JP4375928B2 - Ｌ−エピ−２−イノソースの新規製造法とエピ−イノシトールの新規製造法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、安価なミオ−イノシトール（ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を原料として用い、それ自体が生物活性を有して且つ医薬品、等の合成の原料としても価値の高いＬ−エピ−２−イノソース（Ｌ−ｅｐｉ−２−Ｉｎｏｓｏｓｅ）を、化学合成工程を経ず、微生物の作用下に一段階で製造する方法に関する。また本発明はＬ−エピ−２−イノソースを還元して、それ自体が生物活性を有し医薬品として有用なエピ−イノシトール（ｅｐｉ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を効率良く製造する方法に関する。
背景技術
ミオ−イノシトールは次の平面式（Ａ）
または次の立体構造式（Ａ´）
で表される天然に産する既知の物質である。
また、Ｌ−エピ−２−イノソースは次の平面式（Ｂ）
または次の立体構造式（Ｂ´）
で表される既知の物質である。さらに、エピ−イノシトールは次の平面式（Ｃ）
または次の立体構造式（Ｃ´）
で表される既知の化学合成物質である。エピ−イノシトールはミオ−イノシトールの立体異生体の一つである。
イノソース（Ｉｎｏｓｏｓｅｓ，別名ではＰｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｎｅｓまたはＡｌｉｃｙｃｌｉｃ ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅｓ）は一般的にイノシトールの微生物的酸化〔Ａ．Ｊ．Ｋｌｕｙｖｅｒ ＆ Ａ．Ｂｏｅｚａａｒｄｔ：「Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．」５８巻、９５６頁（１９３９）〕、酵素的酸化〔Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」７８巻、５１８頁（１９５８）〕、白金触媒を用いた空気酸化〔Ｋ．Ｈｅｙｎｓ ａｎｄ Ｈ．Ｐａｕｌｓｅｎ：「Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．」８６巻、８３３頁（１９５３）〕、硝酸等の酸化剤による酸化〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」１９巻、１３３３頁（１９３６）〕によって合成されることが知られている。
イノシトールのうち、ミオ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化で生成するイノソースとしては、これまでシロ−イノソース（別名ミオ−イノソース−２）が知られているのみである〔Ａ．Ｊ．Ｋｌｕｙｖｅｒ ＆ Ａ．Ｂｏｅｚａａｒｄｔ：「Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．」５８巻、９５６頁（１９３９）、Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」７８巻、５１８頁（１９５８）〕。ミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースを生成できる微生物はこれまで報告されていない。
Ｌ−エピ−２−イノソースは、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩと略記される）の合成原料として有用である（米国特許第５，４０６，００５号）。このＤＣＩはインシュリン抵抗性糖尿病の治療薬として有用であり（ＷＯ９０／１０４３９号公報）、あるいは多嚢胞性卵巣症候群の改善薬として利用される〔Ｊ．Ｅ．Ｎｅｓｔｌｅｒ等：「ＮＥＷ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」３４０巻、１３１４頁（１９９９）〕ことが期待されている。このＬ−エピ−２−イノソースの製法としては、▲１▼ミオ−イノシトールの硝酸による酸化で生成するラセミ体のＤＬ−エピ−２−イノソース（（±）−エピ−２−イノソース）を、酸化白金触媒の存在下に水素で還元してエピ−イノシトールを生成し、その後に細菌のアセトバクター・サブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）によるエピ−イノシトールの微生物的酸化を行うことにより、Ｌ−エピ−２−イノソースを合成する方法の報告がある〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」２９巻、１９９１頁（１９４６）〕。また、▲２▼Ｄ−グルクロン酸を出発原料にして化学合成したグルコジアルドースをアシロイン縮合して生成する化合物の一つとしてＬ−エピ−２−イノソースが合成されるという報告がある（米国特許第５，４０６，００５号）。
イノシトールは、シクロヘキサンから誘導される６価アルコールの総称であり、イノシトールには９種の立体異生体が存在する。天然産イノシトールにはミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、シロ−イノシトールの５種のイノシトールが見出されている。その他のイノシトールにはエピ−イノシトール、アロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、シス−イノシトールがあり、これら４種のイノシトールは非天然型の化学合成されたイノシトールである。非天然型のイノシトールのうち、エピ−イノシトールはうつ病、不安症の改善薬としての利用が期待されている〔Ｒ．Ｈ．Ｂｅｌｍａｋｅｒ等のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＬ／００５２３号の国際公開明細書ＷＯ９９／２２７２７号及びＲ．Ｈ．Ｂｅｌｍａｋｅｒ等：「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１巻、３１頁（１９９８）参照〕。
このエピ−イノシトールの製法としては、（１）ミオ−イノシトールの硝酸による酸化で生成するラセミ体のＤ，Ｌ−エピ−２−イノソースを酸化白金触媒の存在下で水素で還元してエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：［Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」２９巻、１９９１頁（１９４６）〕と、（２）シクロヘキサジエンの２価アルコールをオスミウム酸で酸化してエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｔ．Ｔｓｃｈａｍｂｅｒ等：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」７５巻、１０５２頁（１９９２）〕と、（３）テトラヒドロベンゾキノンに水素添加してエピ−イノシトールを合成する方法（Ｌ．Ｏｄｉｅｒ：ＥＰ特願公開５２４０８２号公報）と、（４）ムコ−イノシトールを適当に保護し、酸化、還元の組合せによりエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｋ．Ｅ．Ｅｓｐｅｌｉｅ等：「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．」４６巻、５３頁（１９７６）〕がある。また、グルコースあるいはガラクトースのＦｅｒｒｉｅｒ環化反応及び適当な還元剤での還元反応の組合せによりエピ−イノシトールを合成する方法〔高橋等：「有機合成化学協会誌」５８巻、１２０頁（２０００）〕もある。
しかしながら、これら既知のＬ−エピ−２−イノソースの製造方法、およびエピ−イノシトールの製造方法は、いずれも工業的規模で製造する方法としては、操作の煩雑さ、環境汚染あるいは経済性の面で問題があるので、従来法は全て必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率良くＬ−エピ−２−イノソースを製造する新しい方法、及び簡便に効率良くエピ−イノシトールを製造する新しい方法が要望されている。本発明の目的は、このような要望に合致して種々の利点を有するＬ−エピ−２−イノソース及びエピ−イノシトールを効率よく製造できる新しい方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、安価に入手できるミオ−イノシトールに対して、本発明者等により土壌から新たに分離した細菌の新しい菌株であるキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株を水性の媒質中で作用させると、式（Ａ）または（Ａ´）で表されるミオ−イノシトールの４位の水酸基のみをほぼ選択的に酸化（または脱水素）できて、式（Ｂ）または（Ｂ´）のＬ−エピ−２−イノソースが生成することを見出した。この生成されたＬ−エピ−２−イノソースを単離し、核磁気共鳴スペクトル装置、質量分析装置、旋光度計などにより機器分析を実施した結果、この物質は光学純度の高いＬ−エピ−２−イノソースであることが判明した。
更に、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる活性または能力を有する微生物を広く自然界から探索したところ、グラム陰性細菌、例えばシュードモナダセア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科のキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌；およびアセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科のアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌；およびリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌；エンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）科のエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌；およびパステウレアセア（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科のパステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属またはヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属の細菌に属するグラム陰性細菌である分類学的に広範な範囲のグラム陰性細菌のうちに、上記のミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる活性または能力を有する菌株が存在することが明らかになった。これらの中でもミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる高い活性または能力を有する菌株の例として、具体的には、上記に記載のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株があり、これ以外に、土壌から新たに本発明者らが分離した細菌の新しい菌株であるシュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５株、あるいはエルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５株があげられる。
上記した知見に基づいて、Ｌ−エピ−２−イノソースの新しい製造方法が後記の通り工夫された。すなわち、ミオ−イノシトール並びに通常の炭素源及び窒素源を含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトール（これの一部が炭素源となる）と窒素源（窒素源が有機質の窒素源である場合、これの一部も培養条件によっては炭素源になる）とを含有する液体培地中で上記のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株あるいはシュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５株あるいはエルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５株、等を好気的に培養すると、これにより、得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生成させ且つこれを蓄積するようにしてＬ−エピ−２−イノソースを効率よく製造できることが知見された。また、Ｌ−エピ−２−イノソースの上記の新しい製造方法では、培養液中に蓄積したＬ−エピ−２−イノソースは、培養液から使用微生物の菌体の除去後に、得られた培養上清液を陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは結晶化操作にかけることにより、あるいはこれら処理の組合せにかけるとこにより、高純度なＬ−エピ−２−イノソースとして効率良く回収できることが知見された。
さらに、本発明者等が別途の研究を行った結果、上記のように培養液中で生成および蓄積されたＬ−エピ−２−イノソースを含む培養液から、菌体を除去し、そしてその後、得られた培養上清液に、直接に、適当な量の水素化ホウ素ナトリウムまたはこれと均等な水素化物の他の還元剤を添加して、培養上清液中でＬ−エピ−２−イノソースに該還元剤を反応させる場合に、Ｌ−エピ−２−イノソースがエピ−イノシトールに効率よく還元されることが知見された。すなわち、培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースは単離されなくとも、培養上清液内で上記還元剤との反応によりＬ−エピ−２−イノソースはエピ−イノシトールに効率良く還元され得ることが見出された。
さらに、上記のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株に代表されるところの、ミオ−イノシトールを酸化によりＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有するグラム陰性細菌でミオ−イノシトールを処理する方法、並びに得られた培養上清液から生成されたＬ−エピ−２−イノソースを単離せずに、培養上清液中でＬ−エピ−２−イノソースを適当な還元剤で処理してエピ−イノシトールを生成し収得する方法について種々の実験を本発明者等は行った。その結果、多くの知見が得られた。それらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
従って、第１の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトールに作用させて、それにより前記ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換させてＬ−エピ−２−イノソースを生成することをから成ることを特徴とする、Ｌ−エピ−２−イノソースの製造方法が提供される。
第１の本発明によるＬ−エピ−２−イノソースの製造方法は、具体的には、以下に示す（Ａ）及び（Ｂ）の２つの実施方法で行うことができる。
実施方法（Ａ）は、上記のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養し、その培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させて培養液を取得する工程と、得られた培養液から菌体を除去し、そして生成蓄積させたＬ−エピ−２−イノソースを、得られた培養上清液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、回収する工程とを含む方法である。
実施方法（Ｂ）は、上記能力を有するグラム陰性細菌を培養し、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加え、該緩衝液または液体培地中でミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成させる工程と、反応液に生成蓄積させたＬ−エピ−２−イノソースを、反応液からイオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはこれら処理の組合せにより、回収する工程とを含む方法である。
第１の本発明の方法において使用するグラム陰性細菌は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換する活性または能力を有するグラム陰性細菌であれば、いずれの菌株でも良い。
具体的に例示すると、前述したようにミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生産できる菌には多種の細菌が存在する。例えば本発明者らが分離した前記のＡＢ１０１１９株、ＡＢ１０２１５株、ＡＢ１０１３５株は本発明方法に最も有効に使用される細菌の例である。前記の３種の菌株の菌学的性質を後記の表１ａ、表１ｂ、表１ｃ、表１ｄに示した。
尚、前記の３種の菌株の同定を行うに当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて、同定のための実験を行った。また、得られた実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＶＯＬ．１（１９８４）を参考に評価して、菌株の同定を行った。
ＡＢ１０１１９株の主な菌学的性状は、次のとおりである。本菌株はコロニーが黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは０．４〜０．６×０．６〜４．０μｍ。また、本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は悪いが、最小培地にメチオニンを添加すると良好な生育となる。硝酸塩の還元性は無く、０．０１％のメチルグリーン及びチアニンに感受性であった。本菌株の細胞のユビキノン分子の種はＱ８で、ＤＮＡのＧＣ含量は６８％であった。
これらの菌学的性質を総合して、ＡＢ１０１１９株はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株であると判断した。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＶＯＬ．１（１９８４）１９９頁〜２１０頁によると、キサントモナス属細菌には５種のスペシーズ（キサントモナス・カンペストリス；キサントモナス・フラガリアエ；キサントモナス・アルブリネンス；キサントモナス・アキソノポディス；キサントモナス・アメリザ）が知られている。ＡＢ１０１１９株の菌学的性状を上記の既知のスペシーズと比較検討した結果、ＡＢ１０１１９株はキサントモナス・カンペストリスに最も近縁の種とであると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質はキサントモナス・カンペストリスに完全には一致しなかったので、本ＡＢ１０１１９株を公知のものと区別するため、キサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７３８２として寄託した（寄託日は１９９９年５月７日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０１１９株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託された。
また、ＡＢ１０２１５株の主な菌学的性状は、次のとおりである。本菌体はコロニーが淡黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは０．３〜０．５×０．６〜６．５μｍ。また本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は良好であり、硝酸塩の還元性を有する。０．０１％のメチルグリーン及びチアニンに感受性であった。本菌株の細胞のユビキノン分子の種はＱ８で、ＤＮＡのＧＣ含量は６８％であった。
これらの菌学的性質を総合すると、ＡＢ１０２１５株はＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（１９８４）１４０頁〜１９９頁に記載されているシュードモナス・マルトフィリアに最も近縁な種であると考えられる。しかし、ＡＢ１０２１５株は、その菌学的性質においてシュードモナス・マルトフィリアに完全には合致しなかったので、本菌株を公知のものと区別するため、シュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８０４として寄託した（寄託日２０００年３月３１日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０２１５株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託された。
一方、ＡＢ１０１３５株の主な菌学的性状は、次のとおりである。本菌株はコロニーが乳白色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは０．４〜０．６×０．８〜２．０μｍ。本菌株はグルコースを好気的・嫌気的のいずれの条件でも分解し酸を生成するが、好気的条件での生育に比べて嫌気的条件での生育は非常に悪い。また、本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性である。普通寒天培地での本菌株の生育は微量であるが、普通寒天培地に５％シュークロースを添加すると非常に旺盛な生育を示す。本菌株の細胞のユビキノン分子の種はＱ８で、ＤＮＡのＧＣ含量は５０％であった。
これらの菌学的性質を総合して、ＡＢ１０１３５株はエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する菌株であると判断した。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（１９８４）４６９頁〜４７６頁によると、エルウィニア属細菌は１５種に分類されているが、ＡＢ１０１３５株はいずれの種とも、その菌学的性質において完全には合致しなかった。従って、ＡＢ１０１３５株を公知のものと区別するため、エルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８０３として寄託した（寄託日は２０００年３月３１日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０１３５株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託された。
以下に、第１の本発明の方法の前記した実施方法（Ａ）〜（Ｂ）をより詳しく説明する。
実施方法（Ａ）では、ミオ−イノシトールならびに炭素源および窒素源を含む栄養液体培地で、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有する微生物を好気的に培養し、その培養液中に、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させる第１工程が行われる。
ここに用いる液体培地の組成は、目的を達する限り何ら特別の制限はない。用いる液体培地は、Ｌ−エピ−２−イノソースへの変換原料であるミオ−イノシトールを含み、これに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地または天然培地のいずれも使用できる。用いる液体培地は、ミオ−イノシトールを０．１％〜４０％、より好ましくは２０〜３０％含有し、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を０．１％〜２０％、より好ましくは０．５〜５％を含有し、また窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を０．０１％〜５．０％、好ましくは０．５％〜２．０％含有するのが望ましい。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。得られる培養液中の水素イオン濃度をｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９に調整しながら、菌を培養すると、効率よくＬ−エピ−２−イノソースを生成できる。
菌の培養条件は、用いた菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃である。また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行うのが好ましい。培養期間は、培養液中でミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ生成されたＬ−エピ−２−イノソースが最大の蓄積量を示すまでの期間であるのが良く、通常１〜１４日、好ましくは３〜１０日である。上記の第１工程によって、Ｌ−エピ−２−イノソースを含む培養液が得られる。
次に、培養液から目的のＬ−エピ−２−イノソースを採取する第２工程が行われる。この採取には、培養液から通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、Ｌ−エピ−２−イノソースを含む培養液から先づ菌体を除去し、その後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理するが、これらの方法により、Ｌ−エピ−２−イノソース以外の不純物を培養上清液からほとんど除くことができる。しかし、イオン交換樹脂処理には、強塩基性陰イオン交換樹脂のＯＨ−型はＬ−エピ−２−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。その後、こうして活性炭またはイオン交換樹脂で処理された培養上清液から、Ｌ−エピ−２−イノソースは、結晶化および必要に応じて再結晶する方法等を用いることにより、目的生成物として単離することができる。
前記の培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースを回収するためには、より具体的には、Ｌ−エピ−２−イノソースを蓄積、含有した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）を充填したカラムに通過させて、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、先に得られた通過液と洗浄液を合併し、その合併された溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ａ３６８Ｓ（遊離塩基型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、Ｌ−エピ−２−イノソースを含むがそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。この水溶液を濃縮して、得られたＬ−エピ−２−イノソースの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なＬ−エピ−２−イノソースの結晶を晶出できる。
第１の本発明方法の前記した実施方法（Ｂ）では、所望の能力を有する微生物を培養し、得られた培養物から該微生物の菌体を分離し、該菌体を、ミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加え、該緩衝液または液体培地中でミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成させる諸工程が行われる。
上記のミオ−イノシトールと菌体との反応工程で用いる菌体としては、実施方法（Ａ）の第１工程により得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、前記微生物を別途の工程で適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。集菌は、培養液を遠心分離、濾過等にかけて菌体を分離する公知の方法により行えばよい。
ミオ−イノシトールと菌体を反応させるための反応媒質としては、液体培地または緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施方法（Ａ）の第１工程において用いたものと同様の組成のものを用いてもよい。また別途に前記微生物を培養した後に、その培養液から菌体を除去して得られた培養上清液よりなる液体培地を、そのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液等を１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で用いればよい。緩衝液または液体培地にとかされたミオ−イノシトールの溶液中のミオ−イノシトールの当初の濃度は０．１〜４０％（重量）程度とするのが好ましい。
ミオ−イノシトールと菌体との反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は５〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間である。液体培地または緩衝液のｐＨは２〜１０、好ましくは３〜９である。
ミオ−イノシトールと菌体との反応の終了後に、得られた反応液からの目的物質のＬ−エピ−２−イノソースを単離する方法は実施方法（Ａ）の第２工程と同様に行えばよい。
第２の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を水性媒質中でミオ−イノシトールに作用させて、前記ミオ−イノシトールのＬ−エピ−２−イノソースへの変換によりＬ−エピ−２−イノソースを該水性媒質中に生成させ、これによりグラム陰性細菌菌体とＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液を収得し、次いで該反応液から菌体を除去してＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液を収得し、さらに得られたＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液ろ液に適当な還元剤を直接に添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させてエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成させることから成ることを特徴とする、エピ−イノシトールの製造方法が提供される。
第２の本発明の方法は、具体的には、以下に示す（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）の３つの実施方法で行うことができる。
第２の本発明方法の実施方法（Ｃ）は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、第１の本発明方法の実施方法（Ａ）に記載の微生物培養方法と同様な要領により、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地よりなる水性媒質中で好気的に培養しながら、該グラム陰性細菌を培養液中でミオ−イノシトールに作用させて、得られた培養液中にミオ−イノシトールのＬ−エピ−２−イノソースへの変換により、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成し且つ蓄積させて培養液を収得する工程(第１工程)と、反応液として得られた培養液から該グラム陰性細菌の菌体を除去して、その後、得られたＬ−エピ−２−イノソースを単離せずに、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液として得られた培養上清液を収得する工程（第２工程）と、該培養上清液に対して直接に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤でＬ−エピ−２−イノソースを還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該培養上清液内で生成する工程(第３工程)と、こうして得られたところの還元反応の反応液、すなわち生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを含有する培養上清液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程(第４工程)と、回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程(第５工程)とからなる方法である。
第２の本発明方法の実施方法（Ｄ）は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を第１の本発明方法の実施方法（Ｂ）に記載の微生物培養方法と同様な要領により、炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して該グラム陰性細菌の培養液を収得し、さらに該培養液から該グラム陰性細菌の菌体を分離する工程(第１工程)と、こうして得られたグラム陰性細菌菌体を水性の緩衝液または液体培地よりなる水性媒質中でミオ−イノシトールと反応させて、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成させる工程(第２工程) と、こうして得られたところの、該グラム陰性細菌菌体と生成されたＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液から菌体を除去して、これにより、グラム陰性細菌菌体を除去されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する得られた反応液ろ液を収得する工程（第３工程）と、この反応液ろ液に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該反応液ろ液内で生成する工程（第４工程）と、生成されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有するその還元反応の反応液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程(第５工程)と、回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程(第６工程)とからなる方法である。
第２の本発明方法の実施方法（Ｅ）は、上記の実施方法（Ｃ）及び（Ｄ）における還元剤を添加してＬ−エピ−２−イノソースを還元剤で還元する工程を行う前に、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液または反応液濾液よりなる水性媒質のｐＨを、ｐＨ８〜１２の範囲のアルカリ性に予め調整する工程を行い、その後、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有するｐＨ８〜１２の水性媒質に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行うことから成る方法である。実施方法（Ｅ）により、副成されたミオ−イノシトールの生成量よりもはるかに高い生成量でエピ−イノシトールを生成させるようにして、エピ−イノシトールが製造される。
第２の本発明方法で使用されるグラム陰性細菌は、第１の本発明方法で用いられたところの、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌と同じであることができる。
以下に、第２の本発明の方法の前記した実施方法（Ｃ）〜（Ｅ）をより詳しく説明する。
第２の本発明方法の前記の実施方法（Ｃ）では、要約すると、ミオ−イノシトールを含む液体栄養培地に、所望の能力を有するグラム陰性細菌を接種して好気的に培養することにより、培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させて培養液を収得する第１工程と、培養液からグラム陰性細菌菌体を除去して、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液を収得する第２の工程と、その後に培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースを単離せず、該培養上清液に適当な還元剤を直接に添加し、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行う第３工程と、こうして得られた還元反応の反応液から生成されたエピ−イノシトールを回収する第４工程とが行われる。
すなわち、第２の本発明方法の実施方法（Ｃ）において、所望の能力を有する微生物をミオ−イノシトール含有の液体培地で培養しながら培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成、蓄積させて培養液を収得する第１工程が先ず行われるが、この第１工程は、第１の本発明方法の実施方法（Ａ）の第１工程と全く同様に行うことができる。
実施方法（Ｃ）の第２工程では、第１工程で得られた培養液から菌体を除去してＬ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液を収得する工程を行う。その後、第３工程では、得られた培養上清液に直接に還元剤として水素化物を添加して還元反応を行う。これによって、培養上清液内でＬ−エピ−２−イノソースからエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールが生成される。使用される還元剤は、水系中でＬ−エピ−２−イノソースをエピ−イノシトールに還元できる還元剤として、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムであるのが望ましい。還元反応は０℃〜室温で行う。Ｌ−エピ−２−イノソースの消失した時点または反応生成物の生成量が適当になった時点で還元反応を終了する。これによって、生成されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する培養上清液が還元反応の反応液として第３工程で得られる。
ここで得られた還元反応の反応液である培養上清液から、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを回収する第４の工程を次に行う。この第４の回収工程では、第３工程から得られてエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併し、その合併された溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ａ１１３（ＯＨ−型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。
実施方法（Ｃ）の最終（第５）工程では、先の第４工程で回収されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールの水溶液からエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを別々に分離する。これらの生成物の分離のためには、前記のエピ−イノシトールとミオ−イノシトールの水溶液を減圧下に濃縮し、その濃縮液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばアンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）を充填したカラムに通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させることによって該カラムを溶出し、これによって、ミオ−イノシトールを主として含有する溶出液画分と、目的とするエピ−イノシトールを含有する溶出液画分とを別々に得ることが好ましい。このエピ−イノシトールを含む水溶液を濃縮して、得られたエピ−イノシトールの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なエピ−イノシトールの結晶を晶出できる。
なお、実施方法（Ｃ）において、上記の還元終了後に、生成されたエピ−イノシトールを含む培養上清液を、直列された複数のイオン交換樹脂カラムで処理する第４工程を行うと、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有するが、その他の不純成分をほとんど含有しない水溶液が得られる。このエピ−イノシトールとミオ−イノシトールの水溶液を濃縮し、得られた濃縮液を、スルホン酸基を交換基とするスチレン重合体よりなる強酸性陽イオン交換樹脂（Ｃａ２＋型）、例えばダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５２０Ｍ（Ｃａ２＋型）のカラムに通して、カラムにエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを吸着させ、ついでカラムを脱イオン水で溶出するようにして第５工程を行う場合には、ミオ−イノシトールからエピ−イノシトールを効率よく分離できることが本発明者等によって見出されている。
第２の本発明方法の前記の実施方法（Ｄ）では、要約すると、栄養液体培地で所望の能力を有するグラム陰性細菌を接種して好気的に培養し、得られた培養液からグラム陰性細菌菌体を分離し、これにより、該菌体を大量に収得する第１工程と、こうして得られた該菌体を、緩衝液あるいは液体培地よりなる水性媒質中で、これに溶解させたミオ−イノシトールに作用させて、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成させる第２工程と、ここで得られた反応液から菌体を除去して、菌体が除去されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液を得る第３工程と、Ｌ−エピ−２−イノソースを単離せず、該反応液ろ液に適当な還元剤を添加し、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行い、これによりエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成する第４工程と、こうして得られた還元反応液から、生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する第５工程と、回収されたエピ−イノシトールをミオ−イノシトールから分離する第６工程とが行われる。
この実施方法（Ｄ）の第１工程では、使用される所望の変換能を有するグラム陰性細菌を、グラム陰性細菌の培養に常用される液体培地で好気的に培養し、得られた培養液から該グラム陰性細菌の菌体を分離する。この様に分離された菌体を実施方法(Ｄ)の第２工程で使用する。菌体としては、実施方法（Ａ）の第１工程により得た培養液から菌体を分離して集めた菌体を用いても良い。また、前記の使用微生物を別途の工程により適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。菌体の分離と集菌は、培養液を遠心分離、濾過等の公知の手段にかけることにより行えば良い。
実施方法（Ｄ）の第２工程において、菌体をミオ−イノシトールに反応させるための液体反応媒質としては、緩衝液または液体培地よりなる水性媒質が用いられる。液体培地としては、実施方法（Ａ）の第１工程で用いたものと同様のものを用いても良い。緩衝液としては、リン酸緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液等を１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で用いれば良い。ここで用いた水性の反応媒質にとかしたミオ−イノシトールの濃度は、０．１〜３０％（重量）の程度とするのが望ましい。菌体とミオ−イノシトールとの反応条件は、使用菌株や使用された反応媒質の緩衝液または液体培地の種類によって異なる。反応温度は５〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間である。水性反応媒質として用いられる緩衝液または液体培地のｐＨはｐＨ２〜１０、好ましくは３〜９である。該第２工程で微生物菌体をミオ−イノシトールと反応させると、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する反応液が得られる。
実施方法（Ｄ）の第３工程では、第２工程で得られたＬ−エピ−２−イノソース含有反応液から遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体を除去し、これによってＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液濾液を収得する。次の第４工程では、第３工程で得られたところの、菌体を除かれたＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液濾液に対して、還元剤としての水素化物を添加して、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを生成する。この第４工程の還元反応は、実施方法（Ｃ）の第３工程で説明したと同じ要領で行いうる。
次いで、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する還元反応液からエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールをそれらの水溶液として回収する第５工程を行う。その後に、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する水溶液からエピ−イノシトールを収得する第６工程を行う。これら第５及び第６工程は、先に実施方法（Ｃ）の第４工程および第５工程で説明した手法と同様に実施できる。
さらに第２の本発明方法の前記した実施方法（Ｅ）においては、第３の本発明方法の実施方法（Ｃ）の第２工程ならびに実施方法（Ｄ）の第４工程を行うに先立ち、すなわちＬ−エピ−２−イノソースを含有した前記の培養上清液あるいは反応液濾液にアルカリ金属水素化物型の還元剤を添加して還元反応を行う工程に先立ち、還元剤を添加する前に、予め前記の培養上清液あるいは反応液濾液を、水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウムあるいは炭酸ナトリウムあるいは炭酸カリウムの添加によりｐＨ８−１１、望ましくはｐＨ９−１０に調整して置く工程を行い、そして、その後に還元剤を添加し還元反応を行うのである。このようにアルカリ性に反応媒質のｐＨを調整することにより、反応媒質のｐＨを未調整（通常ｐＨ５−７）で還元反応を行う場合（通常エピ−イノシトール６〜７部に対しミオ−イノシトール３〜４部が生成する）と比較すると、生成するエピ−イノシトールの量が１．３〜１．５倍に増加し、副成するミオ−イノシトールの量が１／２〜１／４に減少することが本発明者の別途の研究で知見された。実施方法（Ｅ）によると、ｐＨ８〜１１の水性媒質中で、Ｌ−エピ−２−イノソースを前記の水素化物で還元することによって、副成されたミオ−イノシトールの生成量よりもはるかに高い生成量でエピ−イノシトールを生成させることができる。
前記のＡＢ１０１１９株、ＡＢ１０２１５株およびＡＢ１０１３５株は新規な微生物であって、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生産できる有用性を有する。従って、第３の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託されたキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株が新規微生物として提供される。
また、第４の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託されたシュードモナス・エスピーＡＢ１０２１５株がが新規微生物として提供される。
さらに、第５の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託されたエルウィニア・エスピーＡＢ１０１３５株が新規微生物として提供される。
第１の本発明および第２の本発明によれば、医農薬合成原料として有用な純度の高いＬ−エピ−２−イノソースと、医薬として有用なエピ−イノシトールとがそれぞれに工業生産規模で安価に且つ簡便に製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を下記の実施例について具体的に説明する。
実施例１
（ａ）第１の本発明の実施方法（Ａ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例（１）
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第１例）
ミオ−イノシトール １２．０％（３６０ｇ）、酵母エキス １．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地３リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で３日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが６６ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（ミオ−イノソースからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率５５．６％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は、次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液１ｍｌ中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷液体培地１ｍｌ中のミオ−イノシトールのモル数〕×１００
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２：４．６×３５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＥＲＣ−７５１５Ａ（ＥＲＭＡ ＣＲ
．ＩＮＣ．）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間：Ｌ−エピ−２−イノソース；
６．７分
（２）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第２例）
ミオ−イノシトール ２５．０％（２５０ｍｇ／ｍｌ）、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地４００ｍｌを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２４７ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率９９．９％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は、前記の計算式により求めた。
（３）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第３例）
ミオ−イノシトール ４．０％（４０ｍｇ／ｍｌ）、酵母エキス ０．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この三角フラスコにエルウィニア・エスピーＡＢ１０１３５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２２ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率５５．６％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースの変換率は、前記の計算式により求めた。
（４）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第４例）
ミオ−イノシトール ２５．０％（２５０ｍｇ／ｍｌ）、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーＡＢ１０２１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２４４ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率９８．７％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
（ｂ）Ｌ−エピ−２−イノソースの回収と単離
上記の実施例１（２）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）８０ｍｌを充填したカラム（内径２ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに８０ｍｌのイオン交換水（脱イオン水）を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、合併して、合併された溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）３６８Ｓ（遊離塩基型）１６０ｍｌを充填したカラム（内径３ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに１６０ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液中には、上記Ｌ−エピ−２−イノソースが含有される以外に、不純物はほとんど存在していなかった。
上記の合併により得た水溶液を減圧下で２００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液にエタノールを３倍量加え５℃で一晩放置したところ、純粋なＬ−エピ−２−イノソースの無色結晶を６０ｇ得た。この時の精製品の回収率は６０．７％、ミオ−イノシトールからのＬ−エピ−２−イノソースの全回収率は６０．６％であった。
なお、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷培養上清液４００ｍｌ中に含まれた精製前のＬ−エピ−２−イノソースの量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷液体培地４００ｍｌ中に含有されたミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例２
第１の本発明の実施方法（Ａ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例（２）
（１）種培養物の調製
ミオ−イノシトール ２．０％、酵母エキス ０．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で１日間振とう培養した。この培養液を種培養物として用いた。
（２）４Ｌ容ジャーファーメンターによるＬ−エピ−２−イノソースの製造
ミオ−イノシトール １２．０％、酵母エキス １．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地２．５リットルを、４Ｌ容ジャーファーメンターに分注し、オートクレーブ滅菌した。このジャーファーメンターにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株の、上記（１）の方法で調製した種培養物２５ｍｌを接種した。この後、培養温度は２７℃、通気量は１ｖｖｍ、回転数は２００ｒｐｍで培養を実施した。培養は３日間行い、培養期間中のｐＨを５Ｍ ＮａＯＨ水溶液及び３Ｍ 塩酸で７±０．２に自動調整した。３日間培養後の培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清を培養上清液として得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記と同様の条件で分析した。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが６０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率５０．６％）ことがわかった。
反応液からのＬ−エピ−２−イノソースの単離方法は、実施例１（ｂ）に記載した方法に準じて行い、結晶として１１４ｇ（精製品回収率７６．０％）を得た。また、この時のミオ−イノシトールからのＬ−エピ−２−イノソースの全回収率は３８．４％であった。
なお、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの変換率は、上記実施例１に準じた計算式で求め、また精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷培養上清液２．５リットル中に含有された精製前のＬ−エピ−２−イノソース量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷培地２．５リットル中に含有されたミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例３
第１の本発明の実施方法（Ｂ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
ミオ−イノシトール ０．５％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地２Ｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を、０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
（２）Ｌ−エピ−２−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体３５ｇを、ミオ−イノシトール４ｇを含有した０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌ（ミオ−イノシトール濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）中に加えた。得られた混合物を３０℃、２４時間緩やかにスターラーで攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−エピ−２−イノソースが６ｍｇ／ｍｌ（変換率６０．７％）の濃度で生成、蓄積していた。反応液からのＬ−エピ−２−イノソースの単離方法は、実施例１（ｂ）に記載した方法に準じて行い、結晶として１．６ｇ（精製品回収率６６．７％）を得た。また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は４０．４％であった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースの変換率は、上記実施例１に準じて求め、精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷反応液４００ｍｌ中の精製前のＬ−エピ−２−イノソース量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷緩液４００ｍｌ中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例４
第２の本発明の実施方法（Ｃ）によるエピ−イノシトールの製造例
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成
ミオ−イノシトール ２５．０％（５００ｇ）、グルコース１．０％、酵母エキス ２．５％を含むｐＨ未調整の液体培地２リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−７１６８）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を実施例１、（１）に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが４１５ｇ（ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は８３．９％）生成していることがわかった。
（２）エピ−イノシトールの生成
前項（１）で得たＬ−エピ−２−イノソース含有の培養上清液の２リットルに還元剤としての水素化ホウ素ナトリウムの２９．２ｇを徐々に加えた。還元反応を室温で行った。反応の終了後、培養上清液（還元反応の反応液）を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した．その結果、還元反応後の反応液（培養上清液）は、生成したエピ−イノシトールの２３５．８ｇを含有し、副生成物として、ミオ−イノシトールの１０２．４ｇを含有していることがわかった（エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は８０．６％）。Ｌ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールの変換率は５６．２％であった。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２：４．６×２５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＥＲＣ−７５１５Ａ
（ＥＲＭＡ ＣＲ．ＩＮＣ．）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間：エピイノシトール；８．５分
なお、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）は次式で計算した。
〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースからエピ−イノシトールへの変換率は次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
（３）エピ−イノシトールの回収と単離の１例
前項（２）で得た還元反応後の反応液（培養上清液）を二等分した。一方の上清液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）３００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに４００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）６００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに７００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した。ここで合併により得られた水溶液は、エピ−イノシトールと副生成物としてのミオ−イノシトールとを含有するが、これら以外に不純物をほとんど含有しなかった。
上記により得た水溶液を減圧下で３００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液（３００ｍｌ）の４分の１量（７５ｍｌ）を、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）１５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ２００ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させて溶出した。該カラムの溶出液はミオ−イノシトールを主として含む画分と、所望なエピ−イノシトールを主として含む画分とに分け集めた。前記の濃縮液の残りの４分の３（２２５ｍｌ）についても同様な操作を行うことにより、エピ−イノシトールを専ら含む溶出液を収得できた。これを濃縮乾固して、エピ−イノシトールを７３ｇ得た。さらにこのエピ−イノシトールを水に溶かし１５％の水溶液とした後、エタノールを２倍量加えて５℃で一晩放置して再結晶させた。こうして純粋なエピ−イノシトールの結晶６３ｇが得られた（精製品回収率５３．４％）。ミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全収率は２５．２％であった。
なお、上記エピ−イノシトールの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔結晶として単離したエピ−イノシトールの量÷還元反応後の上清液中のエピ−イノシトールの量〕×１００
また、上記のミオ−イノシトールからのエピ−イノシトール全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔結晶として単離したエピ−イノシトールの量÷培地１リットルに含有されたミオ−イノシトールの量〕×１００
（４）エピ−イノシトールの回収と単離の第２例
前項（３）で二等分された還元反応後の反応液（培養上清液）の残りの一方を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）３００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに４００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）６００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに７００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
上記により通過液及び水洗浄液を合併して、合併により得られた水溶液を減圧下で３００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液（３００ｍｌ）を強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５２０Ｍ（Ｃａ＋型）１５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ２００ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させて溶出した。該カラムの溶出液はミオ−イノシトールを主として含む画分と、所望なエピ−イノシトールを主として含む画分とに分け集めた。このクロマトグラフィー操作でエピ−イノシトールを７５ｇ得た。さらにこのエピ−イノシトールを水に溶かし１５％の水溶液とした後、エタノールを２倍量加えて５℃で一晩放置して再結晶させた。こうして純粋なエピ−イノシトールの結晶６６ｇ（精製品回収率５６．０％）を得た。この時の出発原料として用いたミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は２６．４％であった。
なお、上記エピ−イノシトールの精製品回収率及び全回収率は前項（３）と同様に計算した。
実施例５
第２の本発明の実施方法（Ｃ）および（Ｅ）によるエピ−イノシトールの製造例
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成
ミオ−イノシトール ２５．０％、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を実施例１、（１）に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２３ｇ（ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率９３．０％に相当）の量で生成していることがわかった。
（２）エピ−イノシトールの生成
前項（１）で得たＬ−エピ−２−イノソース含有の培養上清液１００ｍｌに、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に調整した。その後、直ちに水素化ホウ素ナトリウム１．３ｇをｐＨ１０の培養上清液に徐々に加えた。還元反応を室温で行った。反応の終了後、培養上清液（反応液）を高速液体クロマトグラフィーにより前記実施例４、（２）記載の条件で分析した．その結果、還元反応後の反応液（培養上清液）は、生成したエピ−イノシトールの１８．４ｇを含有し、副生成物として、ミオ−イノシトールの０．８ｇを含有していることがわかった（エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は８２．６％）。Ｌ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールの変換率は７９．１％であった。
この時のエピ−イノシトールとミオ−イノシトールへの合計反応収率は次の計算式により求めた。
エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールへの変換率は次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
（３）エピ−イノシトールの回収と単離
反応液からのエピ−イノシトールの回収と精製、単離は、実施例４、（４）に記載した方法に準じて行った。エピ−イノシトールの結晶として１５．７ｇを得た。このときの反応液中のエピ−イノシトールからの精製品回収率は８５．３％であった。反応液中のＬ−エピ−２−イノソースに基づくエピ−イノシトールの収率は６７．５％、出発原料として用いたミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は６２．８％であった。
なお、上記の反応液中のエピ−イノシトールからのエピ−イノシトールの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトール量÷還元反応後の培養上清液１００ｍｌ中に含有された精製前のエピ−イノシトール量〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースに基づくエピ−イノシトールの収率は次の計算式により求めた。
収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液１００ｍｌ中に含有された還元反応前のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトール量÷培養開始時の培養液１００ｍｌ中に含有されたミオ−イノシトール量〕×１００
産業上の利用可能性
本発明によれば、ミオ−イノシトールから、医薬の合成用中間体として有用なＬ−エピ−２−イノソースが簡便に且つ効率よく製造できる。また、本発明によれば、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースが生成され、さらにＬ−エピ−２−イノソースの還元により、各種の医薬として有用なエピ−イノシトールが簡便に且つ効率よく製造できる。従って、本発明方法は産業上で有用である。
本発明は、安価なミオ−イノシトール（ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を原料として用い、それ自体が生物活性を有して且つ医薬品、等の合成の原料としても価値の高いＬ−エピ−２−イノソース（Ｌ−ｅｐｉ−２−Ｉｎｏｓｏｓｅ）を、化学合成工程を経ず、微生物の作用下に一段階で製造する方法に関する。また本発明はＬ−エピ−２−イノソースを還元して、それ自体が生物活性を有し医薬品として有用なエピ−イノシトール（ｅｐｉ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を効率良く製造する方法に関する。
背景技術
ミオ−イノシトールは次の平面式（Ａ）
また、Ｌ−エピ−２−イノソースは次の平面式（Ｂ）
イノソース（Ｉｎｏｓｏｓｅｓ，別名ではＰｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｎｅｓまたはＡｌｉｃｙｃｌｉｃ ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅｓ）は一般的にイノシトールの微生物的酸化〔Ａ．Ｊ．Ｋｌｕｙｖｅｒ ＆ Ａ．Ｂｏｅｚａａｒｄｔ：「Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．」５８巻、９５６頁（１９３９）〕、酵素的酸化〔Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」７８巻、５１８頁（１９５８）〕、白金触媒を用いた空気酸化〔Ｋ．Ｈｅｙｎｓ ａｎｄ Ｈ．Ｐａｕｌｓｅｎ：「Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．」８６巻、８３３頁（１９５３）〕、硝酸等の酸化剤による酸化〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」１９巻、１３３３頁（１９３６）〕によって合成されることが知られている。
イノシトールのうち、ミオ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化で生成するイノソースとしては、これまでシロ−イノソース（別名ミオ−イノソース−２）が知られているのみである〔Ａ．Ｊ．Ｋｌｕｙｖｅｒ ＆ Ａ．Ｂｏｅｚａａｒｄｔ：「Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．」５８巻、９５６頁（１９３９）、Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等：「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」７８巻、５１８頁（１９５８）〕。ミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースを生成できる微生物はこれまで報告されていない。
Ｌ−エピ−２−イノソースは、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩと略記される）の合成原料として有用である（米国特許第５，４０６，００５号）。このＤＣＩはインシュリン抵抗性糖尿病の治療薬として有用であり（ＷＯ９０／１０４３９号公報）、あるいは多嚢胞性卵巣症候群の改善薬として利用される〔Ｊ．Ｅ．Ｎｅｓｔｌｅｒ等：「ＮＥＷ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」３４０巻、１３１４頁（１９９９）〕ことが期待されている。このＬ−エピ−２−イノソースの製法としては、▲１▼ミオ−イノシトールの硝酸による酸化で生成するラセミ体のＤＬ−エピ−２−イノソース（（±）−エピ−２−イノソース）を、酸化白金触媒の存在下に水素で還元してエピ−イノシトールを生成し、その後に細菌のアセトバクター・サブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）によるエピ−イノシトールの微生物的酸化を行うことにより、Ｌ−エピ−２−イノソースを合成する方法の報告がある〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」２９巻、１９９１頁（１９４６）〕。また、▲２▼Ｄ−グルクロン酸を出発原料にして化学合成したグルコジアルドースをアシロイン縮合して生成する化合物の一つとしてＬ−エピ−２−イノソースが合成されるという報告がある（米国特許第５，４０６，００５号）。
イノシトールは、シクロヘキサンから誘導される６価アルコールの総称であり、イノシトールには９種の立体異生体が存在する。天然産イノシトールにはミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、シロ−イノシトールの５種のイノシトールが見出されている。その他のイノシトールにはエピ−イノシトール、アロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、シス−イノシトールがあり、これら４種のイノシトールは非天然型の化学合成されたイノシトールである。非天然型のイノシトールのうち、エピ−イノシトールはうつ病、不安症の改善薬としての利用が期待されている〔Ｒ．Ｈ．Ｂｅｌｍａｋｅｒ等のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＬ／００５２３号の国際公開明細書ＷＯ９９／２２７２７号及びＲ．Ｈ．Ｂｅｌｍａｋｅｒ等：「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１巻、３１頁（１９９８）参照〕。
このエピ−イノシトールの製法としては、（１）ミオ−イノシトールの硝酸による酸化で生成するラセミ体のＤ，Ｌ−エピ−２−イノソースを酸化白金触媒の存在下で水素で還元してエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｔ．Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ：［Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」２９巻、１９９１頁（１９４６）〕と、（２）シクロヘキサジエンの２価アルコールをオスミウム酸で酸化してエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｔ．Ｔｓｃｈａｍｂｅｒ等：「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」７５巻、１０５２頁（１９９２）〕と、（３）テトラヒドロベンゾキノンに水素添加してエピ−イノシトールを合成する方法（Ｌ．Ｏｄｉｅｒ：ＥＰ特願公開５２４０８２号公報）と、（４）ムコ−イノシトールを適当に保護し、酸化、還元の組合せによりエピ−イノシトールを合成する方法〔Ｋ．Ｅ．Ｅｓｐｅｌｉｅ等：「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．」４６巻、５３頁（１９７６）〕がある。また、グルコースあるいはガラクトースのＦｅｒｒｉｅｒ環化反応及び適当な還元剤での還元反応の組合せによりエピ−イノシトールを合成する方法〔高橋等：「有機合成化学協会誌」５８巻、１２０頁（２０００）〕もある。
しかしながら、これら既知のＬ−エピ−２−イノソースの製造方法、およびエピ−イノシトールの製造方法は、いずれも工業的規模で製造する方法としては、操作の煩雑さ、環境汚染あるいは経済性の面で問題があるので、従来法は全て必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率良くＬ−エピ−２−イノソースを製造する新しい方法、及び簡便に効率良くエピ−イノシトールを製造する新しい方法が要望されている。本発明の目的は、このような要望に合致して種々の利点を有するＬ−エピ−２−イノソース及びエピ−イノシトールを効率よく製造できる新しい方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、安価に入手できるミオ−イノシトールに対して、本発明者等により土壌から新たに分離した細菌の新しい菌株であるキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株を水性の媒質中で作用させると、式（Ａ）または（Ａ´）で表されるミオ−イノシトールの４位の水酸基のみをほぼ選択的に酸化（または脱水素）できて、式（Ｂ）または（Ｂ´）のＬ−エピ−２−イノソースが生成することを見出した。この生成されたＬ−エピ−２−イノソースを単離し、核磁気共鳴スペクトル装置、質量分析装置、旋光度計などにより機器分析を実施した結果、この物質は光学純度の高いＬ−エピ−２−イノソースであることが判明した。
更に、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる活性または能力を有する微生物を広く自然界から探索したところ、グラム陰性細菌、例えばシュードモナダセア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科のキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌；およびアセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科のアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌；およびリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌；エンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）科のエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌；およびパステウレアセア（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科のパステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属またはヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属の細菌に属するグラム陰性細菌である分類学的に広範な範囲のグラム陰性細菌のうちに、上記のミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる活性または能力を有する菌株が存在することが明らかになった。これらの中でもミオ−イノシトールを酸化してＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる高い活性または能力を有する菌株の例として、具体的には、上記に記載のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株があり、これ以外に、土壌から新たに本発明者らが分離した細菌の新しい菌株であるシュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５株、あるいはエルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５株があげられる。
上記した知見に基づいて、Ｌ−エピ−２−イノソースの新しい製造方法が後記の通り工夫された。すなわち、ミオ−イノシトール並びに通常の炭素源及び窒素源を含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトール（これの一部が炭素源となる）と窒素源（窒素源が有機質の窒素源である場合、これの一部も培養条件によっては炭素源になる）とを含有する液体培地中で上記のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株あるいはシュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５株あるいはエルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５株、等を好気的に培養すると、これにより、得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生成させ且つこれを蓄積するようにしてＬ−エピ−２−イノソースを効率よく製造できることが知見された。また、Ｌ−エピ−２−イノソースの上記の新しい製造方法では、培養液中に蓄積したＬ−エピ−２−イノソースは、培養液から使用微生物の菌体の除去後に、得られた培養上清液を陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは結晶化操作にかけることにより、あるいはこれら処理の組合せにかけるとこにより、高純度なＬ−エピ−２−イノソースとして効率良く回収できることが知見された。
さらに、本発明者等が別途の研究を行った結果、上記のように培養液中で生成および蓄積されたＬ−エピ−２−イノソースを含む培養液から、菌体を除去し、そしてその後、得られた培養上清液に、直接に、適当な量の水素化ホウ素ナトリウムまたはこれと均等な水素化物の他の還元剤を添加して、培養上清液中でＬ−エピ−２−イノソースに該還元剤を反応させる場合に、Ｌ−エピ−２−イノソースがエピ−イノシトールに効率よく還元されることが知見された。すなわち、培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースは単離されなくとも、培養上清液内で上記還元剤との反応によりＬ−エピ−２−イノソースはエピ−イノシトールに効率良く還元され得ることが見出された。
さらに、上記のキサントモナス・エスピー ＡＢ１０１１９株に代表されるところの、ミオ−イノシトールを酸化によりＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有するグラム陰性細菌でミオ−イノシトールを処理する方法、並びに得られた培養上清液から生成されたＬ−エピ−２−イノソースを単離せずに、培養上清液中でＬ−エピ−２−イノソースを適当な還元剤で処理してエピ−イノシトールを生成し収得する方法について種々の実験を本発明者等は行った。その結果、多くの知見が得られた。それらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
従って、第１の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトールに作用させて、それにより前記ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換させてＬ−エピ−２−イノソースを生成することをから成ることを特徴とする、Ｌ−エピ−２−イノソースの製造方法が提供される。
第１の本発明によるＬ−エピ−２−イノソースの製造方法は、具体的には、以下に示す（Ａ）及び（Ｂ）の２つの実施方法で行うことができる。
実施方法（Ａ）は、上記のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養し、その培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させて培養液を取得する工程と、得られた培養液から菌体を除去し、そして生成蓄積させたＬ−エピ−２−イノソースを、得られた培養上清液から、イオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはそれらの処理などの組合せにより、回収する工程とを含む方法である。
実施方法（Ｂ）は、上記能力を有するグラム陰性細菌を培養し、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加え、該緩衝液または液体培地中でミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成させる工程と、反応液に生成蓄積させたＬ−エピ−２−イノソースを、反応液からイオン交換樹脂処理、活性炭処理または結晶化操作あるいはこれら処理の組合せにより、回収する工程とを含む方法である。
第１の本発明の方法において使用するグラム陰性細菌は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換する活性または能力を有するグラム陰性細菌であれば、いずれの菌株でも良い。
具体的に例示すると、前述したようにミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生産できる菌には多種の細菌が存在する。例えば本発明者らが分離した前記のＡＢ１０１１９株、ＡＢ１０２１５株、ＡＢ１０１３５株は本発明方法に最も有効に使用される細菌の例である。前記の３種の菌株の菌学的性質を後記の表１ａ、表１ｂ、表１ｃ、表１ｄに示した。
尚、前記の３種の菌株の同定を行うに当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて、同定のための実験を行った。また、得られた実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＶＯＬ．１（１９８４）を参考に評価して、菌株の同定を行った。
これらの菌学的性質を総合して、ＡＢ１０１１９株はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株であると判断した。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ＶＯＬ．１（１９８４）１９９頁〜２１０頁によると、キサントモナス属細菌には５種のスペシーズ（キサントモナス・カンペストリス；キサントモナス・フラガリアエ；キサントモナス・アルブリネンス；キサントモナス・アキソノポディス；キサントモナス・アメリザ）が知られている。ＡＢ１０１１９株の菌学的性状を上記の既知のスペシーズと比較検討した結果、ＡＢ１０１１９株はキサントモナス・カンペストリスに最も近縁の種とであると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質はキサントモナス・カンペストリスに完全には一致しなかったので、本ＡＢ１０１１９株を公知のものと区別するため、キサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７３８２として寄託した（寄託日は１９９９年５月７日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０１１９株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託された。
また、ＡＢ１０２１５株の主な菌学的性状は、次のとおりである。本菌体はコロニーが淡黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは０．３〜０．５×０．６〜６．５μｍ。また本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は良好であり、硝酸塩の還元性を有する。０．０１％のメチルグリーン及びチアニンに感受性であった。本菌株の細胞のユビキノン分子の種はＱ８で、ＤＮＡのＧＣ含量は６８％であった。
これらの菌学的性質を総合すると、ＡＢ１０２１５株はＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（１９８４）１４０頁〜１９９頁に記載されているシュードモナス・マルトフィリアに最も近縁な種であると考えられる。しかし、ＡＢ１０２１５株は、その菌学的性質においてシュードモナス・マルトフィリアに完全には合致しなかったので、本菌株を公知のものと区別するため、シュードモナス・エスピー ＡＢ１０２１５と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８０４として寄託した（寄託日２０００年３月３１日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０２１５株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託された。
一方、ＡＢ１０１３５株の主な菌学的性状は、次のとおりである。本菌株はコロニーが乳白色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは０．４〜０．６×０．８〜２．０μｍ。本菌株はグルコースを好気的・嫌気的のいずれの条件でも分解し酸を生成するが、好気的条件での生育に比べて嫌気的条件での生育は非常に悪い。また、本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性である。普通寒天培地での本菌株の生育は微量であるが、普通寒天培地に５％シュークロースを添加すると非常に旺盛な生育を示す。本菌株の細胞のユビキノン分子の種はＱ８で、ＤＮＡのＧＣ含量は５０％であった。
これらの菌学的性質を総合して、ＡＢ１０１３５株はエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する菌株であると判断した。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（１９８４）４６９頁〜４７６頁によると、エルウィニア属細菌は１５種に分類されているが、ＡＢ１０１３５株はいずれの種とも、その菌学的性質において完全には合致しなかった。従って、ＡＢ１０１３５株を公知のものと区別するため、エルウィニア・エスピー ＡＢ１０１３５と命名し、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に在る工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８０３として寄託した（寄託日は２０００年３月３１日）。さらに、２０００年５月２３日の寄託日で前記の研究所にＡＢ１０１３５株はブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託された。
以下に、第１の本発明の方法の前記した実施方法（Ａ）〜（Ｂ）をより詳しく説明する。
実施方法（Ａ）では、ミオ−イノシトールならびに炭素源および窒素源を含む栄養液体培地で、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換できる能力を有する微生物を好気的に培養し、その培養液中に、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させる第１工程が行われる。
ここに用いる液体培地の組成は、目的を達する限り何ら特別の制限はない。用いる液体培地は、Ｌ−エピ−２−イノソースへの変換原料であるミオ−イノシトールを含み、これに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地または天然培地のいずれも使用できる。用いる液体培地は、ミオ−イノシトールを０．１％〜４０％、より好ましくは２０〜３０％含有し、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を０．１％〜２０％、より好ましくは０．５〜５％を含有し、また窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を０．０１％〜５．０％、好ましくは０．５％〜２．０％含有するのが望ましい。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。得られる培養液中の水素イオン濃度をｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９に調整しながら、菌を培養すると、効率よくＬ−エピ−２−イノソースを生成できる。
菌の培養条件は、用いた菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃である。また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行うのが好ましい。培養期間は、培養液中でミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ生成されたＬ−エピ−２−イノソースが最大の蓄積量を示すまでの期間であるのが良く、通常１〜１４日、好ましくは３〜１０日である。上記の第１工程によって、Ｌ−エピ−２−イノソースを含む培養液が得られる。
次に、培養液から目的のＬ−エピ−２−イノソースを採取する第２工程が行われる。この採取には、培養液から通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、Ｌ−エピ−２−イノソースを含む培養液から先づ菌体を除去し、その後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理するが、これらの方法により、Ｌ−エピ−２−イノソース以外の不純物を培養上清液からほとんど除くことができる。しかし、イオン交換樹脂処理には、強塩基性陰イオン交換樹脂のＯＨ−型はＬ−エピ−２−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。その後、こうして活性炭またはイオン交換樹脂で処理された培養上清液から、Ｌ−エピ−２−イノソースは、結晶化および必要に応じて再結晶する方法等を用いることにより、目的生成物として単離することができる。
前記の培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースを回収するためには、より具体的には、Ｌ−エピ−２−イノソースを蓄積、含有した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）を充填したカラムに通過させて、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、先に得られた通過液と洗浄液を合併し、その合併された溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ａ３６８Ｓ（遊離塩基型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、Ｌ−エピ−２−イノソースを含むがそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。この水溶液を濃縮して、得られたＬ−エピ−２−イノソースの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なＬ−エピ−２−イノソースの結晶を晶出できる。
第１の本発明方法の前記した実施方法（Ｂ）では、所望の能力を有する微生物を培養し、得られた培養物から該微生物の菌体を分離し、該菌体を、ミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加え、該緩衝液または液体培地中でミオ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成させる諸工程が行われる。
上記のミオ−イノシトールと菌体との反応工程で用いる菌体としては、実施方法（Ａ）の第１工程により得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、前記微生物を別途の工程で適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。集菌は、培養液を遠心分離、濾過等にかけて菌体を分離する公知の方法により行えばよい。
ミオ−イノシトールと菌体を反応させるための反応媒質としては、液体培地または緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施方法（Ａ）の第１工程において用いたものと同様の組成のものを用いてもよい。また別途に前記微生物を培養した後に、その培養液から菌体を除去して得られた培養上清液よりなる液体培地を、そのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液等を１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で用いればよい。緩衝液または液体培地にとかされたミオ−イノシトールの溶液中のミオ−イノシトールの当初の濃度は０．１〜４０％（重量）程度とするのが好ましい。
ミオ−イノシトールと菌体との反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は５〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間である。液体培地または緩衝液のｐＨは２〜１０、好ましくは３〜９である。
ミオ−イノシトールと菌体との反応の終了後に、得られた反応液からの目的物質のＬ−エピ−２−イノソースを単離する方法は実施方法（Ａ）の第２工程と同様に行えばよい。
第２の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を水性媒質中でミオ−イノシトールに作用させて、前記ミオ−イノシトールのＬ−エピ−２−イノソースへの変換によりＬ−エピ−２−イノソースを該水性媒質中に生成させ、これによりグラム陰性細菌菌体とＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液を収得し、次いで該反応液から菌体を除去してＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液を収得し、さらに得られたＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液ろ液に適当な還元剤を直接に添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させてエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成させることから成ることを特徴とする、エピ−イノシトールの製造方法が提供される。
第２の本発明の方法は、具体的には、以下に示す（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）の３つの実施方法で行うことができる。
第２の本発明方法の実施方法（Ｃ）は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、第１の本発明方法の実施方法（Ａ）に記載の微生物培養方法と同様な要領により、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地よりなる水性媒質中で好気的に培養しながら、該グラム陰性細菌を培養液中でミオ−イノシトールに作用させて、得られた培養液中にミオ−イノシトールのＬ−エピ−２−イノソースへの変換により、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成し且つ蓄積させて培養液を収得する工程(第１工程)と、反応液として得られた培養液から該グラム陰性細菌の菌体を除去して、その後、得られたＬ−エピ−２−イノソースを単離せずに、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液として得られた培養上清液を収得する工程（第２工程）と、該培養上清液に対して直接に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤でＬ−エピ−２−イノソースを還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該培養上清液内で生成する工程(第３工程)と、こうして得られたところの還元反応の反応液、すなわち生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを含有する培養上清液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程(第４工程)と、回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程(第５工程)とからなる方法である。
第２の本発明方法の実施方法（Ｄ）は、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を第１の本発明方法の実施方法（Ｂ）に記載の微生物培養方法と同様な要領により、炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して該グラム陰性細菌の培養液を収得し、さらに該培養液から該グラム陰性細菌の菌体を分離する工程(第１工程)と、こうして得られたグラム陰性細菌菌体を水性の緩衝液または液体培地よりなる水性媒質中でミオ−イノシトールと反応させて、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成させる工程(第２工程) と、こうして得られたところの、該グラム陰性細菌菌体と生成されたＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液から菌体を除去して、これにより、グラム陰性細菌菌体を除去されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する得られた反応液ろ液を収得する工程（第３工程）と、この反応液ろ液に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該反応液ろ液内で生成する工程（第４工程）と、生成されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有するその還元反応の反応液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程(第５工程)と、回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程(第６工程)とからなる方法である。
第２の本発明方法の実施方法（Ｅ）は、上記の実施方法（Ｃ）及び（Ｄ）における還元剤を添加してＬ−エピ−２−イノソースを還元剤で還元する工程を行う前に、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液または反応液濾液よりなる水性媒質のｐＨを、ｐＨ８〜１２の範囲のアルカリ性に予め調整する工程を行い、その後、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有するｐＨ８〜１２の水性媒質に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行うことから成る方法である。実施方法（Ｅ）により、副成されたミオ−イノシトールの生成量よりもはるかに高い生成量でエピ−イノシトールを生成させるようにして、エピ−イノシトールが製造される。
第２の本発明方法で使用されるグラム陰性細菌は、第１の本発明方法で用いられたところの、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌と同じであることができる。
以下に、第２の本発明の方法の前記した実施方法（Ｃ）〜（Ｅ）をより詳しく説明する。
第２の本発明方法の前記の実施方法（Ｃ）では、要約すると、ミオ−イノシトールを含む液体栄養培地に、所望の能力を有するグラム陰性細菌を接種して好気的に培養することにより、培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成蓄積させて培養液を収得する第１工程と、培養液からグラム陰性細菌菌体を除去して、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液を収得する第２の工程と、その後に培養上清液からＬ−エピ−２−イノソースを単離せず、該培養上清液に適当な還元剤を直接に添加し、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行う第３工程と、こうして得られた還元反応の反応液から生成されたエピ−イノシトールを回収する第４工程とが行われる。
すなわち、第２の本発明方法の実施方法（Ｃ）において、所望の能力を有する微生物をミオ−イノシトール含有の液体培地で培養しながら培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成、蓄積させて培養液を収得する第１工程が先ず行われるが、この第１工程は、第１の本発明方法の実施方法（Ａ）の第１工程と全く同様に行うことができる。
実施方法（Ｃ）の第２工程では、第１工程で得られた培養液から菌体を除去してＬ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液を収得する工程を行う。その後、第３工程では、得られた培養上清液に直接に還元剤として水素化物を添加して還元反応を行う。これによって、培養上清液内でＬ−エピ−２−イノソースからエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールが生成される。使用される還元剤は、水系中でＬ−エピ−２−イノソースをエピ−イノシトールに還元できる還元剤として、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムであるのが望ましい。還元反応は０℃〜室温で行う。Ｌ−エピ−２−イノソースの消失した時点または反応生成物の生成量が適当になった時点で還元反応を終了する。これによって、生成されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する培養上清液が還元反応の反応液として第３工程で得られる。
ここで得られた還元反応の反応液である培養上清液から、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを回収する第４の工程を次に行う。この第４の回収工程では、第３工程から得られてエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併し、その合併された溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ａ１１３（ＯＨ−型）を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得するのが好ましい。
実施方法（Ｃ）の最終（第５）工程では、先の第４工程で回収されたエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールの水溶液からエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを別々に分離する。これらの生成物の分離のためには、前記のエピ−イノシトールとミオ−イノシトールの水溶液を減圧下に濃縮し、その濃縮液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばアンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）を充填したカラムに通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させることによって該カラムを溶出し、これによって、ミオ−イノシトールを主として含有する溶出液画分と、目的とするエピ−イノシトールを含有する溶出液画分とを別々に得ることが好ましい。このエピ−イノシトールを含む水溶液を濃縮して、得られたエピ−イノシトールの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なエピ−イノシトールの結晶を晶出できる。
なお、実施方法（Ｃ）において、上記の還元終了後に、生成されたエピ−イノシトールを含む培養上清液を、直列された複数のイオン交換樹脂カラムで処理する第４工程を行うと、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有するが、その他の不純成分をほとんど含有しない水溶液が得られる。このエピ−イノシトールとミオ−イノシトールの水溶液を濃縮し、得られた濃縮液を、スルホン酸基を交換基とするスチレン重合体よりなる強酸性陽イオン交換樹脂（Ｃａ２＋型）、例えばダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５２０Ｍ（Ｃａ２＋型）のカラムに通して、カラムにエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを吸着させ、ついでカラムを脱イオン水で溶出するようにして第５工程を行う場合には、ミオ−イノシトールからエピ−イノシトールを効率よく分離できることが本発明者等によって見出されている。
第２の本発明方法の前記の実施方法（Ｄ）では、要約すると、栄養液体培地で所望の能力を有するグラム陰性細菌を接種して好気的に培養し、得られた培養液からグラム陰性細菌菌体を分離し、これにより、該菌体を大量に収得する第１工程と、こうして得られた該菌体を、緩衝液あるいは液体培地よりなる水性媒質中で、これに溶解させたミオ−イノシトールに作用させて、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成させる第２工程と、ここで得られた反応液から菌体を除去して、菌体が除去されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液を得る第３工程と、Ｌ−エピ−２−イノソースを単離せず、該反応液ろ液に適当な還元剤を添加し、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行い、これによりエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成する第４工程と、こうして得られた還元反応液から、生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する第５工程と、回収されたエピ−イノシトールをミオ−イノシトールから分離する第６工程とが行われる。
この実施方法（Ｄ）の第１工程では、使用される所望の変換能を有するグラム陰性細菌を、グラム陰性細菌の培養に常用される液体培地で好気的に培養し、得られた培養液から該グラム陰性細菌の菌体を分離する。この様に分離された菌体を実施方法(Ｄ)の第２工程で使用する。菌体としては、実施方法（Ａ）の第１工程により得た培養液から菌体を分離して集めた菌体を用いても良い。また、前記の使用微生物を別途の工程により適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。菌体の分離と集菌は、培養液を遠心分離、濾過等の公知の手段にかけることにより行えば良い。
実施方法（Ｄ）の第２工程において、菌体をミオ−イノシトールに反応させるための液体反応媒質としては、緩衝液または液体培地よりなる水性媒質が用いられる。液体培地としては、実施方法（Ａ）の第１工程で用いたものと同様のものを用いても良い。緩衝液としては、リン酸緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液等を１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で用いれば良い。ここで用いた水性の反応媒質にとかしたミオ−イノシトールの濃度は、０．１〜３０％（重量）の程度とするのが望ましい。菌体とミオ−イノシトールとの反応条件は、使用菌株や使用された反応媒質の緩衝液または液体培地の種類によって異なる。反応温度は５〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間である。水性反応媒質として用いられる緩衝液または液体培地のｐＨはｐＨ２〜１０、好ましくは３〜９である。該第２工程で微生物菌体をミオ−イノシトールと反応させると、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する反応液が得られる。
実施方法（Ｄ）の第３工程では、第２工程で得られたＬ−エピ−２−イノソース含有反応液から遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体を除去し、これによってＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液濾液を収得する。次の第４工程では、第３工程で得られたところの、菌体を除かれたＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液濾液に対して、還元剤としての水素化物を添加して、Ｌ−エピ−２−イノソースの還元反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを生成する。この第４工程の還元反応は、実施方法（Ｃ）の第３工程で説明したと同じ要領で行いうる。
次いで、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する還元反応液からエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールをそれらの水溶液として回収する第５工程を行う。その後に、エピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含有する水溶液からエピ−イノシトールを収得する第６工程を行う。これら第５及び第６工程は、先に実施方法（Ｃ）の第４工程および第５工程で説明した手法と同様に実施できる。
さらに第２の本発明方法の前記した実施方法（Ｅ）においては、第３の本発明方法の実施方法（Ｃ）の第２工程ならびに実施方法（Ｄ）の第４工程を行うに先立ち、すなわちＬ−エピ−２−イノソースを含有した前記の培養上清液あるいは反応液濾液にアルカリ金属水素化物型の還元剤を添加して還元反応を行う工程に先立ち、還元剤を添加する前に、予め前記の培養上清液あるいは反応液濾液を、水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウムあるいは炭酸ナトリウムあるいは炭酸カリウムの添加によりｐＨ８−１１、望ましくはｐＨ９−１０に調整して置く工程を行い、そして、その後に還元剤を添加し還元反応を行うのである。このようにアルカリ性に反応媒質のｐＨを調整することにより、反応媒質のｐＨを未調整（通常ｐＨ５−７）で還元反応を行う場合（通常エピ−イノシトール６〜７部に対しミオ−イノシトール３〜４部が生成する）と比較すると、生成するエピ−イノシトールの量が１．３〜１．５倍に増加し、副成するミオ−イノシトールの量が１／２〜１／４に減少することが本発明者の別途の研究で知見された。実施方法（Ｅ）によると、ｐＨ８〜１１の水性媒質中で、Ｌ−エピ−２−イノソースを前記の水素化物で還元することによって、副成されたミオ−イノシトールの生成量よりもはるかに高い生成量でエピ−イノシトールを生成させることができる。
前記のＡＢ１０１１９株、ＡＢ１０２１５株およびＡＢ１０１３５株は新規な微生物であって、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースを生産できる有用性を有する。従って、第３の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託されたキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株が新規微生物として提供される。
また、第４の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託されたシュードモナス・エスピーＡＢ１０２１５株がが新規微生物として提供される。
さらに、第５の本発明においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託されたエルウィニア・エスピーＡＢ１０１３５株が新規微生物として提供される。
第１の本発明および第２の本発明によれば、医農薬合成原料として有用な純度の高いＬ−エピ−２−イノソースと、医薬として有用なエピ−イノシトールとがそれぞれに工業生産規模で安価に且つ簡便に製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を下記の実施例について具体的に説明する。
実施例１
（ａ）第１の本発明の実施方法（Ａ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例（１）
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第１例）
ミオ−イノシトール １２．０％（３６０ｇ）、酵母エキス １．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地３リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で３日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが６６ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（ミオ−イノソースからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率５５．６％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は、次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液１ｍｌ中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷液体培地１ｍｌ中のミオ−イノシトールのモル数〕×１００
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２：４．６×３５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＥＲＣ−７５１５Ａ（ＥＲＭＡ ＣＲ
．ＩＮＣ．）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間：Ｌ−エピ−２−イノソース；
６．７分
（２）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第２例）
ミオ−イノシトール ２５．０％（２５０ｍｇ／ｍｌ）、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地４００ｍｌを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２４７ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率９９．９％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は、前記の計算式により求めた。
（３）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第３例）
ミオ−イノシトール ４．０％（４０ｍｇ／ｍｌ）、酵母エキス ０．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この三角フラスコにエルウィニア・エスピーＡＢ１０１３５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２２ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率５５．６％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースの変換率は、前記の計算式により求めた。
（４）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成（第４例）
ミオ−イノシトール ２５．０％（２５０ｍｇ／ｍｌ）、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーＡＢ１０２１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２４４ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率９８．７％）ことがわかった。この時の培養上清液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
（ｂ）Ｌ−エピ−２−イノソースの回収と単離
上記の実施例１（２）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）８０ｍｌを充填したカラム（内径２ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに８０ｍｌのイオン交換水（脱イオン水）を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、合併して、合併された溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）３６８Ｓ（遊離塩基型）１６０ｍｌを充填したカラム（内径３ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに１６０ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液中には、上記Ｌ−エピ−２−イノソースが含有される以外に、不純物はほとんど存在していなかった。
上記の合併により得た水溶液を減圧下で２００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液にエタノールを３倍量加え５℃で一晩放置したところ、純粋なＬ−エピ−２−イノソースの無色結晶を６０ｇ得た。この時の精製品の回収率は６０．７％、ミオ−イノシトールからのＬ−エピ−２−イノソースの全回収率は６０．６％であった。
なお、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷培養上清液４００ｍｌ中に含まれた精製前のＬ−エピ−２−イノソースの量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷液体培地４００ｍｌ中に含有されたミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例２
第１の本発明の実施方法（Ａ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例（２）
（１）種培養物の調製
ミオ−イノシトール ２．０％、酵母エキス ０．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で１日間振とう培養した。この培養液を種培養物として用いた。
（２）４Ｌ容ジャーファーメンターによるＬ−エピ−２−イノソースの製造
ミオ−イノシトール １２．０％、酵母エキス １．２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地２．５リットルを、４Ｌ容ジャーファーメンターに分注し、オートクレーブ滅菌した。このジャーファーメンターにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株の、上記（１）の方法で調製した種培養物２５ｍｌを接種した。この後、培養温度は２７℃、通気量は１ｖｖｍ、回転数は２００ｒｐｍで培養を実施した。培養は３日間行い、培養期間中のｐＨを５Ｍ ＮａＯＨ水溶液及び３Ｍ 塩酸で７±０．２に自動調整した。３日間培養後の培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清を培養上清液として得た。
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより前記と同様の条件で分析した。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが６０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成している（変換率５０．６％）ことがわかった。
反応液からのＬ−エピ−２−イノソースの単離方法は、実施例１（ｂ）に記載した方法に準じて行い、結晶として１１４ｇ（精製品回収率７６．０％）を得た。また、この時のミオ−イノシトールからのＬ−エピ−２−イノソースの全回収率は３８．４％であった。
なお、上記Ｌ−エピ−２−イノソースの変換率は、上記実施例１に準じた計算式で求め、また精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷培養上清液２．５リットル中に含有された精製前のＬ−エピ−２−イノソース量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷培地２．５リットル中に含有されたミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例３
第１の本発明の実施方法（Ｂ）によるＬ−エピ−２−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
ミオ−イノシトール ０．５％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％を含むｐＨ７の液体培地２Ｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を、０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
（２）Ｌ−エピ−２−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体３５ｇを、ミオ−イノシトール４ｇを含有した０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌ（ミオ−イノシトール濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）中に加えた。得られた混合物を３０℃、２４時間緩やかにスターラーで攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−エピ−２−イノソースが６ｍｇ／ｍｌ（変換率６０．７％）の濃度で生成、蓄積していた。反応液からのＬ−エピ−２−イノソースの単離方法は、実施例１（ｂ）に記載した方法に準じて行い、結晶として１．６ｇ（精製品回収率６６．７％）を得た。また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は４０．４％であった。
なお、上記のＬ−エピ−２−イノソースの変換率は、上記実施例１に準じて求め、精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソース量÷反応液４００ｍｌ中の精製前のＬ−エピ−２−イノソース量〕×１００
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＬ−エピ−２−イノソースのモル数÷緩液４００ｍｌ中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×１００
実施例４
第２の本発明の実施方法（Ｃ）によるエピ−イノシトールの製造例
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成
ミオ−イノシトール ２５．０％（５００ｇ）、グルコース１．０％、酵母エキス ２．５％を含むｐＨ未調整の液体培地２リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−７１６８）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を実施例１、（１）に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが４１５ｇ（ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率は８３．９％）生成していることがわかった。
（２）エピ−イノシトールの生成
前項（１）で得たＬ−エピ−２−イノソース含有の培養上清液の２リットルに還元剤としての水素化ホウ素ナトリウムの２９．２ｇを徐々に加えた。還元反応を室温で行った。反応の終了後、培養上清液（還元反応の反応液）を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した．その結果、還元反応後の反応液（培養上清液）は、生成したエピ−イノシトールの２３５．８ｇを含有し、副生成物として、ミオ−イノシトールの１０２．４ｇを含有していることがわかった（エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は８０．６％）。Ｌ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールの変換率は５６．２％であった。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２：４．６×２５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＥＲＣ−７５１５Ａ
（ＥＲＭＡ ＣＲ．ＩＮＣ．）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル−水＝４：１
溶出時間：エピイノシトール；８．５分
なお、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）は次式で計算した。
〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースからエピ−イノシトールへの変換率は次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
（３）エピ−イノシトールの回収と単離の１例
前項（２）で得た還元反応後の反応液（培養上清液）を二等分した。一方の上清液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）３００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに４００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）６００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに７００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した。ここで合併により得られた水溶液は、エピ−イノシトールと副生成物としてのミオ−イノシトールとを含有するが、これら以外に不純物をほとんど含有しなかった。
上記により得た水溶液を減圧下で３００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液（３００ｍｌ）の４分の１量（７５ｍｌ）を、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）１５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ２００ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させて溶出した。該カラムの溶出液はミオ−イノシトールを主として含む画分と、所望なエピ−イノシトールを主として含む画分とに分け集めた。前記の濃縮液の残りの４分の３（２２５ｍｌ）についても同様な操作を行うことにより、エピ−イノシトールを専ら含む溶出液を収得できた。これを濃縮乾固して、エピ−イノシトールを７３ｇ得た。さらにこのエピ−イノシトールを水に溶かし１５％の水溶液とした後、エタノールを２倍量加えて５℃で一晩放置して再結晶させた。こうして純粋なエピ−イノシトールの結晶６３ｇが得られた（精製品回収率５３．４％）。ミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全収率は２５．２％であった。
なお、上記エピ−イノシトールの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔結晶として単離したエピ−イノシトールの量÷還元反応後の上清液中のエピ−イノシトールの量〕×１００
また、上記のミオ−イノシトールからのエピ−イノシトール全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔結晶として単離したエピ−イノシトールの量÷培地１リットルに含有されたミオ−イノシトールの量〕×１００
（４）エピ−イノシトールの回収と単離の第２例
前項（３）で二等分された還元反応後の反応液（培養上清液）の残りの一方を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）３００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに４００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）６００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに７００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
上記により通過液及び水洗浄液を合併して、合併により得られた水溶液を減圧下で３００ｍｌまで濃縮した。その濃縮液（３００ｍｌ）を強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５２０Ｍ（Ｃａ＋型）１５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ２００ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させて溶出した。該カラムの溶出液はミオ−イノシトールを主として含む画分と、所望なエピ−イノシトールを主として含む画分とに分け集めた。このクロマトグラフィー操作でエピ−イノシトールを７５ｇ得た。さらにこのエピ−イノシトールを水に溶かし１５％の水溶液とした後、エタノールを２倍量加えて５℃で一晩放置して再結晶させた。こうして純粋なエピ−イノシトールの結晶６６ｇ（精製品回収率５６．０％）を得た。この時の出発原料として用いたミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は２６．４％であった。
なお、上記エピ−イノシトールの精製品回収率及び全回収率は前項（３）と同様に計算した。
実施例５
第２の本発明の実施方法（Ｃ）および（Ｅ）によるエピ−イノシトールの製造例
（１）Ｌ−エピ−２−イノソースの生成
ミオ−イノシトール ２５．０％、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８）を接種し、２７℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、培養上清液を得た。
この培養上清液を実施例１、（１）に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＬ−エピ−２−イノソースが２３ｇ（ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースへの変換率９３．０％に相当）の量で生成していることがわかった。
（２）エピ−イノシトールの生成
前項（１）で得たＬ−エピ−２−イノソース含有の培養上清液１００ｍｌに、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に調整した。その後、直ちに水素化ホウ素ナトリウム１．３ｇをｐＨ１０の培養上清液に徐々に加えた。還元反応を室温で行った。反応の終了後、培養上清液（反応液）を高速液体クロマトグラフィーにより前記実施例４、（２）記載の条件で分析した．その結果、還元反応後の反応液（培養上清液）は、生成したエピ−イノシトールの１８．４ｇを含有し、副生成物として、ミオ−イノシトールの０．８ｇを含有していることがわかった（エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は８２．６％）。Ｌ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールの変換率は７９．１％であった。
この時のエピ−イノシトールとミオ−イノシトールへの合計反応収率は次の計算式により求めた。
エピ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースからのエピ−イノシトールへの変換率は次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
（３）エピ−イノシトールの回収と単離
反応液からのエピ−イノシトールの回収と精製、単離は、実施例４、（４）に記載した方法に準じて行った。エピ−イノシトールの結晶として１５．７ｇを得た。このときの反応液中のエピ−イノシトールからの精製品回収率は８５．３％であった。反応液中のＬ−エピ−２−イノソースに基づくエピ−イノシトールの収率は６７．５％、出発原料として用いたミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は６２．８％であった。
なお、上記の反応液中のエピ−イノシトールからのエピ−イノシトールの精製品回収率は次の計算式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトール量÷還元反応後の培養上清液１００ｍｌ中に含有された精製前のエピ−イノシトール量〕×１００
また、上記のＬ−エピ−２−イノソースに基づくエピ−イノシトールの収率は次の計算式により求めた。
収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液１００ｍｌ中に含有された還元反応前のＬ−エピ−２−イノソースのモル数〕×１００
また、上記のミオ−イノシトールからのエピ−イノシトールの全回収率は次の計算式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したエピ−イノシトール量÷培養開始時の培養液１００ｍｌ中に含有されたミオ−イノシトール量〕×１００
産業上の利用可能性
本発明によれば、ミオ−イノシトールから、医薬の合成用中間体として有用なＬ−エピ−２−イノソースが簡便に且つ効率よく製造できる。また、本発明によれば、ミオ−イノシトールからＬ−エピ−２−イノソースが生成され、さらにＬ−エピ−２−イノソースの還元により、各種の医薬として有用なエピ−イノシトールが簡便に且つ効率よく製造できる。従って、本発明方法は産業上で有用である。
Claims (17)
- ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトールに作用させて、
それにより前記ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換させてＬ−エピ−２−イノソースを生成する
ことから成ることを特徴とする、Ｌ−エピ−２−イノソースの製造方法。 - 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌が、
シュードモナダセア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科に属するキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌、
あるいはアセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科に属するアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌、
あるいはリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科に属するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌、
あるいはエンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）科に属するエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌、
あるいはパステウレアセア（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科に属するパステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属またはヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属の細菌
から選ばれるグラム陰性細菌である、請求項１に記載の方法。 - 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌が、
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８として寄託）
あるいはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）・エスピーＡＢ１０２１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０として寄託）
あるいはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）・エスピーＡＢ１０１３５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９として寄託）である、
請求項１に記載の方法。 - 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養し、
その培養液中において該グラム陰性細菌をミオ−イノシトールに作用させて培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成、蓄積させる、
請求項１に記載の方法。 - 請求項１に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を培養し、
得られた培養物から該グラム陰性細菌の菌体を分離し、
該菌体を、溶解されたミオ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加え、
該緩衝液または液体培地中でミオ−イノシトールと反応させ、
得られた反応液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成させる工程を含む、
請求項１に記載の方法。 - 請求項４または５に記載の方法により、生成、蓄積されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する培養液または反応液を収得し、
さらに該培養液または反応液から、菌体を除去し、
その後、菌体を除去されたＬ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液または反応液ろ液を、イオン交換樹脂処理または活性炭処理または結晶化操作あるいはこれらの組合せの処理にかけ、
この処理により、高純度のＬ−エピ−２−イノソースを培養上清液または反応液ろ液から回収することを特徴とする、
請求項１に記載の方法。 - ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を水性媒質中でミオ−イノシトールに作用させて、
前記ミオ−イノシトールのＬ−エピ−２−イノソースへの変換によりＬ−エピ−２−イノソースを該水性媒質中に生成させ、
これによりグラム陰性細菌菌体とＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液を収得し、
次いで該反応液から菌体を除去してＬ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液を収得し、
さらに得られたＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液ろ液に適当な還元剤を直接に添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させてエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを生成させる
ことから成ることを特徴とする、エピ−イノシトールの製造方法。 - 請求項７に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌が、
シュードモナダセア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科に属するキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌、
あるいはアセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科に属するアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌、あるいはリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科に属するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌、
あるいはエンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）科に属するエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌、
あるいはパステウレアセア（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科に属するパステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属またはヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属の細菌から
選ばれるグラム陰性細菌である
請求項７に記載の方法。 - 請求項７に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌が、
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）・エスピーＡＢ１０１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８として寄託）
あるいはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）・エスピーＡＢ１０２１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０として寄託）
あるいはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）・エスピーＡＢ１０１３５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９として寄託）である
請求項７に記載の方法。 - 請求項７に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、
ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地よりなる水性媒質中で好気的に培養しながら、該グラム陰性細菌をミオ−イノシトールに作用させて、得られた培養液中にＬ−エピ−２−イノソースを生成し且つ蓄積させてグラム陰性細菌菌体とＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液として、培養液を収得する工程と、
その培養液から該グラム陰性細菌の菌体を除去して、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する反応液ろ液として、得られた培養上清液を収得する工程と、
該培養上清液に直接にＬ−エピ−２−イノソースの還元のための還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤でＬ−エピ−２−イノソースを還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該反応液ろ液、すなわち該培養上清液内で生成する工程と、
こうして得られたところの還元反応の反応液、すなわち生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを含有する培養上清液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程と、
回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程と
からなる請求項７に記載の方法。 - 請求項７に記載のミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる能力を有するグラム陰性細菌を、
炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養して該グラム陰性細菌の培養液を収得し、さらに該培養液から該グラム陰性細菌の菌体を分離する工程と、
こうして得られたグラム陰性細菌菌体を緩衝液または液体培地よりなる水性媒質中でミオ−イノシトールと反応させて、Ｌ−エピ−２−イノソースを生成させる工程と、
こうして得られたところの、該グラム陰性細菌菌体と生成されたＬ−エピ−２−イノソースとを含有する反応液から菌体を除去して、これにより、グラム陰性細菌菌体を除去されたがＬ−エピ−２−イノソースを含有する得られた反応液ろ液を収得する工程と、
このＬ−エピ−２−イノソース含有の反応液ろ液に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加し、該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行い、これによりエピ−イノシトール及びミオ−イノシトールを該反応液ろ液内で生成する工程と、
こうして得られて、生成されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを含有する還元反応の反応液から、エピ−イノシトールとミオ−イノシトールを回収する工程と、
回収されたエピ−イノシトールとミオ−イノシトールを相互から分離する工程と
からなる請求項７に記載の方法。 - 請求項１０又は１１に記載の方法における還元剤を添加してＬ−エピ−２−イノソースを還元剤で還元する工程を行う前に、
Ｌ−エピ−２−イノソースを含有する培養上清液または反応液ろ液よりなる水性媒質のｐＨを、ｐＨ８〜１２の範囲のアルカリ性に予め調整する工程を行い、
その後、Ｌ−エピ−２−イノソースを含有するｐＨ８〜１２の該水性媒質に、還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加して該還元剤をＬ−エピ−２−イノソースに作用させて還元する反応を行い、
これにより、副成されたミオ−イノシトールの生成量よりもはるかに高い生成量でエピ−イノシトールを生成させることを特徴とする、
請求項１０又は１１に記載の方法。 - Ｌ−エピ−２−イノソースを還元するのに用いられる還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化メトキシホウ素ナトリウムまたはシアン化水素化ホウ素ナトリウムである
請求項７に記載の方法。 - 用いる水性媒質は水であり、用いる還元剤が水素化ホウ素ナトリウムである
請求項７に記載の方法。 - ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６８の受託番号で寄託されたキサントモナス・エスピーＡＢ１０１１９株。
- ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１７０の受託番号で寄託されたシュードモナス・エスピーＡＢ１０２１５株。
- ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースへ変換できる特性を有して工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−７１６９の受託番号で寄託されたエルウィニア・エスピーＡＢ１０１３５株。
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