KR101816615B1 - 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도{Alpha amylase cel57-KG91 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof}

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물 세포벽의 주요 구성요인은 셀룰로오스(celluloase), 헤미-셀룰로오스(hemi-cellulose), 펙틴(pectin)이며, 이들은 초식동물의 반추위에서 복잡하고도 효과적인 과정을 통해 미생물에 의해 분해 및 흡수된다. 반추위의 미생물은 극도의 혐기성으로, 곰팡이, 프로토조아 및 박테리아를 포함하며, 섬유소의 분해는 주로 박테리아와 곰팡이가 담당하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이들 미생물은 대부분 배양이 어려워 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 현재까지 알려진 바로, 반추위 미생물 중에서 식물 세포벽을 소화하는데 주요하게 관여하는 박테리아로는 파이브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 루미노코커스 플라베파시엔스(Ruminococcus flavefaciens), 루미노코쿠살버스(Ruminococcusalbus), 부티리비브릭 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 유박테리움 셀룰로솔벤스(Eubacterium cellulosolvens), 프레보텔라(Prevotella), 그리고 일부 클로스트리디움(Clostridium) 속에 속하는 박테리아가 밝혀져 있다. 현재까지 대부분의 반추동물의 섬유소분해효소 유전자를 발굴하기 위하여 소와 토끼, 캥거루의 소화기관의 총 미생물 DNA, 혹은 메타게놈(metagenome; 환경미생물의 총 DNA를 일컬음)에 대한 연구가 진행되었으며, 이를 통해 다수의 글루카나아제(glucanase), 베타-글루코시다아제(xylanase) 및 셀룰로솜 복합체(cellulosome complex)들이 밝혀진 바 있다.

하지만, 상기 대부분은 연질의 식물 섬유소원을 먹이로 진화한 경우이다. 산업적으로는 섬유소분해효소 중 보다 경질의 섬유소원에 대한 분해 능력이 요구된다.

흑염소는 나뭇가지 및 껍질, 그리고 초목과 같이 보다 조악한 섬유소원의 사료를 잘 소화하도록 진화하였다. 이는 흑염소의 반추위 미생물군이 다른 초식동물과 다르게 공생되어 진화되었다는 것을 의미한다. 난배양성 미생물군에 대한 유전자 탐색을 위하여 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid) 및 BAC(bacterial artificial chromosome) 유전자은행을 이용하여 신규 물질을 탐색하는 기술이 널리 사용되고 있다. 이러한 방법으로 현재까지 많은 섬유소분해효소 유전자가 밝혀진 바 있다.

한국공개특허공보 제2011-0119961호 한국공개특허공보 제2007-0116881호

이와 같은 기술적 배경 하에서 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH57 도메인을 포함하며 탄수화물 에스터라아제 4(CE4) 계열 알파 아밀라아제 단백질이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 아밀라아제 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료첨가제가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 아밀라아제 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 알파 아밀라아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명은 신규한 흑염소 유래의 섬유소분해효소 제공하며, 이를 통해 보다 경질의 섬유소원을 분해할 수 있다. 본 발명을 활용하여 사료 곡물 가격 상승에 대비한 저가의 사료 첨가제를 개발할 수 있고, 지구상에서 가장 풍부한 자원인 섬유소를 이용한 바이오연료를 개발할 수 있으며, 섬유유연제 및 섬유소분해효소 첨가 공정 등 다양한 방면에 적용할 수 있다.

도 1은 포스미드(Fosmid) 유전자 은행 구축을 위한 메타게놈 DNA 부분절단 조건 확립 및 삽입 DNA 절단 결과를 나타낸다.
도 2는 Ad 분획과 Lq 분획에 대한 포스미드 유전자은행 평균 삽입 크기 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 에스큘린-아가(Esculin-Agar) 플레이트 상에 접종 후, 에스큘린 분해에 따라 주위가 갈색으로 변한 클론 선발 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 의한 뉴클레오티드 검색(nucleotide blast) 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 의한 단백질 검색(protein blast)에 따른 주요 도메인 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 의한 단백질 검색(protein blast) 결과에 따른 주요 유사 단백질을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의한 단백질 검색(protein blast) 결과 중 최상위 상동 단백질과 다른 섬유소분해효소 단백질과의 유사성 검토(phylogenetic tree) 및 상동성과 추정값을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어, 상과(superfamily)란, 아미노산 배열, 단백질 기능 및 단백질의 입체 구조 등이 서로 유사한 단백질 군을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '바이오매스(biomass)'란, 태양광을 사용하여 이산화탄소를 고정하는 탄소동화과정을 하는 식물체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물유기체 전반을 일컫는다. 상기 바이오매스로부터 생산되는 알콜, 디젤, 수소와 같은 각종 연료는 바이오연료(biofuel)라 불리우며 이러한 바이오매스, 특히 섬유소와 같은 식물계 바이오매스는 석유로 부터 얻어지는 화학물질들을 대체할 수 있는 물질로 제안되고 있다. 식물계 바이오매스는 각종 화학제품을 생산하는데 있어 석유를 원료로 하는 것보다 에너지 수지면에서 유리하다.

그 이유는 식물계 바이오매스의 경우는 산소를 포함하는 다양한 기능기가 포함되어 있어 기능기가 첨부된 각종 화학제품들을 생산하는 경우 더 낮은 활성화 에너지로 전환이 가능하기 때문이다.

본 발명에서 사용되는 용어, '바이오연료(biofuel)'란, 연료로 살아있는 유기체뿐 아니라 동물의 배설물 등 대사활동에서 나오는 부산물을 모두 포함하며, 화석연료와는 다른 신재생 에너지로 바이오에탄올과 바이오디젤 등이 포함된다.

본 발명은 흑염소 반추위 미생물의 섬유소분해 능력에 초점을 두고, 흑염소 반추위 미생물 메타게놈에 대하여 fosmid 유전자은행을 구축하고, 이로부터 엑소셀룰라제(exocellulase) 계통인 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성에 대한 기질인 에스큘린(esculin)을 분해하는 활성을 갖는 포스미드 클론을 선발하고, 그 클론의 플라스미드 DNA를 해독함으로써 유전정보를 확보하였다. 활성을 갖는 포스미드 클론의 플라스미드 DNA는 Qiagen Midi Prep Kit을 사용하여 추출하였으며, 추출된 DNA는 평균 220bp 길이로 100배수의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing) 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 염기서열 정보를 확보하였다. 확보된 활성 fosmid 플라스미드 DNA 서열에 대하여 NCBI blastp 검색을 통해 주요 도메인과 유사 유전자를 검색하여 섬유소분해효소 관련 유전자를 발굴하였다.

본 발명은 현재까지 공개된 섬유소분해효소 유전자 서열과 매우 상이한 신규이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자는 알파 아밀라아제 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로부터 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 '서열 상동성의 %'는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따라, 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자는 바람직하게는 흑염소 반추위 미생물 유래일 수 있다. 다만, 반드시 이에 제한될 것은 아니며, 본 발명의 실시예는 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자와 높은 상동성(예를 들어, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성)을 갖고, 흑염소가 아닌 다른 생물의 반추위 미생물로부터 유래한 유전자를 포함할 수 있다. 서열정렬 방법 및 서열 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들어, BLAST 등)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH57 도메인을 포함하며 탄수화물 에스터라아제 4(CE4) 계열 계열 알파 아밀라아제 단백질이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 알파 아밀라아제 단백질의 범위는 흑염소 반추위 미생물로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GH57 도메인을 포함하며 탄수화물 에스터라아제 4(CE4) 계열 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 '기능적 동등물'이란 용어는, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 상기 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 용어는, 동일한 알파 아밀라아제 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 알파 아밀라아제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 상기 '단편', '유도체' 및 '유사체'란 용어는 본 발명에 따른 알파 아밀라아제 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명에 따른 알파 아밀라아제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 따라 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 즉 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

상기 '폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'란 용어는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 상기에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL프로모터, trp프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지의 좌향 프로모터 (pL프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

여기서, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX, pQE80L 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 일반적으로 폴리아데닐화 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 벡터는 선택표지(marker)로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터를 원핵세포에 안정적으로 형질전환시킨 후 발현시키기 위한 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 숙주세포, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 또는 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주등을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우, 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료첨가제가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 및 사과산 등과 같은 유기산; 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염)등과 같은 인산염; 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등과 같은 천연 항산화제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소 및 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들어, 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들어, 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들어, 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들어, 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들어, 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 첨가제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 효소 제제, 예를 들어, 리파아제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라아제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 사료 첨가제에 포함되는 본 발명에 따른 알파 아밀라아제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔, 페이스트 또는 슬러리 형태일 수 있다. 상기 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 전분 다당류의 촉매-매개 가수분해를 통한 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 또는 콘택트 렌즈 세정 용액과 같은 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 알파-아밀라아제활성 효소 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오매스 물질은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질이며, 본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 전처리하는 단계; 전처리한 바이오매스를 효소로 가수분해시키는 단계; 및 가수분해된 바이오매스 물질을 발효시키는 단계;로 이루어지며, 상기 바이오연료의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스는 전분질계(곡물, 감자류 등), 셀룰로오스계(초본, 임목, 왕겨 등), 당질계(사탕수수, 사탕무 등) 또는 단백질계(가축분뇨, 사체, 미생물 균체 및 이들로부터 유래하는 종이와 음식물찌꺼기 등 유기성 자원)등의 고분자량의 탄수화물일 수 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되지 않는다.

실시예

흑염소 반추위 미생물 분리 및 DNA 추출

수컷 2마리와 암컷 1마리 흑염소에 대하여 1개월 간 볏짚 사료와 미네랄 보충제만으로 사육한 후, 도축을 실시하였고 이로부터 4개의 위 중에서 첫 번째 위인 반추위를 취하여 그 내용물을 확보하였다. 확보된 내용물은 먼저 거즈를 이용하여 위액상(Lq; liquid phase)과 사료 소화상(Ad; adherent phase)로 구분하여 시료를 준비하였다. 사료 소화상 Ad는 거즈로 거른 후의 찌꺼기를 다시 0.15%(volume/volume) Tween-80, PBS 용액에 현탁하여 볏짚 소화물에 부착된 미생물을 회수한 것이다. 이들에 대해 각각 5g의 침전 시료를 마련하고 이를 CTAB(hexadecylmethylammonium bromide)와 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다.

흑염소 반추위 미생물 fosmid 유전자은행 구축

Ad와 Lq에서 추출된 DNA에 대하여 fosmid 유전자은행을 구축하기 위한 적절한 크기로 임의 부분절단 조건을 위해 여러 HindIII 제한효소의 양을 조절한 결과, Ad는 HindIII 5units 그리고 Lq는 2.5units를 사용하도록 결정하였다(도 1). 부분절단된 DNA 절편들은 Pulse-Field Gel 전기영동 방법을 사용하여 10kb 에서 50kb 사이의 영역을 오려내어 이로부터 다시 인서트 DNA 단편을 마련하였다. 마련된 DNA는 말단 평활화 반응을 수행하고 이를 pCC1FOS 벡터에 ligation 반응으로 연결하였다. Ligation 연결 반응 후, 이를 DH5alpha 대장균에 전기적 충격법으로 형질전환하여 유전자은행을 구축하였다. 구축된 fosmid 유전자은행에 대하여 평균 삽입크기를 확인하기 위하여 NotI 효소 처리를 하여 이를 전기영동으로 확인한 결과, Ad의 경우 30 kb, Lq의 경우는 31kb로 판명되었다(도 2). 이들에 대해서 각각 384 well plate 총 150 plates에 냉동보존 가능 배지에 접종하여 초저온냉동고(-70℃)에 보관하였다.

에스큘린 ( Esculin ) 분해 활성을 지닌 포스미드 ( fosmind ) 클론 선발

Ad와 Lq의 포스미드 클론 전부인 115,200개 클론에 대하여 INTEGRA사의 VIAFLO 384 기기를 사용하여, 384 클론 단위로 1.65% esculin iron 기질이 포함된 LB chloramphenicol agar 배지에 0.5 ㎕씩 접종을 하고, 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양된 plate의 esculin 분해 활성을 갖는 클론은 주변이 갈색을 나타내게 되므로, 육안으로 활성 클론을 선발하였다(도 3).

에스큘린 ( Esculin ) 분해 활성 포스미드 클론에 대한 염기서열 해독

상기 확인된 포스미드 클론 Ad_006O06에 대하여 fosmid 플라스미드 추출을 Qiagen plasmid midi prep kit을 사용하여 수행하였으며, 추출된 플라스미드 DNA는 semi-conductor sequencing 방식인 Ion Personal Genome Machine(PGM)을 사용하여 평균 220bp 길이로 100배수의 shotgun sequencing 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 전환하여 Newbler 2.5 de novo assembler 프로그램을 사용하여 어셈블리(assembly)를 진행하였다. 총 3개의 컨티그 서열이 만들어졌으며, 각 22,495bp, 9,103bp, 3,272bp의 길이로, 총 34,870bp의 메타게놈 서열 정보를 확보할 수 있었다.

서열목록

- 서열 발견 장소: 농촌진흥청 국립축산과학원

- 서열 유래 흑염소: 농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원시험장 출생 흑염소 3두(수컷 2두, 암컷 1두)에 대하여 동물유전체과에서 관리이전 후 볏짚사료와 미네랄 보충제로만 한 달간 급여한 후 도축하여 얻은 반추위 미생물 시료

- Fosmid 유전자은행 벡터: pCC1Fos

- 유전자 유래 Fosmid 클론 명칭: Ad_006O06

- 유전자의 DNA 염기서열(서열번호 1) 길이: 1,203 bp

- 유전자의 아미노산 서열(서열번호 2) 길이: 400 amino acids

- 유전자의 DNA 및 단백질 서열 : 하기 표 및 서열목록 첨부

유전자 탐색 및 유사성 조사

확보된 fosmid 클론의 삽입 DNA 염기서열 정보에 대해서는 MetaGeneMark 프로그램을 이용하여 유전자 영역을 탐색하였다. 탐색된 유전자 정보에 대해서는 일차적으로 NCBI의 protein blast 검색을 통해 각 유전자의 유사 서열 정보를 얻었으며, 이 과정에서 주요 도메인 검색 결과와 유사 단백질을 참조하여 신규 섬유소분해효소 유전자를 발굴하였다. Cel57-KG91은 2015년 10월 현재 nucleotide blast 결과(도 4), 전체 1,203bp의 유전자 크기 중에서 42bp만이 Pyrobaculum oqunlense TE7의 유전체 일부와 91% 유사성을 갖는 것으로, 이는 전체의 3.5%에 해당하여 cel57-KG91 유전자가 Pyrobaculum oqunlense TE7에서 유래하였다고 볼 수 없다. 또한 protein blast 결과, carbohydrate esterase 4 superfamily(CE4-SF) 도메인을 가지고 있으며, protein family(pfam) 도메인 검색으로는 glycosyl hydrolase family 57(GH57)을 포함하고 있다는 것이 확인되었다(도 5). 유사한 단백질은 탐색한 결과, cel57-KG91은 Cecembia lonarensis의 알파-아밀라아제(WP_009183789)와 단백질 수준에서 전체 96% 수준에서 61%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다(도 5). 다른 종류의 섬유소분해효소 관련 단백질의 서열과 비교해 본 결과, cel57-KG91 유전자의 산물은 알파-아밀라아제 계통의 섬유소분해효소라고 할 수 있다(도 6).

본 발명의 따른 섬유소분해효소 알파 아밀라아제의 일종인 cel57-KG91 유전자의 산물은 사료 첨가제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 세제 및 바이오연료 생산에도 이용되어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Alpha amylase cel57-KG91 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof <130> NPF-29281 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1203 <212> DNA <213> unidentified bacterium <400> 1 atgagcaaat caatctgttt ctatttccaa gtgcatcagc cttacaggct ccgcacgtat 60 cgtttcttcg agattggcaa gaaacattat tactatgacg actacagcaa ccgcatgatc 120 atgcggcgtg tggcggagaa atgctacctg cccatgaacg agctgctgat gcggcaaatc 180 gagaagttcg gcgacaaggt caagttcgcg ttctcgttct cgggtgtggt catcgagcag 240 atggagcaat tcgcacctga ggtgctggag agcttccaaa aactcgttgc tacgggcagg 300 gtagaggtgc tttccgagac ctacgcccat tcgctggctt cgctgtcgaa tcccgatgag 360 ttcaaacggc aagtgctggc ccacaagcac aagatgaaag aggtgtttgg tgtgacgccc 420 aagaccttcc gcaacaccga gttgatctac agcgatgaaa tcggtgcggc cgtggccgac 480 atgggctata acctcatgct cactgaaggc gccaagcaca tcttgggttg gaagagcccc 540 aactacatgt acgccaacgc catcaacccg aagctgaagg tgctgctgcg caacttcaag 600 ttcagcgacg agatcgcctt ccgcttcgtg caggacggct tccgcgccga ggactttgtc 660 agctggctca acgccttgcc ggaagaggag gaagtggtca atatcttcat ggactatgag 720 accttcggcg agcaccaaca ggccgagacg ggcatcttca acttcatgga ggctctgccc 780 gaggccatcc tgaaaggtag taaattcaag tttgccacgc cgcaggagtt ggccaaggcc 840 ttgcagccgg tgagtgctgt caacgtgccc aatgttctgt cgtggagcga cgaggagcgc 900 gacctcacgg cctggctcgg caaccccttg caggacgatg ccttccgtgc cttgtacgac 960 ctgaacgcca aggtgcaccg catcaaggac gaggagctgc aacaggactg gaccatgctc 1020 cagacctcgg accatttcta ctacatgtgc acgaagtggc tctccgacgg cgtggtgcat 1080 aagtatttca accactatgc ctcgccgtat gatgcttacg tcaactacat gaatgtcttg 1140 acggacttcg ccgatcgtgt gactaagctg tcgaagcgca aggtggcgaa agttgagaaa 1200 tag 1203 <210> 2 <211> 400 <212> PRT <213> unidentified bacterium <400> 2 Met Ser Lys Ser Ile Cys Phe Tyr Phe Gln Val His Gln Pro Tyr Arg 1 5 10 15 Leu Arg Thr Tyr Arg Phe Phe Glu Ile Gly Lys Lys His Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asp Asp Tyr Ser Asn Arg Met Ile Met Arg Arg Val Ala Glu Lys Cys 35 40 45 Tyr Leu Pro Met Asn Glu Leu Leu Met Arg Gln Ile Glu Lys Phe Gly 50 55 60 Asp Lys Val Lys Phe Ala Phe Ser Phe Ser Gly Val Val Ile Glu Gln 65 70 75 80 Met Glu Gln Phe Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Phe Gln Lys Leu Val 85 90 95 Ala Thr Gly Arg Val Glu Val Leu Ser Glu Thr Tyr Ala His Ser Leu 100 105 110 Ala Ser Leu Ser Asn Pro Asp Glu Phe Lys Arg Gln Val Leu Ala His 115 120 125 Lys His Lys Met Lys Glu Val Phe Gly Val Thr Pro Lys Thr Phe Arg 130 135 140 Asn Thr Glu Leu Ile Tyr Ser Asp Glu Ile Gly Ala Ala Val Ala Asp 145 150 155 160 Met Gly Tyr Asn Leu Met Leu Thr Glu Gly Ala Lys His Ile Leu Gly 165 170 175 Trp Lys Ser Pro Asn Tyr Met Tyr Ala Asn Ala Ile Asn Pro Lys Leu 180 185 190 Lys Val Leu Leu Arg Asn Phe Lys Phe Ser Asp Glu Ile Ala Phe Arg 195 200 205 Phe Val Gln Asp Gly Phe Arg Ala Glu Asp Phe Val Ser Trp Leu Asn 210 215 220 Ala Leu Pro Glu Glu Glu Glu Val Val Asn Ile Phe Met Asp Tyr Glu 225 230 235 240 Thr Phe Gly Glu His Gln Gln Ala Glu Thr Gly Ile Phe Asn Phe Met 245 250 255 Glu Ala Leu Pro Glu Ala Ile Leu Lys Gly Ser Lys Phe Lys Phe Ala 260 265 270 Thr Pro Gln Glu Leu Ala Lys Ala Leu Gln Pro Val Ser Ala Val Asn 275 280 285 Val Pro Asn Val Leu Ser Trp Ser Asp Glu Glu Arg Asp Leu Thr Ala 290 295 300 Trp Leu Gly Asn Pro Leu Gln Asp Asp Ala Phe Arg Ala Leu Tyr Asp 305 310 315 320 Leu Asn Ala Lys Val His Arg Ile Lys Asp Glu Glu Leu Gln Gln Asp 325 330 335 Trp Thr Met Leu Gln Thr Ser Asp His Phe Tyr Tyr Met Cys Thr Lys 340 345 350 Trp Leu Ser Asp Gly Val Val His Lys Tyr Phe Asn His Tyr Ala Ser 355 360 365 Pro Tyr Asp Ala Tyr Val Asn Tyr Met Asn Val Leu Thr Asp Phe Ala 370 375 380 Asp Arg Val Thr Lys Leu Ser Lys Arg Lys Val Ala Lys Val Glu Lys 385 390 395 400

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자.
2. 제1항에 따른 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH57 도메인을 포함하며 탄수화물 에스터라아제 4(CE4) 계열인 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질.
3. 제1항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제3항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
5. 제2항에 따른 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료 첨가제.
6. 제2항에 따른 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질을 포함하는 세제 조성물.
7. 바이오매스 물질에 제2항에 따른 알파-아밀라아제 활성 효소 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법.

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