상톱밥은 버섯재배시 버섯곰팡이가 탄소원을 이용하기 위한 분해작용으로 1차 처리된 경우이므로 돈분+톱밥 혼합구에 비해 분해양상이 더욱 진전된 것으로 판단된다. 따라서 양질의 퇴비를 조기 생산할 수 있는 톱밥 대체물질로서 버섯폐상톱밥의 활용가치는 큰 것으로 판단된다.

퇴비화 과정중 pH 변화는 돈분+톱밥 혼합구의 pH는 퇴비화 과정이 진행되면서 초기 8.5에서 65일정도 경과되면서 7.6∼7.9로 낮아졌다. 이러한 경향은 퇴비화 과정중 분해활동에 의한 SO₄함량의 증가에 기인된 것으로 판단된다.

돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 공시재료의 특성에 따라 pH 변동이 거의 없었으며, 돈분+톱밥과 돈분+버섯폐상톱밥에 본건 균주를 접종한 처리구는 무처리구에 비해 약간 높아지는 경향을 나타내었다.

EC값은 모든 처리구에서 퇴비화가 진행되면서 급격히 높아지는 특성을 보였다. 이러한 결과는 난용성 물질이 분해되면서 가용성 물질로 변화되었고, 수분함량의 감소로 무기이온함량이 상대적으로 증가된 데 기인된 것으로 판단되었다. 돈분+톱밥의 EC는 공시재료를 혼합할 때 C/N율 조절 등의 이유로 돈분량이 돈분+버섯폐상톱밥에 비해 많이 첨가되었고, 톱밥의 NaCl 함량이 많아 수치가 높아진 것으로 생각된다. 본건 균주를 접종하였을 경우 무기이온의 이용등으로 무처리구에 비해 EC값이 약간 낮은 특성을 나타내었다.

수분함량은 모든 처리구에서 부숙이 진행될수록 감소되는 경향이었으며, 본건 균주를 처리구와 무처리구는 뚜렷한 차이가 없었다.

퇴비화 기간중 퇴비의 화학성분은 퇴비화가 진행될수록 P₂O₅, Mg, Na 함량은 증가한 반면, T-C 및 K 함량은 감소하는 경향이었으며, Ca 및 T-N 함량은 큰 변화가 없었다. 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 돈분+톱밥 혼합구에 비해 P₂O₅함량이 높았으며, 본건 균주 접종으로 무처리구에 비해 P₂O₅, MgO 함량은 높아진 반면 T-C 함량은 낮아졌다. 부숙이 진행되면서 모든 처리구에서 Cl, SO₄, NO₃-N, Mn, 및 Zn 함량은 증가한 반면 NH₄-N 함량은 감소하였다. 돈분+톱밥 혼합구는 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에 비해 Cl, NO₃-N 및 Zn 함량은 높은 반면, SO₄, NH₄-N 및 Mn 함량은 낮았다. 퇴비중의 P₂O₅등의 무기성분 증가는 퇴비를 습한 상태로 부숙하였기 때문에 수분율의 감소에 기인한 것으로 판단되었다.

돈분+톱밥 혼합구의 NH₄-N 함량은 초기 퇴비의 pH가 8이상에서 암모니아 가스로 방출되어 퇴비화 공정기간 50일경에 급격히 낮아지는 양상을 나타냈다. 본건 균주를 접종할 경우 SO₄함량과 NO₃-N 함량은 증가하였고 퇴비화 초기에는 Mn과 Zn 함량이 증가하였으나 그 이후는 차이가 없었다.

부숙이 진행되면서 중금속 함량의 변화는 모든 처리구에서 As, Pb, Cd, Cr, Cu 등의 중금속 함량은 증가되었고, 본건 균주 처리구와 무처리구는 차이가 없었으며, 톱밥과 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에서도 차이가 나타나지 않았다.

(2) 미생물 밀도의 변화

퇴비화 과정중 고온성 미생물의 개체수 변화는 퇴비화 초기에 급격히 증가하는 경향이었다. 이러한 경향은 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에서 두드러지게 나타났으며 본건 균주를 처리한 구가 무처리구에 비해 미생물상이 증가하는 것으로 나타났다.

섬유질 분해와 관련된 Bacillus sp. 개체수는 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에서 높았으며 본건 균주를 처리함으로써 28×10⁶마리가 증가한 것으로 나타났다. 미생물에 의해 부숙되는 동안 온도의 상승, 하강 등의 과정을 거치면서 미생물 분포상의 천이가 일어났다. 즉, 퇴비의 온도가 50℃이상으로 상승됨에 따라 B/F값은 급격히 증가하였다. 모든 처리구에서 퇴비화 공정이 진행되면서 25일경까지는 세균, 방선균, Bacillus sp. 및 본건 균주의 밀도가 높아진 반면, 곰팡이는 다소 낮아진 경향이었으며 부숙 후반기인 65일경에는 세균, 방선균, Bacillus 및 본건 균주의 밀도가 낮아진 반면, 곰팡이 밀도는 높아졌다. 따라서, 퇴비화 초기 분해에 관여하는 것은 세균과 고온성 방선균이며 후기에는 곰팡이가 우점하는 것으로 판단되었다. 세균은 초기에 톱밥처리구가 2.22∼4.21×10⁸CFU/g을 나타내었고 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 12.5∼26.8×10⁹CFU/g을 나타냈다. 본건 균주를 접종하여 공시재료를 혼합한 결과 돈분+톱밥 혼합구는 12.14×10⁶CFU/g이었고, 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 21.25×10⁶CFU/g을 나타냈다. 본건 균주는 부숙기간이 경과되면서 25일경에는 돈분+톱밥 혼합구에서 2배, 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에서 5배 정도 증식되었고 부숙기간 65일경에는 초기 25일 경에 비해 절반정도의 수준으로 낮아졌다. 부숙기간중 중온성 미생물의 밀도변화는 고온성 미생물의 밀도변화와 비슷한 양상을 보였다. 각종 분해효소를 분비하는 고온성 미생물은 카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 자일래나제(xylanase), 프로테아제(protease), 알파-아밀라제(α-amylase)를 분비하는 미생물은 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구에서 높은 경향을 나타낸 반면 리파제(Lipase)를 분비하는 미생물은 돈분+톱밥 혼합구에서 높았다. 분해효소를 분비하는 고온성 미생물은 부숙기간이 경과할수록 고온성 세균의 밀도변화와 비슷한 경향이었다. 본건 균주 접종으로 톱밥 및 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구의 개체수가 증가되었으며, 리파제를 분비하는 미생물 밀도는 낮아졌다. 이러한 경향은 각종 분해효소를 분비하는 중온성 미생물의 개체수의 변화에서도 비슷한 양상을 나타냈다.

(3) 암모니아성 질소 이용률 조사

본건 균주를 바실러스 선택배지 100㎖에 5.7∼6.6×10⁷cells/㎖ 조제용액을 1㎖ 접종하여 암모니아성 질소이용률을 조사하였다. 질소원을 암모니아로 공급하여 액체배양한 결과 처리후 2일경에 약 23㎎/㎏의 암모니아를 이용한 것으로 나타났으며, 배양시간과 암모니아성 질소 이용율 간에는 고도의 유의적 정의상관(R2≒0.970**, n=21)을 나타냈다. 이러한 결과는 퇴비화 초기에 발생되는 암모니아 가스를 에너지원으로 이용함으로써 환경적으로 문제가 되는 악취를 경감시킬 수 있음을 의미하는 것이다.

(4) 암모니아가스 및 휘발성 지방산 함량변화

퇴비화 과정중 NH₃가스는 초기에 발생량이 많았으며 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구가 돈분+톱밥 혼합구에 비해 톤당 100∼200㎎ 낮은 발생량을 보였고 본건 균주를 처리함으로써 버섯폐상톱밥이나 돈분+톱밥 혼합구에서 NH₃가스 발생이 억제되는 것으로 나타났다. 이와같은 결과는 암모니아태질소 이용율 실험에서 나타낸 바와 같이 본건 균주가 NH₃를 질소원으로 이용한 것으로 판단되었다.

유기산 함량은 NH₃가스 발생량과 유사한 결과를 나타냈다. 즉, 초기에 유기산 함량이 높은 것은 돈분에 유기산 함량이 높았던 것으로 판단되며 이후 미생물의 작용으로 점차 감소되는 것으로 생각되었다. 버섯폐상톱밥은 돈분+톱밥 혼합구에비해 유기산 함량이 매우 낮았으며 부숙기간동안 함량변화가 적었다.

휘발성 지방산 함량은 퇴비화 공정이 진행될수록 점차 감소되는 경향이었다. 특히, 초기 아세틱산(acetic acid), 이소부틸릭산(isobutyric acid), 부틸릭산(butyric acid) 함량은 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구가 돈분+톱밥 혼합구에 비해 현저히 감소되었고 부틸릭산(butyric acid) 함량은 본건 균주를 처리함으로써 점차 감소되는 경향이었다.

(5) 배추발아율 검정

퇴비부숙도 판정방법으로 C/N 비 등의 방법외에 새로운 방법으로 배추종자를 이용하여 퇴비와 증류수 비율이 1:5인 침출액에서 종자발아율을 조사하였다. 배추종자 발아율은 퇴비화 공정이 진행될수록 높아졌으며 돈분+버섯폐상톱밥 혼합구는 돈분+톱밥 혼합구에 비해 초기 발아율이 25∼30%정도 높았고 본건 균주를 처리한 구에서는 무처리에 비해 3∼5% 높았다. 배추종자 발아율은 퇴비부숙기간과 고도의 정의상관을 보인 반면 NH₃가스와는 고도의 부의상관을 나타냈다.

(6) 퇴비화에 관여하는 성분의 기여도 분석

퇴비화 과정중 각 처리구의 실제 분해율은 유기물, 수분율, 암모니아가스 발생량 및 C/N율과 부의상관을 나타낸 반면, 퇴비중 Mg 함량, 배추종자 발아율 및 이산화탄소 발생량과는 정의상관을 나타냈다. 실제 분해율에 관여하는 각 성분의 기여도 분석을 보면, 직접 효과에서 유기물함량과 수분율이 높게 나타났으며, C/N율, 암모니아 가스 발생량, 이산화탄소 발생량, 배추종자 발아율과 Mg 함량은 직접적 효과보다는 유기물에 의한 간접효과가 더 큰 것으로 나타났다.

퇴비 부숙도 판정지표로 이용되는 C/N율은 유기물함량, 암모니아가스 발생량, 퇴비중 pH, 유기산 함량과 정의상관을 나타낸 반면, Bacillus sp. 개체수, 방선균 개체수, 유기물 실제 분해율, CO₂가스 발생량, 배추종자 발아율, 퇴비중 Mn 함량, 본건 균주의 개체수 및 퇴비중 P₂O₅함량과 부의상관을 나타냈다. 퇴비화가 진행될수록 C/N은 감소되어 10∼15의 범위를 나타내는데 C/N율의 감소에 기여하는 성분중 CO₂가스 발생량, 퇴비중 pH와 Mn 함량, 방선균 개체수의 직접효과가 높은 반면, Bacillus sp. 개체수는 pH, 본건 균주 개체수는 퇴비중 P₂O₅의 함량에 의한 간접효과가 큰 것으로 나타났다.

암모니아가스 발생량과 퇴비의 각 성분과의 관계는 암모니아가스 발생량은 유기물 함량, 수분율, C/N율 및 유기산 함량과 정의상관을 나타냈고, CO₂가스 발생량, 배추 종자 발아율 및 퇴비중 Mg 함량과는 부의상관을 나타냈다. 암모니아가스 발생에 기여하는 각 성분중 수분율과 C/N은 직접 효과가 높은 반면, 유기산, CO₂가스 함량, 배추종자 발아율, 유기산 함량 및 퇴비중 Mg 함량은 수분율에 의한 간접효과가 보다 높게 나타났다.

배추 종자 발아율에 관여하는 각 성분은 유기물 함량, 암모니아가스 발생량 및 C/N율과 부의상관을 나타냈으며, 기여도 분석결과 유기물 함량은 직접효과가 높은 반면, C/N율과 암모니아가스 발생량은 유기물에 의한 간접효과가 높은 것으로 나타났다.

[실험 3]

상기와 같이 제조된 유기질 비료를 사용하여 실제 작물에 시비할 때의 성능을 알아보기 위하여 비닐하우스 내에서 멜론을 공시작물로 실험하였으며, 처리내용은 퇴비를 사용하지 않은 무처리구와 실험 2에서 생산된 4수준의 퇴비를 20t/ha 시용하였다. 시비량은 밑거름으로 토양중 N-P₂O₅-K₂O 함량이 97-63-57㎏/ha 수준이 되도록 시비처방하여 웃거름으로 N-K₂O 함량이 90-52㎏/Ha 시용하였다.

(1) 생육 및 수량

본건 균주를 처리하여 생산된 퇴비를 멜론재배시 토양에 시용한 결과 수량은 돈분+버섯폐상톱밥에 본건 균주를 처리한 구가 다른 처리구에 비해 높은 것으로 유의성이 인정되었으며, 멜론의 당도도 높은 경향을 나타내었다.

(2) 토양 이화학성 변화와 식물체 무기성분 조사

토양 물리적 특성은 퇴비 시용으로 공극율이 크게 개선되는 효과가 있었다. 특히, 버섯폐상톱밥에 본건 균주를 처리한 구가 다른 처리구보다 공극율을 높은 반면 가밀도나 수분율은 낮았다.

정식후 77일(수확기) 토양의 원추관입저항(수직경도)은 모든 처리구에서 토심20㎝까지는 경도가 낮았으며, 20㎝부근에서 경도가 0.3∼1.2 MPa로 높아지기 시작하여 근권 부근인 토심 40㎝에서 다시 낮아지는 특성을 나타냈다. 특히, 버섯폐상톱밥에 본건 균주를 처리한 구의 수직정도가 낮았는데, 이러한 경향은 본건 균주를 처리하여 생성된 퇴비를 시용함으로써 토양 입단화 및 공극율의 증가에 기인된것으로 생각되었다.

토양의 화학적인 특성을 살펴보면, pH, OM, P₂O₅, K, Ca 및 Mg 함량은 생육기간이 경과할수록 낮아졌으나, EC 값은 모든처리구에서 정식후 40일에 평균 2.32∼3.68 dS/m로 가장 높았다. 정식후 40일에 토양의 pH가 낮아지고 EC값의 증가는 추비로 요소와 염화칼륨을 시용한데 기인된 것으로 생각되었다. 초기 토양의 EC값과 K 함량은 돈분+톱밥 및 돈분+톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구가 다른 처리구에 비해 높았으며, 이러한 경향은 정식후 77일(수확기)에도 비슷하였으나 통계적 유의성은 인정되지 않았다.

정식후 77일(수확기) 과실의 무기성분은 돈분+톱밥+본건 균주 처리한 퇴비 시용구가 다른 처리구에 비해 T-N, P₂O₅, K₂O 및 MgO 함량이 높았으나, T-N을 제외한 나머지 무기성분 함량은 유의성이 인정되지 않았다. 엽중 무기성분 함량은 돈분+톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구가 T-N, K₂O, Fe 및 Zn 함량이 높은 반면, 돈분+톱밥 시용구는 P₂O₅및 CaO 함량이 높았다.

정식후 77일(수확기) 과실의 무기성분 총 흡수량은 과실의 T-N, P₂O₅및 MgO 총흡수량은 돈분+톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구가 다른 처리구에 비해 높은 반면, K₂O 함량은 돈분+버섯폐상톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구에서 높았다. 엽중 T-N 및 K₂O 총흡수량은 돈분+톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구가 다른 처리구에 비해 높은 반면, MgO 총흡수량은 돈분+버섯폐상톱밥+본건 균주를 처리한 퇴비 시용구에서 높았다.

(3) 토양 미생물 분포변화

토양중 미생물상 변화는 퇴비시용으로 미생물 개체수가 생식생장 단계까지 증가하였다가 정식후 77일(수확기)에 급격히 감소되는 경향을 나타냈다. 정식기에 퇴비를 시용한 처리구는 무처리에 비해 세균은 8.60∼123.5×107 CFU/g, 방선균은 12.20∼54.70×10⁶CFU/g, 곰팡이는 1.1∼18.5×10⁵CFU/g으로 개체수가 많았다. 특히, 생육초기에서 중기까지는 본건 균주를 처리한 퇴비시용구에서 전체 미생물의 분포가 많았다.

토양중 각종 분해효소를 분비하는 미생물은 정식기에 퇴비를 시용한 처리구는 무처리에 비해 카르복시메틸셀룰라제(CMCase)를 분비하는 미생물은 0.78∼5.71×10⁶CFU/g, 자일래나제(xylanase)를 분비하는 미생물은 23.57∼63.53×10⁶CFU/g, 프로테아제(protease)를 분비하는 미생물은 7.41∼20.75×10⁶CFU/g, 리파제(lipase)를 분비하는 미생물은 5.19∼26.45×10⁶CFU/g, 알파아밀라제(α-amylase)를 분비하는 미생물은 6.65∼7.66×10⁶CFU/g 로 개체수가 많았다.

각종 분해효소를 분비하는 미생물의 밀도는 생식생장 단계까지 증가하였다가 정식후 77일(수확기)에 급격히 감소하는 경향을 나타냈다. 이러한 경향은 후기에 요소와 염화칼륨을 분할하여 시용함으로 화학비료에 의한 미생물 개체수가 감소된 것으로 추정되며, 본건 균주를 접종한 혼합퇴비구의카르복시메틸셀룰라제(CMCase), 자일래나제(xylanase), 프로테아제(protease), 리파제(lipase)와, 알파아밀라제(α-amylase)를 분비하는 미생물의 개체수가 많았다.

(4) 수량과 품질에 관여하는 성분의 기여도 분석

멜론의 당도는 과실중의 Fe 함량과 Fe 총흡수량 및 엽중 Mg 함량과 총흡수량은 정의상관을 보인 반면, 토양중 EC값, 엽중 Zn 함량, 과실중 Ca 함량 및 Mg 함량, 엽중 Zn 총흡수량, 과실중 Mg 총흡수량과는 부의상관을 나타냈다. 그러나, 당도에 관여하는 기여도 분석결과를 보면, 엽중 Mg 함량과 Zn 함량, 과실중 Mg 및 Fe 총흡수량의 직접효과가 높은 반면, 다른 요인들은 과실중 Mg 함량과 Mg 총흡수량의 간접효과가 보다 높은 것으로 나타났다. 따라서, 멜론의 당도를 높이기 위해서는 엽중 Mg 함량을 높이는 것이 좋을 것으로 생각되었다.

멜론의 수량은 과장, 과촉 및 과중과 정의상관을 나타냈다. 상관에 미치는 생육인자들의 기여도 분석에서 과중은 직접효과가 높은 것으로 나타났으며, 과장과 과폭은 과중에 의한 간접효과가 높았다.

토양물리적 성질에서 토양 가밀도와 고상율은 수량과 부의상관을 나타낸 반면, 공극률 및 기숭율과 정의상관을 나타냈다. 토양 물리적 성질이 수량에 미치는기려도는 공극률과 고상률은 직접효과가 높게 나타난 반면, 가밀도와 기상률은 고상률에 의한 간접효과가 높게 나타났다. 따라서, 멜론의 수량증대를 위해서는 공극률을 높여 통기성을 개선하고 고상률을 적절히 낮게 유지하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.

수량과 과실중의 무기양분 총흡수량과의 관계를 보면, 질소 총흡수량, P₂O₅총흡수량, K 총흡수량, Fe 총흡수량 및 Mn 총흡수량과 정의상관을 나타냈으며, 기여도 분석결과 과실의 Fe 및 Mn 총흡수량은 직접효과가 높은 반면 과실의 T-N, P₂O₅및 K 총흡수량은 과실중 Mn 총흡수량에 의한 간접효과가 보다 높은 것으로 나타났다.

멜론의 수량과 토양 미생물상과의 관계는 수량과 토양중 프소이드모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 방선균, 세균, 아밀로즈 분해균, 단백질 분해균, 목질 분해균, 프소이드모나스 플루오레슨스(pseudomonas fluorescence) 및 섬유소 분해균의 개체수와 정의상관을 나타냈다. 수량에 영향을 주는 토양 미생물의 개체수는 프소이드 모나스(Pseudomonas putida)와 방선균은 직접효과가 높았으나, 단백질 분해균, 섬유소 분해균, 아밀로즈 분해균, 세균 및 프소이드모나스 플루오레슨스(pseudomonas fluorescence)의 개체수는 프소이드모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에 의한 간접효과가 높게 나타났다.

이상을 종합하여 보면 본 발명은 가축분 퇴비에서 부숙촉진 및 악취경감 효과가 뛰어난 바실러스 서브틸리스 균을 선발하여 분해와 관련된 bglC, xynA와 xynD, pelA와 pelB 유전자를 분리하여 유전적인 특성을 구명한 것으로, 이중 xynD의 분해효소는 기존의 바실러스 서브틸리스에서는 보고된 바가 없고 다만 Bacillus polymyxa XYND_PAEPO(P45796)와 상동성이 높았다. 또한, 본건 균주의 현장적용 연구를 위하여 돈분을 이용한 퇴비화에 응용한 결과 퇴비내의 실제분해율과 NH₃가스경감 및 퇴비의 품질향상에 효과가 큰 것으로 나타났으며, 톱밥 대체물질로 버섯폐상톱밥의 이용이 기대되었다. 또한, 본건 균주의 접종으로 생산된 퇴비를 멜론 재배시 시용한 결과 무접종구에 비해 8.1∼9.0% 증수되었고, 과실의 당도는 5.7∼6.8% 향상되었다. 따라서 본건 균주를 퇴비화 공정시 접종할 경우 부숙촉진 및 악취경감과 작물재배시 증수 및 품질향상을 기대할 수 있을 것으로 판단되며, 본건 균주는 2001년 4월 14일 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 Bacillus subtilis KBF001로 기탁되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 가축분 퇴비로부터 부숙촉진 및 악취경감을 나타내는 균주를 선발하여 그 유전자를 분석한 결과 1개의 셀룰로오스 분해 유전자(bglC), 2개의 자일랜 분해 유전자(xynA, xynD), 2개의 펙틴 분해 유전자(pelA, pelB)를 가진 신규한 바실러스 서브틸리스 균주로 판명되었는데, 이러한 유전자 중 xynD의 분해효소는 바실러스 서브틸리스에서는 보고되지 않은 최초의 것으로 목질분해 작용과 관계되며, 각각의 효소가 개별적으로 작용하는 것이 아니고 각각의 유전자들이 분비하는 펙테이트 리아제(pectate lyase), 셀룰라제(cellulase), 자일래나제(xylanase)의 공역작용으로 분해작용을 가속화시켜 가축분 퇴비의 부숙을 촉진시킬 수 있는 것이다.

특히, 이러한 균주를 퇴비화에 적용할 경우에는 퇴비내의 실제분해율 향상, NH₃가스경감 즉 악취경감, 퇴비의 품질향상에 큰 효과를 발휘할 수 있는 것이며, 따라서 본 발명에 따른 균주를 대량생산하여 부숙촉진, 악취경감, 작물재배시 증수 및 품질향상에 기여할 수 있는 것이다.

Claims

하기의 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 섬유소 분해 효소를 분비하는 유전자 pLYH7-39(bglC).
하기의 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 자일랜 분해 효소를 분비하는 유전자 pLYH8-49(xynA).
하기의 염기서열을 갖는 섬유질 분해 효소를 분비하는 유전자 pLYH8-62(xynD).
하기의 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 펙틴 분해 효소를 분비하는 유전자 pLYH9-24(pelA).
하기의 염기서열을 갖는 세포벽 분해 효소를 분비하는 유전자 pLYH9-46(pelB).
청구항 3에서 언급한 유전자 pLYH8-62(xynD)로부터 분비되는 섬유질 분해효소.
청구항 1 내지 청구항 5에서 언급한 유전자를 포함하는 미생물.
청구항 7에서 언급한 미생물을 축분과 톱밥에 적량 접종하여 부숙시켜서 된 미생물을 이용한 유기질 비료.