JPS6229974A - キシラナ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技　　術　　分　　ηヨ 本発明は、新規なキシラナーぜ及びその製造法に関する
。

発　　明　　の　　背　　順 キシランは、稲藁等の植物細胞壁、樹木の外囲構造組織
体等を構築している強固な多糖類であり、キジローズを
主要構成糖として、アラビノース、マンノース、グルコ
ース等を微量構成糖として成り、セルローズとは異なる
物質として知られている。該キシランは、セルラーゼ等
のセルロース分解酵素を含む各種の酵素製剤により部分
的に分解されるが、完全には分解されない。従って、キ
シランを含む各種原料を有効利用するためには、キシラ
ンに対して特異性の高い酵素、特にキシラナーゼを作用
させる必要があるが、用在この種キシラナーゼとしては
、作用至適温度上限が約４５〜５０℃の中温のものが知
られているに過ぎない。

発　　明　　の　　開　　示 本発明者らは、上記の如き実状に鑑み、稲ワラ等のキシ
ランを多く含む農産廃棄物等からキシ［１−ズを効率よ
く分解生成できる酵素の生産能を有する微生物を自然界
に探索した。その結果、特殊な動物糞尿廃棄物中より、
クロスｉ〜リデイウｌオ属に属する新しい耐熱性キシラ
ナーゼ生産菌を見出し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明は下記特性を有するキシラナーゼＫＢ−１
０−ＩＴ及びその製造法に係わる。

（１）基質特異性：キシランをよく分解する。セルロー
スは分解しない。

（２）至適ｐＨ：約６．０付近。

本酵素をｌ］Ｈ３，０〜７．０の範囲で、６５°Ｃにで
、基質溶液と接触させ、反応液中の還元糖量を測定して
酵素活性（相対値）を求めた結果を下記第１表に示す。

なお、基質溶液としては燐酸緩衝液（０，２Ｍ、＋１８
７．Ｏ）に１％キシラン（木材又は稲ワラ）を懸濁し、
電子１ノンジにて加熱溶解した溶液と、酵素液とを等容
量で使用した。

また酵素活性は５５℃で１分間に１μモルのキジローズ
相当の還元糖を生成する酵素量を１単位とし、その相対
値は、最も高い活性値（ｒｌｌ−１−４，５の場合）を
１００％としこれに対する％にて表わした。

第１表 り比表４　　　　　４七月ＩＬすＯ− ３，０１０ ３、５２０ ４、０３０ ４・５　　　　　　４０ ５・　０　　　　　　　　　　７０ ５−　５　　　　　　　　　　　？０ ６．０　　　　　　１００ ６・５　　　　　　３０ ７．０　　　　　　　　　　１０ 上記第１表より、本酵素の至適１）Ｈは約６．０付近に
あることが判る。

（３）至適温度：約６５℃付近。

本酵素を１）Ｈ６，Ｏで、０〜１００℃にて、上記（２
）と同様にして基質溶液と接触させ、反応液中の還元糖
量を測定して酵素活性（相対値）を求めた。結果を下記
第２表に示す。

第２表 濡面（℃）　　　　相対活性（％） ２０　　　　　　　　’　　５ １００　　　　　　　　〇 上記第２表より、本酵素の至適温度は、約６５℃付近に
あることが判る。

（４）温度安定性：５５℃、１時間（＋１）−１−５，
５）の処理で残存活性１００％、６０℃、１時間（ｔ）
ｌ−１＝５．５）の処理で残存活性５０％を示す。

本酵素をＩ）＋５．５で、０〜１００℃にて１時間、上
記（２）と同様にして基質溶液と接触させ、反応液中の
還元糖量を測定して酵素活性を求め、その残存活性（％
）を求めた。結果を下記第３表に示１′。

第３表 １度（’Ｃ）　　　　　残存活性（％）温度（’Ｃ）　
　　　　残存活性（％）上記第３表より、本酵素は５５
℃、１時間（１’１ｌ−１＝５．５）の処理で残存活性
１００％、また６０℃、１時間（ｐＨ＝５．５）の処理
でも５０％の残存活性を示づことが判る。

（５）キシラン分解度：６５℃、ｒｌＨ５，０で５時間
作用の後、７１６％ｈｌ水分解する。

キシラン粉末０．５％を含有する燐酸緩衝液を基質溶液
どして、本Ｉ９素を、ｐＨ＝５．０、温度６５°Ｃで作
用させ、経時的にキシラン分解度を求めた結果を下記第
４表に示す。

第４表 時間（Ｈｒ　）　　　分解率（％） ０．５　　　　　　　２５ １、０　　　　　　　３５ ２、０　　　　　　　４０ ３．０　　　　　　　４２ ４、０　　　　　　　４５ ５、０　　　　　　　４６ 上記第４表より、本酵素はキシラン（木材）を６５℃、
ｐＨ５，０にて５時間作用の後４６％加水分解し得るも
のであることが判る。

（６）基質分解の特異性：エキソ型の作用様式を示す。

上記（５）に記載の試験において、経時的に反応液をサ
ンプリングしてＴＬＣ（シリカゲル、メルク社製）にて
展開（ブタノール：ピリジン：水−８：１：１）Ｌ、、
硫酸噴霧の後、オリゴ糖、キシロトリオース、キシロビ
オース及びキジローズをマーカーとして、之等各マーカ
ーのスポットと比較して各分解物の検出を行なった。結
果を下記第５表に示す。尚、表中各分解物における表示
は次のことを示す。

■・・・・・・・・・大量、　拝・・・・・・・・・中
子・・・・・・・・・小、　　　−・・・・・・・・・
無第５表 分解物　　　　　　　作用時間（分） ６０分後　１２０分後 オリゴ糖　　　　　　−− キシロトリオース　　−− キシロビオース　　　−　　　　　− キジローズ　　　　　＋　　　　　■ 上記第５表より、本酵素はエキソ型の作用様式を示すこ
とが判る。

以上の各種試験結果より、本発明酵素（キシラナーゼ）
は、特に耐熱性に優れている点において特徴付けられ、
この点で従来のキシラナーゼとは異なる新規なものであ
ることが確認される。叩も、従来公知のキシラナーゼは
、全て中湿度にて安定なものであり、その作用至適温度
の上限は、約４５〜５０℃とされているが、本発明のキ
シラナーゼＫＢ−１０−Ｉｆの作用至適温度は、約６５
℃付近であり、従来例を見ない高温耐性の酵素であるこ
とが判る。従って本発明の耐熱性キシラナーゼは、殊に
キシランを含む各種原料、例えば稲ワラ等の農産廃棄物
の有効利用に、ｔｉｌｌも之等の原料からキジローズの
分離収得に非常に有用であり、該加水分解を効率よ〈実
施できる利点がある。

本発明のキシラナーゼＫ　１３−１０−ＩＴは、本発明
者らが新たに見出したクロス［ヘリディラム属に属し、
下記菌学的性質を有する新規微生物の培養により得られ
る。

Ａ　形態学的特徴 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌で、大きさは０．４〜
０．６Ｉ１ｍｘ４．０−Ｌ５．０μ’ｍである。

（ｂ）細胞の多形性：無し。

（ｃ）運動性：有り。

（ｄ）胞子形成能；有り。胞子の形状は（ｈ円乃至球状
で末端に位置し、径は０．８〜１．０μｍである。

（ｅ）グラム染色性：陰性。

（ｆ）抗酸性：無し。

Ｂ　次の培地における生育状態（嫌気性条件下）（ａ）
リドマスミルク：酸性、凝固。

Ｃ生理学的性質 （ａ）ＶＰテスｌへ：　　　陰性。

（ｂ）ゼラチン液化能：　陰性。

（ｃ、）硫化水素の生成：　陰性。

（ｄ）澱粉の加水分解：　陽性。

（ｅ）力Ｕイン分解能：　陰性。

（ｆ）無機窒素源の利用：陰性。

（Ｑ）色素の生成：　　　陰性。

（ｈ）カタラーゼ生成：　陰性。

（ｉ）生育の節回：　ｌ）　ｌ−１４〜８、濃度３５〜
６５℃である。

（ｊ）酸素に対する態度：嫌気性（偏性）。

（ｋ）Ｏ−Ｆテスト：好気的にはブドウ糖より酸を生成
せず。

（Ｑ）下記の糖類から酸及びガスの生成の右無糖　類　
　　　　酸生成　ガス生成 １−アラビノース　　　」−＋ Ｄ−キシロース　　　　＋　　　＋ Ｄ−グル］−ス　　　　＋　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　＋　　　＋ Ｄ−フラクト・−ス　　　＋　　　十 り−ガラクトース　　　＋　　　十 麦芽糖　　　　　　　　十　　　＋ ショ糖　　　　　　　　＋　　　４− 乳糖　　　　　　　　　十　　　＋ ］・レバロース　　　　　→−＋ Ｄ−ソルビット　　　　−− Ｄ−マンニット　　　　千　　　十 イノジット　　　　　　−　　　− グリセリン　　　　　　−− 澱粉　　　　　　　　　４−十 上記形態学的特徴、生育状態及び生理学的性質を有する
微生物は、バーシイのマニアル・オブ・デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー第８版による検索によれば、ク
ロストリディウム属に属することが判明した。しかしな
がら本微生物が該当する種は見当たらなかった。最も近
似したものとしてはクロストリディウム・１ナーモサツ
カロリテイカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｔｈｅｒ
ｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｌ　ｉｃｕｍ　）が挙げられ
るが、該株を始め従来公知のクロストリディウム属菌に
ついては、キシラン分解能は知られていない。唯一キシ
ラン分解能について記載されているクロストリディウム
菌としては、クロストリゾイウム・サーモセラム（Ｃ。

ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ２７４０５
があるが、この菌もこれがセルビオースの存在下で（よ
じめでキシラナーゼを生産すること及び強力なセルラー
ゼ生産菌であること等の点で本菌株とは本質的に異なっ
ている。本菌株と上記バーシイのマニュアル第８版第５
７２頁に記載されたクロストリディウム・サーモセラム
（Ｖ　１ｌｊｏｅｎ、　Ｆ　ｒｅｄ　ａｎｄＰｅｔｅｒ
ｓｏｎ　、　　１９２６．７　）との周界を対比して示
せば下記第６表の通りである。

第　　６　　表 上記第６表に示す通り、本菌株は、色素生成が陰性であ
る点、酪酸生成を行なう点等においてクロストリディウ
ム・サーモセラムとは明確に区別される。

またクロストリディウム属には、上記した通り本菌株に
該当する種は存在しないことから、本発明者らは、本菌
株をクロストリディウム属に属する新種と認め、これを
クロストリディウム　エスピー、　ＫＢ　−１０（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｓｐ、　ＫＢ　−１０）と命名
した。本菌株は工業技術院微生物工業技術ω１究所に受
託番号　微■研菌奇第８３１７号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８
３１７＞として寄託されている。

本発明の新規なキシラナーゼＫＢ−１０−Ｈの生産能を
有する微生物には、上記ＫＢ−１０株の通常の変異株、
即ち該株を常法に従い例えば紫外線又番よＸ線照射、変
異誘発剤処理等により変異させた変異株も包含される。

１７一 本発明の新規なキシラナーゼＫＢ−１０−ＩＩは、上記
微生物の培養により、主として菌体内に生産される。

上記微生物からの本発明キシラナーゼの収得は、該微生
物を通常のこの種嫌気性菌の培養と同様にして培養する
ことにより実施できる。上記培養に用いられる培地は、
上記微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよ
く、これはクロストリジウム属その他の通常の嫌気性菌
の培養に用いられる培地と同様の各種炭素源、窒素源、
無機金属塩等を適宜含有させたものでよい。特に好まし
い培地としては、例えば以下の各科栄養源その他を含有
するＰＹ−Ｘ培地を例示することができる。

（ＰＹ−Ｘ培地） キシラン　　　　　　　　　０．５ａ ポリペプトン　　　　　　　１．０ｇ イーストエキストラクト　　１．Ｏｇ ｍ機塩類溶液ＩＫＩ　　　　　　４．Ｑ制ヘミン水溶液
Ｙ２　　　　　１．ｏ誦 システィン塩酸塩　　　　　０．０５！ｌ］イオン交換
水　　　　　　１００ｍ（１ｐＨ７，０ 上記無機塩類溶液ｘ１は、以下の組成を有する。

Ｃａ　ＣＧ！２　　　　　　　０．０２％Ｍｇ５−０４
　・７Ｈ２００，０４８％に２　ＨＰＯ４０，−１％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ ＮａＨＣＯａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｏ、ｉ　　％またヘミン水溶液Ｘ２におけるヘミンは、
培地中に０．５１１１（＋／　１００ｍＱの割合で含有
される。

上記培地ＰＹ−Ｘに示したように、微生物Ｋ　Ｂ−１０
株の培養用培地には、特にキシランを添加配合するのが
好ましくこれにより目的酵素の生産量を増加させること
ができる。また培地にはヘミン及びシスティンを添加配
合するのも好ましい。

上記培地を利用した微生物の培養条件は、特に制限はな
いが、通常利用する微生物の至適温度及び至適ｐ　Ｈ条
件を採用するのが好ましい。また培養は、通常の各種培
養方法によることができるが、特に静置培養及び液体培
養によるのがよく、培養に当っては嫌気性雰囲気、例え
ば窒素雰囲気、炭酸ガス雰囲気等を維持するのが好まし
い。

上記培養により目的とするキシラナーゼが培養物中に産
生される。その培養物からの採取は、培養物中に目的酵
素が著聞蓄積される頃、通常培養開始２４時間頃に行な
うのがよく、約１５〜７２時間後でも採取可能である。

上記酵素の採取は、常法に従うことができる。即ち、例
えば培養物、特に好ましくは培養液を遠心分前１〕で１
ｑられる菌体から、超音波破砕、リゾチーム処理等の通
常の手段により酵素を溶離した後、遠心分離により上清
を採取して、菌体抽出粗酵素液とすることができる。

上記のごとくして得られる粗酵素液は、そのままで酵素
液として用いることもでき、また通常の精製手段により
更に精製して酵素標品とすることもできる。該精製手段
としては、例えば樹脂吸着法、塩析法、抽出法、カラム
クロマトグラフィー等を例示できる。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を挙げる
。

実施例１ クロストリディウム　エスピー、ＫＢ−１０（微工研菌
奇第８３１７号）を、ＰＹ−Ｘ培地（１）Ｈ７，Ｏ）１
００ｍ（ｌ中にｌＸ１０５〜１×１０８個／ｍＱとなる
濃度で播種し、これを小型バイアル瓶（ゴムキャップ付
）に入れ、その気相の空気を窒素ガス９０％、炭酸ガス
５％及び水素ガス５％の気体と置換した後、５５℃で２
４時間、４８時間及び７２時間各々静置培養を行なった
。

上記培養の後、遠心分離（８０００ｒｐｉ＋　、１０分
間）により上清と菌体とを分離した。

上記菌体を、燐酸緩衝液（０，０２Ｍ、ｐ　Ｈ７，０）
に２−メルカプトエタノールを０．５ｍＱ／３Ｑの割合
で添加した溶液１００購で２回洗浄した後、同緩衝液（
０，０２Ｍ、ｒｌ　１−１６．０）１００戒に懸濁させ
、超音波破砕（５分間）を行ない、次いで遠心分離（８
０００ｐｐｍ　、１０分間）して上清として菌体抽出粗
酵素液を得た。

得られた粗酵素液とその培養時間どの関係を調べた結果
を下記第７表に示す。

第７表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記特性を有するキシラナーゼＫＢ−１０−II。 （１）基質特異性：キシランをよく分解する。 セルロースは分解しない。 （２）至適ｐＨ：約６．０付近。 （３）至適温度：約６５℃付近。 （４）温度安定性：５５℃、１時間（ｐＨ＝５．５）の
   処理で残存活性１００％、 ６０℃、１時間（ｐＨ＝５．５）の処理 で残存活性５０％を示す。 （５）キシラン分解度：６５℃、ｐＨ５．０で５時間作
   用の後、４６％加水分解する。 （６）基質分解の特異性：エキソ型の作用様式を示す。 ［２］クロストリデイウム属に属するキシラナーゼＫＢ
   −１０−II生産菌を培養して、培養物から下記特性を有
   するキシラナーゼＫＢ−１０−IIを採取することを特徴
   とするキシラナーゼＫＢ−１０−IIの製造法。 （１）基質特異性：キシランをよく分解する。 セルロースは分解しない。 （２）至適ｐＨ：約６．０付近。 （３）至適温度：約６５℃付近。 （４）温度安定性：５５℃、１時間（ｐＨ＝５．５）の
   処理で残存活性１００％、 ６０℃、１時間（ｐＨ＝５．５）の処理 で残存活性５０％を示す。 （５）キシラン分解度：６５℃、ｐＨ５．０で５時間作
   用の後、４６％加水分解する。 （６）基質分解の特異性：エキソ型の作用様式を示す。