CN111386341B - 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法 - Google Patents

用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111386341B
CN111386341B CN201880051486.8A CN201880051486A CN111386341B CN 111386341 B CN111386341 B CN 111386341B CN 201880051486 A CN201880051486 A CN 201880051486A CN 111386341 B CN111386341 B CN 111386341B
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium thermocellum
xylanase
mutant
producing
carbon source
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880051486.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111386341A (zh
Inventor
C·塔查帕空
K·叻他那卡诺克猜
P·帕索尼
R·瓦努库
P·革博特
W·塔恰纳
K·吉滴苏里杨
N·凯秀万
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PTT Global Chemical PCL
Original Assignee
PTT Global Chemical PCL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from TH1701003165A external-priority patent/TH1701003165A/th
Application filed by PTT Global Chemical PCL filed Critical PTT Global Chemical PCL
Publication of CN111386341A publication Critical patent/CN111386341A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111386341B publication Critical patent/CN111386341B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的突变株热纤梭菌M2_15‑C8(Clostridium thermocellum M2_15‑C8)和所述细菌的一种基因修饰方法，其中，本发明所述的突变株比野生型能产生更多的纤维素酶和木聚糖酶。而且，所获得的酶能用于消化预处理的甘蔗渣以进一步有效地产生糖。

Description

用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备 方法
技术领域
生物技术涉及用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)及其制备方法。
背景技术
目前，从木质纤维素生物质生产生物燃料和基础化学品作为石油产品的替代越来越引起人们的兴趣，因为有效的生物精炼工业(biorefinery industrials)是燃料、化学品、材料和来自生物质化学组成成分的能源的整合，包括来自接近零废物处理过程的它们的副产品，以最大化原材料的价值。这在技术和经济两方面都是非常有趣的方式。因此，在通过合适的生物和化学过程生产生物燃料中的糖化过程引起了更多的兴趣。
木质纤维素生物质包含三个主要组成部分：纤维素、半纤维素和排列复杂而牢固的木质素。因此，需要木质纤维素生物质的预处理过程来破坏木质素结构以产生可消化的生物质。
生物质的酶糖化是在生产燃料和其他生化物质的过程中，为了从生物质中生产糖而获得许多利益的消化过程之一，因为该过程需要较少的极端化学品、温度或能量，在催化中不需要辅因子或其他金属。因此，生物质的酶糖化引起了许多兴趣。
糖化过程使用2个主要的酶组：纤维素酶组和半纤维素酶组。纤维素酶组包含3种类型的酶：1)内切葡聚糖酶，2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶，以及3)β-葡萄糖苷酶，可将纤维素消化为葡萄糖。半纤维素酶组包括木聚糖内切酶和β-木糖苷酶，它们消化作为半纤维素的主要成分的木聚糖。此外，还有其他消化半纤维素的酶，例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和β-甘露聚糖酶。
纤维素酶和半纤维素酶的协同作用是有效糖化过程中的重要因素。这些酶可以分为两种主要形式：游离酶和含有几种酶的纤维小体(cellulosome)。纤维小体可由厌氧微生物产生，例如热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)、约氏梭菌(Clostridium josui)和解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)。
目前，有几种改进微生物菌株的方法，例如突变体诱导、重组和基因克隆等。使用紫外线(UV)辐射诱导生物体突变是一种改良菌株的流行方法，因为它既简单又高效。在利用紫外线辐射改善微生物菌株以提高蛋白质或酶的生产率或提高微生物的性能方面，存在一些专利文献和报道。
CN 103409347公开了修饰的菌株嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)CGMCCNo.7545，以提高可耐受碱性条件的蛋白酶的生产性能。获得的菌株是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ap180。所述菌株可以产生能够耐受超过8,000单位/mL的碱性条件的蛋白酶，并且在碱性条件下具有比原始菌株更好的稳定性。
CN 104630084和CN 104630180公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC7926菌株的修饰，该菌株可以通过紫外线修饰产生良好的耐受热的淀粉酶，从而使该菌株耐受酸、热，并产生可以应用于多种应用的更多的酶。
RU0002564127公开了使用紫外线对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行基因修饰，该该菌是一种益生菌，并且能产生必需的氨基酸，应用在动物饲料工业中很好地提高其消化系统胆汁酸中的稳定性。
此外，CN101531972公开了对琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593菌株使用紫外线进行改良，产生的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)CGMCC 2653菌株比原始菌株可产生更多的琥珀酸，并且对钠离子的耐受性更好。
WO2012/088467A2公开了利用重组法对热纤梭菌菌株进行改良以生产木糖。
然而，酶糖化过程的一个问题是由微生物生产酶的高成本。已经尝试研究和开发能够产生大量酶的微生物。由于上述原因，能够大量生产纤维素酶和木聚糖酶的微生物可用于大规模工业中，以应用酶从农业原料生产糖。
而且，根据以上公开的信息，尚未对热纤梭菌(Clostridium thermocellum)进行基因修饰，以产生更高的纤维素酶和木聚糖酶。因此，本发明的目的是通过紫外光诱导制备突变株热纤梭菌，使该菌株能够产生大量的纤维素酶和木聚糖酶。
发明内容
本发明涉及一种新的突变株热纤梭菌M2_15-C8(Clostridium thermocellum M2_15-C8)和所述细菌的基因修饰方法，其中所述新型突变株以保藏登录号NITE BP-02390保藏在日本国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NITE Patent MicroorganismsDepositary，NPMD)。
所述突变株热纤梭菌可以产生纤维素酶和木聚糖酶，可用于消化预处理的蔗渣(bagasse)以进一步有效地产生糖分。
附图说明
图1显示了野生型热纤梭菌KK8.3菌株和基因修饰的菌株的培养基管中微生物和剩余纤维素粉末的生长特征。
图2显示了接种后直至第10代，修饰的菌株热纤梭菌M2_15-C8产生纤维素酶和木聚糖酶的稳定性。
图3显示了野生型热纤梭菌菌株和基因修饰的M2_15-C8菌株的培养基管中微生物和剩余纤维素粉末的生长特征。
图4显示了由野生型热纤梭菌菌株和基因修饰的M2_15-C8菌株产生的蛋白质和酶的特征：A)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)技术测试的蛋白质特性；B)通过酶谱技术(zymogram technique)测试的纤维素酶特性；C)通过酶谱技术测试的木聚糖酶特性，其中M表示分子量已知的标准蛋白质，且kDa表示千道尔顿。
图5显示了不同方法处理的从甘蔗渣消化的葡萄糖含量，所述方法使用来自突变株热纤梭菌M2_15-C8的酶。
具体实施方式
定义
除非另有说明，否则本文使用的技术术语或科学术语具有本领域普通技术人员理解的定义。
本文提及的任何工具、设备、方法或化学物质是指本领域技术人员通常操作或使用的工具、设备、方法或化学物质，除非另外说明它们是特定用于本发明的工具、设备、方法或化学物质。
权利要求或说明书中单数名词或单数代词与“包含”一同使用是指“一个”以及“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。
在本发明中公开和要求保护的所有组合物和/或方法旨在涵盖来自任何行为、性能、修改或调整的实施方案，而不进行与本发明显著不同的实验，以根据本领域普通技术人员获得与本实施方案相同的结果，即使在权利要求中没有具体说明。因此，本实施方案的可替代或相似的客体，包括本领域普通技术人员显而易见的任何小的修改或调整，都应被认为是所附属权利要求中所显示的本发明的精神、范围和概念的其余部分。
在整个申请中，术语“约”用于表示在本文中提出或显示的任何数值可能会变化或有偏差。这种变化或偏差可能是由设备、方法或使用所述设备或方法的个人的误差引起的。
以下，所示出的本发明实施方案无任何意图限制本发明的范围。
本发明涉及热纤梭菌M2_15-C8菌株(Clostridium thermocellum M2_15-C8strain)，其通过紫外光诱导进行基因修饰，以产生能生产大量纤维素酶和木聚糖酶的新菌株，包括基因修饰的方法和所得酶在生物质糖化中的应用。
本发明的热纤梭菌M2_15-C8按布达佩斯条约的规定保存在日本的，国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NPMD)，其中所述菌株于2016年12月19日保藏，保藏登录号为NITE BP-02390。
本发明中使用的术语“培养”是指包括液体培养或固体培养，但不限于所述方法，只要能够培养根据本发明的菌株即可。
术语“糖化”表示生物质中纤维素和/或半纤维素的糖化为寡糖、二糖、单糖或它们的混合物。同样，生物质的糖化包括通过纤维素酶和/或半纤维素酶水解多糖的糖苷键。
在一实施例中，突变株热纤梭菌是由紫外线诱导的野生型热纤梭菌的基因修饰产生的，其中所述突变株是热纤梭菌M2_15-C8。
在本发明的一方面，获得突变株热纤梭菌的基因修饰方法可以这样操作：通过每平方厘米40至100微瓦(microwatt)强度的紫外线辐射作用于浓度为每克碳源0.1至1.0克的野生型梭热纤梭菌，持续时间为10至120分钟。
优选地，上述基因修饰方法可以通过以每平方厘米40至80微瓦的紫外线辐射强度对野生型热纤梭菌作用15至60分钟来操作。
在本发明的一方面，为了获得突变株热纤梭菌的基因修饰方法在厌氧条件(anaerobic condition)下操作。
在本发明的一方面，为了获得突变株热纤梭菌的基因修饰方法被操作两次。
在本发明的一方面，通过上述方法获得的突变株热纤梭菌M2_15-C8具有与纤维素酶和木聚糖酶组(cellulase and xylanase groups)的产生有关的相关基因的核苷酸序列，以及与向细胞外转运蛋白和酶有关的蛋白，其与原始不同的基因编码为：111、220、419、427、442、453、850、1252、1257、1305、1456、1529、1884、1902、2246、2479、2611、2654、2701、2854和2875。
在本发明的一方面，用于基因修饰过程的细菌的培养可以通过在厌氧条件下，温度范围为55至65℃，优选为60℃的条件下，在碳源浓度为0.5–1.0％(w/v)的基础培养基中持续24–96小时培养细菌来进行。
在本发明的一方面，碳源选自但不限于纤维素粉、稻草、甘蔗渣，或它们的混合物。优选地，碳源是纤维素粉末。
在本发明的一方面，通过添加二氧化碳气体除去制备好的培养基中的空气，并在接种前在约110–130℃温度下，10–20磅每平方英寸(psi)的压力下灭菌15–20分钟。
在本发明的一方面，可以通过以下步骤来进行基因修饰细菌的分离：1)在上述条件下在基础培养基中培养基因修饰的细菌；2)稀释培养的基因修饰的细菌；3)将稀释的基因修饰的细菌转移到含有纤维素粉作为碳源的基础琼脂培养基中，然后应用滚管法在约60℃的温度下孵育大约24–48小时；和4)分离目标菌落，其中根据上述培养方法对分离的突变株热纤梭菌M2_15-C8进行进一步培养，以进一步产生酶。
在本发明的一方面，从突变株热纤梭菌M2_15-C8生产纤维素酶和木聚糖酶的方法可以通过在含有碳源的培养基中培养突变株热纤梭菌M2_15-C8来进行。细菌与碳源的比例范围为0.1-1.0g细菌相对于每g碳源在55–65℃温度范围内24–96小时。
优选地，细菌与碳源的比例范围为0.2–0.5g细菌相对于每g碳源。
优选地，用于酶生产的突变株热纤梭菌M2_15-C8的培养操作温度为60℃。
优选地，用于酶生产的突变株热纤梭菌M2_15-C8的合适的培养时间在48至72小时的范围内。最优选地，合适的培养时间为72小时。
在本发明的一方面，培养基中的碳源浓度范围为1-3％(w/v)。
在本发明的一方面，用于生产酶的突变株热纤梭菌M2_15-C8的培养过程在厌氧条件下运行。
在本发明的一方面，用于产生酶的突变株热纤梭菌M2_15-C8的培养过程选自但不限于稻草、甘蔗渣以及稻草和甘蔗渣的混合物。优选地，所使用的碳源是甘蔗渣。
在本发明的一方面，可以通过本领域普通技术人员已知的一般分离方法，例如离心、过滤或相关方法，从含有细菌产生的酶的培养基中分离细菌。含纤维素酶和木聚糖酶的培养液可以直接用作粗酶。
在本发明的一方面，含有纤维素酶和木聚糖酶的培养液可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进一步纯化，其中可以将两种以上的纯化方法一起使用。
在本发明的一方面，由突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的酶包括：1)纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)，例如羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶(avicelase)、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶；以及2)木聚糖降解酶(xylanolytic enzyme)，例如木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶。
在本发明的一方面，由突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的酶可以用于生物质的糖化，其中优选的生物质是甘蔗渣。
在本发明的一方面，用于糖化的生物质可以是湿的和干的两种形式。
在本发明的一方面，用于糖化的生物质可进行预处理工艺，该预处理工艺选自使用碱催化剂进行蒸汽闪爆法(steam explosion，STEX)、有机溶剂分离法(FR)、丙酮中的氢氧化钠法(sodium hydroxide in acetone method，AC)和甲醇中的甲醇钠法(sodiummethoxide in methanol method，MM)的，其中在酶促糖化之前可以使用两种或更多种预处理方法。
在本发明的一方面，由突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的酶可与其他酶一起用作混合酶，以增加生物质的糖化性能。
以下部分仅旨在描述本发明的实施方案，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：紫外线诱导热纤梭菌的基因修饰及产生大量纤维素酶和木聚糖酶的突 变株的选择
基础培养基含0.045％(w/v)的磷酸氢二钾(K2HPO4)和0.045％(w/v)的磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.09％(w/v)硫酸铵((NH4)2SO4)、0.09％(w/v)氯化钠(NaCl)、0.018％(w/v)七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)、0.012％(w/v)氯化钙水合物(CaCl2.2H2O)、0.4％(w/v)碳酸钠(Na2CO3)，在含有约0.5–1.0％(w/v)纤维素粉作为碳源的亨盖特管(Hungate tube)中制备0.4％(w/v)的酵母提取物。然后，通过添加二氧化碳除去所述培养基中的空气，并在约120–125℃的温度、15磅每平方英寸(psi)的压力下灭菌约15–20分钟。野生型热纤梭菌KK8.3在制备好的培养基中培养，并在60℃的温度下孵育保持24-72小时，直到纤维素粉末的消化率超过90％(w/v)。保留获得的细胞用于进一步突变。
将获得的细菌细胞置于紫外线灯下，强度为每平方厘米40–100微瓦，在从10分钟到120分钟的不同持续时间下，离灯的距离为10–30cm。然后，将经辐射的细菌细胞转移到含有0.5–1.0％(w/v)纤维素粉末作为碳源的基础培养基试管中，并于60℃下孵育持续24–48小时。测试获得的上清液的纤维素酶活性和木聚糖酶活性，并计算出与野生型相比增加的酶活性。
从表1中发现，突变株热纤梭菌M1_60能比野生型菌株产生分别高出约2倍和2.5倍的纤维素酶和木聚糖酶。而且，突变株热纤梭菌M1_60具有稳定性，并在10代后仍能保持其生产纤维素酶和木聚糖酶的有效性。
然后，将突变株热纤梭菌M1_60在包含纤维素粉末作为碳源的液体基础培养基中培养，并根据上述条件再次用紫外线进行基因修饰。图1显示了微生物的生长和纤维素粉末的减少比例。测试获得的上清液的纤维素酶活性和木聚糖酶活性，并计算与野生型和M1_60菌株相比增加的酶活性。从表1中发现，突变株热纤梭菌M2_15仍然能够比野生型菌株分别生产高出2倍和2.5倍的纤维素酶和木聚糖酶，并在10代后仍能保持其生产纤维素酶和木聚糖酶的有效性。
表1：野生型热纤梭菌KK8.3和在不同条件下通过紫外线基因修饰的热纤梭菌的纤维素酶活性和木聚糖酶活性比较
为了分离突变株，突变株热纤梭菌M2_15在厌氧条件下稀释。将稀释的细菌按照上述方法转移到含有纤维素粉末作为碳源的基础培养基琼脂中除去空气，并用滚管法在整个管上形成一层薄膜。然后，将获得的培养管在60℃的温度下孵育大约24–48小时。然后，分离单个菌落并在上述条件下在液体基础培养基中培养，并选择能够快速消化纤维素的菌落，从而在相同的培养时间下获得比野生型少的纤维素。
从表2中发现，菌落M2_15-C8能比野生型更快地消化纤维素粉末，并且产生的纤维素酶和木聚糖酶分别比野生型高约2倍和4倍。而且，热纤梭菌M2_15-C8很稳定，并在10代后仍能保持其纤维素酶和木聚糖酶的生产力，如图2所示。
表2：热纤梭菌KK8.3野生型和突变株的纤维素酶和木聚糖酶活性的比较
实施例2：突变株热纤梭菌M2_15-C8的物理特征
将突变株热纤梭菌M2_15-C8的物理特性与热纤梭菌野生型进行了比较。发现该突变株热纤梭菌M2_15-C8的颜色为乳黄色(cream-yellow)，而野生型细菌的颜色为深黄色(strong yellow)，如图3所示。此外，突变株热纤梭菌M2_15-C8的纤维素消化速率比野生型快。该突变株能在48小时内消化在基础培养基中1％(w/v)纤维素粉末的90％以上，而在相同条件下，野生型则耗时超过48小时。
实施例3：野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的蛋白质以及纤维素酶和木聚 糖酶特性的研究
纤维素酶和木聚糖酶是在如上所述的厌氧条件下通过在含有1-3％(w/v)甘蔗渣作为碳源的液态基础培养基中培养野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8，然后在60℃的温度下孵育持续24–72小时而产生的。将获得的上清液在4–10℃的温度下以高于8,000转每分钟(rpm)的速度离心10–20分钟。只有澄清的上清液被通过3-10千道尔顿的膜(Quix Stand系统(Quix Stand Systems)；通用电气生命科学(GE life sciences))过滤以获得浓缩酶用于进一步研究。
从表3中发现，野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的酶包含纤维素分解酶，例如10.21单位/mL羧甲基纤维素酶、2.55单位/mL微晶纤维素酶、4.34单位/mL纤维二糖水解酶和2.30单位/mLβ-葡萄糖苷酶，以及木聚糖分解酶(xylolytic enzyme)，例如36.85单位/mL的木聚糖酶、0.17单位/mLβ-木糖苷酶、0.31单位/mLβ-半乳糖苷酶、0.36单位/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶和0.31单位/mL的乙酰木聚糖酯酶。此外，发现所有突变株产生的酶均高于野生型。特别是，木聚糖酶的产量至少高出4倍，而羧甲基纤维素酶和微晶纤维素酶的产量至少能高出2倍。
图4显示了使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法比较野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的蛋白质特征。结果发现，两种菌株产生的酶在20–250kDa处具有相似的特性，其中包含14种20、22、30、35、45、50、60、70、75、80、100、125、150和250kDa的蛋白质。然而，两种菌株产生的蛋白质强度不同，这表明蛋白质数量不同。图4a显示了突变株热纤梭菌M2_15-C8产生了比野生型更多的30、35、45、50、60、70、100和125kDa蛋白质。
而且，如图4b所示，使用酶谱法比较纤维素酶和木聚糖酶的特征，两种菌株在20–250kDa处的纤维素酶特征相似，但是突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的一些纤维素酶显示出更高的消化活性，例如60、70、75和80kDa处的纤维素酶。从图4c中，在20-250kDa的木聚糖酶中，发现由两种菌株产生的酶是相似的，但是由突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的一些木聚糖酶显示出更高的消化活性，例如，35、45、60、70和75kDa处的木聚糖酶。
表3：野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的纤维素分解酶和木聚糖分解酶的酶活性
实施例4：野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8遗传物质核苷酸序列的比较
野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8的遗传物质核苷酸序列的比较可以通过改进的CTAB方法进行。然后，使用离子个人化操作基因组测序仪(PGM)，通过离子激流测序法(ion torrent sequencing method)搜索约5μg提取的遗传物质进行DNA测序。以热纤梭菌ATCC27405菌株的信息为参考遗传物质，通过生物信息学方法，对获得的野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8的DNA序列进行差异分析。
通过比较野生型和突变株热纤梭菌M2_15-C8的遗传物质，如表4所示，发现纤维素分解酶和木聚糖分解酶至少突变了21个基因，这些酶产生与其细胞外蛋白质和酶的转运相关的基因和蛋白。两个突变区域位于CDS之前的500个碱基处和编码序列(CDS)处。
从表4可以看出，根据CDS之前500个碱基的突变，缺失了基因编码220、427、453、850、1252、1257、1305、1884和1902的核苷酸序列，而基因编码2701的核苷酸序列增加了。这是因为CDS之前的500个碱基包含调节基因、启动子基因和操纵基因。因此，该区域的突变影响蛋白质和酶的不同表达。
此外，根据CDS处的突变，基因编码111、419、442、1456、1529、2246、2479、2611、2654、2854和2875的核苷酸序列缺失。因为CDS是响应蛋白质或酶产生的区域，该区域的突变影响蛋白质和酶的不同表达。
因此，对纤维素分解酶和木聚糖分解酶的产生响应的基因的突变，包括与蛋白质和酶转运至其细胞外有关的蛋白质，影响纤维素分解酶和木聚糖分解酶的不同表达、活性和特征，如实施例3所示。
表4：野生型和突变株热纤梭菌的与纤维素分解酶和木聚糖分解酶的产生有关的基因以及与蛋白质和酶转运至其细胞外有关的蛋白质
表4(续)
实施例5：突变株热纤梭菌M2_15-C8产生的酶在甘蔗渣糖化中的应用
用几种方法预处理甘蔗渣在5.0-10.0％(w/v)的浓度和约6.0至7.0的pH值下糖化，并添加实施例3的突变型热纤梭菌M2_15-C8菌株产生的酶。所述预处理方法例如：1)使用碱催化剂进行蒸汽闪爆法(STEX)；2)有机溶剂分离方法(FR)；3)丙酮中的氢氧化钠法(AC)；和4)甲醇中的甲醇钠法(MM)。酶的浓度约为10–20mg/g甘蔗渣。重组体β-葡萄糖苷酶也以约10-30单位/g甘蔗渣的浓度加入到混合物中。将所得混合物在50-60C的温度下孵育12–48小时。然后，对获得的葡萄糖进行定量分析。结果发现，突变株产生的酶与重组β-葡萄糖苷酶一起能将蒸汽闪爆法预处理的甘蔗渣糖化，并产生超过590mg/g底物的葡萄糖，能将通过以有机溶剂法进行成分分离预处理的甘蔗渣糖化，并产生超过600mg/g底物的葡萄糖，以及能将通过丙酮中氢氧化钠法预处理的甘蔗渣糖化，并产生超过500mg/g底物的葡萄糖。此外，它们能将通过在甲醇中甲醇钠法预处理的蔗渣糖化，并产生超过530mg/g底物的葡萄糖，如图5所示。
本发明的优选实施方案
本发明的优选实施方式如本发明的说明书中所述。

Claims (9)

1.一种利用紫外线诱导基因修饰获得的生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，其中，所述突变株热纤梭菌是热纤梭菌M2_15-C8，保藏登录号为NITE BP-02390。
2.一种纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，所述方法包括在碳源中培养根据权利要求1所述的突变株热纤梭菌的步骤，其中，所述细菌与碳源以0.1至1.0g细菌相对于每g碳源的比例范围在55至65℃的温度范围下24至96小时。
3.根据权利要求2所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中，所述细菌与碳源的比例在0.2至0.5g细菌相对于每g碳源范围内。
4.根据权利要求2所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中所述碳源选自纤维素粉末、稻草、甘蔗渣，或它们的混合物。
5.根据权利要求4所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中所述碳源是甘蔗渣。
6.根据权利要求2所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中，所述方法在60℃的温度下操作。
7.根据权利要求2所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中所述方法在48-72小时的范围内操作。
8.根据权利要求7所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中，所述方法操作72小时。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的纤维素酶和木聚糖酶的生产方法，其中所述方法在厌氧条件下操作。
CN201880051486.8A 2017-06-07 2018-05-30 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法 Active CN111386341B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TH1701003165A TH1701003165A (th) 2017-06-07 "แบคทีเรียดัดแปลงพันธุกรรมสายพันธุ์ (mutant strain) คลอสทริเดียม เทอร์โมเซลลัม (Clostridium thermocellum) สำหรับผลิตเอนไซม์เซลลูเลส และไซลาเนส และวิธีผลิต เอนไซม์ดังกล่าว"
TH1701003165 2017-06-07
PCT/TH2018/000028 WO2018226170A2 (en) 2017-06-07 2018-05-30 Mutant strain clostridium thermocellum for producing cellulase and xylanase and preparation method thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111386341A CN111386341A (zh) 2020-07-07
CN111386341B true CN111386341B (zh) 2023-09-15

Family

ID=64567084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880051486.8A Active CN111386341B (zh) 2017-06-07 2018-05-30 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11236375B2 (zh)
JP (1) JP7019926B2 (zh)
CN (1) CN111386341B (zh)
DE (1) DE112018002933B4 (zh)
SG (1) SG11201911796QA (zh)
WO (1) WO2018226170A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111386341B (zh) * 2017-06-07 2023-09-15 Ptt全球化学公共有限公司 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法
CN110540982B (zh) * 2019-09-30 2021-11-02 江南大学 一种提高梭热杆菌纤维素酶酶活的发酵方法
CN111848757B (zh) * 2020-07-27 2022-03-04 齐鲁工业大学 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用
CN114807067A (zh) * 2022-03-31 2022-07-29 苏州聚维元创生物科技有限公司 一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方法与应用
CN114854655B (zh) * 2022-04-22 2023-10-24 苏州聚维元创生物科技有限公司 一种可以高效分泌木聚糖酶的工程菌株、构建方法与应用
CN116200286B (zh) * 2022-07-07 2024-02-27 哈尔滨工业大学 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010051295A (ja) * 2008-08-30 2010-03-11 Japan International Research Center For Agricultural Services クロストリジウム属菌並びにセルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法
WO2012153189A2 (pt) * 2011-05-11 2012-11-15 Cetrel S.A. Processo e sistema de produção de biogás a partir da digestão anaeróbia de biomassa vegetal em fase sólida
CN103429751A (zh) * 2010-12-22 2013-12-04 马斯科马公司 经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌
JP2016208852A (ja) * 2015-04-30 2016-12-15 味の素株式会社 脂肪酸を生成する緑藻改変株

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6229974A (ja) * 1985-07-30 1987-02-07 Kubota Ltd キシラナ−ゼ及びその製造法
JP5881234B2 (ja) 2010-07-14 2016-03-09 東レ株式会社 変異型βグルコシダーゼ、バイオマス分解用酵素組成物および糖液の製造方法
DK2782998T3 (en) * 2011-11-22 2018-04-16 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH BETA-XYLOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2014007189A1 (ja) 2012-07-03 2014-01-09 東レ株式会社 糖液の製造方法
JP2017035001A (ja) 2013-11-19 2017-02-16 花王株式会社 耐熱性キシラナーゼ
CN111386341B (zh) * 2017-06-07 2023-09-15 Ptt全球化学公共有限公司 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010051295A (ja) * 2008-08-30 2010-03-11 Japan International Research Center For Agricultural Services クロストリジウム属菌並びにセルロソームを含むセルラーゼ及びヘミセルラーゼの製造方法
CN103429751A (zh) * 2010-12-22 2013-12-04 马斯科马公司 经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌
WO2012153189A2 (pt) * 2011-05-11 2012-11-15 Cetrel S.A. Processo e sistema de produção de biogás a partir da digestão anaeróbia de biomassa vegetal em fase sólida
JP2016208852A (ja) * 2015-04-30 2016-12-15 味の素株式会社 脂肪酸を生成する緑藻改変株

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P. TAILLIEZ et al..Enhanced Cellulose Fermentation by an Asporogenous and Ethanol-Tolerant Mutant of Clostridium thermocellum.《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》.1989,第55卷(第1期),207-211. *
Shuo-Fu Yuan et al..Biochemical Characterization and Structural Analysis of a Bifunctional Cellulase/Xylanase from Clostridium thermocellum.《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》.2015,第290卷(第9期),5739-5748. *
Yutaka Mori et al..Isolation of Mutants of Clostridium thermocellum with Enhanced Cellulase Production.《Agricultural and Biological Chemistry》.1990,第54卷(第3期),825-826. *
季萍等.热纤梭菌纤维素酶的研究.《上海工程技术大学学报》.1996,第10卷(第2期),32-36. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11236375B2 (en) 2022-02-01
CN111386341A (zh) 2020-07-07
SG11201911796QA (en) 2020-01-30
DE112018002933T5 (de) 2020-02-20
US20210079434A1 (en) 2021-03-18
DE112018002933B4 (de) 2020-11-05
JP2020523019A (ja) 2020-08-06
WO2018226170A3 (en) 2019-03-07
WO2018226170A2 (en) 2018-12-13
JP7019926B2 (ja) 2022-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111386341B (zh) 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株热纤梭菌及其制备方法
Ma et al. Genomic and secretomic insight into lignocellulolytic system of an endophytic bacterium Pantoea ananatis Sd-1
DK2342329T3 (en) Beta-glucosidase variants with improved activity, and use thereof
JP2013545491A (ja) バイオマス加水分解物培地中でのキシロース資化性ザイモモナス・モビリスによるエタノール産生の向上
Acharya et al. Alkaline cellulase produced by a newly isolated thermophilic Aneurinibacillus thermoaerophilus WBS2 from hot spring, India
Adav et al. Label free quantitative proteomic analysis of secretome by Thermobifida fusca on different lignocellulosic biomass
US11286472B2 (en) Variants of exoglucanases having improved activity and uses thereof
WO2017177289A1 (en) Process for conversion of biomass into fermentable sugars with integrated enzyme
CN111770996B (zh) 突变β-葡萄糖苷酶
CN111094556B (zh) 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法
US8916366B2 (en) Multi-cellulase enzyme compositions for hydrolysis of cellulosic biomass
WO2021029828A1 (en) Talaromyces pinophilus strain for producing cellulolytic enzymes
Heng et al. Genomics and cellulolytic, hemicellulolytic, and amylolytic potential of Iocasia fonsfrigidae strain SP3-1 for polysaccharide degradation
Mou et al. Isolation of a newly Trichoderma asperellum LYS1 with abundant cellulase-hemicellulase enzyme cocktail for lignocellulosic biomass degradation
KR101746398B1 (ko) 새로운 자일란 분해 균주 스트렙토마이세스 아트로비랜스 wj2
Pandey et al. Evaluation of ${\beta} $-1, 4-Endoglucanases Produced by Bacilli Isolated from Paper and Pulp Mill Effluents Irrigated Soil
CN111757939A (zh) 突变β-葡萄糖苷酶
KR101594995B1 (ko) 흰코뿔소 유래 바실러스 푸밀러스 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제
Swaminathan et al. Isolation and screening of hydrogen producing bacterial strain from sugarcane bagasse yard soil
An et al. Genomic analysis of a halophilic bacterium Nesterenkonia sp. CL21 with ability to produce a diverse group of lignocellulolytic enzymes
Carbonaro et al. Genomic mining of Geobacillus stearothermophilus GF16 for xylose production from hemicellulose-rich biomasses using secreted enzymes
WO2015076260A1 (ja) 耐熱性キシラナーゼ
Tongsuk et al. CHARACTERIZATION OF LIGNOCELLULOSE-DEGRADING THERMOPHILIC ANAEROBIC BACTERIUM, CALDICELLULOSIRUPTOR SP. STRAIN EP2: ITS PROPERTIES AND GENOME
Thirumala et al. Isolation of a cellulolytic bacterium from the Lonar Soda lake and genomic analysis of it
Balakrishnan et al. Cellulolytic activity of Streptomyces clavifer TBG-MNR13 (MTCC 4150), isolated from Neyyar wild life sanctuary of Kerala, India

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant