KR101437544B1 - 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 ｃｅｌ－ｋｇ２５ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 섬유소분해효소 유전자인 cel-KG25 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 흑염소 반추위 미생물로부터 신규한 섬유소분해효소 유전자인 cel-KG25 유전자를 선별할 수 있으며, 이를 통해 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 단백질 산물을 제공함으로써 저가의 사료 첨가제 개발에 이용할 수 있고, 섬유 유연제 및 세제 개발뿐만 아니라 풍부한 자원인 섬유소를 분해하여 바이오연료의 생산에도 적극적으로 이용할 수 있다.

Description

흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 ＣＥＬ－ＫＧ２５ 유전자 및 이의 용도{cellulase cel-KG25 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof}

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 섬유소분해효소 유전자인 cel-KG25 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물 세포벽의 주요 구성 요소는 셀룰로오스(cellulose), 헤미-셀룰로오스(hemi-cellulose) 및 펙틴(pectin)이며, 이들은 초식동물의 반추위에서 복잡하고도 효과적인 미생물 분해과정에 의하여 소화된다. 반추위의 미생물은 극도의 혐기성 미생물이며, 곰팡이, 프로토조아 및 박테리아로 이루어져 있으며, 섬유소분해는 주로 박테리아와 곰팡이에서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 하지만 이들 미생물은 대부분은 배양이 어려워 잘 알려져 있지 않은 상태다.

현재까지 반추위 박테리아 중에서 식물 세포벽을 소화하는데 주요하게 관여하는 박테리아로는 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 루미노코커스 플라베파시엔스(Ruminococcus flavefaciens), 루미노코커스 알부스(Ruminococcus albus), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 유박테리움 셀룰로솔벤스(Eubacterium cellulosolvens), 프레보텔라(Prevotella) 및 일부분의 클로스트리디움(Clostridium) 속에 속하는 박테리아로 밝혀져 있다.

현재까지 대부분의 반추동물의 섬유소분해효소 유전자를 발굴하기 위하여 소와 토끼, 캥거루의 소화기관의 총 미생물 DNA, 혹은 메타게놈 (metagenome; 환경미생물의 총 DNA를 일컬음)을 연구하였고, 이로부터 다수의 글루카나아제(glucanase), 자일라나아제(xylanase) 및 셀룰로솜 복합체 (cellulosome complex)들이 밝혀진 바가 있다. 하지만 이들은 대부분 연질의 식물 섬유소원을 먹이로 진화한 경우이며, 섬유소분해효소 중에서도 경질의 섬유소원에 대한 분해 능력이 요구된다.

흑염소는 일반적으로 나뭇가지, 껍질 및 초목과 같은 조악한 섬유소원의 사료에 잘 적응하고 소화할 수 있도록 현재까지 진화되어온 것으로 알려져 있다. 비록 흑염소의 반추위 미생물에 대한 연구는 소에 비하여 상대적으로 많이 이루어지지 않은 실정이나, 흑염소의 반추위 미생물은 섬유소분해 능력과 관련하여 소와 같은 대가축의 반추위와는 다른 보다 효율적인 환경 미생물로 이루어져 있을 것으로 예상되고 있다. 이는 흑염소의 반추위 미생물군이 다른 초식동물과 다르게 공생되어 진화되었다는 것을 의미한다.

난배양성 미생물군에 대한 유전자 탐색을 위하여 포스미드 (fosmid), 코스미드 (cosmid) 및 BAC (bacterial artificial chromosome) 유전자은행을 이용하여 신규 물질을 탐색하는 기술이 널리 사용되고 있다. 본 발명 역시 최근 획기적으로 발전한 메타게놈 유전체 분석 기법을 적용하여 고효율 섬유소분해효소 유전자를 발굴하고자 하였다. 이러한 방법으로 현재까지 많은 섬유소분해효소 유전자가 밝혀졌지만, 본 발명에 따른 흑염소 유래 섬유소분해효소 유전자는 현재까지 밝혀진 어떤 유전자와도 상이한 신규의 것이다.

한편, 종래기술로서 한국공개특허공보 제2011-0119961호에는 '섬유소분해효소를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법'이 개시되어 있으, 한국공개특허공보 제2007-0116881호에는 '셀룰라제, 이것을 암호화하는 핵산 및 이들을 제조 및 사용하는 방법'이 개시되어 있다.

이와 같은 기술적 배경 하에서 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 이의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH3 도메인 계열 섬유소분해효소 단백질이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 섬유소분해효소 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료 첨가제가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 섬유소분해효소 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 섬유소분해효소 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따르면, 흑염소 반추위 미생물로부터 신규한 섬유소분해효소 유전자인 cel-KG25 유전자를 선별할 수 있으며, 이를 통해 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 단백질 산물을 제공함으로써 저가의 사료 첨가제 개발에 이용할 수 있고, 섬유 유연제 및 세제 개발뿐만 아니라 풍부한 자원인 섬유소를 분해하여 바이오연료의 생산에도 적극적으로 이용할 수 있다.

도 1은 포스미드 유전자 은행 구축을 위한 메타게놈 DNA 부분절단 조건 확립 및 삽입 DNA 절단 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Ad (Ad; adherent phase) 분획과 Lq (Lq; liquid phase) 분획에 대한 포스미드 유전자은행 평균 삽입 크기 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 CMC-Agar 플레이트 상에 접종 후 CMC 분해 활성을 갖는 포스미드 클론 선발 예(콩고레드/NaCl에 의한 클리어 존 확인)를 나타낸 것이다.
도 4는 뉴클레오티드 블라스트(nucleotide blast) 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 단백질 블라스트(protein blast) 검색에 따른 주요 도메인 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 단백질 블라스트 검색 결과 중 최상위 상동 단백질에 대한 유사성 검토(phylogenetic tree) 및 상동성과 추정값을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '반추위 미생물(rumen microorganism)'이란, 반추류(Ruminantia)의 동물(소, 염소, 양, 사슴 등)에 있는 반추위에 서식하는 미생물로서, 소화하기 어려운 섬유소 등을 반추위에 대량으로 공생하고 있는 미생물이 휘발성 지방산 등으로 분해한다. 대표적인 예로, 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 루미노코커스 플라베파시엔스(Ruminococcus flavefaciens), 루미노코커스 알부스(Ruminococcus albus), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 유박테리움 셀룰로솔벤스(Eubacterium cellulosolvens), 프레보텔라(Prevotella) 및 일부분의 클로스트리디움(Clostridium) 속에 속하는 박테리아 등이 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '탄수화물 결합 단위(CBM; carbohydrate-binding module)'란, 탄수화물-활성 효소(carbohydrate-active enzyme)에서 발견되는 단백질 도메인으로, 상기 도메인은 탄수화물-결합 활성(carbohydrate-binding activity)을 가지고 있다. 상기 CBM은 주로 셀룰로오즈-결합 도메인(cellulose-binding domain)으로 알려져 있으며, 셀룰로소말 스캐폴딩 단백질(cellulosomal scaffoldin protein)에서 발견되기도 하며, 현재 아미노산 서열의 유사 정도에 따라 64개의 패밀리로 분류되고 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '글라이코시드 가수분해효소(GH; glycoside hydrolase) 도메인'이란, 배당체와 올리고당, 다당에 작용하고 글리코시드 결합을 가수분해하는 효소 활성을 가지는 도메인을 의미하며, 현재 아미노산 서열의 유사 정도에 따라 127개의 패밀리로 분류되고 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '바이오매스(biomass)'란, 태양광을 사용하여 이산화탄소를 고정하는 탄소동화과정을 하는 식물체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물유기체 전반을 일컫는다. 상기 바이오매스로부터 생산되는 알콜, 디젤, 수소와 같은 각종 연료는 바이오연료(biofuel)라 불리우며 이러한 바이오매스, 특히 섬유소와 같은 식물계 바이오매스는 석유로 부터 얻어지는 화학물질들을 대체할 수 있는 물질로 제안되고 있다. 식물계 바이오매스는 각종 화학제품을 생산하는데 있어 석유를 원료로 하는 것보다 에너지 수지면에서 유리하다. 그 이유는 식물계 바이오매스의 경우는 산소를 포함하는 다양한 기능기가 포함되어 있어 기능기가 첨부된 각종 화학제품들을 생산하는 경우 더 낮은 활성화 에너지로 전환이 가능하기 때문이다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '바이오연료(biofuel)'란, 연료로 살아있는 유기체뿐 아니라 동물의 배성물 등 대사활동에서 나오는 부산물을 모두포함하며, 화석연료와는 다른 신재생에너지로 바이오에탄올과 바이오디젤 등이 포함된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열(642bp)로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자는 섬유소분해효소 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로부터 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 '서열 상동성의 %'는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따라, 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자는 바람직하게는 흑염소 반추위 미생물 유래일 수 있다. 다만, 반드시 이에 제한될 것은 아니며, 본 발명의 실시예는 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자와 높은 상동성(예를 들어, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성)을 갖고, 흑염소가 아닌 다른 생물의 반추위 미생물로부터 유래한 유전자를 포함할 수 있다. 서열정렬 방법 및 서열 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들어, BLAST 등)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(213개의 아미노산)로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH3 도메인 계열 섬유소분해효소 단백질이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 섬유소분해효소 단백질은 농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원시험장 출생 흑염소 3두(수컷 2두, 암컷 1두)에 대하여 동물유전체과에서 관리 이전 후 볏짚 사료와 미네랄 보충제로만 한 달간 급여한 후 도축하여 얻은 반추위에 공생하는 미생물 시료로부터 얻어졌다.

본 발명에 따른 섬유소분해효소 단백질의 범위는 흑염소 반추위 미생물로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GH3 도메인 계열 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 '기능적 동등물'이란 용어는, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 상기 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 용어는, 동일한 섬유소분해효소 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 섬유소분해효소 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 상기 '단편', '유도체' 및 '유사체'란 용어는 본 발명에 따른 섬유소분해효소 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명에 따른 섬유소분해효소 단백질의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 따라 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 즉 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

상기 '폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'란 용어는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 상기에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 의 좌향 프로모터 (pL프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

여기서, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 일반적으로 폴리아데닐화 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 벡터는 선택표지(marker)로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터를 원핵세포에 안정적으로 형질전환시킨 후 발현시키기 위한 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 숙주세포, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 또는 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우, 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 섬유소분해효소 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료 첨가제가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 및 사과산 등과 같은 유기산; 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염)등과 같은 인산염; 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등과 같은 천연 항산화제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소 및 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들어, 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들어, 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들어, 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들어, 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들어, 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 첨가제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 효소 제제, 예를 들어, 리파아제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 사료 첨가제에 포함되는 본 발명에 따른 섬유소분해효소의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 섬유소분해효소 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔, 페이스트 또는 슬러리 형태일 수 있다. 상기 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 전분 다당류의 촉매-매개 가수분해를 통한 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 또는 콘택트 렌즈 세정 용액과 같은 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 섬유소분해효소 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오매스 물질은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질이며, 본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 전처리하는 단계; 전처리한 바이오매스를 효소로 가수분해시키는 단계; 및 가수분해된 바이오매스 물질을 발효시키는 단계;로 이루어지며, 상기 바이오연료의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스는 전분질계(곡물, 감자류 등), 셀룰로오스계(초본, 임목, 왕겨 등), 당질계(사탕수수, 사탕무 등) 또는 단백질계(가축분뇨, 사체, 미생물 균체 및 이들로부터 유래하는 종이와 음식물찌꺼기 등 유기성 자원)등의 고분자량의 탄수화물일 수 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1. 흑염소 반추위 미생물 분리 및 DNA 추출

수컷 2마리와 암컷 1마리 흑염소에 대하여 1개월간 볏짚 사료와 미네랄 보충제만으로 사육한 후, 도축을 실시하였고 이로부터 4개의 위 중에서 첫 번째 위인 반추위를 취하여 그 내용물을 확보하였다. 확보된 내용물은 먼저 거즈를 이용하여 위액상(Lq; liquid phase)과 사료 소화상(Ad; adherent phase)으로 구분하여 시료를 준비하였다. 사료 소화상 Ad는 거즈로 거른 후의 찌꺼기를 다시 0.15%(volume/volume) Tween-80, PBS 용액에 현탁하여 볏짚 소화물에 부착된 미생물을 회수한 것이다. 이들에 대해 각각 5g의 침전 시료를 마련하고 이를 CTAB (hexadecylmethylammonium bromide)와 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다.

실시예 2. 흑염소 반추위 미생물 포스미드 유전자은행 구축

Ad와 Lq에서 추출된 DNA에 대하여 포스미드 유전자은행을 구축하기 위한 적절한 크기로 임의 부분절단 조건을 위해 여러 HindIII 제한효소의 양을 조절하였다. Ad는 HindIII 5단위 그리고 Lq는 2.5단위를 사용하도록 결정하였다(도 1). 부분절단된 DNA 절편들은 펄스장 겔(Pulse-Field Gel) 전기영동 방법을 사용하여 10kb 내지 50kb 사이의 영역을 오려내어 이로부터 다시 삽입 DNA 단편을 마련하였다. 마련된 DNA는 말단 평활화 반응을 수행하고 이를 pCC1FOS 벡터에 ligation 반응으로 연결하였다. Ligation 연결 반응 후, 이를 DH5α 대장균에 전기적 충격법으로 형질전환하여 유전자은행을 구축하였다.

구축된 포스미드 유전자은행에 대하여 평균 삽입크기를 확인하기 위하여 NotI 효소 처리를 하여 이를 전기영동으로 확인한 결과, Ad의 경우 30 kb, Lq의 경우는 31 kb로 판명되었다(도 2). 이들에 대해서 각각 384 웰 플레이트의 총 150 플레이트에 냉동보존 가능 배지에 접종하여 초저온냉동고(-70℃)에 보관하였다.

실시예 3. CMCase 활성을 지닌 포스미드 클론 선발

Ad와 Lq의 포스미드 클론 전부인 115,200개 클론에 대하여 MultiMek 96 기기를 사용하여 384 클론 단위로 2.5% CMC LB 클로람페니콜 아가(chloramphenicol agar) 배지에 접종을 하고 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양된 플레이트는 0.2%의 콩고 레드(Congo Red) 용액을 붓고 30분간 방치를 한 후, 이를 1차 증류수로 3회 이상 세척을 실시하고 여기에 다시 1M NaCl 용액을 넣고 5분 정도 방치하였다. 이 단계가 끝나면 라이트 박스(light box)에 플레이트를 올려 놓고 클리어 영역(clear zone)이 확인된 클론의 주소를 알아내었다(도 3).

실시예 4. CMCase 활성 포스미드 클론에 대한 염기서열 해독

실시예 3에서 확인된 포스미드 클론 Ad_113I18에 대하여 포스미드 플라스미드 추출을 Qiagen plasmid midi prep kit을 사용하여 수행하였으며, 추출된 플라스미드 DNA는 Sanger shotgun 염기서열 해독 방법과 한 방향 파이로염기서열해독 기법을 병행하여 해당 클론의 플라스미드에 삽입된 DNA의 서열 정보를 확보하였다.

Sanger shotgun 염기서열 해독은 추출된 플라스미드 DNA를 임의 절단하여 말단 평활화를 하고 이를 SmaI 제한효소로 마련된 탈인산화된 pUC19 벡터와 ligation 반응을 한 후, 이를 DH5α 대장균에 형질전환하여 이로부터 생성된 단일 클론 192개에 대한 플라스미드 DNA를 추출하여 양방향으로 M13_정방향 프라이머 (GTAAAACGACGGCCAGT)와 M13_역방향 프라이머 (AACAGCTATGACCATG)를 사용하여 Dye termination sequencing kit을 사용하여 염기서열 해독 반응을 하였고, 반응물은 에탄올 정제를 거친 후, ABI사의 Genome Analyzer 3730XL 기종을 사용하여 해독 작업을 진행하였다.

해독된 염기서열 데이터는 phredphrap 프로그램을 이용하여 조합작업(assembly)를 진행하여 공통서열 정보를 일차 확보하였다. 또한 같은 클론의 DNA에 대하여 네블라이저를 이용하여 임의 절단한 조각에 대하여 파이로염기서열 해독 기법을 이용하여 GS Junior 기종을 사용하여 총 7200개 서열을 확보하고 이를 Newbler2.5 de novo assembler 프로그램을 이용하여 조합작업을 진행하였다. Sanger 염기서열 해독 데이터와 파이로 염기서열 해독 데이터는 Lasergene의 Seqman 프로그램을 이용하여 통합하여 최장 긴 서열을 확보하였다.

실시예 5. 유전자 탐색 및 유사성 조사

확보된 포스미드 클론의 삽입 DNA 염기서열 정보에 대해서는 MetaGeneMark 프로그램을 이용하여 유전자 영역을 탐색하였다. 탐색된 유전자 정보에 대해서는 일차적으로 자체 pfam 도메인 데이터베이스에서 글라이코시드 하이드롤라아제(GH; glycoside hydrolase) 도메인과 탄수화물 결합 단위(CBM; carbohydrate binding module) 도메인을 갖는 유전자를 탐색한 결과, cel-KG25 유전자에서 섬유소분해효소 도메인을 확인하였고, 다음으로 NCBI에서 운영하는 nucleotide blast와 protein blast를 이용하여 동일 서열이 존재하는지 여부를 확인하였다.

2012년 9월 현재 nucleotide blast 결과 기본 검색 조건에서 어떠한 유사 DNA 서열을 찾을 수 없었다(도 4). 또한 protein blast 결과 일반적인 섬유소분해효소 도메인을 갖고 있음을 확인할 수 있었으며(도 5), 가장 유사한 유전자는 프레보텔라 코프리(Prevotella copri DSM 18205)에서 트랜스펩티다아제 상과(transpeptidase superfamily) 도메인을 지닌 카복실에스테라아제(carboxylesterase) 유전자 (Accession No. ZP_06253763)로서 총 213개 아미노산 중에서 96개만이 서로 상동성 (46%)을 보였다. 이로써 본 발명에서 밝혀 낸 cel-KG25 유전자 및 그의 산물은 신규 섬유소분해효소라고 할 수 있다(도 6).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면, 흑염소 반추위 미생물로부터 신규한 섬유소분해효소 유전자인 cel-KG25 유전자를 선별할 수 있으며, 이를 통해 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자 및 단백질 산물을 제공함으로써 저가의 사료 첨가제 개발에 이용할 수 있고, 섬유 유연제 및 세제 개발뿐만 아니라 풍부한 자원인 섬유소를 분해하여 바이오연료의 생산에도 적극적으로 이용할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> cellulase cel-KG25 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof <130> NPF-22662 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> unidentified bacterium <400> 1 atgcacagaa ataatattcg tctttcacac tctgtcacat tcaccaaaga ggaattgata 60 gagggcactt ggtcgcccaa gttaggagac ataaagacat ctcagtcgtt tacctatgca 120 gaactcatca gttactctct catgctcagt gacaacaacg cttgcgatgt tctctttaga 180 caatgtggcg ctccgaaaga tgtcgaatct tatatccgcg aacttggctt taagagaatt 240 tatattcgaa agaccgaaaa gcagatgcgt gcggatcatt cgtactgtag atacaacaag 300 gctacaccca aagatatggc cttgttgttg cagtggtttt caagtcatca ttcagacacc 360 ccgattcttc agttcatttg ggaaacgatg atgaaatgtg agactggcat ggataggctg 420 cctgcagcta ctcctgaagg agctgcgcta ttgcacaaga caggctcagg gtataccaat 480 aaggatggaa caacggatat tggtgatgca ggaatatact tgctcagcga tgggagtaaa 540 ttgccgatat gtgtattcgt caaggaatca tcgagtgatc acatcatcag agaaatttct 600 ctcaaacttc aagctgtggc tcttgcgcca gacagggagt ga 642 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> unidentified bacterium <400> 2 Met His Arg Asn Asn Ile Arg Leu Ser His Ser Val Thr Phe Thr Lys 1 5 10 15 Glu Glu Leu Ile Glu Gly Thr Trp Ser Pro Lys Leu Gly Asp Ile Lys 20 25 30 Thr Ser Gln Ser Phe Thr Tyr Ala Glu Leu Ile Ser Tyr Ser Leu Met 35 40 45 Leu Ser Asp Asn Asn Ala Cys Asp Val Leu Phe Arg Gln Cys Gly Ala 50 55 60 Pro Lys Asp Val Glu Ser Tyr Ile Arg Glu Leu Gly Phe Lys Arg Ile 65 70 75 80 Tyr Ile Arg Lys Thr Glu Lys Gln Met Arg Ala Asp His Ser Tyr Cys 85 90 95 Arg Tyr Asn Lys Ala Thr Pro Lys Asp Met Ala Leu Leu Leu Gln Trp 100 105 110 Phe Ser Ser His His Ser Asp Thr Pro Ile Leu Gln Phe Ile Trp Glu 115 120 125 Thr Met Met Lys Cys Glu Thr Gly Met Asp Arg Leu Pro Ala Ala Thr 130 135 140 Pro Glu Gly Ala Ala Leu Leu His Lys Thr Gly Ser Gly Tyr Thr Asn 145 150 155 160 Lys Asp Gly Thr Thr Asp Ile Gly Asp Ala Gly Ile Tyr Leu Leu Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Lys Leu Pro Ile Cys Val Phe Val Lys Glu Ser Ser Ser 180 185 190 Asp His Ile Ile Arg Glu Ile Ser Leu Lys Leu Gln Ala Val Ala Leu 195 200 205 Ala Pro Asp Arg Glu 210

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel-KG25 유전자.
   
2. 제1항에 따른 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH3 도메인 계열 섬유소분해효소 단백질.
   
3. 제1항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
4. 제3항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
   
5. 삭제
6. 삭제
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