KR20090085379A

KR20090085379A - 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ) ＤＬ-3 유래셀룰라아제 단백질 및 이의 형질전환된 에셰리키아 콜리ＤＬ-3 균주

Info

Publication number: KR20090085379A
Application number: KR1020080011233A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 윤원주; 이유정; 김보경; 이보화
Original assignee: 주식회사 진상; 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2009-08-07

Abstract

본 발명은 토양에서 분리하여 동정한 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3; KACC 91344P) 균주로부터 신규한 셀룰라아제를 얻고, 이를 발현벡터를 이용하여 에셰리키아 콜리(E.coli)에 도입하여 형질전환된 셀룰라아제 생성이 증가된 에셰리키아 콜리 DL-3(Escherichia coli DL-3; KACC 91333P) 균주에 관한 것으로, 섬유소 분해 활성이 뛰어난 셀룰라아제 유전자를 대장균(E.coli)을 이용한 유전자 재조합을 통해서 기존 균주보다 생산성 및 효율성을 증대시킬 수 있는 바, 곡류가공, 생물자원으로부터의 에탄올 발효, 주류 생산, 폐기물 처리 및 세탁이나 주방용 세제에 대량 사용되는 셀룰라아제를 경제성 있는 생산 비용으로 대량생산이 가능하게 한 뛰어난 효과가 있다.

바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens), 셀룰라아제(cellulase), 섬유소 분해 효소

Description

바실러스 아밀로리퀘페이션스(Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ) ＤＬ-3 유래 셀룰라아제 단백질 및 이의 형질전환된 에셰리키아 콜리 ＤＬ-3 균주{Cellulase protein derived from Bacillus amyloliquefaciens DL-3 and transformed Escherichia coli DL-3 strain thereof}

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DL-3 유래 셀룰라아제 단백질 및 이의 형질전환된 에셰리키아 콜리(Escherichia coli) DL-3 균주에 관한 것으로 보다 상세하게는 토양에서 분리하여 동정한 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주로부터 셀룰라아제 를 얻고, 이를 발현벡터를 이용하여 에셰리키아 콜리(E.coli)에 도입하여 형질전환된 셀룰라아제 생성이 증가된 에셰리키아 콜리 DL-3 균주에 관한 것이다.

셀룰로오스는 β-1,4-글루코시드 결합으로 연결된 글루코스 단위의 선형 중합체로서 목재 바이오매스의 주성분이다. 셀룰로오스는 셀룰라아제(cellulase)에 의하여 최종적으로 글루코오스(glucose)로 분해되므로 이를 이용하여 에탄올을 생 산함으로써 바이오에너지를 생산할 수 있다.

따라서 미국은 에너지부 (Department of Energy, DOE) 의 국립재생에너지연구실 (National Renewable Energy Laboratory, NREL)과 효소를 주로 생산하는 회사인 제넨코 인터네셔널(Genencor International) 및 노보자임(Novozymes) 등이 이들은 주로 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)에서 얻은 효소시스템을 이용하여 보다 효율적이며 저렴한 셀룰라아제를 생산하려는 연구를 진행하고 있고, 일본은 삼림종합연구소에서 목재로부터 당을 고 효율적으로 생산하기 위하여 초임계수를 이용한 고속당화법의 기술 개발을 위한 연구를 진행 중에 있다. 또한 쿄토대학의 와타나베(Watanabe) 등은 백색부후균을 이용하여 선택적으로 리그닌을 분해시킨 뒤 목재로부터 에탄올과 같은 유용물질로의 변환에 관한 연구를 진행 중에 있다. 국내에서도 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 기술의 실용화를 위해 많은 연구를 수행 중이나 큰 성과를 거두지 못하고 있다.

균류에 의한 셀룰로오스 분해에는 일반적으로 3그룹의 가수분해 효소인 엔도글루카나아제(endoglucanase;EG), 엑소글루카나아제(exoglucanase;CBH) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase;BGL)이 관여한다고 여겨지고 있다.

EG는 셀룰로오스 내부 사슬의 β-1,4 결합을 무작위로 가수분해하고, CBH은 EG에 가수분해되어 생성된 셀룰로오스 중합체의 환원말단 및 비환원말단을 점진적으로 가수분해하여 2분자의 글루코오스가 결합한 셀로비오스를 생산한다. 셀로비오스는 EG와 CBH에 있어서 강력한 억제제로 작용하므로, BGL은 이러한 셀로비오스를 가수분해시켜 각각 EG와 CBH의 강한 억제를 제거시킨다. 일반적으로 EG는 셀룰로오 스 분자의 무결정 영역을 가수분해할 수 있고, CBH는 결정 영역에 결합하여 셀룰로오스 사슬의 환원 및 비환원말단으로부터 가용성 환원당을 생산할 수 있다. 셀룰라아제는 세균과 곰팡이에서 얻어지며, 셀룰로오스 분해효소를 생산하는 곰팡이로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 푸사리움(Fusarium), 스포로트리쿰(Sporotricum) 등이 있으며, 세균으로는 셀로비브리오(Cellovibrio), 클로스트리듐(Clostridium), 아세토비브리오(Acetovibrio), 박테리오데스(Bacteriodes), 셀룰로모나스(Cellulomonas), 슈도모나스(Pseudomonas) 또한 방선균인 써모액티노미세테스(Thermoactinomycetes), 써모모노스포라(Thermomonospora) 및 스트렙토미세스(Streptomyces) 등에 대한 효소학적 연구가 지속적으로 행하여져 왔다.

셀룰라아제에 관한 종래 등록된 특허기술을 살펴보면, 셀룰라제를 분비하는 효모 및 그것을 포함하는 사료첨가제(대한민국 특허등록 제 10-0377954호), 크리소스포리움 셀룰라아제 및 사용방법((대한민국 특허등록 제 10-0641878호), 중성 셀룰라아제를 생산하는 신규한 바실러스속 79-23 균주((대한민국 특허등록 제 10-0318554호), 셀룰라아제와 자일란아제를 생산하는 아스퍼질러스 균주와 이에 의해 제조된 효소 및 고체배양물(대한민국 특허등록 제 10-0449170호) 등이 있다.

산업적인 규모로 셀룰라아제를 생산하는 기존의 방법은 트리코더마(Tricoderma)종들이나 아스퍼질러스(Aspergillus)종과 같은 곰팡이를 고체배양(solid state fermentation)하여 섬유소 분해효소를 생산하고 있으나 고체배양은 액체배양에 비하여 비효율적이며 곰팡이는 세균에 비하여 생육속도가 낮기 때문에 생산성이 낮아 섬유소 분해효소의 가격이 높은 편이다. 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위한 방법으로 곰팡이의 섬유소 분해효소 유전자를 대장균(E. coli)과 같은 세균에 도입하고 섬유소 분해효소 유전자를 포함하는 변이주를 액체 배양하여 섬유소 분해효소의 생산성을 높이기 위한 연구가 진행되고 있으나 산업화된 것은 아직 없으며, 그 생산효율도 낮은 실정이다.

이에 본 발명자들은 섬유소 분해효소의 생산성을 높이기 위한 연구를 꾸준히 계속한 결과, 섬유소 분해 능력이 뛰어난 균주를 토양에서부터 분리, 동정하였으며 동정한 균주를 사용하여 섬유소 분해효소 유전자를 분리 한 후 대장균(E. coli)에 도입, 유전자 재조합을 통하여 섬유소 분해효소의 생산능력을 향상시키는 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 토양 내의 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주로부터 셀룰라아제를 얻고 상기 효소 유전자를 외래 숙주에 도입하여 셀룰라아제 생성을 증가시키는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 섬유소 분해효소 생산 균주를 분리, 동정하고 상기 균주가 생산하는 셀룰라아제 유전자를 분리하여 염기서열을 확인함으로써 신규한 염기서열임을 확인하고, 이를 외래 숙주에 도입함으로써 기존 균주보다 셀룰라아제 생산성이 증가됨을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 서열목록 1의 DNA 서열에 의해 코딩되는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3; KACC91344P) 유래 셀룰라아제 단백질을 제공함을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 기재의 셀룰라아제 단백질을 생산하며 하기의 균학적 성질을 갖는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DL-3 균주(KACC 91344p)를 제공함을 특징으로 한다. 상기 균주는 통상적인 바실러스 서브틸리스와 유사하였으며, gyrA 염기서열 분석을 통해 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정하였다. 상기 균주는 검은 무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병의 생물학적 방제 효과를 가지며, 키토산 분해효 소, 키틴 분해효소, 단백질 분해효소를 생산하고, 농업부산물인 왕겨 및 미강을 영양원으로 이용하여 생장가능한 특징이 있다.

본 발명은 서열목록 1의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공함을 특징으로 하며, 상기 재조합벡터의 바람직한 일예는 서열목록 1의 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 연결한 후 결합시켜 제조된, 하기의 개열지도를 갖는 재조합벡터 pTDL-3일 수 있다.

본 발명은 상기의 재조합벡터 pTDL-3의 도입으로 형질전환되어 셀룰라아제 생산능이 증가된 에셰리키아 콜리(E. coli) DL-3 (기탁번호 KACC 91333p)를 제공함을 특징으로 한다.

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DL-3 유래 셀룰라아제 단백질 및 이의 형질전환된 에셰리키아 콜리 DL-3 균주에 관한 것으로, 섬유소 분해 활성이 뛰어난 셀룰라아제 유전자를 대장균(E.coli)을 이용한 유전자 재조합을 통해서 기존 균주보다 생산성 및 효율성을 증대시킬 수 있는 바, 곡류가공, 생물자원으로부터의 에탄올 발효, 주류 생산, 폐기물 처리 및 세탁이나 주방용 세제에 대량 사용되는 셀룰라아제를 경제성 있는 생산 비용으로 대량생산이 가능하게 한 뛰어난 효과가 있다.

이하 본 발명에서 구체적인 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 섬유소 분해효소(셀룰라아제) 생산 균주를 분리하고 동정하는 실시예 1, 상기 균주로부터 셀룰라아제 유전자를 분리하고, 염기서열을 분석하는 실시예 2, 상기 셀룰라아제의 최적조건을 확립하는 실험예 1, 2 및 3, 상기 셀룰라아제를 대장균에 도입하는 실시예 3, 상기 형질전환된 대장균의 셀룰라아제 활성을 측정하는 실험예 4로 구성되어 있다.

실시예 1 : 섬유소 분해효소 생산 균주의 분리, 동정 및 배양

섬유소 분해효소 생산 균주의 분리

토양에서 채취한 일정한 양의 흙을 멸균된 생리식염수 (0.85% 염화나트륨)에 적당히 희석한 후 NB(nutrient broth) 아가를 사용하여 배양하면서 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물을 풀루란 액체배지(Pullulan broth)에 한 백금니 접종하고 37℃에서 200rpm으로 24시간 동안 배양하여 종균 배양액을 제조하였으며, 상기 종균 배양액을 전기 배지(2%(w/v) 글루코스, 0.25% 효모추출물, 0.1% 염화나트륨, 0.5% 인산수소칼륨(K₂HPO₄), 0.02% 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 및 0.06% 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)pH 6.8 으로 조정한 배지조성)에 5%(v/v)로 접종하고, 37℃에서 200rpm으로 3일 동안 배양하였다. 상기 배양액을 6000 rpm 범위에서 10분 동 안 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 섬유소 분해시험에 사용하였다.

상기 상등액 40μL를 직경 1.0cm의 페이퍼 디스크에 점적한 후, 건조하였다. 상기 페이퍼 디스크를 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose; CMC)를 2.0%(w/v) 첨가한 한천배지위에 올려놓고 37℃에서 3일간 배양한 후 카르복시메틸셀룰로오스를 분해하여 생성된 저지원의 크기로 섬유소 분해효소의 생산성을 비교하였다. 비교 결과 섬유소 분해효소의 생산성이 가장 우수한 균주를 선발하였다.

섬유소 분해효소 생산 균주의 동정

상기 선발된 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 및 자이레이즈(자이라제;gyrase) A의 염기서열을 부분적으로 결정하였으며, 이를 도 1 및 도 2에 나타내었고, 서열목록 1 및 2에 각각 첨부하였다.

16s rDNA 염기서열 분석에는 27F(5'-AGA GTT-TGA TCM TGG CTC AG-3')과 1522R(5'-AAG GAG GTG WTC CAR CC-3')를 프라이머로 사용하고, 다음과 같은 조건하에서 PCR을 수행하여 16s rDNA 유전자를 증폭하였다. PCR 반응조건은 94℃, 3분 → [94℃,30초 → 50℃,30초,→ 72℃,5분] 30회 → post-elongation : 72℃, 10분이었다.

자이레이즈 A(gyrase A) 염기서열 분석에는 p-gyrA-f(5'- CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT - 3') 및 p-gyrA-r(5'- CAA GCA AAT GCG GCT CCA GGC ATT GCT -3')을 프라이머로 사용하고 다음과 같은 조건하에서 PCR을 수행하고 gyrase A 유 전자를 증폭하였다. PCR 반응조건은 94℃, 3분 → [94℃,30초 → 50℃,30초,→ 72℃,5분] 30회 → post-elongation : 72℃, 10분이었다

Genbank상의 데이터 베이스에 보고된 균주들과 염기서열을 비교하는 방법으로 동정한 결과, 세균의 일종인 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 임을 확인하고 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3)으로 명명하였으며, 이를 한국농용미생물보존센터(기탁기관)에 2008.1.9일에 기탁하고 기탁번호 KACC 91344p를 받았다.

바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3) 균주(KACC 91344p)의 16S rDNA 염기서열과 자이레이즈 A 염기서열을 PCR을 통해서 증폭하여 Genbank의 데이터베이스를 통하여 다른 종들과 유전적 연관을 조사하였다.

균주의 16s rDNA의 부분적 염기서열 분석 결과 바실러스 애트로패우스(Bacillus atrophaeus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 발리스몰티스(B. vallimortis)등의 바실러스(Bacillus)속의 다른 종들과 99% 이상의 높은 상동성을 나타내었다. 최종적으로 99.95%의 확률로 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)로 판명되었다.

자이레이즈 A(gyrase A) 염기서열은 바실러스 모자벤시스(B. mojavensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ), 바실러스 발리스몰티스(B. vallimortis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis)와 각각 84.10%, 82.84%, 81.49%, 78.25%의 상동성을 나타내었다. 유전자의 부분적인 염기서열을 바 탕으로 분석한 다른 종의 균주들과의 유사성을 계통도로 표시하면 도 3과 같다. 염기서열을 통해 분석되어진 이 균주의 균학적 성질으로는 통상적인 바실러스 서브틸리스와 유사하였으며, gyrA 염기서열을 통해 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)으로 동정하였다. 이 균주는 검은 무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병의 생물학적방제 효과를 가지며, 키토산 분해효소, 키틴 분해효소, 단백질 분해효소를 생산하고, 농업부산물인 왕겨 및 미강을 영양원으로 이용하여 생장함을 확인하였다.

실시예 2 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주로부터의 섬유소 분해효소(셀룰라아제)의 분리 및 염기서열 분석

본 발명에서 선별된 균주의 섬유소 분해효소 유전자를 클로닝 하기 위해서 GenBank로부터 알려진 바실러스 유래 유전자를 바탕으로 제작한 프라이머(p1 5'-ATG AAA CGG TCA ATT TCT ATT TT-3', p2 5'-CTA ATT GGG TTC TGR RCC CAA AT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 초기 변성 단계는 95℃ 1분을 시작으로 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분을 30 cycle 수행하고 최종 72℃ 에 10분간 신장 단계를 수행하였다.

PCR을 통하여 1.5kb 크기의 유전자를 얻을 수 있었다. 상기 유전자의 염기서열 분석을 위하여 pGEM T-easy vector (프로메가사, USA)에 결합(ligation)시켜 수행하였다. 상기 유전자 클로닝 벡터로 사용한 pGEM T-easy vector (프로메가사, USA)는 도 4에 나타내었으며, DNA 염기서열의 분석을 위하여 통상적으로 사용되는 벡터이다. 전형적인 벡터가 주로 원형 형태의 플라스미드인데 반해 pGEM T-easy vector는 직선형이며, 직선형 DNA의 양 끝에 overhang(DNA가 2가닥인데 한가닥만 튀어나와 있다는 의미)으로 T서열을 가지고 있으며 PCR 결과물을 pGEN T-easy vector와 연결하여 원형 형태로 만들어준 후에 대장균에 재조합 하는 원리이다.

DNA sequencer를 이용하여 상기 섬유소 분해효소 유전자의 염기서열을 분석하였다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3의 섬유소 분해효소 유전자의 아미노산 서열은 도 5에 나타내었으며, 서열목록 3에 첨부하였다.

상기 섬유소 분해효소(셀룰라아제)의 분석 결과 499개의 아미노산을 암호화 하고 있는 1500bp의 뉴클레오타이드로 구성되어 있으며, 그 분자량은 55,059 Da 인 것을 확인 할 수 있었다. 아미노산 염기 서열을 GenBank에 등록되어 있는 다른 바실러스 속 계열의 다른 섬유소 분해효소들과 상동성을 조사한 결과, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 UMAS1002 (NCBI-gi:19850856), 바실러스 아밀로리퀘페이션스 FZB42 (gi:42491093)과 바실러스 서브틸리스 DLG (gi:143007)과 91%의 상동성을 보였다.

실험예 1 : 온도에 따른 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 유래 셀룰라아제의 활성 측정

바실러스 아밀로페이션스 DL-3 균주가 생산하는 섬유소 분해효소를 분리 정제하기 위하여 균체를 제거한 배양액에 황산암모늄을 처리하여 단백질을 농축한 후 에 투석을 통하여 염 성분을 제거 하였다. 염 성분을 제거한 시료를 HiTrap^TMQXL 와 Mono Q HR 5/5 (Ion -exchange chromotography)를 사용하여 섬유소 분해효소를 분리하였다. 분리정제하여 동결건조 된 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 를 이용하여 아래와 같은 특성을 분석하였다.

최적 반응온도 측정

실시예 2의 셀룰라아제의 최적 반응온도를 구하기 위하여 완충용액(50mM Tris-HCl buffer pH 8.0)에 녹인 셀룰라아제 상등액 0.5mL을 취하고 1%(w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 용액 0.5mL을 첨가한 후, 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 및 90℃에서 1시간 반응시키고, 반응액에 존재하는 환원당을 DNS 방법으로 측정하여 온도에 따른 셀룰라아제의 활성을 검토하였다. 실험 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 50℃가 다른 온도에 비하여 월등히 높은 상대 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

온도 안정성 측정

셀룰라아제의 온도에 대한 안정성은 완충용액(50mM Tris-HCl buffer pH 8.0)에 녹인 셀룰라아제를 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 및 90℃에 보관하면서 각각 1,3,5,7,10 및 20시간 보관한 후 일정한 양의 셀룰라아제를 기질에 첨가하여 활성을 측정 및 비교하였다. 셀룰라아제의 활성은 카르복시메틸 셀룰 로오스를 기질로 사용하여 측정하였다. 측정방법은 0.5mL의 상등액과 0.5mL의 1.0% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 혼합하여 50℃에서 20분간 반응한 후, 생성된 환원당을 DNS 방법에 의하여 측정하였다.

실험 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 50-70℃까지의 온도에서 상대 활성이 80%이상을 나타내었으며, 20-30℃에서는 상대활성이 40%로 낮아짐을 관찰 할 수 있었다.

실험예 2 : pH 에 따른 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL -3 유래 셀룰라아제의 활성 측정

최적 pH 측정

상기 셀룰라아제의 최적 pH를 구하기 위하여 완충용액(50mM Tris-HCl buffer pH 8.0)에 녹인 셀룰라아제를 0.5mL 첨가한 후 0.5mL의 1.0% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 혼합하여 50℃에서 1시간동안 반응시킨 후 반응액에 존재하는 환원당을 DNS로 측정하여 셀룰라아제의 pH에 따른 활성을 검토하였다. 각 버퍼로는 시트레이트 버퍼(Citrate buffer; pH 3.0-6.0), 소디움 포스페이트 버퍼(Sodium phosphate buffer; pH 6.0-7.6), 트리스-염산 버퍼(Tris-HCl buffer; pH 7.5-9.0), 글리신-수산화나트륨 버퍼(Glycine-NaOH buffer; pH 9.0-11.0)를 사용하였다.

측정결과 도 8에 나타낸 바와 같이, pH 5에서 가장 활성이 높았으며 pH 7.0-8.0에서 약 70% 정도의 활성을 나타내었다.

pH 안정성 측정

셀룰라아제의 pH에 대한 안정성은 각각의 pH 3-11 완충용액에 녹인 셀룰라아제를 기질에 첨가하여 50℃, 60분간 반응을 시킨 후 셀룰라아제 활성을 측정하였다. 셀룰라아제 활성은 카르복시메틸 셀룰로오스를 기질로 사용하여 측정하였다. 측정방법은 0.5mL의 상등액과 0.5mL의 1.0% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 혼합하여 50℃에서 20분간 반응한 후, 생성된 환원당을 DNS 방법에 의하여 측정하였다.

실험 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, pH 6-9 사이의 pH에서 안정함을 확인 할 수 있었다.

실험예 3 : 금속이온에 따른 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL -3 유래 셀룰라아제의 활성 측정

여러 가지 금속 이온들이 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3이 생산하는 셀룰라아제에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 금속 이온으로는 염화칼슘(CaCl₂)_,염화코발트(CoCl₂)_,염화칼륨(KCl), 염화망간(MnCl₂)_,염화니켈(NiCl₂)_,염화수은(HgCl₂)_,N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide), EDTA의 다양한 금속 이온을 실험에 이용하였다.

상기 화합물은 시그마(Sigma)사에서 구입한 분석용 등급(analytical grade)을 사용하였다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 배양 상등액 0.5mL와 0.5mL의 1.0% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 혼합한 후 각 금속 이온들을 5mM 첨가하여 50℃에서 60분간 반응한 후, 생성된 환원당을 DNS 방법에 의하여 측정하였다. 측정결과는 하기의 표 1에 나타내었다.

바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 유래 셀룰라아제의 금속이온 및 시약에 따른 상대활성도(%)

화합물명 (최종농도 5mM)	상대 활성(%)
대조군	100
염화칼슘(CaCl₂)	119
염화코발트(CoCl₂)	29
염화칼륨(KCl)	98
염화망간MnCl₂)	58
염화니켈(NiCl₂)	59
염화수은(HgCl₂)	1
N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)	44
EDTA	20

표 1에 나타낸 바와 같이, Ca² ⁺의 경우 119% 증가됨을 확인 하였고 Hg² ⁺, Ni² ⁺, Co² ⁺ 그리고 EDTA와 같은 효소들은 섬유소 분해 효소에 강력한 저해제로 작용하는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 3 : 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL -3 유래 셀룰라아제의 외래숙주로의 도입

재조합벡터로의 도입

바실러스 아밀로페이션스 DL-3의 셀룰라아제 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 연결한 후 리가아제(ligase)를 이용하여 결합(ligation)시켰다. 상기 재조합 벡터를 pTDL-3라 명명하였고, 상기 벡터는 도 10에 나타난 것과 같은 개열지도(cleavage map)를 지니고 있다.

이종숙주( 에셰리키아 콜리 )로의 도입

상기 pTDL-3 벡터를 에셰리키아 콜리 JM109(Escherichia coli JM109)로 도입하는 실험을 수행하였다. 상기 대장균 JM109는 널리 이용되고 있는 균주로 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 상기 pTDL-3가 도입되어 형질변환된 균주를 에셰리키아 콜리 DL-3(Escherichia coli DL-3)로 명명하고 2007년 11월 O7일 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KACC 91333p를 얻었다.

실험예 4 : 유전자 재조합균인 에셰리키아 콜리 DL -3 (E. coli DL -3)의 섬유소 분해효소 생산성 측정

아밀로리퀘페이션스 DL-3와 상기 유전자 재조합 균인 에셰리키아 콜리 DL-3를 동일한 조건으로 종균배양을 한 후 셀룰라아제 생산배지에 각각 5% 종균배양액을 첨가하였다. 이 때 배지조성은 탄소원으로 각각 2%(w/v) 포도당(glucose), 미강(rice bran), 왕겨(rice hull)을 사용하고 질소원으로 0.25% 효모 추출물, 무기염으로 0.1% 염화나트륨, 0.5% 인산이칼륨(K₂HPO₄), 0.02% 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 및 0.06% 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 첨가하였다. 37℃에서 200 rpm 으로 3일간 배양을 한 후 셀룰라아제의 활성을 확인하였다.

실험 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, 유전자 재조합을 한 균 pTDL-3/JM109이 탄소원으로 미강(rice bran)을 사용했을 때 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 재조합균은 아밀로리퀘페이션스 DL-3보다 우수하게 탄소원을 분해시킬 수 있으며, 이는 곡류가공, 생물자원으로부터의 에탄올 발효, 주류 생산, 폐기물 처리 및 세탁이나 주방용 세제에 대량 사용되는 셀룰라아제를 경제성 있는 생산 비용으로 대량생산할 수 있음을 보여준다.

도 1은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3) 균주의 16S rDNA 염기서열을 부분적으로 결정한 염기서열이다.

도 2는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주의 가이레이즈 A(gyrase A) 유전자의 염기서열을 부분적인 결정한 염기서열이다.

도 3은 자이레이즈 A(gyrase A) 유전자의 염기서열을 부분적인 결정한 것을 바탕으로 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주와 다른 균주들 간의 계통수를 도식화한 것이다.

도 4는 pGEM T-easy 벡터의 지도를 나타낸 것이다.

도 5는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3의 섬유소 분해효소 유전자와 그에 따른 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 6은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3가 생산하는 섬유소 분해효소 활성에 온도가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 7은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3가 생산하는 섬유소 분해효소 활성의 온도 안정성에 관한 그래프이다.

도 8은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3가 생산하는 섬유소 분해효소 활성에 pH가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 9는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3가 생산하는 섬유소 분해효소 활성의 pH 안정성에 관한 그래프이다.

도 10은 재조합벡터 pTDL-3의 그림이다.

도 11은 탄소원을 글루코스로 하여 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3와 유전자 재조합 된 pTDL-3/JM109(E. coli DL-3)균이 생산하는 섬유소 분해효소 활성 비교에 관한 그래프이다.

도 12는 탄소원을 미강으로 하여 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3와 유전자 재조합 된 pTDL-3/JM109(E.coli DL-3)균이 생산하는 섬유소 분해효소 활성 비교에 관한 그래프이다.

도 13은 탄소원을 왕겨로 하여 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3와 유전자 재조합 된 pTDL-3/JM109(E.coli DL-3)균이 생산하는 섬유소 분해효소 활성 비교에 관한 그래프이다.

<110> Dong-A University Research Foundation for Industry-Academy Cooperation <120> Cellulase protein derived from Bacillus amyloliquefaciens DL-3 and transformed Escherichia coli DL-3 strain thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 814 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60 ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120 ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180 cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240 caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420 agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540 gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600 gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720 aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggt 814 <210> 2 <211> 959 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 tatgcaatga gcgttatcgt atcccgggcg cttccggatg tgcgtgacgg tctgaagccg 60 gttcacagac ggattttgta cgcaatgaat gatttaggca tgaccagtga caaaccatat 120 aaaaaatctg cccgtatcgt cggtgaagtt atcggtaagt accacccgca cggtgactca 180 gcggtttacg aatcaatggt cagaatggcg caggatttta actaccgcta catgcttgtt 240 gacggacacg gcaacttcgg ttcggttgac ggcgactcag cggccgcgat gcgttacaca 300 gaagcgagaa tgtcaaaaat cgcaatggaa attctgcgtg acattacgaa agacacgatt 360 gactatcaag ataactatga cggttcagaa agagagcctg ccgtcatgcc ttcgagattt 420 ccgaatctgc tcgtaaacgg ggctgccggt attgcggtcg gaatggcgac aaacattccc 480 ccgcatcagc ttggggaagt cattgaaggc gtgcttgccg taagtgagaa tcctgagatt 540 acaaaccagg agctgatgga atacatcccg ggcccggatt ttccgactgc aggtcagatt 600 ttgggccgga gcggcatccg caaggcatat gaatccggac ggggatcaat cacgatccgg 660 gctaaggctg aaatcgaaga gacttcatcg ggaaaagaaa gaattattgt cacggaactt 720 ccttatcagg tgaacaaagc gagattaatt gaaaaaatcg cggatcttgt ccgagacaaa 780 aaaatcgaag gaattaccga tctgcgagac gaatccgacc gtaacggaat gagaatcgtc 840 attgagatcc gccgtgacgc caatgctcac gtcattttga ataacctgta caaacaaacg 900 gccctgcaga cgtctttcgg aatcaatctg ctggcgctcg ttgacggaca gccgaaggt 959 <210> 3 <211> 1500 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 atgaaacggt caatttctat ttttattacg tgtttattga ttgcggtatt gacaatgggc 60 ggcttgctgc cttcgccggg atcagcagca gggacaaaaa cgccagcagc caagaatggg 120 cagcttagca taaaaggaac acagctcgta aaccgggacg gcaaagcggt acaattgaaa 180 gggatcagtt cacatggatt gcagtggtat ggcgattttg tcaataaaga cagcttaaaa 240 tggctgagag acgattgggg cataaccgtt ttccgcgcgg cgatgtatac ggcagatggc 300 ggttatattg ataatccgtc cgtgaaaaat aaagtaaaag aagcggttga agcggcaaaa 360 gaactcggga tatatgtcat cattgactgg catatcttaa atgacggcaa cccaaaccaa 420 cataaagaga aggcaaaaga attttttaag gaaatgtcaa gtctttacgg aaacacgcca 480 aacgtcattt atgaaattgc aaacgaacca aacggtgatg tgaactggaa gcgtgatatt 540 aaaccgtatg cggaagaagt gatttccgtt atccgcaaaa atgatccaga caacatcatc 600 attgtcggaa ccggtacatg gagccaagat gtgaatgatg cagccgatga tcagctaaaa 660 gatgcaaacg tcatgtacgc gcttcatttt tatgccggca cacacggcca atctttacgg 720 gataaagcaa actatgcact cagtaaagga gcgcctattt tcgtgacgga atggggaaca 780 agcgacgcgt ctggaaatgg cggtgtattc cttgaccagt cgcgggaatg gctgaattat 840 ctcgacagca agaacatcag ctgggagaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 900 tcagcgttaa agccgggagc atctaaaaca ggcggctggc cgcttacaga tttaactgct 960 tcaggaacat tcgtaagaga aaacattctc ggcaacaaag attcaacgaa agaacgccct 1020 gaaacgccag cacaagataa ccccgcacag gaaaacggca tttctgtaca atacaaagca 1080 ggggatgggg gtgttaacag caaccaaatc cgcccgcagc ttcacataaa aaataacggc 1140 aatgcgacgg ttgatttaaa agatgtcact gcccgttact ggtataacgc gaaaaacaag 1200 ggccaaaact ttgactgtga ctacgcgcag attggatgcg gcaatctgac ccacaaattt 1260 gtgacgctgc ataaacccaa gcaaggtgca gatacctatc tggaactggg ttttaaaaca 1320 ggaacgctgt caccgggagc aagcacaggg aatattcagc ttcgtcttca caatgatgac 1380 tggagtagtt atgcacaaag cggcgattat tccttttttc aatcaaatac gtttaaaaca 1440 acgaaaaaaa ttacattata tcatcaagga aaactgattt ggggaacaga accccattag 1500 1500

Claims

서열목록 1의 DNA 서열에 의해 코딩되는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 (Bacillus amyloliquefaciens DL-3; KACC 91344P) 유래 셀룰라아제 단백질.
청구항 1항 기재의 셀룰라아제 단백질을 생산하며 하기의 균학적 성질을 갖는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 DL-3 균주(KACC 91344P)

(a) 검은 무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병에 대한 생물학적 방제효과;

(b) 키토산 분해효소, 키틴 분해효소, 단백질 분해효소 생산;

(c) 왕겨 또는 미강을 영양원으로 이용하여 생장;
서열목록 1의 유전자를 p-TGEM T-easy 벡터에 연결한 후 결합시켜 제조되어 제 10도에 기재된 개열지도를 갖으며, 에셰리키아 콜리(E.coli)의 셀룰라아제 발현용 재조합벡터 pTDL-3.
제 3항 기재의 재조합벡터 pTDL-3의 도입으로 형질전환되어 셀룰라아제 생산 능이 증가된 에셰리키아 콜리 DL-3 (E. coli; KACC 91333P).