JPH0419835B2

JPH0419835B2 -

Info

Publication number: JPH0419835B2
Application number: JP8966484A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Kamori; Shuzo Sakai
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1984-05-05
Filing date: 1984-05-05
Publication date: 1992-03-31
Also published as: JPS60248196A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、Ｄ−タガトースの製造方法に関する
ものであり、更に詳細には、アルスロバクター属
に属し、ダルシトール（別名、Ｄ−ガラクチトー
ル）からＤ−タガトース産生能を有する細菌を用
いて、ダルシトールからＤ−タガトースを製造す
る方法に関するものである。従来の技術Ｄ−タガトースは、ケトヘキソースに分類され
る甘味の強い単糖類である。その製造方法として
は、有機化学的手法が古くから知られており、例
えば、Helv.Chim.Acta.、Vol.17、753頁（1934
年）では、Ｄ−ガラクトースをピリジンによつて
異性化させ、Ｄ−タガトースが収率約6.5％で製
造されることが、また、Carbohyd.Res.、
Vol.16、474頁（1971年）では、Ｄ−フラクトー
スを繁雑な合成法によつて誘導体に変えた後、Ｄ
−タガトースが収率約21％で製造されることが報
告されている。また、微生物によるダルシトール、ガラクトー
スの代謝中間物として、Ｄ−タガトース存在が知
られている。すなわち、Biochem.J.、Vol.64、394頁（1956
年）では、シユードモナス属細菌に、ラルシトー
ルからのＤ−タガトース生成酵素、すなわちＤ−
ガラクチトールデヒドロゲナーゼ
（EC1.1.1.16）の存在が報告され、また、FEBS
Letters Vol.124、270頁（1981年）では、マイコ
バクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）
がガラクトース２ｇから最高でタガトースを約
100mg（収率で約5.0％）生成することが報告され
ている。発明が解決しようとする問題点近年、生化学工業が急速に発達し、糖質化学の
分野においても、新らたな糖質の開発が望まれて
いる。Ｄ−タガトースは、試薬として少量市販さ
れているものの、その大量製造方法が確立されて
おらず、未だ、食品工業、医薬品工業、化学工業
などの工業原料として使用されるに至つていな
い。問題を解決するための手段本発明者等は、Ｄ−タガトースを生化学的手段
により大量、安価に製造することを目的に鋭意研
究した。その結果、アルスロバクター属に属し、ダルシ
トールからＤ−タガトース産生能を有する細菌
を、ダルシトールを含有する水溶液に接触させ
て、Ｄ−タガトースを生成せしめ、これを採取す
ることにより、容易に、高収率でＤ−タガトース
を製造し得ることを見いだし、本発明を完成し
た。すなわち、本発明において、ダルシトールから
Ｄ−タガトースを製造するのに使用される細菌
は、アルスロバクター属に属し、ダルシトールか
らＤ−タガトース産生能を有する細菌である。そ
の一例としては、後に説明するアルスロバクタ
ー・グロビフオルミス（Arthrobacter
globiformis）ST−48、または、これの変異株な
どが有利に利用できる。アルスロバクター・グロビフオルミスST−48
は、昭和59年５月１日付で、工業技術院微生物工
業技術研究所に、微工研菌寄第7592号（FERM
Ｐ−7592）として寄託され、その後、昭和63年２
月19日付で国際寄託に移管され、微工研条寄第
1743号（FERM BP−1743）として国際寄託さ
れている。このアルスロバクター・グロビフオルミスST
−48の菌学的性質を、以下に記載する。Ａ採集地及び分離源採取地岡山県津山市分離源土壌Ｂ細胞の形態 (1) 細胞の形及び大きさ桿菌球形および楕円形も少し見られる。 0.6〜0.8×1.0〜2.0μ (2) 細胞の多形性の有無数は少ないがカーブした細胞が見られる。 (3) 運動性の有無無 (4) 鞭毛の着生状態無 (5) 胞子の有無無 (6) グラム染色性陰性 (7) カプセル（莢膜）の有無無 (8) 抗酸性無Ｃ各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（28℃５日）菌の生育はやや遅く、５日後に２〜３mmの
コロニーを形成する。コロニーは、不透明な湿光を滞びた黄白色
の円形で、表面は平滑であり、半レンズ状の
隆起をしている。周縁は全縁で内容は均質で
ある。色素は生成しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（28℃５日）菌の生育はやや遅く、中程度である。コロ
ニーは半透明で湿光を滞びた灰白色をし、糸
状で表面は平滑であり扁平な隆起をしてい
る。粘稠であるが、色素は生成しない。 (3) 肉汁液体培養（28℃３日）菌の生育はやや遅く、全体的に薄く濁つて
くる。液表面に厚膜状の生育がみられ、粉状
の沈殿を形成する。色素、ガスは生成しな
い。 (4) 肉汁穿刺培養（28℃５日）培地表面にコロニーの形成がみられ、穿刺
線の上層部にはとげ状の生育がみられる。ガ
ス、色素は生成しな。 (5) 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃40日）培地表面に穿刺部を中心にコロニーが形成
され、穿刺線上層部にとげ状の生育がみられ
が、液化しない。（20℃40日）全体的に生育する。培養終了後、冷却する
とゼラチンは固化する。 (6) リトマス・ミルク（28℃40日）リトマスは変化せず、ブロムクレゾー
ル・パープル（BCP）は青色となりアルカ
リ性を示すが、液化、凝固は見られない。Ｄ生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元陽性 (2) 脱窒反応陽性 (3) MRテスト陰性 (4) VPテスト陰性 (5) インドールの生成陰性 (6) 硫化水素の生成陽性 (7) デンプンの加水分解陽性（非常に弱い） (8) クエン酸の利用陽性 (9) 無機窒素源の利用
硝酸塩・アンモニウム塩いずれも利用 (10) 色素の生成生成せず (11) ウレアーゼ陽性 (12) オキシダーゼ陽性 (13) カタラーゼ陽性 (14) 生育の範囲生育PH５〜８生育温度５〜37℃ 食塩濃度０〜３％ (15) 酸素に対する態度好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト
糖（グルコース）をほとんど分解しない (17) 糖類から酸及びガスの生成の有無酸ガスＬ−アラビノース＋ − Ｄ−キシロース＋ − Ｄ−グルコース − − Ｄ−フラクトース − − シヨ糖 − − 乳糖 − − マンニトール − − グリセロール − − (18) 生育PH PH7.62 （プロテオースペプトン・グルコース培
地） (19) セルロースの分解陰性 (20) 温度抵抗性
80℃、10分の処理で菌生育せず (21) 栄養要求性なし本菌株は、上述の菌学的性質から、パージー
ズ・マニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バ
クテリオロジー（Bergey′s manual of
determinative bacteriology）第７版（1957年）、
第８版（1974年）に準じて分類すれば、グラム陰
性、好気性の桿菌であり、胞子を形成せず、運動
性なく、また、カタラーゼおよびオキシダーゼが
陽性であり、多形性も一部みられ、土壌中より分
離されたことからアルスロバクター属に属する。
更に、詳細に見れば、本菌株は、糖類からの酸の
生成が少なく、硝酸塩を還元し、インドールの生
成がなく、窒素源として硝酸塩、アンモニウム塩
を利用できる。また、クエン酸も利用できるが色
素を生成せず、更に、37℃でも生育し、デンプン
も弱いが分解することから、アルスロバクター・
グロビフオルミス（Arthrobacter globiformis）
と同定され、アルスロバクター・グロビフオルミ
スST−48と命名された。本発明でいう、アルスロバクター属に属し、ダ
ルシトールからＤ−タガトース産生能を有する細
菌を、ダルシトールを含有する水溶液に接触させ
てＤ−タガトースを生成せしめ、これを採取する
とは、ダルシトールからＤ−タガトース産生能を
有する、例えば、アルスロバクター・グロビフオ
ルミスST−48、または、この変異株などの細菌
をダルシトールを含有する栄養培地で培養する。
望ましくは、振とう、通気撹拌などの好気的条件
下で培養し、培養液中にＤ−タガトースを生成せ
しめ、これを採取するか、または、このようにし
て培養した後、得られる細菌を用いて水溶液中の
ダルシトールをＤ−タガトースに変換する。望ま
しくは、振とう、通気撹拌、酸素の圧入などの好
気的条件下で変換させ、生成するＤ−タガトース
を採取すればよい。培養方法としては、ダルシトール、ソルビトー
ルなどの糖アルコールとともにアルスロバクター
属の属する細菌が必要とする栄養源、例えば、炭
素源、窒素源、無機塩などを含有する培地、望ま
しくは、微酸性なしい微アルカリ性の液体培地
に、ダルシトールからＤ−タガトース産生性を有
する細菌を植菌し、約20〜35℃で、１〜15日間好
気的条件下で培養すればよい。培養中に、ダルシトールからＤ−タガトースに
変換させ、培養液中にＤ−タガトースを生成蓄積
せしめる場合には、ダルシトールを約1.0〜
10.0W／Ｖ％含有する液体培地を用いるのが望ま
しい。また、培養が、細菌の増殖と、細菌のダルシト
ールからＤ−タガトースへの変換能を高めること
を目的とするのであれば、ダルシトール、ソルビ
トールなどの糖アルコールが適宜選択できるが、
細菌の増殖が速く、細菌のダルシトールからＤ−
タガトースへの変換能が高く、しかも安価である
などの点から、ソルビトールを含有する培地を用
いるのが望ましい。また、例えば、ラクトースを加水分解するなど
して得られるＤ−ガラクトースとＤ−グルコース
との混合物をラネーニツケル触媒などで水素添加
し、ダルシトールとソルビトールとの混合物と
し、この混合物を含有する栄養培地にダルシトー
ルからＤ−タガトース産生能を有する細菌を植菌
して培養し、細菌のダルシトールからＤ−タガト
ース産生能を高めるとともに培養液中にＤ−タガ
トースを生成蓄積せしめることも有利に採用でき
る。また、前述のような培養方法によつて得られた
細菌を、ダルシトールを含有する水溶液と触媒、
望ましくは好気的条件下で接触させ、Ｄ−タガト
ースに変換させることも有利に採用できる。この
変換に用いられる細菌は、培養液から分離された
生の細菌に限る必要はなく、例えば、生の細菌を
中性ないし微酸性下でトルエン２，４−ジイソシ
アネートなどのジイソシアネート化合物や、グル
タールアルデヒドなどのジアルデヒド化合物で処
理した細菌、半透膜製のホローフアイバーに封入
した細菌、寒天、ゼラチン、ｋ−カラギーナン、
アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状
などの各種形状に固定化した細菌などとして、ダ
ルシトールからＤ−タガトースへの変換に、繰り
返し利用すれば、好都合である。以上述べた各種の方法により生成、蓄積したＤ
−タガトースを含有する水溶液は、適当な分離方
法、例えば、遠心分離、過などの方法によつて
細菌と分離され、採取される。得られたＤ−タガトース液は、必要により、例
えば、硫安塩析、水酸化亜鉛吸着などによる除蛋
白、活性炭吸着による脱色、Ｈ型、OH型イオン
交換樹脂による脱塩などの方法で精製し、濃縮し
てシラツプ状の高純度Ｄ−タガトースを採取する
ことも、また、このシラツプを更に濃縮し、乾燥
粉末化して非晶質粉末状のＤ−タガトースとする
か、更に、このシラツプに、例えば、アルコー
ル、アセトンなどの親水性有機溶媒を加え、必要
によりＤ−タガトースの種晶を加え、Ｄ−タガト
ースの結晶を晶出させ、これを別するか、遠心
分離するかなどの方法により最高純度のＤ−タガ
トース結晶を採取することも自由にできる。このようにして製造されるＤ−タガトースは、
ダルシトールに対して50W／Ｗ以上の高収率で得
られ、大量、安価に供給できる工業的製造方法と
して好適である。従つて、Ｄ−タガトースの用途も、従来とは違
つて、試薬のみの用途に限定されることなく、例
えば、甘味料、品質改良剤などとして食品工業
に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学
工業など多くの用途に、有利に利用できる。以下、実施例について述べる。実施例１硫酸アンモニウム0.2W／Ｖ％、リン酸−カリ
ウム0.24W／Ｖ％、リン酸二カリウム0.56W／Ｖ
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.01W／Ｖ％、酵
母エキス0.5W／Ｖ％、ダルシトール2W／Ｖ％お
よび脱イオン水からなる培養液100mlずつを500ml
容振とうフラスコ20本にとり、120℃で20分間オ
ートクレーブした後、アルスロバクター・グロビ
フオルミスST−48 FERM BP−1743を１白金耳
ずつ植菌し、30℃で７日間振とう培養した。培養終了液をガスクロマトグラフイーづ分析し
たところ、ダルシトールは検出されず、Ｄ−タガ
トースは原料ダルシトールの約85％の収率であつ
た。培養終了後、培養液を遠心分離して細菌と上
清とを別々に採取した。得られた上清に25W／Ｖ％硫酸亜鉛を1/10容加
えPH7.6に調整し、遠心分離して上清を採取した。
この上清を、常法に従つて、活性炭を用いて脱色
し、次いで、ダイヤイオンSKIB（Ｈ型、三菱化
成工業(株)製造の商品名）およびダイヤイオン
WA30（OH型、三菱化成工業(株)製造の商品名）を
用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約95％の透明な
シラツプを得た。これに約３倍容の無水エタノー
ルを加えて混合し、室温に放置してＤ−タガトー
スの結晶を晶出させた。本結晶を別し、無水エ
タノールで洗浄した。得られた結晶をできるだけ
少量の水に溶解し、これに３倍容の無水エタノー
ルを加えてＤ−タガトースを再結し、同様に別
し、洗浄し、Ｄ−タガトースの結晶を採取した。Ｄ−タガトースのダルシトールに対する収率
は、約70％であつた。このようにして得られた結晶を同定するため、
Sigma社が市販している試薬Ｄ−タガトース結晶
と、その理化学的性質を比較実験した。この実験
においては、Sigma社の試薬Ｄ−タガトース結晶
を標準Ｄ−タガトースと呼び、本発明の方法で得
られたＤ−タガトース結晶を本発明調製品と呼
ぶ。

【表】 (4) 赤外線吸収スペクトルの比較 KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルの
結果を図面に示す。図面から明らかなように、標準Ｄ−タガトー
スの吸収スペクトルと本発明調製品のそれはよ
く一致している。以上の結果から明らかなように、本発明の方法
で得られた結晶は、Ｄ−タガトースであると判断
される。実施例２ダルシトール4W／Ｖ％を含有する0.005Mリン
酸塩緩衝得（PH7.0）１に、実施例１の方法に
より培着液２から得た細菌を加えて混合し、こ
の混合液約100mlずつを500ml容振とうフラスコに
分注し、32℃で５日間振とうし、ダルシトールを
Ｄ−タガトースに変換させ、次いで遠心分離して
細菌を除去し、得られた上清を実施例１の方法に
準じて、活性炭で脱色し、Ｈ型、OH型イオン交
換樹脂にて脱塩、精製し、更に濃縮して、濃度約
90％のシラツプを原料のダルシトールに対して固
形物当り93％の収率で採取した。本品Ｄ−タガトース純度は、固形物当り約97％
であつた。実施例３実施例１の培着液のうち、ダルシトールをソル
ビトールに代えた以外は同じ組成とし培養液15
を30容ジヤーフアーメンター２基にとり、120
℃で20分間滅菌した後、30℃に冷却し、これに、
同組成の培養液に30℃で１日間振とう培養したア
ルスロバクター・グロビフオルミスST−48
FERM BP−1743の種培養液を1V／Ｖ％植菌し、
30℃で２日間通気撹拌培養し、次いで遠心分離し
て菌体を採取し、これを0.02Mリン酸塩緩衝液
（PH6.8）にて懸濁し、再び遠心分離して集菌し
た。このようにして得られた細菌を、ダルシトール
5W／Ｖ％を含有する0.02Mリン酸塩緩衝液（PH
6.8）10とともに20容ジヤーフアーメンター
にとり、通気撹拌しつつ35℃で３日間保つて、ダ
ルシトールをＤ−タガトースに変換させ、次い
で、遠心分離して細菌を除去し、得られた上清を
実施例１の方法に準じて、活性炭、イオン交換樹
脂を用いて精製し、濃縮した後、無水エタノール
を加えてＤ−タガトースの結晶を晶出させ、更
に、再結してＤ−タガトースの結晶を採取した。Ｄ−タガトース結晶のダルシトールに対する収
率は、約86％であつた。本結晶の理化学的性質も、実施例１の場合と同
様に、Sigma社の試薬Ｄ−タガトース結晶とよく
一致した。発明の効果上記したことから明らかなように、本発明によ
れば、従来きわめて収率が低く、その製造が繁雑
であつたＤ−タガトースの製造を容易にし、その
収率を大幅に向上することができる。従つて、本発明の方法は、Ｄ−タガトースの工
業的製造方法として好適であり、大量、安価な供
給を可能にし、従来予想すらできなかつた食品工
業、医薬品工業、化学工業などの原料、中間体な
どへの用途を可能にするものである。

【図面の簡単な説明】

図面は、標準Ｄ−タガトースと本発明調製品と
の赤外線吸収スペクトルを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１アルスロバクター属に属し、ダルシトールか
らＤ−タガトース産生能を有する細菌を、ダルシ
トールを含有する水溶液に接触させてＤ−タガト
ースを生成せしめ、これを採取することを特徴と
するＤ−タガトースの製造方法。２アルスロバクター属に属し、ダルシトールか
らＤ−タガトース産生能を有する細菌を、ダルシ
トールを含有する水溶液に好気的条件下で接触さ
せることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
のＤ−タガトースの製造方法。３アルスロバクター属に属する細菌が、アルス
ロバクター・グロビフオルミスST−48（FERM
BP−1743）であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項または第２項記載のＤ−タガトースの
製造方法。