CN107418915A - 用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，由短小芽孢杆菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂、乙酸钙不动杆菌剂、脱氮副球菌剂、粪球产碱菌剂混合后发酵、按比例混合、经冷冻干燥制成成品菌种；其使用方法将成品菌种用蒸馏水溶解，重悬；进一步稀释至OD600 0.5左右，灌装入喷壶，对降解堆材料进行充分喷洒。本发明制成的成品菌种易于储藏，使用方便，适于各种环境的使用，降低使用成本。

Description

用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法及其使用
技术领域
本发明涉及一种牲畜粪尿无公害处理技术领域，尤其涉及一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法及其使用。
背景技术
近年来，随着牲畜集约化养殖业的快速发展，如何快速、高效处理牲畜粪尿，使其不对环境造成污染，成为养殖企业急需解决的重大问题。
目前牲畜养殖企业一般会采用沼气工程技术来对牲牲畜粪尿进行处理。这项技术在理论上解决了牲畜粪尿的处理和秸秆还田，但在实际操作中遇到很多技术难题，处理效率低下。因此，近几年来，沼气工程技术进步缓慢，没有得到广泛的应用。此外，养殖场污染物包括生成粪便和圈舍冲洗水两类，前者浓度高，但是其量仅为冲洗水量的1/7左右。如果将两类粪污放在一起发酵处理，基建投资和运行费用很高，发酵条件也很难得到满足。
沼气工程技术还存在着如下缺点：
1、沼气处理的相关设备多，且成本昂贵。日常的管理与维护工作烦琐。
2、为了达到圈舍内清粪目的，还必须依靠大量的人力或者昂贵的机械设备。
3、沼气化处理需要消耗大量的淡水资源以及土地资源。
4、厌氧微生物增殖缓慢，因此沼气处理的时间周期漫长，无法应对每天产生的大量牲畜粪尿。
5、一般情况下，沼气处理后的出水水质不能直接达到符合排放标准的要求，需要进一步处理，因此还需要增加相应的处理设备。
6、沼气处理过程中产生的以甲烷气体为主的沼气是一种易燃易爆气体，存在安全隐患。
7、对温度要求严格，废水温度低时对处理效果影响很大，管理操作比较复杂。
8、无法解决圈舍内的臭气，影响周边居民的生活环境。
因此，近年来，在养殖技术中采用了一种在发酵床的条件下养殖的技术，即利用特异微生物菌群将锯末、稻壳、米糠等有机物经发酵处理制成垫料，牲畜饲养在垫料上，由有益微生物组成的复合菌群以牲畜粪尿为基础营养迅速繁殖，各种病原微生物被杀灭抑制，为牲畜的生长发育提供了良好的养殖环境，同时粪尿也被消化分解，圈舍物臭味，实现零排放。发酵床的制作基本上是采用如米糠、谷壳、秸秆等有机质作为垫料，垫料厚度从40cm到60cm 不等，并用微生物菌种对垫料进行发酵制成。
目前发酵床或是发酵垫已有在先发明专利公开，如《畜禽生物降解垫》(CN104126515B)，由载体和混合菌剂混合后粉碎制成，需要将混合物制成降解垫按照一定要求铺设在圈舍中，形成发酵床，因此载体与混合菌剂均不可缺少，还需要在已布置好的圈舍中实施，这对开展这一降解方式形成了限制，不利于全面实施。
发明内容
本发明目的是提供一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法及其使用，使用该方法，可使牲畜粪尿零排放，无污染，无臭味，同时牲畜生物降解垫含有天然抗生素，提高牲畜免疫力，能保持恒温、稳定发酵；且可节约土地资源，节约牲畜养殖建设成本，节约人工，节约能源等，有利于全面实施。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，采用六种种子菌为：短小芽孢杆菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂、乙酸钙不动杆菌剂、脱氮副球菌剂、粪球产碱菌剂，其步骤为：
⑴混合菌培养：包括培养基的制备、六种种子菌复苏、菌种扩增培养及菌种放大培养；
⑵菌种混合：将步骤⑴中收集获得的菌体按照短小芽孢杆菌剂10:枯草芽孢杆菌剂10:地衣芽孢杆菌剂3:乙酸钙不动杆菌剂2:脱氮副球菌剂2:粪球产碱菌剂8的比例混合；
⑶冻干后制成成品菌种；
其中：①所述培养基的制备包括平板培养基和液体培养基，所述平板培养基为0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl；1％胰蛋白胨 Tryptone；1.5％冻粉Agar；所述液体培养基为0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl；1％胰蛋白胨Tryptone；②所述种子菌复苏是将种子菌分别放置于平板培养基上接种；③所述菌种扩增培养是将复苏后的种子菌分别加入到液体培养基中接种，获得种子液；④所述菌种放大培养是将种子液在液体培养基中发酵，离心收集菌体。
上述技术方案中，所述种子菌复苏为：从-80℃菌种库中分别取出种子菌，室温下，融化后，在所述平板培养基上接种，每一种种子菌分别接种， 37℃下培养12-24h。
上述技术方案中，所述菌种扩增培养为：在超净工作台上，从平板培养基上挑取单克隆菌落，无菌条件下用接种针接种至10ml液体培养基中，37 ℃振摇培养12h，使得OD600达到1.0，此为一级种子液；无菌条件下，将10ml 一级种子液加入到250ml液体培养基中，37℃振摇培养超过12h，使得OD600达到1.0，此为二级种子液，二级种子液作为后续菌种放大培养的种子液。
上述技术方案中，所述菌种放大培养为:配置5L发酵罐，培养基为液体培养基，体积为4L，经121℃高温消毒灭菌后，将种子液按1:100的比例接种到发酵罐中，继续37℃扩增培养，至OD600达到5.0，结束发酵， 800～1200rpm转速离心收集菌体。
上述技术方案中，所述步骤⑶中冻干过程为：将混合菌用消毒灭菌的去离子水重悬，使菌密度达到OD600 10.0，加入脱脂奶粉，终浓度为0.5％，充分混合后，立即至于-40℃冰箱中冷冻，4小时候，至于菌种冻干机中冷冻干燥，制成成品菌种。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种成品菌种的使用方法，将成品菌种用蒸馏水溶解，重悬；进一步稀释至OD600到0.5，灌装入喷壶，对待降解牛粪尿材料进行充分喷洒，24h内完成降解。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明制备成为成品菌种，通过冷藏备用，便于储藏；在使用时，使用蒸馏水溶解成品菌种，稀释至OD600 0.5左右，即可喷洒，使用方便，对降解材料堆放无要求，24小时内完全降解，无残留，无臭味，平均降解堆中心温度为50 ℃左右，相对湿度为10％左右。经30天观察，降解堆色泽保持不变，相对湿度保持恒定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，由短小芽孢杆菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂、乙酸钙不动杆菌剂、脱氮副球菌剂、粪球产碱菌剂混合后发酵、按比例混合、经冷冻干燥制成成品菌种。
⑴混合菌培养
a.培养基配方：
LB平板培养基配方：0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl； 1％胰蛋白胨Tryptone；1.5％冻粉Agar。
LB液体培养基配方：0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl； 1％胰蛋白胨Tryptone。
培养基经过高压消毒灭菌，备用。
b.菌种复苏：
从-80℃菌种库中分别取出上述6种种子菌，室温下，融化后，在LB 平板上接种，每一种菌分别接种，37℃培养12-24h。
c.菌种扩增培养
在超净工作台上，从LB平板上挑取单克隆菌落，无菌条件下用接种针接种至10mlLB培养液中，37℃振摇培养12h，OD600达到1.0，此为一级种子液。无菌条件下，将10ml一级种子液加入到250ml LB培养液中， 37℃振摇培养过夜，OD600达到1.0，此为二级种子液，每一种菌分别接种。
d.菌种放大培养
配置5L发酵罐，培养基为LB液体培养基，体积为4L，经121℃高温消毒灭菌后，备用。将第3步二级种子液按1:100的比例接种到发酵罐中，继续37℃扩增培养，至OD600达到5.0，结束发酵，1000rpm离心，收集菌体。
⑵菌种混合：
将离心获得的菌体按比例混合，短小芽孢杆菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂、乙酸钙不动杆菌剂、脱氮副球菌剂、粪球产碱菌剂混合比例为10:10:3:2:2:8。
⑶冻干后制成成品菌种
将混合菌用消毒灭菌的去离子水重悬，使菌密度达到OD600 10.0，加入脱脂奶粉，终浓度为0.5％，充分混合后，立即至于-40℃冰箱中冷冻，4小时候，至于菌种冻干机中冷冻干燥，制成成品菌种，冷藏备用。
牛粪尿降解试验
将成品菌种用蒸馏水溶解，重悬；进一步稀释至OD600 0.5左右，灌装入喷壶，对降解堆材料进行充分喷洒。每天添加牛粪尿，观察降解情况，并记录温度、湿度等参数。
研究结果显示，每天添加牛粪尿材料后，24小时内完全降解，未见粪尿残留，无臭味散发。温度记录仪显示，平均降解堆中心温度为50℃左右，相对湿度为10％左右。经30天观察，降解堆色泽保持不变，相对湿度保持恒定。

Claims (6)

1.一种用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，采用六种种子菌为：短小芽孢杆菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂、乙酸钙不动杆菌剂、脱氮副球菌剂、粪球产碱菌剂，其步骤为：
⑴混合菌培养：包括培养基的制备、六种种子菌复苏、菌种扩增培养及菌种放大培养；
⑵菌种混合：将步骤⑴中收集获得的菌体按照短小芽孢杆菌剂10:枯草芽孢杆菌剂10:地衣芽孢杆菌剂3:乙酸钙不动杆菌剂2:脱氮副球菌剂2:粪球产碱菌剂8的比例混合；
⑶冻干后制成成品菌种；
其中：①所述培养基的制备包括平板培养基和液体培养基，所述平板培养基为0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl；1％胰蛋白胨Tryptone；1.5％冻粉Agar；所述液体培养基为0.5％酵母抽提物Yeast extract；1％氯化钠NaCl；1％胰蛋白胨Tryptone；②所述种子菌复苏是将种子菌分别放置于平板培养基上接种；③所述菌种扩增培养是将复苏后的种子菌分别加入到液体培养基中接种，获得种子液；④所述菌种放大培养是将种子液在液体培养基中发酵，离心收集菌体。
2.根据权利要求1所述的用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，其特征在于：所述种子菌复苏为：从-80℃菌种库中分别取出种子菌，室温下，融化后，在所述平板培养基上接种，每一种种子菌分别接种，37℃下培养12-24h。
3.根据权利要求1所述的用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，其特征在于：所述菌种扩增培养为：在超净工作台上，从平板培养基上挑取单克隆菌落，无菌条件下用接种针接种至10ml液体培养基中，37℃振摇培养12h，使得OD600达到1.0，此为一级种子液；无菌条件下，将10ml一级种子液加入到250ml液体培养基中，37℃振摇培养超过12h，使得OD600达到1.0，此为二级种子液，二级种子液作为后续菌种放大培养的种子液。
4.根据权利要求1所述的用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，其特征在于：所述菌种放大培养为:配置5L发酵罐，培养基为液体培养基，体积为4L，经121℃高温消毒灭菌后，将种子液按1:100的比例接种到发酵罐中，继续37℃扩增培养，至OD600达到5.0，结束发酵，800～1200rpm转速离心收集菌体。
5.根据权利要求1所述的用于牲畜粪料生物降解的成品菌种制备方法，其特征在于：所述步骤⑶中冻干过程为：将混合菌用消毒灭菌的去离子水重悬，使菌密度达到OD600 10.0，加入脱脂奶粉，终浓度为0.5％，充分混合后，立即至于-40℃冰箱中冷冻，4小时候，至于菌种冻干机中冷冻干燥，制成成品菌种。
6.一种使用权利要求1制备获得的成品菌种的使用方法，其特征在于：将成品菌种用蒸馏水溶解，重悬；进一步稀释至OD600到0.5，灌装入喷壶，对待降解牛粪尿材料进行充分喷洒，24h内完成降解。
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