JPH0586188B2 - - Google Patents

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JPH0586188B2
JPH0586188B2 JP58060412A JP6041283A JPH0586188B2 JP H0586188 B2 JPH0586188 B2 JP H0586188B2 JP 58060412 A JP58060412 A JP 58060412A JP 6041283 A JP6041283 A JP 6041283A JP H0586188 B2 JPH0586188 B2 JP H0586188B2
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JP
Japan
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carnitine
apocarnitine
enzyme
strain
solution
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JP58060412A
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JPS59183694A (ja
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Usao Nakamura
Makoto Takao
Etsuko Ueno
Yoshitaro Kawaguchi
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Hamari Chemicals Ltd
Original Assignee
Hamari Chemicals Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、アポカルニチンに微生物の生産する
酵素を作用させて光学活性なカルニチンを製造す
る方法に関する。 Ｌ−カルニチンは多くの薬理作用、特に消化機
能亢進作用を有する物質で、医薬品として用られ
ている。現在医薬品として使用されているＬ−カ
ルニチンは、化学的反応により得られたラセミ体
化合物を光学分割することによつて製造されてい
る。しかしこの方法によると高価な光学分割剤を
必要とし、操作も繁雑なためより安価な製造法の
開発が望まれている。本発明者らは生化学的方法
により光学活性カルニチンの製造について検討し
た。 従来、生化学的にＬ−カルニチンを生成する反
応としては、４−Ｎ−トリメチルアミノ酪酸の水
酸化反応（Ｊ，Biol，Chem・、256巻12437〜
12444頁．1981年）、３−デヒドロカルニチンの還
元反応（Appl.Environ，Microbiol.、39巻、329
〜334頁、1980年）等が知られているが、原料が
高価であり、また使用される酵素が不安定である
など実用に供し得るものではない。 本発明者らはより安価な光学的活性なカルニチ
ンの製造法を検討した結果、微生物の産生する酵
素を用いて、従来知られていなかつた反応によつ
てアポカルニチンをＬ−カルニチンに転換する方
法を見出し本発明を完成するに至つた。 本発明は化学的反応によるカルニチンの合成中
間体であるアポカルニチンを微生物の産生する酵
素の作用を利用してＬ−カルニチンを製造する方
法に関する。 更に本発明について詳細に説明する。本発明に
用いる微生物としては、エンテロバクター属に属
しアポカルニチンをＬ−カルニチンに転換する反
応を有する酵素を産生するものであればいずれで
も用いられる。例えば本発明者らが自然界より単
離した細菌Ｙ−239−ｂ，Ｙ−ii株などがあげら
れる。 このＹ−239−ｂ菌株は次のような性状を示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 性
栄養要求性 ビオチン、パントテン酸
以上のような菌学的性質を有する菌について、
バージエーズ・マニユアル・オブ・デタミネイテ
イブ・バクテリオロジー（第８版）の分類に従つ
て同定するとエンテロバクター属に属するので、
エンテロバクター・エスピー・Ｙ−239−ｂ
（Enterobacter sp.Y−239−ｂ）と称することに
した。本菌株は微工研に寄託しその寄託番号は微
工研菌寄第6976号である。また、Ｙ−11菌株の性
状は、Ｙ−239−ｂ菌株と同様であり、エンテロ
バクター・エスピー・Ｙ−11（Enterobacter
SP・Ｙ−11）と称することとし、本菌株は微工
研に寄託し、その寄託番号は微工研菌寄第7201号
である。Y239−ｂ、Ｙ−11株は、性状が変化し
やすく、例えば紫外線、エツクス線、高周波、放
射線、薬品等を用いる人工的変異手段で変異する
ものであり、このようにして得られた変異株であ
つても、アポカルニチンをＬ−カルニチンに転換
し得る能力を有するものは、すべて本発明の方法
に使用することができる。本発明の方法では、前
記菌株を通常微生物が利用し得る栄養物を含有す
る培地で培養する。栄養源としては、従来細菌の
培養に利用されている公知のものが使用できる。
例えば炭素源としてグルコース、シユクロース、
でん粉、デキストリン、糖蜜、有機酸など、窒素
源として尿素、塩化アンモニウム、硫化アンモニ
ウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなど、そ
の他必要に応じてリン酸、マグネシウム、カリウ
ム、ナトリウム、カルシウム、マンガン、亜鉛、
銅、鉄、モリブデン酸などの無機塩類を適当に含
有する培地などが用いられる。 培養方法としては、やや好気的条件下にて25〜
37℃で24〜72時間培養すると、アポカルニチンを
Ｌ−カルニチンに転換する酵素が産生される。こ
の酵素は培養液内および菌体成分（固型分）内
に蓄積される。 このエンテロバクター・エスピー・Ｙ−239−
ｂ，Ｙ−ii株の産生する酵素の反応は、通常PH４
〜10、反応温度は20〜60℃が適当で、反応時間は
酵素の力価、濃度などによつて異なる。反応に当
つては、微生物の培養液（菌体を含む）をそのま
ま用いても、菌体と培養液を分離した培養液また
は菌体、あるいは分離した菌体を磨砕あるいは自
己消化、超音波処理などの方法によつて得た菌体
破砕液、又は菌体破砕液を遠心分離、塩析、溶媒
沈澱などの処理を行なつたもの、あるいはこれを
風乾、アセトン、エーテルなどの溶媒で処理乾燥
したもの、更にこれらの処理を行なつたものを固
定化しても用いられる。なお、アポカルニチンを
含有する培地に本微生物を培養することによつて
もＬ−カルニチンを得ることができる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 培地の組成 アポカルニチン硫酸塩 5.0ｇ グルコース 4.0〃 ペプトン 1.0〃 Ｌ−アスパラギン 2.0〃 KH2PO4 1.5〃 CaCl2・2H2O 0.3〃 MgSO4・7H2O 0.5〃 （NH4）2SO4 2.0〃 微量元素溶液(a) 1.0ml ビタミン溶液(b) 10.0ml 脱イオン水 989.0ml PH 6.0 (a) 微量元素溶液 H3BO3 60mg MnSO4 30〃 ZnSO4・7H2O 300〃 CuSO4・5H2O 40〃 FeCl3・6H2O 250〃 Na2M0O4・2H2O 25〃 脱イオン水 100ml (b) ビタミン溶液 チアミン塩酸塩 20mg ピリドキシン塩酸塩 20〃 ニコチン酸 20〃 パントテン酸 20〃 ビオチン 200μｇ イノシトール 1.0ｇ 脱イオン水 100ml 上記の培地にＹ−239−ｂ株を接種し、30℃で
48時間振とう培養を行なう。培養後、培養液を遠
心分離し、上澄液1000mlを得、上澄液をPH８に調
整して強酸性陽イオン交換樹脂・ダイヤイオン
SK−1B H+型に通して吸着させ、0.5Nアンモニ
ア水200mlで溶出し、溶出液を40℃で減圧濃縮す
る。これを高速液体クロマトグラフイーでＬ−カ
ルニチン画分を分取し、その画分を減圧濃縮して
油状のＬ−カルニチンを得る。この油状物質をメ
タノール、アセトンで再結晶すると白色結晶のＬ
−カルニチン500mgを得る。得られたＬ−カルニ
チンの物性は次の通りである。 〔α〕20 Ｄ＝−30.5゜（Ｃ＝1.0、水溶液） 分解点 197〜198℃ 元素分析値（％） C7H15NO3として 理論値 Ｃ，52.15； Ｈ，9.38； Ｏ，29.78 測定値 Ｃ，52.20； Ｈ，9.35； Ｏ，29.82 実施例 ２ 実施例１の培地にＹ−239−ｂ株を接種して、
30℃で48時間培養した培養液600mlを遠心分離し
て得た菌体を、生理的食塩水で３回洗浄した後10
℃以下で超音波処理を行ない、次いで遠心分離し
て得た残留物に50mlの0.1Nリン酸カリウム緩衝
液を加えて酵素液を得る。 この酵素液50μを１％アポカルニチン硫酸塩
50μ、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.5）
400μの溶液中で30℃、2.5時間反応させた後、
TLCを用いて定量を行なつたところ、180μｇの
Ｌ−カルニチンを生成していた。 実施例 ３ アポカルニチン硫酸塩を除いた実施例１の培地
にＹ−239−ｂ株を接種し、30℃、48時間培養後、
培養液を遠心分離して得た菌体を生理的食塩水で
洗浄し、通常の方法によつてアセトンパウダーを
調製し、300mlの培養液から440mgのアセトンパウ
ダーを得た。アセトンパウダー20mgを、10％アポ
カルニチン硫酸塩20μ、0.1Mリン酸カリウム緩
衝液（PH6.5）980μl溶液中で30℃、３時間反応を
行ないTLCを用いて定量を行なつた。その結果
アセトンパウダー（菌体）20mg当り200μｇのＬ
−カルニチンを生成していた。 実施例 ４ アポカルニチンベタイン 5.0％ フマール酸 0.4％ Ｄ−ソルビトール 0.4％ KH2PO4 0.2％ NH4Cl 0.15％ MgSO4・7H2O 0.05％ 酵母エキス 0.01％ PH 6.0 の組成より成る培地にＹ−11菌株を接種し、30℃
で48時間振とう培養を行う。培養液100mlを遠心
分離し上澄液を活性炭で脱色濾過し、濾液を強性
陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンSK−1BH+型）
に通して吸着させ、1N−アンモニア水で溶出し、
その溶出液を減圧濃縮して得た油状物質をメタノ
ール・アセトンで再結晶するとＬ−カルニチンの
白色結晶3.5ｇを得る。 〔α〕20 Ｄ＝−30.3゜（Ｃ＝1.0 水溶液） 元素分析値 （％） C7H15NO3として 理論値 Ｃ，52.15； Ｈ，9.38； Ｎ，8.68 測定値 Ｃ，52.10； Ｈ，9.35； Ｎ，8.69

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ エンテロバクター属に属し、アポカルニチン
    をカルニチンに変換する酵素を生産する株の該酵
    素を、アポカルニチンに作用させることを特徴と
    するカルニチンの生化学的製造法。
JP58060412A 1983-04-05 1983-04-05 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 Granted JPS59183694A (ja)

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EP0121444B1 (en) 1989-02-08
EP0121444A2 (en) 1984-10-10
EP0121444A3 (en) 1986-08-13
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