JPS62228287A

JPS62228287A - 醗酵法による２−ケト−ｄ−グルカル酸の製造法

Info

Publication number: JPS62228287A
Application number: JP61312541A
Authority: JP
Inventors: Hideo Shirafuji; 白藤　英夫; Takamasa Yamaguchi; 山口　高正; Akio Nogami; 野上　▲いく▼雄
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-12-26
Filing date: 1986-12-25
Publication date: 1987-10-07
Anticipated expiration: 2010-05-01
Also published as: EP0228274B1; ATE73850T1; DE3684434D1; CA1276122C; CN86108590A; KR950005132B1; SU1753949A3; DK617386A; EP0228274A2; KR870006181A; DK617386D0; JPH0738796B2; EP0228274A3; US4876195A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、飼料のカルシウム強化助剤、洗剤のビルグー
、セメントの可塑剤および糖代謝研究用の試薬として有
用な２−ケトーＤ−グルカル酸（２−ｋｅｃｏ−Ｄ　−
ｇｌｕｃａｒｉｃ　　ａｃｉｄ、第１式）の醗酵法によ
る製造法に関する。

０ＯＨＣ＝０ＨＣＯＨＣＯＯＨ従来の技術２−ケトーＤ−グルカル酸の製造法としては、これまで
グルコースの化学的酸化により合成されるＤ−グルカル
酸にシュードモナス・アエルギノーサを作用させ、微生
物酸化により２−ケトーＤ−グルカル酸を得る方法（チ
ェコスロバキア特許。

Ｃｚｅｃｈ、ｃｓ　２２２，５７７（１９８１１，２，
Ｉ））が知られているにすぎない。

発明が解決しようとしている問題点しかし上記の方法においては、原料であるＤ−グルカル
酸を化学的酸化により合成するという工程が必要とされ
、また収率的にも工業技術として満足すべきものではな
い。

問題点を解決するための手段本発明者らは微生物による単糖類の酸化機構を研究中、
土壌資料より分離した細菌、Ｋ５９１！１株、１２−５
株、１２−１５株、１２−４株および２２−３株がＤ−
グルコース、Ｄ−フラクトースやその他の単糖類を炭素
源とする培地で培養されると、その培養液中に著量の２
−ケト−ローグルカル酸が生成蓄積されることを見いだ
した。また前記生産菌の分類学的研究を行ない、これら
が新しい属の新菌株であることを知り、鋭意研究の結果
、本発明を完成するに到った。

すなイつち本発明は、鎖状式で表わした場合、一般式、Ｈ０６Ｈ（ＩＩ　）ＣＯＨ籠ＣＯＨＣＨ，ＯＨ［式中、Ｒ’１ｉ−ＣＩＩＯ，−ＣＨ，０Ｉ−１，まタ
ハをそれぞれ示す。］で表される化合物を２−ケト−ロ
ーグルカル酸に酸化する能力を有し、シュードグルコノ
バクタ−属に属する細菌またはその処理物を、上記化合
物に接触させて２−ケト−ローグルカル酸を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする２−ケト−ロー
グルカル酸の製造法である。

Ｋ５９１ｓ株は和歌両県の、１２−５株、１２−！５株
、＋　２−４株および２２−３株は滋賀具の土壌資料か
らそれぞれ分離された細菌である。これら５株の分類学
的性状を示すと次の通りである。

Ｋ５９１ｓ株、１２−５株の分類学的性状（ａ）形　態（１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μｍ０（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を存する。

（４）胞子を形成しない。

（５）ダラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態（１）肉汁寒天平板培養：殆ど生育しない。酵母エキス
添加肉汁寒天平板培養では円形。

金縁、平滑、乳白色。

（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。

（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度、培地
全体を均一に混濁する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養二上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。

（５）リドマスミルク：酸性化する。凝固する。

（Ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は微弱であるが陽性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは陽性。

（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは陰
性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（［０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼを生成する。

（１２）オキシダーゼは陽性。

（１３）カタラーゼは陽性。

（１４）１６〜３６℃で生育し、至適生育温度は２４〜
３４℃。ｐＨ５，５〜８．７で生育し、至適生育ｐ　ｔ
ｒは６．０〜７．５゜（１５）好気性。

（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストで糖の分解は
酸化的。

（１７）　Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−
マンノース、麦芽糖、ショ１、乳１．Ｌｌ−レバロース
、Ｄ−マンニトール、グリセロールから酸を生成するが
、ガスは生成されない。

Ｄ−ソルビトール、イノシトール、デンプンから酸、ガ
スの生成は認められない。

（ｄ）その他の性質（１）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。

（２）ビオチン、ヂアミン、リボフラビンおよび補酵素
Ａ（以下ＣｏＡと称することらある）を生育に要求する
。

（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成する。

（４）Ｄ　Ｎ　Ａのグアニン＋シトシン含量は６７±１
モル％。

（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣｏＱ
＋ｏ）を有する。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

＋２−１５株の分類学的性状（ａ）形　態（１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μｍ０（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）ダラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態（１）肉汁寒天平板培養；殆ど生育しない。酵母エキス
添加肉汁寒天平板培養では円形。

金縁、平滑、乳白色。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。

（５）リドマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（Ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は陰性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メヂルレッド（Ｍ　Ｒ）テストは陽性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（１０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼを生成する。

（１２）オキシダーゼは陽性。

（＋３）カタラーゼは陽性。

（１４）２３〜３２℃で生育し、至適生育温度は２８〜
３２℃。ｐｒ−ｉｓ、ｏ〜７．５で生育し、至適生育ｐ
　Ｉ−Ｉは６，５〜７，１゜（１５）好気性。

（１７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マ
ンノース、麦芽糖、ンヨ糖、乳糖、トレハロース、グリ
セロールから酸を生成するが、ガスは生成されない。

Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、
デンプンから酸、ガスの生成は認められない。

（２）ビオチン、チアミン、リボフラビンおよびＣｏＡ
を生育に要求する。

（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣＱＱ
ＩＯ）を有する。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

Ｉ２−４株の分類学的性状（ａ）形　態（１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１４μｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を育する。

（４）胞子を形成しない。

（５）ダラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態（１）肉汁寒天平板培養：微少コロニーとしてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形。

金縁、平滑、乳白色。

（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面、生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。

（３）酵母エキス添加肉汁液体培芥：生育中程度、培地
全体を均一に混濁する。

（５）リドマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（Ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は陰性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは陽性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成する。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（１０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼを生成する。

（１２）オキシダーゼは陽性。

（１３）カタラーゼは陽性。

（１４）　１６〜３６℃で生育し、至適生育温度は２４
〜３４°Ｃｏｐ［５，５〜８．２で生育し、至適生育ｐ
Ｉ−Ｉは６．０〜７．５゜（１５）好気性。

（１７）　Ｌ−アラビノース、Ｄ−キンロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−
マンノース、麦芽糖、ショａ、乳ｉ、トレハロース、グ
リセロールから酸を生成するが、ガスは生成されない。

（２）ビオチン。チアミンおよびリボフラビンとＣｏＡ
またはパントテン酸を生育に要求する。

（３）グリセロールからジハイドロオキノアセトンを生
成する。

（４）ＤＮＡのグアニン＋シトシン含量は６７±１モル
％。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

２２−３株の分類学的性状（ａ）形　聾（１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４ａｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を°有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）ダラム陰性。

（６）非抗酸性。

金縁、平滑、乳白色。

（５）リドマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メヂルレッド（ＭＲ）テストは陽性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を４１１用する。

（１０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼを生成する。

（Ｉ２）オキシダーゼは陽性。

（１３）カタラーゼは陽性。

（１４）１６〜３８℃ぞ生育し、至適生育温度は２４〜
３４℃。ｐＨ５，５〜８．７で生育し、至適生育ｐＨは
６．０〜７．８゜（１５）好気性。

（１７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マ
ンノース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、グリ
セロールから酸を生成するか、ガスは生成されない。

（２）ビオチン、チアミンおよびリボフラビンとＣｏＡ
またはパントテン酸を生育に要求する。

（３）グリセロールからハイドロオキシアセトンを生成
する。

（４）ＤＮＡのグアニン＋ノドノン含量は６７±１モル
％。

（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣＯＱ
ＩＯ）を有する。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

以上土壌分離細菌５株の分類学的諸性質を、バーノーズ
・マニュアル・オブ・デタミネーティブ２ハクテリオロ
ジー　　（Ｂ　ｅｒｇｅｙ’　ｓ　　　ｍａｎｕａｌｏ
「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）　　第８版（１９７４年）およびバーシーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
−（Ｂｃｒ−ｇｅｙ’ｓ　　ｍａｎｕａｌ　　ｏｒＳｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１
巻（１９８４年）に照合してみると、５菌株即ち、Ｋ５
９１ｓｉ、１２−５株、＋２−１５ｔＬＩ２−４株と２
２−３株は、ダラム陰性、極鞭毛を有する運動性桿菌で
、好気性、オキシダーゼ陽性であることからシュードモ
ナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌種と一応は考
えられる。生育因子を要求すること、ＤＮＡのグアニン
とシトシンとの総含量が６７±Ｉモル％であること、キ
ノン系はイソプレンユニット数１０のユビキノンである
ことがら、この属のセクション■のＲＮＡクループ■に
属するシュードモナス・ディミニュタ　（Ｐ　ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｄｉｍｉｎｕｔａ）、シュードモナス・ベ
シキュラリス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｖｅｓｉ
ｃｕｌａｒｉｓ）に類似している。

しかしながらエタノールから微弱ながらも酢酸を生成す
ること、グリセロールからジハイドロオキンアセトンを
生成ずろことはシュードモナス属菌の性質とは異なる。

これらの性質は、グルコノバクタ−（Ｇ　］　ｕｃｏｎ
ｏ　−ｂａＣｔｅｒ）属菌種のそれである。しかしまた
これ等５菌株はオキンダーゼが陽性であること、ｐＩ−
（４，５では生育できないこと、糖（力源）を含まない
酵母エキス添加肉汁培地またはペプトン−酵母エキス培
地でよく生育出来ること、ＤＮＡグアニンとシトシンと
の総含量が６７±１モル％であること等の性質はグルコ
ノバクタ−属の菌種のそれとは異なる。

従って、これら５閑株即ち、Ｋ５９１ｓ株、１２−５株
、１２−１５株、＋　２−４株と２２−３株は既知の属
に該当するものを見い出だすことが出来ず新しい属の新
菌種とみなさざるを得ない。そこでに５９１ｓ株、Ｉ　
２−５株、１２−１５株、１２−４株と２２−３株の５
菌株はシュードグルコノバクタ−・サッカロケトゲネス
（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓａｃｃｈ
ａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）と命名された。

以下これらの菌株および後述のＴｌｌ１４−８６株を酸
化菌と称することもある。ここでこれ等５菌株の栄養要
求性について触れると、Ｋ５９１ｓ株。

１２−５株および１２−１５株はＣｏＡを生育に要求す
る珍しい性質を存している。これら３株のＣｏＡ要求性
はパントテン酸によって代替することは出来ない。一方
１２−４株および２２−３株はＣｏＡ存在下でもまたパ
ントテン酸存在下においてら生育出来る。

本発明に用いられる菌株は上記した５菌株は勿論のこと
、例えば、５菌株を紫外線やＸ線照射したり、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンにトロソグ
アニジン）、メチルメタンスルポン酸、ナイトロジエン
マスタードの様な変異誘起剤で処理して得られる変異株
も有利に用いられる。その例としてシュードグルコノバ
クタ−・サッカロケトゲネスに５９１ｓからニトロソグ
アニジン処理によって誘導されたＴ　ＨＩ　４−８６味
を挙げることができる。Ｔ　Ｉ−ｒ　Ｉ　４−８６株は
後述する原料糖類から２−ケトーＤ−グルカル酸生成能
が増強されている他は、親株であろに５９１ｓ株と同じ
分類学的性質を示した。

上記シュードグルコノバクタ−・サツ力ロケトゲネスに
５９１ｓ株、１２−５株およびＴＨＩ４−８６株は、昭
和６０年（１９８５年）９月１９日に、ンユードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲホス１２−１５株、１２−
４株および２２−３株は、昭和６０年（１９８５年）１
２月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＩ”Ｏ）に受託番
号　ＩＦ’０　１４４６４、ＩＦｏ　　１４４６５．Ｉ
ＰＯＬ４．４６６゜［ＦＯ１４４８２，ＩＦＯ１４４８
３，およびＩＦｏ　　１４４ｇ４としてそれぞれ寄託さ
れ、ま１こツユ−トグルコノバクター・サツカロケトゲ
ネスに５９１ｓ株、＋２−５ｆｆおよび′ｒ■１１４−
８６株は、昭和６０年ｌＯ月７日に、ツユ−トグルコノ
バクター・ザソカロケトゲネス１２−１５株。

１２−４株および２２−３株は昭和６０年＋２Ｊ］２０
日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ）に受託番号ＦＥｒｔＭ　Ｐ−８４８１゜１’；’Ｅ
ｒＬＭ　Ｐ−８４８０，ＦＥＲＭ　Ｐ−８４７９゜Ｆ’
ＥＲＭ　Ｐ−８５７７、ＦＥＲＭ　Ｐ−８５７６および
ＦＥＩＲＭ　Ｐ’−８５７８としてそれぞれ寄託され、
該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて、
下記に示す受託番号として同研究所に保管されている。

本発明において用いられる化合物（ＩＩ）の具体例とし
ては、たとえば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、Ｄ
−グルコン酸、２−ケトーＤ−グルコン酸、Ｄ−グルコ
ソンおよびＤ−マンノン酸などが挙げられる。　以下、
これらを「原料糖類」と称することもある。

原料糖類を使うに当たっては、各々を単独で使用するこ
とは勿論、２種またはそれ以上の混合物として使用する
ことも出来る。さらにノヨ糖、糖蜜にインベルターゼを
働かせて得られろ転化糖等ら原料糖類として有利に利用
することかできる。

本発明においては、原料糖類を含有する培地に前記の菌
を培養してもよく、また原料糖類に前記の菌体処理物を
作用させてもよい。

本発明で用いられる「菌体処理物」とは、原料糖類を酸
化し２−ケトーＤ−グルカル酸を生成する反応に関与す
る酵素系を含む標品を意味する。該標品としては例えば
洗浄菌体、乾燥菌体、包括固定化菌体などが挙げられ、
これらは前記の微生物の培養物を適宜の処理（例、遠心
分離、ろ過１食塩水等の溶媒による洗浄、アセトン−ド
ライアイスによる乾燥、ポリアクリルアミドゲルまたは
に一カラギーナンによる包括固定化等）に付すことによ
って得られる。

原料糖類を培地に加えるに際し、使用全屯を培養当初か
ら培地に添加してもよいし、全量を何回かに分けて、ま
たは連続的に培養液に加えてもよい。

原料糖類と前記の微生物とを接触させて行なう反応にお
ける反応液中の原料糖類の濃度は、培地に対して１〜３
０％（ｗ／　ｖ）、好ましくは５〜２０％（ｗ／ｖ）で
ある。

原料糖類と菌体処理物とを接触さける方法としては、た
とえば、菌体処理物に原料糖類、２−（Ｎ−モルフォリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐ［（６，５
，０，５Ｍ）およびＣａ　ＣＯ３を加え、水で希釈して
三角フラスコ中で振盪させる方法が挙げられる。

原料糖類と前記の微生物の処理物を接触させて行なう反
応におけろ反応液中の原料糖類の濃度は、０．１〜１０
％（ｗ／ｖ）である。微生物の処理物の量は、処理油の
乾燥菌体量として１〜３０ｍｇ／ｍσである。反応液の
ｐＩ−１は、約５．５〜７，５に調整され、反応温度は
、約２０〜４０６Ｃ９反応時間は約１〜！００時間であ
る。

前記の微生物の培養に用いられる培地は、該菌株がｆｌ
Ｊ用し得る栄養源を含むらのなら液状でも固体状でもよ
いが、大量のものを得る時には液体培地を用いるのが好
ましい。

該培地には、通常微生物の培養に用いられる炭素源、窒
素源、無機塩類、有機酸塩及び微量栄養素が用いられる
。

炭素源としては前記の原料糖類がそのまま使用されうる
が、その他の補助炭素源として、例えば、グリセリン、
ンヨ糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜等が使用できる。

窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類（例、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等）、コーンスチープリカー（以下
ＣＳ　Ｌと称することもある）、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、綿実粕、尿素等の無機
または有機の窒素含有物が挙げられる。また無機塩類と
してはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅及び燐酸の塩類
が用いられる。

微量栄養素としては前記の菌の生育必須因子であろＣｏ
Ａ、パントテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン
は勿論のこと、生育及び２−ケトーＤ−グルカル酸生成
に促進的効果を示すフラビンモノヌクレオヂド（以下Ｆ
ＭＮと称することらある）。

フラビンアデニンジヌクレオヂド（以下ＦＡＤと称する
こともある）、その他のビタミン類ルーシスティン、Ｌ
−グルタミン酸、チオ硫酸ナトリウム等が化合物として
、または、それらを含むものとして天然物を適宜加えら
れる。

培養の手段は、静置培養でら、振盪培養あるいは通気攪
拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、い
わゆる深部通気攪拌培養によるのが望ましい。

培養条゛件は、勿論菌株の種類、培地の組成、その他に
よっても異なり、要するに目的物が最ら効率よく生産さ
れる様に個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、
培養温度は２５〜３５℃にて行うのがよく、培地のｐ　
Ｈは５〜９程度が望ましい。

以上の様な条件下で１０〜１２０時間培養すんば反応す
ることにより２−ケトーＤ−グルカル酸が最高濃度に蓄
積される。尚この場合目的物の生成に伴ってｐ　１４が
低下するのが一般的であるので、適当な塩基性物質、例
えば苛性ソーダ、苛性カリ。

１　　アンモニアを添加して常に微生物の２−ケトーＤ
−グルカル酸生成に最も適したｐＨに保持するのらよく
、また培地中に適当な緩衝剤を添加しておいて最適のｐ
　Ｉ−ｔが維持される様にするのもよい。

この他、前記の酸化菌とは別種の細菌の滅菌培養物を培
地成分として有効にｐＨ用することらできる。利用でき
ろ菌としては、例えば、バチルス属。

ンユードモナス属、シトロバクター属、エシェリヒア属
およびエルウィニア属に属ずろ菌が挙げられ、さらに具
体例として下記に示す菌が挙げられろ。

バチルス・セレウス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅ
ｕｓ）ＩＦＯ３１３１バチルス・ズブチリス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）ｒｈｏ　　３０２３バチルス・プミルス　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍ
ｉｌｕｓ）ＩＦＯ１２０８９バチルス・メガテリウム　（Ｉ３　ａｃｉｌｌｕｓ　　
ｍｅｇａｔｅ−ｒｉｕｍ）　　ＩＦＯ１２１０８バチルス・アミロリケファンエンス　（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｒａｃｉｅｎｓ）　　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３０２２シユードモナス・トリホリ　（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　Ｌｒ１−ｆｏｌｉｉ）　　ｒ　Ｆ　Ｏ１２
０５６シトロバクター・フロインディ　（Ｃ１ｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１２６８
１エシエリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）ＩＦｏ　　３５４６エルウィニア・ハービコラ　（Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　　ｈ
ｅｒｂｉ−ｃｏｌａ）　　ＩＰＯ１２６８にれらの細菌を、これらが生育しうる培地に、２０℃〜４
０℃で２日から４日間培養し、得られる培養液を滅菌し
、これを本酸化菌の培地に０．５〜５．０％（ｖ／　ｖ
）の割合で加え、酸化菌の生育を促進させることらでき
る。

この様にして培養液中または反応液中に生成し蓄積した
２−ケト−ローグルカル酸は、その性状を利用したそれ
自体公知の手段で分離精製することができる。２−ケト
−ローグルカル酸は遊離の酸として分離してもよく、例
えば、ナトリウム。

カリウム、カルシウム、アンモニウム等の塩として分離
してらよい。

分離の方法としては目的を阻害しないかぎり、いかなる
乙のでもよいが、例えば必要に応じて反応生成物から濾
過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行って、菌体を除
去した後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結晶を
濾取し、さらに再結晶させて目的物を取り出す方法、溶
媒抽出法、クロマトグラフィー法、塩析法などを単独で
、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利用すること
もできる。

２−ケト−ローグルカル酸が遊離型で得られる場合はこ
れを適宜の方法によって、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてしよく、ま
た塩として得られろ場合は、これを適宜の方法によって
遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。

本発明の方法によって得られる目的物が２−ケト−ロー
グルカル酸であることは、例えば元素分析、融点、旋光
度、赤外線スペクトル等の物理化学的諸性質の測定によ
って同定された。

反応液、培養液中に生成した２−ケト−ローグルカル酸
の定量は、スルホン化ポリスチレンゲル充填カラム（品
用製作所製、５ＣＲ−１０１１（カラム、７　、９ｍｍ
ｘ　３０ｃｎ＋）を用いろ高速液体クロマトグラフィー
法（移動相：ｐＨ２，２の希硫酸、流量；　０　、　５
　ｍｌ！／ｍｉｎ、検出器：示差屈折計）で行ない、標
準品としては、後述する参考例に示した様に、クルハネ
ク・ミロス（Ｋｕｌｈａｎｅｋ　　Ｍｉｌｏｓ）等のチ
ェコスロバキア特許　ＣＳ２２２，５７７（１９８４年
）に準じ、シュードモナス・エルギノーザ（ＩＦｏ　　
３４４８）を用いて、Ｄ−グルカル酸から調製した２−
ケト−ローグルカル酸を用いた。

実施例以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。なお培地の％は特に記載のない限り重ｆ
ｆｌ／容量％（Ｗ／Ｖ％）を示す。

参考例ペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、Ｄ−グルコー
ス１．０％およびに２ＨＰ０．０．１％からなる培地（
以下、ＰＹＧ培地と弥することもある）の３０雁を２０
　（７容の三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで２０分
間蒸気滅菌を行なった。このフラスコにＰＹＧ培地に２
．０％の寒天を加えて作成した斜面培地上で２８℃、２
日間生育させたシュードモナスーエルギノーサ　Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　　（Ｉ　Ｆｏ
　　３４４８）の新鮮な菌体−白金耳を植菌した。３０
℃で一昼夜回転振盪（２０Ｏｒｐｍ）培養し、種培養液
とした。

Ｄ−グルカル酸・モノカリウム塩（シグマ社製。

米国）の５％（Ｗ／Ｖ）水溶液をあらかじめｌ）Ｈを７
．０にＮａ０ＩＩで調製し、０．４５ミクロンのフィル
ターを用いてろ過除菌し、１％（Ｗ／Ｖ）になるように
ＰＹＧ培地に添加した。この培地２０Ｍ１を含む２００
威容の三角フラスコに、前述の種培養液Ｉ旋を移値し、
３０°Ｃで２４時間振盪培養した。

斯くして得られた培養液には９．０２ｍｇ／−の２−ケ
トーＤ−グルカル酸が高速液体クロマトグラフィーで認
められた。培養液５９０威から遠心分離によって除菌し
、５８０ｙ４の上ｌＷ液を得た。上清液はアンバーライ
トカチオン交換樹脂ｌＲ１２０Ｂ（Ｈ”型、ローム・ア
ンド・ハース社製、米国、２００ｄ）カラムを流下させ
、Ｉ５０蔵の脱イオン水でカラムを洗浄し、カチオン除
去した後、活性炭（７０ｄ）カラムを通し、５０威の脱
イオン水でカラムを洗浄して、脱色した。通過液７８０
歳をＣａ（ＯＨ）ｔでｐＨを６．５に調製し、ろ過によ
って自局を除いた後、減圧下において約２０蔵にまで濃
縮した。

濃縮液には白色の無定型結晶が生じる。この結晶をガラ
スフィルター上に集め、少量の冷水、メタノールおよび
エチルエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥し、５．０４ｇ
の２−ケトーＤ−グルカル酸ンカルシウム・３，５水塩
を得た。この結晶の分析値は下記に示すしおりである。

融点：１５２〜１５７℃（分解）元素分析値（Ｃ，ＨａＯ，Ｃａ・３．５Ｈ２０）（％）
：理論値：Ｃ；２３．３０．　　Ｈ；４．２４．　　Ｃ
ａ；１２．９６測定値：Ｃ；２３．１５．　　Ｉ４　；
４．１８．　　Ｃａ；１４．００比旋光度＝［α］甘甘
子＋９．Ｑ°ｃｍ１．０７５゜０、ＩＮＨＣｌ）赤外部（Ｉ　Ｒ）吸収スペクトル：主な吸収を示す波数
（ｃｍ””）　３５９０，３５００．３４００〜２７０
０（ｂｒ）注。

１６５０．１６００，１４３０，１３８０，１３６０，
１３００，１２５０，１２４０゜１２２０．１１２５，
１０９５．Ｌ０６５．１０４０，１００５．９９５．９
５５゜９００、８４０．８００．７６５．７２５注）た
だしｂｒはｂｒｏａｄを表わす。

実施例１Ｄ−グルコース２．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵母
１．０％およびＣａＣＯ３２，０％からなる種培地２０
ｇを２００藏容の三角フラスコに分注し、あらかじめ１
２０℃で２０分間蒸気滅菌した。このフラスコに、Ｄ−
ソルビトール２．５％、ペプトン１．０％、酸１ｕエキ
ス１．０％、ＣａＣ０，０，２％および寒天２．０％か
らなる斜面培地上で２８℃。

４日間生育したンユードグルコノバクター・サッカロケ
トゲネスに５９１ｓ株（ｒ；’ＥＲＭ　　ＢＰ−１１３
０、ＩＦｏ　　１４４６４）の菌体−白金耳を植菌し、
３０℃で２日間振盪（２００ｒｐｍ）培養し、種培養液
を得た。種培地と同組成の培地２００旙を１９容の三角
フラスコに分注し、上記と同様に滅菌し、このフラスコ
に種培養液１０旋を移植後、３０℃で３日間振盪培養を
行なった。

得られた培養液には、ｌ　９　、４　＋ｎｇ／ｒｄの２
−ケトーＤ−グルカル酸が生成していた。

この培養液１６００蔵を遠心分ｌ（７，００Ｏｒｐｍ、
　Ｉ　０分）して菌体を含む沈澱物を除き、上清１５２
０１ｎ１を得た。上清を４℃に冷却後、３日間静置する
と、無定型の２−ケトーＤ−グルカル酸カルンウム塩結
晶が生じる。生成した結晶をガラスフィルター（Ｎｏ、
３）上に集め、少量の冷水、メタノールおよびエチルエ
ーテルで洗浄し、五酸化リン上で減圧下に乾燥した。斯
くして、１８ｇの２−ケトーＤ−グルカル酸ジカルンウ
ム・３水塩を得た。得られた結晶の分析値は下記に示す
とおりである。

融点：１５２〜１５７°Ｃ（分解）元素分析値（ｃｓｎａｏｉｃａ・３ｏｔｏＸ％）・理論
値：Ｃ；２４．００．　　Ｈ；４，３０．　　Ｃａ；１
３．３５測定値：　Ｃ；２３．９６．　　Ｈ；４．１６
．　　Ｃａ；１３．００比旋光度：［α戸５＝＋７．９
°（ｃｍ１．０６５゜Ｏ，ＩＮＨＣＩ）赤外部（ＩＲ）吸収スペクトル・主な吸収を示す波数（
ｃｍ−’）　３５９０，３５００．３４００〜２７００
（ｂｒ）注。

１６５０．１６００，１４３０．１３８０，１３６０．
Ｈｏｏ、１２５０，１２４０゜１２２０．１１２５．１
０９５．ＩＱ６５，１０４０，１００５．９９５．９５
５゜９００．８４０．８００．７６５．７２５注）ただ
しｂｒはｂ　ｒｏａｄを表わす。

この結晶標品と標準品は同一の赤外スペクトル（第１図
および第２図）を示した。また、高速液体クロマトグラ
フィー法での保持時間（９，４分）および２１４ｎｍに
おけろ紫外部吸収と示差屈折強度との比（約１．０）は
標準品と同じであった。さらに薄層クロマトグラフィー
ではフェノール：蟻酸：水（７５・５：２５）の溶媒と
セルロースプレート（メルク社製）を用いて、両標品を
室温で３時間展開すると、同じ０２０の［値を示した。

また両者は硝酸銀試薬では黒褐色の、０−フェニレンジ
アミン試薬では黄色のアニリンフタル酸試薬では黄色の
同じ呈色を示した。

以下の分析結果からシュードグルコノバクタ−・サッカ
ロケトゲネスに５９１ｓ株のグルコース代謝産物を２−
ケトーＤ−グルカル酸であると同定した。

実施例２実施例１で示したと同じ方法でシュードグルコノバクタ
−・サッカロケトゲネスに５９１ｓ株（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１１３０，ＩＦＯ１４４６４）。

１２−５株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ１４
４６５）、１２−１５株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１３２
、ｆＦ’０　１４４８２）、１２−４株（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ１４４８３）および２２−３株
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ　　Ｉ　Ｉ　３３゜ＩＦ；’０　１
４４８４）の種培養液を調製した。

Ｃ３Ｌ３．０％、乾燥酵母０．５％、硫酸アンモニウム
０．５％、チオ硫酸ソーダ０．０５％、硫酸鉄０．２％
、　Ｃａ　ＣＯｓ　３　、０％、からなる培地（ｐＨ６
５）に第１表に示した原料糖類を別途滅菌して添加し、
醗酵培地を作成した。この醗酵培地２５滅を含む２００
滅容の三角フラスコに１．２５ｄの種培養液を移植し、
３０°Ｃで３日間振盪培養した。培養液は０．３Ｎ硫酸
で希釈し、その遠心上清について高速液体クロマトグラ
フィーで２−ケトーＤ−グルカル酸を定量した。この結
果を第１表に示す。

７２−ケトーＤ−グルコン酸は２．５％で、それ以外の
原料糖類は５．０％で添加した。

実施例３Ｄ−グルコース２．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵母
１．０％、炭酸カルシウム２．０％およびアクトコール
（消泡剤、武田薬品工業製）０．０１％からなる前培養
培地５００蔵を２９容の坂ロフラスコに分注し、１２０
℃で２０分間蒸気滅菌した。実施例１に示す斜面培地に
２８℃で４日間生育させたシュードグルコノバクタ−・
サッカロケトゲホスＩ２−５株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１
１２９，ＩＩ’；’０１４４６５）の菌体を１０ｄの滅
菌水に懸副し、全量を前記の坂ロフラスコに移植後、２
８℃で２日間、往復振盪（８５ｓｐｍ）培養して前培養
液を得た。

Ｄ−グルコース３．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵は
１．０％、炭酸力ルンウム２．０％およびアクトコール
０．０３％からなる種培養培地３０２を５０９容醗酵槽
に仕込み、１２５℃で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵
槽に前記した前培谷液ｌ、０９を移植し、攪拌２００　
ｒｐｍ、通気２４Ｑ／ｍｉｎ、内圧１　、０　Ｋｇ／ｃ
ｍ”、　２８℃の条件下で２日間培養して種培養液を得
た。

一方、実施例１の斜面培地に２８°Ｃ１２日間生育させ
たバチルス・メガテリウム（ＩＦＯ１２１０８株）の菌
体を１０ｄの滅菌水に懸濁し、その全量を前記した坂ロ
フラスコに植菌、２８℃で２日間往復振盪（８５ｓｐｍ
）培養してバチルス・メガテリウムの種培養液とした。

ショ糖４．０％、綿実粕４．０％、　Ｋ　２　ＨＰ　０
　。

０．６５％、ＫＩ（、Ｐｏ、０．５５％、硫安０．０５
％。

ＮａＣ１０，０５％、硫酸マグネシウム０．０５％およ
びパントテン酸カルシウム０．０５％からなる培地（ｐ
ｌ（７，０）３０Ｒを５０Ｑ、容醗酵槽に仕込み１２５
℃で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽にバチルス・メ
ガテリウムの種培養液１ｇを移植し、攪拌２０　Ｏｒｐ
ｍ、通気２４　ｆｌ　／ｍｉｎ、内圧１　、０　Ｋｇ／
ｃｍ２．２８℃の条件下で４日間培養した。得られた培
養液を１２０°Ｃｌ２Ｏ分間蒸気滅菌して冷所に保存し
、バチルス・メガテリウムの滅菌培養物として下記する
醗酵培地の一成分として使用した。

Ｄ−グルコース１Ｏ１０％（１２０°Ｃ，１５分間別滅
菌）、ペプトン１．０％、硫酸第一鉄０．１％、Ｌ−シ
スティン０．０１％、炭酸力ルンウム６．０％。

ＦＭＮ　　Ｉμｇ／滅、ヂアミン塩酸塩ｌμｇ／ｍｉ！
、ビオチン０．５μｇ／Ｍｌ、アクトコール０．０２％
および前記バチルス・メガテリウムの滅菌培養物４．０
％（Ｖ／Ｖ）からなる醗酵培地Ｉ２０２を２００Ｑ容醗
酵槽に仕込み、１２５℃で２０分間蒸気滅菌した。この
醗酵槽に前記の種培養液Ｉ０２を移植し、攪拌２００　
ｒｐｍ、通気９６ρ／ｍｉｎ、内圧１　、０　Ｋｇ／ｃ
ｍ”、　２８℃の条件下で４日間培養した。得られた培
養液には９９　、３　ｍｇ／ｍｅの２−ケト−ローグル
カル酸が含まれていた。

この培養液約１１０Ｑをシャープレス逮心分離機（１５
，０００ｒｐｍ）で処理して約３１Ｋｇの、グ沈り物を
得た。この湿性澱物を水＋５［）で洗浄、遠心分離（３
、ＯＯＯｒｐｍ）後、３０Ｑのアセトンに懸濁して脱水
、遠心分離（３、ＯＯＯｒｐｍ）Ｌ、て白色粉末を得た
。この白色粉末を５０°Ｃ９減圧下に一昼夜乾燥して１
４．６Ｋｇの２−ケトーＤ−グルカル酸シカルシウム塩
の白色粗粉末を得た。この粗粉末の純度は遊離の２−ケ
ト−ローグルカル酸として５８．９％であった。

実施例４参考例１と同様の方法によって得られた粗２−ケトーＤ
−グルカル酸のンカルノウム塩［高速液体クロマトグラ
フィーによる定ｌ注で２−ケト−ローグルカル酸のジカ
ルソウム塩の３水和物（Ｃ，Ｈ，０８Ｃａ−３１，１２
０）として８５．１％を含ａ］５、Ｏｇを５００蔵マイ
ヤーに入れ、これに蒸留水３００轍を加えて攪拌し懸濁
状態とした。この懸濁液に陽イオン交換樹脂１ｒ（−１
２０１３（米国ローム　アンド　ハース社製）（１１＋
型）６０藏を加え、室温で１時間かきまぜた。反応物を
グラスフィルターでろ過し、固形物を１００　ｍｌ、の
蒸留水で洗浄した。ろ液および洗浄液を合せ、減圧下に
約５０成まで濃縮し、約１０ｇのハイフロス−パーセル
（米国　ジョンマンビル社製セライト）を敷きつめたミ
リボアろ紙（米国　ミリポアｔＬＮ　　ＧｑＷＰｏ　　
４７００．孔径０．２２μｍ）で精ろ過し、さらに２０
滅の蒸留水で洗浄しろ液に合せた。ろ液の高速液体クロ
マトグラフィーによる定ｍで２．６６ｇの２−ケト−ロ
ーグルカル酸が含まれていた（回収率９０．１％）このろ液を活性炭（武田薬品工業製、クロマト用白さぎ
Ａ）ｌ　Ｏｇを充填しＬカラムを通過させ、蒸留水１０
０戒で洗浄した。流出液を２個の５００滅ナス型フラス
コに２分し、凍結乾燥法により水を留去した。７時間後
、得られた無色油状物を五酸化燐存在下、減圧で３時間
乾燥して元素分析およびＩＲスペクトルのサンプルとし
た。

元素分析値（％ＸＣ，ｌ−１ｅ０８　・ｌ　、４　Ｈ，
Ｏ）理論値：０．３０．８ｇ、　　Ｈ，４，６６測定値
：Ｃ：３１．１２．　　Ｈ，４，５７高速液体クロマト
グラフィー６、保持時間７．３０ｍ１ｎＩ　Ｒ（ｆｉｌｍ）：主な吸収を示す波数（ｃｍ−’）
　３７００−２７００．１７３０．１７ＱＯ（ｓｈ）、
１６８０（ｓｈ）、Ｌ６イ０゜ゞ注高速液体クロマトグラフィー測定条件ＨＰＬＣ：品用製作所　ＬＣ〜３Ａ型カラム　：Ａｍ１ｎｅｘ　　ｉｏｎ　　ｅｘｃｌｕｓｉ
ｏｎ　　Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｘ　−８７１−１３００ｘ７．８
ｍｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）流速　　　：０．６旋／ｍｉｎカラム温度：２５°Ｃ移動相　：０．００８Ｎ　Ｈ２ＳＯ。

検出器　：ＵＶ（２１０ｎｍ）およびＲＩ（昭和電工社
製　５Ｅ−３１型）実施例５５．０ｇの粗２−ケトーＤ−グルカル酸のシカルシウム
塩・３水和物（Ｃ，Ｈ，０ａＣａ・３ｔｒｔｏとして８
５．１％含有）から実施例４の方法に従い調製した１０
旋の２−ケｌ−−Ｄ−グルカル酸溶液（高速液体クロマ
トグラフィーによる定量で２．７１ｇ（０，０１３モル
）の２−ケトーＤ−グルカル酸を含む、収率９２．０％
）をＤｏｗｅｘ　　５０Ｗ−Ｘ　８（米国ダウケミカル
社の陽イオン交換樹脂）（Ｎａ＋型）３０旋を充填した
カラムに通す。蒸留水でカラムの溶出を行い４００ｄの
溶出液（ｐＨ３，４を示す）を得た。この溶出液を減圧
下濃縮乾固し、残留物に４００　ｒｒ＆のメタノールを
加えて攪拌すると粉末状となった。ろ取し少量のアセト
ンで洗浄後、テンケータ−中で減圧下乾燥することによ
り２．４４ｇの２−ケトーＤ−グルカル酸のモノナトリ
ウム塩を得た。収率７５．６％。

融点　１５５〜１６０°Ｃ（分解）元素分析値（％）　（Ｃｅ　Ｈ７０ｓ　Ｎ　ａ　・Ｈ２
０）理論値：Ｃ，２９，０４，Ｈ，３，６６測定値：Ｃ
；２８．７２．　　Ｈ；３．８０Ｉｎ（ＫＢｒ）主な波
数（ｃｍ−’）：　３６００−２８００．１７２０゜１
６２０．１４１０実施例６５０ｇの粗２−ケトーＤ−グルカル酸のシカルシウム塩
・３水和物（ＣａＨｅＯｅＣａ’　３ＨｔＯとして８５
．１％含有）から実施例４の方法に従い調製したＩＯｄ
の２−ケトーＤ−グルカル酸溶液（高速液体クロマトグ
ラフィーによる定量で２．７１ｇ（０，０１３モル）の
２−ケトーＤ−グルカル酸を含む）をＤｏｗｅｘ　　５
０Ｗ−Ｘ　８（Ｋ＋型）３　Ｕｄを充填したカラムに通
した。蒸留水で溶出を行ない４００滅の溶出液（ｐＨ３
，４２を示す）を得た。この溶出液を減圧下濃縮し、残
留物に４００１ｎ１．のメタノールを加えて攪拌すると
粉末状となった。ろ取し少量のアセトンで洗浄後、デシ
ケータ−中で減圧下乾燥することにより２．１２ｇの２
−ケトーＤ−グルカル酸のモノカリウム塩を得た。収率
６１．７％。

融点　１３５〜１５０°Ｃ（分解）元素分析値（％ＸＣ３Ｈ□Ｏ，Ｋ・Ｈ２０）理論値：Ｃ
；２７．２７．　１−Ｉ：３．４３測定ｇｉ：Ｃ：２６
゜８３．　　Ｈ；３．６６ＩＲ（ＫＩ３ｒ）主な波数（
ｃｍ″″’）：　３６００−２８００．１７２０゜１６
１０、１４１０実施例７第２表に示す斜面培地で生育したシュードグルコノハク
ター・サノ力ロケトゲネスに５９１ｓ株の菌体Ｉ白金耳
を第２表に示す完全培地５滅を含む試験管（１６ｍｍＸ
　ｌ　６０ｍｍ）に植菌し、３０°Ｃで２日間振盪培養
した。この培養液１ｄを同じ培地５旋を含む試験管に移
植し、４時間振盪培養した。

得られた培養液５威を無菌的に５℃で１５分間遠心分離
（１２，００Ｏｒｐｍ）して集菌し、次いでＩＯｄのト
リスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６，５，０，０５Ｍ）に懸
罰し、再び遠心分離（１２，００Ｏｒｐｍ）した。これ
を２回繰り返して得た洗浄菌体を１ｍｇ／ｒｎｌのニト
ロソグアニジンを含む上記緩衝液５成に懸濁し、３０℃
で２時間振盪して変異剤処理した。

この処理液を５℃で１５分間遠心分離（１２，０００ｒ
ｐｍＮ、て菌体を集め、１０ｄのトリスマレイン酸緩衝
液で上記と同じ様に２回洗浄して、ニトロソグアニジン
処理菌体を得た。これを０．８５％の食塩水で適当に希
釈して、＋５ｄの完全培地（固型）を含むプレート（直
径９　ｃｍ）に撒き、２８℃で５０間培養しコロニーを
生成させた。生じたコロニーを計数し、無処理のものと
比較すると、このニトロソグアニジン処理による閑の死
滅率は９０・１％であった。また完全培地プレート上の
コロニーを第３表に示す最少培地プレートにレプリカ２
８℃で３日間培養後、栄養要求変異株の出現頻度を調べ
ると約６．６％であった。

以上の様に変異剤処理した完全培地プレート上のコロニ
ーを新しい完全培地プレートに一枚当り１２株の割合で
約２ｃｍの長さに画線移植した。

２８℃で２日間培養後、成育した菌体１白金耳をＤ−グ
ルコース７．０％（別滅菌）、乾燥酵母１．０％、ペプ
トン１．０％、塩化第一鉄０．１％およびＣａＣＯ５３
，０％からなる培地（ｐＨ６，５）３ｄを含む試験管に
移植し、３０°Ｃで３日間振盪培養した。この条件下で
親株に５９１ｓ株の約２倍の２−ケトーＤ−グルカル酸
を生成したＴ　Ｈ１４−８６株（Ｉ　ＦＯ１４４６６，
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１２８）をＤ−グルコース酸化能
増強株として選択した。

第２表　完全培地（ｇ／Ｉ）Ｄ−ソルヒトール　　　　　　　　２５ペプトン　　　
　　　　　　　　ｌＯ酵母エキス　　　　　　　　　　１０ｐＩ−１６，５（固型培地では寒天２０ｇを加える。）
第３表　最少培地（ｇ／Ｉ）ショ糖　　　　　　　　　　　　５Ｋ　２　ＨＰ　０　、　　　　　　　　　　３Ｋ　Ｉ−
１２Ｐ　０　、　　　　　　　　　　１（ＮＨ，）２Ｓ
ｏ、　　　　　　　　　　ｌＮａＣｌ　　　　　　　　
　　　　　ｌＭｇ５Ｏ，−７Ｈｔ　　　　　　　　　Ｏ
，ＩＭｎＣ１２・ｎＨｚｏ　　　　　　　　　０　、０
０２し一グルタミン酸ナトリウム　　　０．１Ｌ−シス
ティン　　　　　　　　　０．ＩＣｏＡ　　　　　　　
　　　　　　　　Ｏ，００２Ｉ”ＭＮ　　　　　　　　
　　　　　　０．００２チアミン　　　　　　　　　　
　　０．００２ビオヂン　　　　　　　　　　　　　０
．００１ｐＨ７，０（固型培地では寒天２０ｇを加えろ
。）実施例８シュードグルコノバクタ−・サブ力ロケトゲネスに５９
１ｓ株から実施例７で誘導された変異株Ｔ　Ｈｌ　４−
１３６株を実施例１と同じ方法で培ｆｔして種培養液を
得た。Ｄ−グルコース３．０％、ペプトン１％、乾燥酵
母１．０％およびＣａ　ＣＯ３２、０％からなる前培養
培地２００旙をＩＱ容の三角フラスコに分注し、１２０
℃で２０分間蒸気滅菌した。このフラスコに前記した種
培養液２０〃Ｉを移随し、３０℃で２日間振盪培養して
Ｔ　Ｉ−１１４−８６株の前培養液を得た。

Ｄ−グルコース５．０％（別滅菌して加えた）、バヂル
ス・メガテリウムの滅菌培養物４．０％（Ｖ／Ｖ、実施
例３で調製した。）、ペプトン１．０％、硫安０．３％
、チオ硫酸ナトリウム０．０５％、第一燐酸カリウム０
０３％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第一鉄０．
１％、アクトコール０．０５％。

硫酸マンガン５ｍｇ／ｌ　、ＦＭＮ　　Ｉ　ｍｇ／Ｒ、
チアミンＩ　Ｂ／ρ、ビオチン０．５ｍｇ／Ｒおよび炭
酸カルシウム９．０％からなる醗酵培地の３９分を２．
４９に調製し、１２０℃で３０分間蒸気滅菌し、予め滅
菌した５９の醗酵槽に仕込んだ。

この醗酵槽に前記したＴ　Ｈｌ　４−８６株の前培養液
３００滅を移植し、３２℃９通気２．０Ｑ、／ｍｉｎ、
ｆａ拌８００　ｒｐｍの条件で培養を開始した。

一方り−グルコース３００ｇを水で溶解して６００滅と
し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌したＤ−グルコース溶
液を、培養６時間目から連続的に醗酵槽に加え、１８時
間で全量を添加した。Ｄ−グルコース添加終了後さらに
３０時間前記条件下で培養し、合計５４時間培養した。

この様にして得られた培養液（３，０５１中には１６４
．９ｍｇ／滅の２−ケトーＤ−グルカル酸が蓄積してい
た。

実施例９Ｌ−ソルボース１．０％（別滅菌）、ペプトン０．５％
および酵母エキス０．５％からなる培地（ｐＨ７，０）
２５滅を２００ｄ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃ
１１５分間蒸気滅菌した。このフラスコに第２表に示す
斜面培地で２８°Ｃ１４日間生育したシュードグルコノ
バクタ−・サッヵロケトゲネスＴ　ｔｒ　ｌ　４−８６
株の菌体１白金耳を植菌し、３０°Ｃで２日間振盪培養
して種培養液を得ｆコ。

Ｄ−グルコース５．０％（別滅菌）、ペプトン１．０％
、酵母エキス０．５％およびＣａＣ０３２、０％からな
る培地（＋１１）ｒ７．Ｑ）２５蔵を２００雁容三角フ
ラスクに分注し、１２０°Ｃ１１５分間蒸気滅菌した。

このフラスコに上記した種培養液１．０ｄを移植し、３
０℃で２日間振盪培養した。

得られた培痒液４６０雁を２０分間室温で静置後、デカ
ントして沈澱物を除き、ついて室温。

１．００Ｏｒｐｍの低速で５分間遠心分離して、主にＣ
ａＣＯ３からなる沈澱物を除き菌体懸濁液を得た。

これをさらに５°Ｃで１０分間遠心分離（６，００Ｏｒ
ｐｍ）　して菌体を集め、約１００雁の冷食塩水（０，
８５％）で２回洗浄、５℃で遠心分離（６、００Ｏｒｐ
ｍ）して洗浄菌体を得た。これを３５蔵の冷食塩水（０
，８５％）に懸濁して、洗浄菌体懸濁液とした。

この洗浄菌体懸濁液２滅にＤ−グルコース３００ｍｇ、
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩
衝液（ｐｌ■６．５，０．５Ｍ）０．５雁とＣａＣＯ３
１８０ｍｇを加え、水で総量を１０旋とし、ｔｏｏｙ容
三角フラスコ中で３０℃、２４時間振盪しながら反応さ
けた。この様にして得られた反応液中には２５　、７　
ｍｇ／ｄの２−ケト−ローグルカル酸が生成していた。

発明の効果本発明はシュードグルコノバクタ−属に属し、Ｄ−グル
コース等を２−ケト−ローグルカル酸に酸化する能力を
有する微生物を用いる方法により、２−ケト−ローグル
カル酸を収率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた結晶標品の光外部吸収ス
ペクトルを、第２図は、参考例で得られた標準品の光外
部吸収スペクトルをそれぞれ表わす。簡Ｎ皆ど層塑織　肥

Claims

【特許請求の範囲】鎖状式で表わした場合、一般式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾１は−ＣＨＯ、−ＣＨ＿２ＯＨ、または−
ＣＯＯＨを、Ｒ＾２は▲数式、化学式、表等があります
▼、▲数式、化学式、表等があります▼またはＣ＝Ｏを
それぞれ示す。］で表される化合物を２−ケト−Ｄ−グ
ルカル酸に酸化する能力を有し、シュードグルコノバク
ター属に属する細菌またはその処理物を、上記化合物に
接触させて２−ケト−Ｄ−グルカル酸を生成蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とする２−ケト−Ｄ−グル
カル酸の製造法。