JPH0738796B2

JPH0738796B2 - 醗酵法による２−ケト−ｄ−グルカル酸の製造法

Info

Publication number: JPH0738796B2
Application number: JP61312541A
Authority: JP
Inventors: 英夫白藤; 高正山口; ▲いく▼雄野上
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-12-26
Filing date: 1986-12-25
Publication date: 1995-05-01
Anticipated expiration: 2010-05-01
Also published as: CA1276122C; EP0228274A3; KR870006181A; CN86108590A; JPS62228287A; DK617386D0; DK617386A; SU1753949A3; DE3684434D1; KR950005132B1; EP0228274B1; EP0228274A2; ATE73850T1; US4876195A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、飼料のカルシウム強化助剤，洗剤のビルダ
ー，セメントの可塑剤および糖代謝研究用の試薬として
有用な２−ケト−Ｄ−グルカル酸（２−keto−Ｄ−gluc
aric acid,第Ｉ式）の醗酵法による製造法に関する。

従来の技術２−ケト−Ｄ−グルカル酸の製造法としては、これまで
グルコースの化学的酸化により合成されるＤ−グルカル
酸にシュードモナス・アエルギノーサを作用させ、微生
物酸化により２−ケト−Ｄ−グルカル酸を得る方法（チ
ェコスロバキア特許,Czech.cs222,577（1984.2.1））が
知られているにすぎない。

発明が解決しようとしている問題点しかし上記の方法においては、原料であるＤ−グルカル
酸を化学的酸化により合成するという工程が必要とさ
れ、また収率的にも工業技術として満足すべきものでは
ない。

問題点を解決するための手段本発明者らは微生物による単糖類の酸化機構を研究中、
土壌資料より分離した細菌、K591s株,12−５株,12−15
株,12−４株および22−３株がＤ−グルコース,D−フラ
クトースやその他の単糖類を炭素源とする培地で培養さ
れると、その培養液中に著量の２−ケト−Ｄ−グルカル
酸が生成蓄積されることを見いだした。また前記生産菌
の分類学的研究を行ない、これらが新しい属の新菌株で
あることを知り、鋭意研究の結果、本発明を完成するに
到った。

すなわち本発明は、鎖状式で表わした場合、一般式、［式中、R¹は−CHO,−CH₂OH,または−COOHを、R²はをそれぞれ示す。］で表される化合物を２−ケト−Ｄ−
グルカル酸に酸化する能力を有し、シュードグルコノバ
クター属に属する細菌またはその処理物を、上記化合物
に接触させて２−ケト−Ｄ−グルカル酸を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする２−ケト−Ｄ−グ
ルカル酸の製造法である。

K591s株は和歌山県の、12−５株,12−15株,12−４株お
よび22−３株は滋賀県の土壌資料からそれぞれ分離され
た細菌である。これら５株の分類学的性状を示すと次の
通りである。

K591s株,12−５株の分類学的性状（ａ）形態（１）桿菌。細胞の大きさは0.3〜0.5×0.7〜1.4μｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）グラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態（１）肉汁寒天平板培養：殆ど生育しない。酵母エキス
添加肉汁寒天平板培養では円形，全縁，平滑，乳白色。

（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度，糸
状，平滑，乳白色。

（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度，培地
全体を均一に混濁する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。

（５）リトマスミルク：酸性化する。凝固する。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は微弱であるが陽性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（MR）テストは陽性。

（４）フォーゲス・プロスカウエル（VP）テストは陰
性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（10）色素の生成は認められない。

（11）ウレアーゼを生成する。

（12）オキシダーゼは陽性。

（13）カタラーゼは陽性。

（14）16〜36℃で生育し、至適生育温度は24〜34℃。pH
5.5〜8.7で生育し、至適生育pHは6.0〜7.5。

（15）好気性。

（16）ヒュー・ライフソンのOFテストで糖の分解は酸化
的。

（17）Ｌ−アラビノース,D−キシロース,D−グルコー
ス,D−フラクトース,D−ガラクトース,D−マンノース，
麦芽糖，ショ糖，乳糖，トレハロース,D−マンニトー
ル，グリセロールから酸を生成するが、ガスは生成され
ない。

Ｄ−ソリブトール，イノシトール，デンプンから酸、ガ
スの生成は認められない。

（ｄ）その他の性質（１）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。

（２）ビオチン，チアミン，リボフラビンおよび補酵素
Ａ（以下CoAと称することもある）を生育に要求する。

（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成する。

（４）DNAのグアニン＋シトシン含量は67±１モル％。

（５）イソプレンユニット数10のユビキノン（CoQ₁₀）
を有する。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

12−15株の分類学的性状（ａ）形態（１）桿菌。細胞の大きさは0.3〜0.5×0.7〜1.4μｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）グラム陰性。

（６）非抗酸性。

（５）リトマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は陰性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（MR）テストは陽性。

（４）フォーゲス・プロスカウエル（VP）テストは陰
性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（10）色素の生成は認められない。

（11）ウレアーゼを生成する。

（12）オキシダーゼは陽性。

（13）カタラーゼは陽性。

（14）23〜32℃で生育し、至適生育温度は28〜32℃。pH
6.0〜7.5で生育し、至適生育pHは6.5〜7.1。

（15）好気性。

（17）Ｌ−アラビノース,D−キシロース,D−グルコー
ス,D−フラクトース,D−ガラクトース,D−マンノース，
麦芽糖，ショ糖，乳糖，トレハロース，グリセロールか
ら酸を生成するが、ガスは生成されない。Ｄ−マンニト
ール,D−ソルビトール，イノシトール，デンプンから
酸、ガスの生成は認められない。

（２）ビオチン，チアミン，リボフラビンおよびCoAを
生育に要求する。

（４）DNAのグアニン＋シトシン含量は67±１モル％。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

12−４株の分類学的性状（ａ）形態（１）桿菌。細胞の大きさは0.3〜0.5×0.7〜1.4μｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）グラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態（１）肉汁寒天平板培養：微少コロニーとしてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形，全縁，平滑，乳白色。

（５）リトマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸の還元は陰性。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（MR）テストは陽性。

（４）フォーゲス・プロスカウエル（VP）テストは陰
性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成する。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（10）色素の生成は認められない。

（11）ウレアーゼを生成する。

（12）オキシダーゼは陽性。

（13）カタラーゼは陽性。

（14）16〜36℃で生育し、至適生育温度は24〜34℃。pH
5.5〜8.2で生育し、至適生育pHは6.0〜7.5。

（15）好気性。

（２）ビオチン，チアミンおよびリボフラビンとCoAま
たはパントテン酸を生育に要求する。

（４）DNAのグアニン＋シトシン含量は67±１モル％。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

22−３株の分類学的性状（ａ）形態（１）桿菌。細胞の大きさは0.3〜0.5×0.7〜1.4μｍ。

（２）細胞の多形性は認められない。

（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）グラム陰性。

（６）非抗酸性。

（５）リトマスミルク：酸性化するが凝固しない。

（２）脱窒反応は認められない。

（３）メチルレッド（MR）テストは陽性。

（４）フォーゲス・プロスカウエル（VP）テストは陰
性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンを加水分解しない。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を利用する。

（10）色素の生成は認められない。

（11）ウレアーゼを生成する。

（12）オキシダーゼは陽性。

（13）カタラーゼは陽性。

（14）16〜38℃で生育し、至適生育温度は24〜34℃。pH
5.5〜8.7で生育し、至適生育pHは6.0〜7.8。

（15）好気性。

（３）グリセロールからハイドロオキシアセトンを生成
する。

（４）DNAのグアニン＋シトシン含量は67±１モル％。

（６）ストレプトマイシンに耐性を有する。

以上土壌分離細菌５株の分類学的諸性質を、バージーズ
・マニュアル・オブ・デタミネーティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′ｓ manual of Determinative Bacte
riology）第８版（1974年）およびバージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgey′ｓ manual of Systematic Bacteriology）第
１巻（1984年）に照合してみると、５菌株即ち、K591s
株,12−５株,12−15株,12−４株と22−３株は、グラム
陰性，極鞭毛を有する運動性桿菌で、好気性、オキシダ
ーゼ陽性であることからシュードモナス（Pseudomona
s）属細菌種と一応は考えられる。生育因子を要求する
こと、DNAのグアニンとシトシンとの総含量が67±１モ
ル％であること、キノン系はイソプレンユニット数10の
ユビキノンであることから、この属のセクションIVのRN
AクループIVに属するジュードモナス・ディミニュタ（P
seudomonas diminuta），シュードモナス・ベシクユラ
リス（Pseudomonas vesicularis）に類似している。

しかしながらエタノールから微弱ながらも酢酸を生成す
ること、グリセロールからジハイドロオキシアセトンを
生成することはシュードモナス属菌の性質とは異なる。

これらの性質は、グルコノバクター（Gluconobacter）
属菌種のそれである。しかしまたこれ等５菌株はオキシ
ダーゼが陽性であること、pH4.5では生育できないこ
と，糖（力源）を含まない酵母エキス添加肉汁培地また
はペプトン−酵母エキス培地でよく生育出来ること、DN
Aグアニンとシトシンとの総含量が67±１モル％である
こと等の性質はグルコノバクター属の菌種のそれとは異
なる。

従って、これら５菌株即ち、K591s株,12−５株,12−15
株,12−４株と22−３株は既知の属に該当するものを見
い出だすことが出来ず新しい属の新菌種とみなさざるを
得ない。そこでK591s株,12−５株,12−15株,12−４株と
22−３株の５菌株はシュードグルコノバクター・サッカ
ロケトゲネス（Pseuogluconobacter saccharoketogene
s）と命名された。

以下これらの菌株および後述のTH14−86株を酸化菌と称
することもある。ここでこれ等５菌株の栄養要求性につ
いて触れると、K591s株,12−５株および12−15株はCoA
を生育に要求する珍しい性質を有している。これら３株
のCoA要求性はパントテン酸によって代替することは出
来ない。一方12−４株および22−３株はCoA存在下でも
またパントテン酸存在下においても生育出来る。

本発明に用いられる菌株は上記した５菌株は勿論のこ
と、例えば、５菌株を紫外線やＸ線照射したり、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ニトロ
ソグアニジン），メチルメタンスルホン酸，ナイトロジ
エンマスタードの様な変異誘起剤で処理して得られる変
異株も有利に用いられる。その例としてシュードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲネスK591sからニトロソグ
アニジン処理によって誘導されたTH14−86株を挙げるこ
とができる。TH14−86株は後述する原料糖類から２−ケ
ト−Ｄ−グルカル酸生成能が増強されている他は、親株
であるK591s株と同じ分類学的性質を示した。

上記シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスK5
91s株,12−５株およびTH14−86株は、昭和60年（1985
年）９月19日に、シュードグルコノバクター・サッカロ
ケトゲネス12−15株,12−４株および22−３株は、昭和6
0年（1985年）12月16日に財団法人発酵研究所（IFO）に
受託番号IFO14464,IFO14465,IFO14466,IFO14482,IFO144
83,およびIFO14484としてそれぞれ寄託され、またシュ
ードグルコノバクター・サッカロケトゲネスK591s株,12
−５株およびTH14−86株は昭和60年10月７日に、シュー
ドグルコノバクター・サッカロケトゲネス12−15株,12
−４株および22−３株は昭和60年12月20日に通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FER
M P−8481,FERM P−8480,FERM P−8479,FERM P−8577,F
ERM P−8576およびFERM P−8578としてそれぞれ受託さ
れ、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられ
て、下記に示す受託番号として同研究所に保管されてい
る。

本発明において用いられる化合物（II）の具体例として
は、たとえば、Ｄ−グルコース,D−フラクトース,D−マ
ンノース,D−ソルビット,D−マンニット,D−グルコン
酸,2−ケト−Ｄ−グルコル酸,D−グルコソンおよびＤ−
マンノン酸などが挙げられる。以下、これを「原料糖
類」と称することもある。

原料糖類を使うに当たっては、各々を単独で使用するこ
とは勿論、２種またはそれ以上の混合物として使用する
ことも出来る。さらにショ糖、糖蜜にインベルターゼを
働かせて得られる転化糖等も原料糖類として有利に利用
することができる。

本発明においては、原料糖類を含有する培地に前記の菌
を培養してもよく、また原料糖類に前記の菌体処理物を
作用させてもよい。

本発明で用いられる「菌体処理物」とは、原料糖類を酸
化し２−ケト−Ｄ−グルカル酸を生成する反応に関与す
る酵素系を含む標品を意味する。該標品としては例えば
洗浄菌体，乾燥菌体，包括固定化菌体などが挙げられ、
これらは前記の微生物の培養物を適宜の処理（例、遠心
分離，ろ過，食塩水等の溶媒による洗浄，アセトン−ド
ライアイスによる乾燥，ポリアクリルアミドゲルまたは
Ｋ−カラギーナンによる包括固定化等）に付すことによ
って得られる。

原料糖類を培地に加えるに際し、使用全量を培養当初か
ら培地に添加してもよいし、全量を何回かに分けて、ま
たは連続的に培養液に加えてもよい。

原料糖類と前記の微生物とを接触させて行なう反応にお
ける反応液中の原料糖類の濃度は、培地に対して１〜30
％（w/v）、好ましくは５〜20％（w/v）である。

原料糖類と菌体処理物とを接触させる方法としては、た
とえば、菌体処理物に原料糖類,2−（Ｎ−モルフォリ
ノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH6.5,0.5M）お
よびCaCO₃を加え、水で希釈して三角フラスコ中で振盪
させる方法が挙げられる。

原料糖類と前記の微生物の処理物を接触させて行なう反
応における反応液中の原料糖類の濃度は、0.1〜10％（w
/v）である。微生物の処理物の量は、処理前の乾燥菌体
量として１〜30mg/mlである。反応液のpHは、約5.5〜7.
5に調整され、反応温度は、約20〜40℃，反応時間は約
１〜100時間である。

前記の微生物の培養に用いられる培地は、該菌株が利用
し得る栄養源を含むものなら液状でも固体状でもよい
が、大量のものを得る時には液体培地を用いるのが好ま
しい。

該培地には、通常微生物の培養に用いられる炭素源，窒
素源，無機塩類，有機酸塩及び微量栄養素が用いられ
る。

炭素源としては前記の原料糖類がそのまま使用されうる
が、その他の補助炭素源として、例えば、グリセリン，
ショ糖，乳糖，麦芽糖，糖蜜等が使用できる。

窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類（例、硫酸
アンモニウム，硝酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
リン酸アンモニウム等），コーンスチープリカー（以下
CSLと称することもある），ペプトン，肉エキス，酵母
エキス，乾燥酵母，大豆粉，綿実粕，尿素等の無機また
は有機の窒素含有物が挙げられる。また無機塩類として
はカリウム，ナトリウム，カルシウム，マグネシウム，
鉄，マンガン，コバルト，亜鉛，銅及び燐酸の塩類が用
いられる。

微量栄養素としては前記の菌の生育必須因子であるCoA,
パントテン酸，ビオチン，チアミン，リボフラビンは勿
論のこと、生育及び２−ケト−Ｄ−グルカル酸生成に促
進的効果を示すフラビンモノヌクレオチド（以下FMNと
称することもある），フラビンアデニンジヌクレオチド
（以下FADと称することもある），その他のビタミン類,
L−システイン,L−グルタミン酸，チオ硫酸ナトリウム
等が化合物として、または、それらを含むものとして天
然物を適宜加えられる。

培養の手段は、静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹
拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、い
わゆる深部通気撹拌培養によるのが望ましい。

培養条件は、勿論菌株の種類，培地の組成，その他によ
っても異なり、要するに目的物が最も効率よく生産され
る様に個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、培
養温度は25〜35℃にて行うのがよく、培地のpHは５〜９
程度が望ましい。以上の様な条件下で10〜120時間培養
または反応することにより２−ケト−Ｄ−グルカル酸が
最高濃度に蓄積される。尚この場合目的物の生成に伴っ
てpHが低下するのが一般的であるので、適当な塩基性物
質、例えば苛性ソーダ，苛性カリ，アンモニアを添加し
て常に微生物の２−ケト−Ｄ−グルカル酸生成に最も適
したpHに保持するのもよく、また培地中に適当な緩衝剤
を添加しておいて最適のpHが維持される様にするのもよ
い。

この他、前記の酸化菌とは別種の細菌の滅菌培養物を培
地成分として有効に利用することもできる。利用できる
菌としては、例えば、バチルス属，シュードモナス属，
シトロバクター属，エシェリヒア属およびエルウィニア
属に属する菌が挙げられ、さらに具体例として下記に示
す菌が挙げられる。

バチルス・セレウス（Bacillus cereus）IFO 3131 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）IFO 302
3 バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）IFO 12089 バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）IFO
12108 バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amylol
iquefaciens）IFO 3022 シュードモナス・トリホリ（Pseudomonas trifolii）IF
O 12056 シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundi
i）IFO 12681 エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）IFO 3546 エルウィニア・ハービコラ（Erwinia herbicola）IFO
12686 これらの細菌を、これらが生育しうる培地に、20℃〜40
℃で２日から４日間培養し、得られる培養液を滅菌し、
これを本酸化菌の培地に0.5〜5.0％（v/v）を割合で加
え、酸化菌の生育を促進させることもできる。

この様にして培養液中または反応液中に生成し蓄積した
２−ケト−Ｄ−グルカル酸はその性状を利用したそれ自
体公知の手段で分離精製することができる。２−ケト−
Ｄ−グルカル酸は遊離の酸としてもよく、例えば、ナト
リウム，カリウム，カルシウム，アンモニウム等の塩と
して分離してもよい。

分離の方法としては目的を阻害しないかぎり、いかなる
ものでもよいが、例えば必要に応じて反応生成物から濾
過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行って、菌体を除
去した後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結晶を
濾取し、さらに再結晶させて目的物を取り出す方法、溶
媒抽出法、クロマトグラフィー法、塩析法などを単独
で、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利用するこ
ともできる。

２−ケト−Ｄ−グルカル酸が遊離型で得られる場合はこ
れを適宜の方法によって、例えば、ナトリウム，カリウ
ム，カルシウム，アンモニウム等の塩にしてもよく、ま
た塩として得られる場合は、これを適宜の方法によって
遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。

本発明の方法によって得られる目的物が２−ケト−Ｄ−
グルカル酸であることは、例えば元素分析，融点，旋光
度，赤外線スペクトル等の物理化学的諸性質の測定によ
って同定された。

反応液，培養液中に生成した２−ケト−Ｄ−グルカル酸
の定量は、スルホン化ポリスチレンゲル充填カラム（島
津製作所製,SCR−101Hカラム、7.9mm×30cm）を用いる
高速液体クロマトグラフィー法（移動相:pH2.2の希硫
酸，流量;0.5ml/min,検出器：示差屈折計）で行ない、
標準品としては、後述する参考例に示した様に、クルハ
ネク・ミロス（Kulhanek Milos）等のチェコスロバキ
ア特許CS222,577（1984年）に準じ、シュードモナス・
エルギノーサ（IFO 3448）を用いて、Ｄ−グルカル酸
から調製した２−ケト−Ｄ−グルカル酸を用いた。

実施例以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。なお培地の％は特に記載のない限り重量
／容量％（W/V％）を示す。

参考例ペプトン0.5％，酵母エキス0.5％,D−グルコース1.0％
およびK₂HPO₄0.1％からなる培地（以下、PYG培地と称す
ることもある）の30mlを200ml容の三角フラスコに分注
し、120℃で20分間蒸気滅菌を行なった。このフラスコ
にPYG培地に2.0％の寒天を加えて作成した斜面培地上で
28℃、２日間生育させたシュードモナス・エルギノーサ
Pseudomonas aeruginosa（IFO 3448）の新鮮な菌体一
白金耳を植菌した。30℃で一昼夜回転振盪（200rpm）培
養し、種培養液とした。

Ｄ−グルカル酸・モノカリウム塩（シグマ社製，米国）
の５％（W/V）水溶液をあらかじめpHを7.0にNaOHで調製
し、0.45ミクロンのフィルターを用いてろ過除菌し、１
％（W/V）になるようにPYG培地に添加した。この培地20
mlを含む200ml容の三角フラスコに、前述の種培養液1ml
を移植し、30℃で24時間振盪培養した。斯くして得られ
た培養液には9.02mg/mlの２−ケト−Ｄ−グルカル酸が
高速液体クロマトグラフィーで認められた。培養液590m
lから遠心分離によって除菌し、580mlの上清液を得た。
上清液はアンバーライトカチオン交換樹脂IR120B（H
⁺型，ローム・アンド・ハース社製，米国,200ml）カラ
ムを流下させ、150mlの脱イオン水でカラムを洗浄し、
カチオン除去した後、活性炭（70ml）カラムを通し、50
mlの脱イオン水でカラムを洗浄して、脱色した。通過液
780mlをCa（OH）_２でpHを6.5に調製し、ろ過によって白
濁を除いた後、減圧下において約20mlにまで濃縮した。

濃縮液には白色の無定型結晶が生じる。この結晶をガラ
スフィルター上に集め、少量の冷水，メタノールおよび
エチルエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥し、5.04gの２
−ケト−Ｄ−グルカル酸ジカルシウム・3.5水塩を得
た。この結晶の分析値は下記に示すしおりである。

融点:152〜157℃（分解）元素分析値（C₆H₆O₈Ca・3.5H₂O）（％）：理論値:C;23.30,H;4.24,Ca;12.96 測定値:C;23.15,H;4.18,Ca;14.00 比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＝＋9.0゜（ｃ＝1.075,0.1NHC
l）赤外部（IR）吸収スペクトル：主な吸収を示す波数（cm
^-1）3590,3500,3400〜2700（br）^注,1650,1600,1430,13
80,1360,1300,1250,1240,1220,1125,1095,1065,1040,10
05,995,955,900,840,800,765,725 注）ただしbrはbroadを表わす。

実施例１Ｄ−グルコース2.0％，ペプトン1.0％，乾燥酵母1.0％
およびCaCO₃2.0％からなる種培地20mlを200ml容の三角
フラスコに分注し、あらかじめ120℃で20分間蒸気滅菌
した。このフラスコに、Ｄ−ソルビトール2.5％，ペプ
トン1.0％，酵母エキス1.0％,CaCO₃0.2％および寒天2.0
％からなる斜面培地上で28℃,4日間生育したシュードグ
ルコノバクター・サッカロケトゲネスK591s株（FERM B
P−1130,IFO 14464）の菌体一白金耳を植菌し、30℃に
２日間振盪（200rpm）培養し、種培養液を得た。種培地
と同組成の培地200mlを１容の三角フラスコに分注
し、上記と同様に滅菌し、このフラスコに種培養液10ml
を移植後、30℃で３日間振盪培養を行なった。

得られた培養液には、19.4mgmlの２−ケト−Ｄ−グルカ
ル酸が生成していた。

この培養液1600mlを遠心分離（7,000rpm,10分）して菌
体を含む沈澱物を除き、上清1520mlを得た。上清を４℃
に冷却後、３日間静置すると、無定型の２−ケト−Ｄ−
グルカル酸カルシウム塩結晶が生じる。生成した結晶を
ガラスフィルター（No.3）上に集め、少量の冷水，メタ
ノールおよびエチルエーテルで洗浄し、五酸化リン上で
減圧下に乾燥した。斯くして、18gの２−ケト−Ｄ−グ
ルカル酸ジカルシウム・３水塩を得た。得られた結晶の
分析値は下記に示すとおりである。

融点:152〜157℃（分解）元素分析値（C₆H₆O₈Ca・3H₂O）（％）：理論値:C;24.00,H;4.30,Ca;13.35 測定値:C;23.96,H;4.16,Ca;13.00 比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＝＋7.9゜（ｃ＝1.065,0.1NHC
l）赤外部（IR）吸収スペクトル：主な吸収を示す波数（cm
^-1）3590,3500,3400〜2700（br）^注,1650,1600,1430,13
80,1360,1300,1250,1240,1220,1125,1095,1065,1040,10
05,995,955,900,840,800,765,725 注）ただしbrはbroadを表わす。

この結晶標品と標準品は同一の赤外スペクトル（第１図
および第２図）を示した。また、高速液体クロマトグラ
フィー法での保持時間（9.4分）および214nmにおける紫
外部吸収と示差屈折強度との比（約1.0）は標準品と同
じであった。さらに薄層クロマトグラフィーではフェノ
ール：蟻酸：水（75:5:25）の溶媒とセルロースプレー
ト（メルク社製）を用いて、両標品を室温で３時間展開
すると、同じ0.20のRf値を示した。また両者は硝酸銀試
薬では黒褐色の、Ｏ−フェニレンジアミン試薬では黄色
のアニリンフタル酸試薬では黄色の同じ呈色を示した。

以下の分析結果からシュードグルコノバクター・サッカ
ロケトゲネスK591s株のグルコース代謝産物を２−ケト
−Ｄ−グルカル酸であると同定した。

実施例２実施例１で示したと同じ方法でシュードグルコノバクタ
ー・サッカロケトゲネスK591s株（FERM BP−1130,IFO
14464）,12−５株（FERM BP−1129,IFO 14465）,12
−15株（FERM BP−1132,IFO 14482）,12−４株（FERM
BP−1131,IFO 14483）および22−３株（FERM BP−1
133,IFO 14484）の種培養液を調製した。CSL3.0％，乾
燥酵母0.5％，硫酸アンモニウム0.5％，チオ硫酸ソーダ
0.05％，硫酸鉄0.2％,CaCO₃3.0％，からなる培地（pH6.
5）に第１表に示した原料糖類を別途滅菌して添加し、
醗酵培地を作成した。この醗酵培地25mlを含む200ml容
の三角フラスコに1.25mlの種培養液を移植し、30℃で３
日間振盪培養した。培養液は0.3N硫酸で希釈し、その遠
心上清について高速液体クロマトグラフィーで２−ケト
−Ｄ−グルカル酸を定量した。この結果を第１表に示
す。

実施例３Ｄ−グルコース2.0％，ペプトン1.0％，乾燥酵母1.0
％，炭酸カルシウム2.0％およびアクトコール（消泡
剤，武田薬品工業製）0.01％からなる前培養培地500ml
を２容の坂口フラスコに分注し、120℃で20分間蒸気
滅菌した。実施例１に示す斜面培地に28℃で４日間生育
させたシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス
12−５株（FERM BP−1129,IFO 14465）の菌体を10ml
の滅菌水に懸濁し、全量を前記の坂口フラスコに移植
後、28℃で２日間、往復振盪（85spm）培養して前培養
液を得た。

Ｄ−グルコース3.0％，ペプトン1.0％，乾燥酵母1.0
％，炭酸カルシウム2.0％およびアクトコール0.03％か
らなる種培養培地30を50容醗酵槽に仕込み、125℃
で20分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に前記した前培養液
1.0を移植し、撹拌200rpm,通気24/min,内圧1.0Kg/c
m²,28℃の条件下で２日間培養して種培養液を得た。

一方、実施例１の斜面培地に28℃、２日間生育させたバ
チルス・メガテリウム（IFO 12108株）の菌体を10mlの
滅菌水に懸濁し、その全量を前記した坂口フラスコに植
菌、28℃で２日間往復振盪（85spm）培養してバチルス
・メガテリウムの種培養液とした。

ショ糖4.0％，綿実粕4.0％,K₂HPO₄0.65％,KH₂PO₄0.55
％，硫安0.05％,NaCl0.05％，硫酸マグネシウム0.05％
およびパントテン酸カルシウム0.05％からなる培地（pH
7.0）30を50容醗酵槽に仕込み125℃で20分間蒸気滅
菌した。この醗酵槽にバチルス・メガテリウムの種培養
液１を移植し、撹拌200rpm,通気24/min,内圧1.0Kg/
cm²,28℃の条件下で４日間培養した。得られた培養液を
120℃,20分間蒸気滅菌して冷所に保存し、バチルス・メ
ガテリウムの滅菌培養物として下記する醗酵培地の一成
分として使用した。Ｄ−グルコース10.0％（120℃,15分
間別滅菌），ペプトン1.0％，硫酸第一鉄0.1％,L−シス
テイン0.01％，炭酸カルシウム6.0％,FMN1μg/ml,チア
ミン塩酸塩１μg/ml,ビオチン0.5μg/ml,アクトコール
0.02％および前記バチルス・メガテリウムの滅菌培養物
4.0％（V/V）からなる醗酵培地120を200容醗酵槽に
仕込み、125℃で20分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に前
記の種培養液10を移植し、撹拌200rpm,通気96/min,
内圧1.0Kg/cm²,28℃の条件下で４日間培養した。得られ
た培養液には99.3mg/mlの２−ケト−Ｄ−グルカル酸が
含まれていた。

この培養液約110をシャープレス遠心分離機（15,000r
pm）で処理して約31Kgの湿沈澱物を得た。この湿沈澱物
を水150で洗浄，遠心分離（3,000rpm）後、30のア
セトンに懸濁して脱水，遠心分離（3,000rpm）して白色
粉末を得た。この白色粉末を50℃，減圧下に一昼夜乾燥
して14.6Kgの２−ケト−Ｄ−グルカル酸ジカルシウム塩
の白色粗粉末を得た。この粗粉末の純度は遊離の２−ケ
ト−Ｄ−グルカル酸として58.9％であった。

実施例４参考例１と同様の方法によって得られた粗２−ケト−Ｄ
−グルカル酸のジカルシウム塩［高速液体クロマトグラ
フィーによる定量^※注で２−ケト−Ｄ−グルカル酸のジ
カルシウム塩の３水和物（C₆H₆O₈Ca・3H₂O）として85.1
％を含有］5.0gを500mlマイヤーに入れ、これに蒸留水3
00mlを加えて撹拌し懸濁状態とした。この懸濁液に陽イ
オン交換樹脂IR−120B（米国ロームアンドハース
社製）（H⁺型）60mlを加え、室温で１時間かきまぜた。
反応物をグラスフィルターでろ過し、固形物を100mlの
蒸留水で洗浄した。ろ液および洗浄液を合せ、減圧下に
約50mlまで濃縮し、約10gのハイフロスーパーセル（米
国ジョンマンビル社製セライト）を敷きつめたミリポ
アろ紙（米国ミリポア社製 GSWPO 4700,孔径0.22μ
ｍ）で精ろ過し、さらに20mlの蒸留水で洗浄しろ液に合
せた。ろ液の高速液体クロマトグラフィーによる定量で
2.66gの２−ケト−Ｄ−グルカル酸が含まれていた（回
収率90.1％）このろ液を活性炭（武田薬品工業製、クロマト用白さぎ
Ａ）10gを充填したカラムを通過させ、蒸留水100mlで洗
浄した。流出液を２個の500mlナス型フラスコに２分
し、凍結乾燥法により水を留去した。７時間後、得られ
た無色油状物を五酸化燐存在下、減圧で３時間乾燥して
元素分析およびIRスペクトルのサンプルとした。

元素分析値（％）（C₆H₈O₈・1.4H₂O）理論値:C;30.88,H;4.66 測定値:C;31.12,H;4.57 高速液体クロマトグラフィー^※：保持時間 7.30min IR（film）：主な吸収を示す波数（cm^-1）3700−2700,1
730,1700（sh）,1680（sh）,1640,^※ 注高速液体クロマトグラフィー測定条件 HPLC:島津製作所 LC−3A型カラム:Aminex ion exclusion HPX−87H 300×7.8m
m（Bio−rad社製）流速:0.6ml/min カラム温度:25℃ 移動相:0.008N H₂SO₄ 検出器:UV（210nm）およびRI（昭和電工社製 SE−31
型）実施例５ 5.0gの粗２−ケト−Ｄ−グルカル酸のジカルシウム塩・
３水和物（C₆H₆O₈Ca・3H₂Oとして85.1％含有）から実施
例４の方法に従い調製した10mlの２−ケト−Ｄ−グルカ
ル酸溶液（高速液体クロマトグラフィーによる定量で2.
71g（0.013モル）の２−ケト−Ｄ−グルカル酸を含む，
収率92.0％）をDowex 50W−X8（米国ダウケミカル社の
陽イオン交換樹脂）（Na⁺型）30mlを充填したカラムに
通す。蒸留水でカラムの溶出を行い400mlの溶出液（pH
3.4を示す）を得た。この溶出液を減圧下濃縮乾固し、
残留物に400mlのメタノールを加えて撹拌すると粉末状
となった。ろ取し少量のアセトンで洗浄後、デシケータ
ー中で減圧下乾燥することにより2.44gの２−ケト−Ｄ
−グルカル酸のモノナトリウム塩を得た。収率75.6％。

融点 155〜160℃（分解）元素分析値（％）（C₆H₇O₈Na・H₂O）理論値:C;29.04,H;3.66 測定値:C;28.72,H;3.80 IR（KBr）主な波数（cm^-1）:3600−2800,1720,1620,141
0 実施例６ 5.0gの粗２−ケト−Ｄ−グルカル酸のジカルシウム塩・
３水和物（C₆H₆O₈Ca・3H₂Oとして85.1％含有）から実施
例４の方法に従い調製した10mlの２−ケト−Ｄ−グルカ
ル酸溶液（高速液体クロマトグラフィーによる定量で2.
71g（0.013モル）の２−ケト−Ｄ−グルカル酸を含む）
をDowex 50W−X8（K⁺型）30mlを充填したカラムに通し
た。蒸留水で溶出を行ない400mlの溶出液（pH3.42を示
す）を得た。この溶出液を減圧下濃縮し、残留物に400m
lのメタノールを加えて撹拌すると粉末状となった。ろ
取し少量のアセトンで洗浄後、デシケーター中で減圧下
乾燥することにより2.12gの２−ケト−Ｄ−グルカル酸
のモノカリウム塩を得た。収率61.7％。

融点 135〜150℃（分解）元素分析値（％）（C₆H₇O₈K・H₂O）理論値:C;27.27,H;3.43 測定値:C;26.83,H;3.66 IR（KBr）主な波数（cm^-1）:3600−2800,1720,1610,141
0 実施例７第２表に示す斜面培地で生育したシュードグルコノバク
ター・サッカロケトゲネスK591s株の菌体１白金耳を第
２表に示す完全培地5mlを含む試験管（16mm×160mm）に
植菌し、30℃で２日間振盪培養した。この培養液1mlを
同じ培地5mlを含む試験管に移植し、４時間振盪培養し
た。得られた培養液5mlを無菌的に５℃で15分間遠心分
離（12,000rpm）して集菌し、次いで10mlのトリスマレ
イン酸緩衝液（pH6.5,0.05M）に懸濁し、再び遠心分離
（12,000rpm）した。これを２回繰り返して得た洗浄菌
体を1mg/mlのニトロソグアニジンを含む上記緩衝液5ml
に懸濁し、30℃で２時間振盪して変異剤処理した。この
処理液を５℃で15分間遠心分離（12,000rpm）して菌体
を集め、10mlのトリスマレイン酸緩衝液で上記と同じ様
に２回洗浄して、ニトロソグアニジン処理菌体を得た。
これを0.85％の食塩水で適当に希釈して、15mlの完全培
地（固型）を含むプレート（直径9cm）に撒き、28℃で
５日間培養しコロニーを生成させた。生じたコロニーを
計数し、無処理のものと比較すると、このニトロソグア
ニジン処理による菌の死滅率は90.4％であった。また完
全培地プレート上のコロニーを第３表に示す最少培地プ
レートにレプリカ28℃で３日間培養後、栄養要求変異株
の出現頻度を調べると約6.6％であった。

以上の様に変異剤処理した完全培地プレート上のコロニ
ーを新しい完全培地プレートに一枚当り12株の割合で約
2cmの長さに画線移植した。28℃で２日間培養後、成育
した菌体１白金耳をＤ−グルコース7.0％（別滅菌），
乾燥酵母1.0％，ペプトン1.0％，塩化第一鉄0.1％およ
びCaCO₃3.0％からなる培地（pH6.5）3mlを含む試験管に
移植し、30℃で３日間振盪培養した。この条件下で親株
K591s株の約２倍の２−ケト−Ｄ−グルカル酸を生成し
たTH14−86株（IFO 14466,FERM BP−1128）をＤ−グ
ルコース酸化能増強株として選択した。

第２表完全倍地（g/）Ｄ−ソルビトール 25 ペプトン 10 酵母エキス 10 pH6.5（固型培地では寒天20gを加える。）第３表最少培地（g/）ショ糖５ K₂HPO₄ ３ KH₂PO₄ １（NH₄）₂SO₄ １ NaCl １ MgSO₄・7H₂ 0.1 MnCl₂・nH₂O 0.002 Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 0.1 Ｌ−システイン 0.1 CoA 0.002 FMN 0.002 チアミン 0.002 ビオチン 0.001 pH7.0（固型培地では寒天20gを加える。）実施例８シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスK591s
株から実施例７で誘導された変異株TH14−86株を実施例
１と同じ方法で培養して種培養液を得た。Ｄ−グルコー
ス3.0％，ペプトン１％，乾燥酵母1.0％およびCaCO₃2.0
％からなる前培養培地200mlを１容の三角フラスコに
分注し、120℃で20分間蒸気滅菌した。このフラスコに
前記した種培養液20mlを移植し、30℃で２日間振盪培養
してTH14−86株の前培養液を得た。

Ｄ−グルコース5.0％（別滅菌して加えた），バチルス
・メガテリウムの滅菌培養物4.0％（V/V,実施例３で調
製した。），ペプトン1.0％，硫安0.3％，チオ硫酸ナト
リウム0.05％，第一燐酸カリウム0.03％，硫酸マグネシ
ウム0.05％，硫酸第一鉄0.1％，アクトコール0.05％，
硫酸マンガン5mg/,FMN1mg/，チアミン1mg/，ビオ
チン0.5mg/および炭酸カルシウム9.0％からなる醗酵
培地の３分を2.4に調製し、120℃で30分間蒸気滅菌
し、予め滅菌した５の醗酵槽に仕込んだ。

この醗酵槽に前記したTH14−86株の前培養液300mlを移
植し、32℃，通気2.0/min,撹拌800rpmの条件で培養を
開始した。

一方Ｄ−グルコース300gを水で溶解して600mlとし、120
℃で20分間蒸気滅菌したＤ−グルコース溶液を、培養６
時間目から連続的に醗酵槽に加え、18時間で全量を添加
した。Ｄ−グルコース添加終了後さらに30時間前記条件
下で培養し、合計54時間培養した。この様にして得られ
た培養液（3.05）中には164.9mg/mlの２−ケト−Ｄ−
グルカル酸が蓄積していた。

実施例９Ｌ−ソルボース1.0％（別滅菌），ペプトン0.5％および
酵母エキス0.5％からなる培地（pH7.0）25mlを200ml容
三角フラスコに分注し、120℃,15分間蒸気滅菌した。こ
のフラスコに第２表に示す斜面培地で28℃、４日間生育
したシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスTH
14−86株の菌体１白金耳を植菌し、30℃で２日間振盪培
養して種培養液を得た。Ｄ−グルコース5.0％（別滅
菌），ペプトン1.0％，酵母エキス0.5％およびCaCO₃2.0
％からなる培地（pH7.0）25mlを200ml容三角フラスコに
分注し、120℃,15分間蒸気滅菌した。このフラスコに上
記した種培養液1.0mlを移植し、30℃で２日間振盪培養
した。

得られた培養液460mlを20分間室温で静置後、デカント
して沈澱物を除き、ついで室温,1,000rpmの低速で５分
間遠心分離して、主にCaCO₃からなる沈澱物を除き菌体
懸濁液を得た。これをさらに５℃で10分間遠心分離（6,
000rpm）して菌体を集め、約100mlの冷食塩水（0.85
％）で２回洗浄、５℃で遠心分離（6,000rpm）して洗浄
菌体を得た。これを35mlの冷食塩水（0.85％）に懸濁し
て、洗浄菌体懸濁液とした。

この洗浄菌体懸濁液2mlにＤ−グルコース300mg,2−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH6.
5,0.5M）0.5mlとCaCO₃180mgを加え、水で総量を10mlと
し、100ml容三角フラスコ中で30℃,24時間振盪しながら
反応させた。この様にして得られた反応液中には25.7mg
/mlの２−ケト−Ｄ−グルカル酸が生成していた。

発明の効果本発明はシュードグルコノバクター属に属し、Ｄ−グル
コース等を２−ケト−Ｄ−グルカル酸に酸化する能力を
有する微生物を用いる方法により、２−ケト−Ｄ−グル
カル酸を収率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた結晶標品の赤外部吸収ス
ペクトルを、第２図は、参考例で得られた標準品の赤外
部吸収スペクトルをそれぞれ表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鎖状式で表わした場合、一般式、［式中、R¹は−CHO,−CH₂OH,または−COOHを、R²はをそれぞれ示す。］で表される化合物を２−ケト−Ｄ−
グルカル酸に酸化する能力を有し、シュードグルコノバ
クター属に属する細菌またはその処理物を、上記化合物
に接触させて２−ケト−Ｄ−グルカル酸を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする２−ケト−Ｄ−グ
ルカル酸の製造法。