JP3015169B2

JP3015169B2 - 微生物及びナフタレンカルボン酸化合物の製造方法

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Publication number: JP3015169B2
Application number: JP28930191A
Authority: JP
Inventors: 伸也宮地; 徹田中; 貴也鈴木; 康司堀田
Original assignee: Cosmo Oil Co Ltd; Petroleum Energy Center PEC
Current assignee: Cosmo Oil Co Ltd; Japan Petroleum Energy Center JPEC
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1991-10-08
Publication date: 2000-03-06
Anticipated expiration: 2015-03-06
Also published as: JPH0515365A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物及び、この微生
物によりアルキルナフタレン化合物を酸化してナフタレ
ンカルボン酸化合物を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ナフタ
レンカルボン酸化合物は、高機能性樹脂原料、農薬原料
あるいは合成中間体等として有用な化合物であり、中で
も２，６−ナフタレンジカルボン酸、ナフチル酢酸は特
に有用である。この２，６−ナフタレンジカルボン酸
は、現在、化学合成法により製造されている。ところ
で、２，６−ナフタレンジカルボン酸を高機能性樹脂原
料として用いる場合、同一芳香環上に官能基が複数個導
入されたものが混入していると重合度を低下させるた
め、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸を必要
とする。しかし、化学合成法では、他の異性体の副生を
伴うばかりでなく、高温高圧反応であるため、官能基の
転移が生起し易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸を得ることが極めて困難である。しかも、化学
合成法は、上記のように高温高圧反応であり、爆発の危
険性があることに加えて、大量のエネルギーを消費する
等の問題もある。また、ナフチル酢酸については、エチ
ルナフタレンを化学酸化させた場合、エチル基のα炭素
が酸化されてしまい、ナフチル酢酸は得られない。

【０００３】これらの問題を解決する方法として、微生
物を用いたいわゆる微生物酸化法により、上記の２，６
−ナフタレンジカルボン酸あるいはナフチル酢酸を製造
する方法が考えられる。微生物酸化法は、常温常圧で反
応を生起させることができる上、官能基の転移が殆どな
いという優れた特長を有している。しかし、これまでに
報告されている微生物による２，６−ジメチルナフタレ
ンの酸化は、多くの場合、片方のメチル基が酸化されて
６−メチル−２−ナフトエ酸が生成された後、ナフタレ
ン環の開環反応が進んでしまい、２，６−ナフタレンジ
カルボン酸は生成されていない（例えば、Ｅ．Ａ．ＢＡ
ＲＮＳＬＥＹＡＰＰＬＩＥＤＡＮＤＥＮＶＩＲＯ
ＮＭＥＮＴＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．
５４，Ｎｏ．２Ｆｅｂ．１９８８年，４２８〜４３８
頁参照）。

【０００４】また、微生物酸化反応により２，６−ナフ
タレンジカルボン酸を製造する方法として、２，６−ジ
メチルナフタレンを単一炭素源として生育するシュード
モナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）
Ｄ−１８６株を用いる方法が提案されている（特願平１
−２１５５８０号公報参照）。しかし、この方法では、
微生物が２，６−ジメチルナフタレンを資化するため、
２，６−ナフタレンジカルボン酸への酸化反応の他に、
芳香環の開裂反応等の不要な反応を伴い、原料の損失が
生じ、生産性が低い。

【０００５】また、上記のような不要な反応を伴わない
方法として、微生物による共酸化法が挙げられる。この
方法で２，６−ジメチルナフタレンを酸化する場合、微
生物は生育のために２，６−ジメチルナフタレンを消費
することはない。従って、２，６−ジメチルナフタレン
のメチル基を酸化する以外の反応は起こらないと考えら
れる。これまでに、ノカルデア・コラリナ（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ）Ａ−６株を、ｎ−ヘキサデ
カンを炭素源として培養し、２，６−ジメチルナフタレ
ンを共酸化法により酸化した報告（Ｒ．Ｌ．ＲＡＹＭＯ
ＮＤｅｔａｌ．，ＡＰＰＬＩＥＤＭＩＣＲＯＢ
ＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．４，Ｊｕｌｙ，１
９６７年８５７〜８６５頁）がある。しかし、この場合
も、６−メチル−２−ナフトエ酸にまでにしか酸化され
ておらず、２，６−ナフタレンジカルボン酸は生成され
ていない。また、ナフチル酢酸については、石油軽質留
分中に多量に含まれているエチルナフタレンを微生物共
酸化してナフチル酢酸を生成するという報告は、これま
で見当たらない。

【０００６】本発明は、以上の実情下において、２，６
−ジメチルナフタレン、エチルナフタレンに限らず他の
アルキルナフタレン類のアルキル基の全てあるいは一部
を酸化する際に、芳香環の開裂反応等の不要な反応を伴
うことのない微生物と、この微生物を含む特定の微生物
により、このような不要な反応を伴うことなく、アルキ
ルナフタレン化合物を酸化してナフタレンカルボン酸化
合物を製造する方法とを提案することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の目
的を達成するために研究を重ね、幾多の微生物をスクリ
ーニングした結果、或る種の微生物を、２，６−ジメチ
ルナフタレン、エチルナフタレン等のアルキルナフタレ
ン類と共に培養すれば、芳香環の開裂反応等の不要な反
応を全く生起することなく、２，６−ナフタレンジカル
ボン酸、ナフチル酢酸、その他のアルキル基が酸化され
たナフタレンカルボン酸化合物を、高純度かつ高濃度で
製造することができるとの知見を得た。

【０００８】本発明は、上記の知見に基づいてなされた
もので、その１つは、脂肪族炭化水素，有機酸類，その
塩，アルコール類，ケトン類，糖類のうちの少なくとも
１つを炭素源として生育可能で、アルキルナフタレン類
に対し強い酸化力を示し、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１１７５３号（ＦＥＲＭＰ−１１
７５３）として寄託されたことを特徴とする微生物（以
下、本発明菌という）を要旨とする。他の１つは、本発
明菌をアルキルナフタレン化合物を含む培地で培養する
ことを特徴とするナフタレンカルボン酸化合物の製造方
法（以下、本発明第１方法という）を要旨とする。ま
た、本発明は、本発明菌の休止菌体又は菌体成分をアル
キルナフタレン化合物と接触させることを特徴とするナ
フタレンカルボン酸化合物の製造方法（以下、本発明第
２方法という）をも要旨とする。

【０００９】以下、本発明菌及び本発明第１，第２方法
の詳細を説明する。先ず、本発明菌の詳細を説明する。
本発明菌は、２，６−ジメチルナフタレンの他に、１−
メチルナフタレン，２−メチルナフタレン等のモノメチ
ルナフタレン類、１，２−ジメチルナフタレン，１，４
−ジメチルナフタレン，１，５−ジメチルナフタレン，
２，３−ジメチルナフタレン，２，７−ジメチルナフタ
レン等のジメチルナフタレン類、１−エチルナフタレ
ン，２−エチルナフタレン等のモノエチルナフタレン類
等の各種のアルキルナフタレン類のアルキル基の全てあ
るいは一部をカルボキシル基まで酸化してナフタレンカ
ルボン酸類を生産する強い酸化酵素を持ち、かつ芳香環
の開裂反応等の不要な反応を生起しない、言い換えれ
ば、芳香環の開裂反応等に必要な酵素を持たない微生物
であって、上記した脂肪族炭化水素等を炭素源として生
育可能であり、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１１７５３号（ＦＥＲＭＰ−１１７５３）と
して寄託されている。

【００１０】本発明菌のスクリーニングは、一般的な微
生物の生育に必要な栄養源を含む培地で微生物を培養
し、その中にアルキルナフタレン類を添加しておき、培
養液中にナフタレンカルボン酸類が生産さているか否か
を確認することによって行われる。この場合、アルキル
ナフタレン類のアルキル基に対して強い酸化力を有する
微生物を効率的に得るために、アルキル化合物の一例と
してｎ−パラフィンを炭素源として加えておき、その資
化性の強さをアルキル基に対する酸化力の指標とするこ
とができる。また、得られた微生物の中から効率的にア
ルキルナフタレン類をナフタレンカルボン酸類に酸化で
きる微生物、すなわちアルキルナフタレン類のアルキル
基を酸化する能力は有するが、アルキルナフタレン類を
資化（消費）する能力は有しない微生物をスクリーニン
グすることが好ましい。

【００１１】このスクリーニングの一例を以下に説明す
る。微生物の増殖に必要な培地成分に炭素源としてｎ−
パラフィンを添加して調製した培地を試験管に分注し、
滅菌した後、採取土壌を添加し、振盪培養する。この培
養液を、上記の培地を上記と同様に分注し滅菌した別の
試験管に加えて、上記と同様に振盪培養する。この後、
培養液を希釈又は無希釈で寒天培地等に撒き、培養す
る。出現したコロニーを拾い、上記の培地に移し、上記
のアルキルナフタレン類を加えて、更に振盪培養する。
この培養液の上清を、例えば高速液体クロマトグラフィ
（以下、ＨＰＬＣ）で分析し、アルキルナフタレン類を
ナフタレンカルボン酸類に変換する強い酸化力を持つ菌
株を選別する。また、得られた菌株の中から炭素源とし
てアルキルナフタレン類だけを含有する培地では生育し
ない菌株を選別することにより、アルキルナフタレン類
のアルキル基を酸化するが、資化する能力は有しない微
生物を得ることができる。この菌株は、上記のアルキル
ナフタレン類のみでも、またナフタレンカルボン酸類の
みでも生育せず、これらの物質よりも微生物が容易に資
化できる他の炭素源で生育可能で、かつアルキルナフタ
レン類をナフタレンカルボン酸に酸化する能力を有す
る。

【００１２】このようなスクリーニング操作に用いる上
記の培地には、生育炭素源としてのｎ−パラフィンの外
に、一般的な培地成分が添加される。このｎ−パラフィ
ンとしては、少なくとも炭素数８〜２０のものを１種又
は２種以上混合して使用される。炭素数が８未満である
と、その溶媒効果により阻害が強く生育が悪くなり、ま
た気化による損失も多く、２０を越えると微生物の生育
時に固体であり培地に充分に混合せず、生育速度が低下
する等の問題がある。なお、炭素数が２０を越えたもの
でも、微生物の生育は可能であるため、炭素数２０〜３
０程度のものを併用してもよい。また、一般的な培地成
分としては、窒素源として、例えばアンモニア，塩化ア
ンモニウム，燐酸アンモニウム，硫酸アンモニウム，炭
酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，硝酸アンモニウ
ム，硝酸ナトリウム，尿素等の無機窒素化合物や、酵母
エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，コーンスティ
ープリカー，カザミノ酸等の有機窒素源を用いることが
できる。また無機塩類として、例えばカリウム，ナトリ
ウム，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウム，
コバルト等の各塩類等を用いることができる。更に、培
養条件としては、培地のｐＨ約３〜９，好ましくは約５
〜７，温度約５〜４０℃，好ましくは約２０〜３６℃，
時間約３〜１４日間，好気的条件下とすることが望まし
い。上記のスクリーニング操作によって得られた本発明
菌は、以下のような菌学的性質を有する。

【００１３】（Ａ）核染色本菌株を核染色したが、核膜の存在は認められなかっ
た。本菌株は原核生物である。（Ｂ）コロニーの観察ＩＳＰ２寒天培地上でのコロニー群にポック形成が見ら
れた。（Ｃ）形態ＩＳＰ２寒天培地：太さ２〜３μｍの糸状菌無機寒天培地^＊：太さ１〜２μｍの糸状菌（＊実施例１の表２に示す組成の無機寒天培地）（Ｄ）グラム染色陽性（Ｅ）イソプレノイドキノンの分析メナキノンタイプ（ＭＫ）のイソプレノイドキノンが存
在する。

【００１４】以上の菌学的性質により、本菌株は放線菌
であると判断される。更に、本菌株を同定するために、
菌学的性質を調べた。本発明菌は、以下のような菌学的
性質を有している。

【００１５】（ａ）形態胞子形成菌糸の分枝法及び形態・分枝法：単純分枝・形態：直状胞子の数：４〜５胞子程度の連鎖胞子の表面構造及び大きさ・表面構造：楕円形・大きさ：０．５〜１．０μｍ×１．５〜２．０μｍ鞭毛胞子の有無：観察されない胞子嚢の有無：観察されない

【００１６】（ｂ）各培地における生育状態シュクロース・硝酸塩寒天培地・生育状態：中程度の生育、黄色、平面状・コロニー裏面の色：淡褐色・気菌糸の形成：僅かに形成、クリーム色・拡散性色素：生産しないグルコース・アスパラギン寒天培地・生育状態：中程度の生育、クリーム色、盛り上がった
生育・コロニー裏面の色：淡褐色・気菌糸の形成：不良・拡散性色素：生産しないグリセリン・アスパラギン寒天培地・生育状態：弱い生育、白色、平面状・コロニー裏面の色：白色・気菌糸の形成：僅かに形成、白色・拡散性色素：生産しないスターチ寒天培地・生育状態：弱い生育、クリーム色、へそ状・コロニー裏面の色：淡褐色・気菌糸の形成：不良・拡散性色素：生産しないチロシン寒天培地・生育状態：中程度の生育、白色、平面状・コロニー裏面の色：白色・気菌糸の形成：良好、白色・拡散性色素：生産しない栄養寒天培地・生育状態：良好な生育、クリーム色、盛り上がった生
育・コロニー裏面の色：白色・気菌糸の形成：僅かに形成、白色・拡散性色素：生産しないイースト・麦芽寒天培地・生育状態：中程度の生育、クリーム色、平面状・コロニー裏面の色：淡褐色・気菌糸の形成：不良・拡散性色素：生産しないオートミール寒天培地・生育状態：中程度の成育・コロニー裏面の色：白色・気菌糸の形成：不良・拡散性色素：生産しない

【００１７】（ｃ）生理学的性質生育温度範囲：１５〜３６℃ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼラチン培地
上）：液化するスターチの加水分解（スターチ寒天培地上）：陽性脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固しない、ペプトン
化するメラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及びペプト
ン・イースト鉄寒天培地上）：生成しない

【００１８】（ｄ）各炭素源の同化性（プリドハム・ゴ
ドリーブ寒天培地上）Ｌ−アラビノース：利用するが、生育弱いＤ−キシロース：同上Ｄ−グルコース：同上Ｄ−フラクトース：同上シュクロース：同上イノシトール：同上Ｌ−ラムノース：同上ラフィノース：同上Ｄ−マンニット：同上

【００１９】（ｅ）糖の分析グルコース：存在するマンノース：存在するリボース：存在しないラムノース：存在しないガラクトース：存在するアラビノース：存在するキシロース：存在しないマジュロース：存在しない

【００２０】（ｆ）ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の分
析ＬＬ−ＤＡＰ：存在しないｍｅｓｏ−ＤＡＰ：存在する（ｇ）ミコール酸の分析ミコール酸：存在しない（ｈ）ＧＣ（グアニン・シトシン）コンテントＧＣコンテント：６０％

【００２１】以上の菌学的性質からバージェイズマニ
ュアルオブシステマティックバクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）に基づき検索を行
ったところ、本菌株に類似の属としてノカルディア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）とアクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙ
ｎｎｅｍａ）が見出された。これらの性質を表１に比較
して示す。なお、表１中、本菌株の一例をＨ−５０３と
して示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１より判るように、本菌株は、類似の属
であるノカルディア及びアクチノシネマとは明らかに異
なる属である。また、形態的にも、ＩＳＰ２寒天培地上
で２〜３μｍの太さの糸状菌は今まで報告されておら
ず、本菌株は新菌であり、現在知られているどの属にも
属さないと判断される。以上の菌学的性質から、本発明
菌は、新規な微生物であると認められ、工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第１１７５３号（ＦＥＲ
ＭＰ−１１７５３）として寄託されている。

【００２４】次に、本発明の第１，第２方法の詳細を説
明する。本発明第１方法では、上記の生育炭素源と、ア
ルキルナフタレン化合物、好ましくは炭素数１〜１０の
低級アルキル基、より好ましくはメチル基，エチル基，
プロピル基を少なくとも１つもつナフタレン化合物とを
含む培養液に、本発明菌を接種するか、あるいは上記の
生育炭素源を含む培養液に本発明菌を接種後、所定の期
間経過後に上記のアルキルナフタレン化合物を添加す
る。但し、アルキルナフタレン化合物のナフタレンカル
ボン酸化合物への変換反応は、菌体が充分生育した後に
生じる反応であり、一方アルキルナフタレン化合物の多
くは昇華性を有するため、培養初期からアルキルナフタ
レン化合物を添加しておくと、アルキルナフタレン化合
物の若干量が昇華し、原料の損失となることがある。ア
ルキルナフタレン化合物の添加量は、培地に対し、約
０．０１〜１０重量％、好ましくは約０．１〜５重量％
が適している。

【００２５】このときの培地としては、上記した有機酸
（例えば、酢酸等）、該有機酸のナトリウム塩やカルシ
ウム塩等、アルコール類（例えば、１−，２−，３−ペ
ンタノールや１−，２−，３−ヘキサノール等）、ケト
ン類（例えば、ジエチルケトン，メチル−ｎ−プロピル
ケトン，ｔ−ブチルメチルケトン，メチルエチルケトン
等）、糖類（例えば、グルコース，Ｄ−アラビノース，
Ｄ−キシロース，Ｄ−グルコース，Ｄ−フラクトース，
シュクロース，イノシトール，Ｌ−ラムノース，ラフィ
ノース，Ｄ−マンニット，ガラクトース等）を生育炭素
源とし、これに前述のアルキルナフタレン化合物、及び
前述のスクリーニングで使用したものと同様の一般的な
培地成分を添加したものが使用される。また、このとき
の培養条件は、上記した本発明菌の培養条件と同様とす
ればよい。

【００２６】本発明第２方法では、本発明菌の休止菌体
又は菌体由来の酵素や他の菌体成分を、アルキルナフタ
レン化合物、好ましくは炭素数１〜１０の低級アルキル
基、より好ましくはメチル基，エチル基，プロピル基を
少なくとも１つもつナフタレン化合物と接触させる。上
記の休止菌体は、本発明第１方法と同様の培地を使用
し、同様の培養条件で培養したものをそのまま用いる
か、あるいは遠心分離等で固液分離して用いる。なお、
固液分離した菌体は、更に、燐酸緩衝液等の溶液で洗浄
し、該溶液に懸濁させて使用することもできる。また、
菌体由来の酵素や他の菌体成分は、常法により精製した
ものを使用することが望ましい。例えば、上記した菌体
の懸濁液を、超音波破砕機，フレンチプレス，高圧ホモ
ジナイザ等により破砕処理して得られた菌体破砕物を、
遠心分離等により固液分離した後、カラム精製，電気泳
動等の一般的精製手段により精製酵素としたものを使用
する。

【００２７】更に、これらの休止菌体や菌体成分は、固
定化したものを使用することもでき、固定化したものを
使用することによって、効率良く反応を行うことができ
る。この固定化は、アルギン酸カルシウム法，ポリアク
リルアミドゲル法，ポリウレタン樹脂法，光架橋樹脂法
等の常法により行うことができる。これらの休止菌体や
菌体成分に、上記のアルキルナフタレン化合物を、燐酸
緩衝液中で接触させると、酸化反応が生じてナフタレン
カルボン酸化合物が製造される。このときの反応条件
は、本発明第１方法の場合の条件と同様とすればよい。
また、休止菌体又は菌体成分の添加量は、いずれも少な
過ぎると上記の酸化反応が生じず、逆に多過ぎると不経
済となるため、いずれも培地に対し、約０．０１〜２０
重量％とすることが好ましい。この反応において、エネ
ルギ−源として、メタノール，エタノール，水素，ニコ
チン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ），ホル
ムアルデヒド，蟻酸等の電子供与体を適宜添加するのが
好ましい。

【００２８】以上のようにして得られる本発明第１方法
の培養液あるいは本発明第２方法の反応液中のナフタレ
ンカルボン酸化合物は、常法により精製することができ
る。例えば、２，６−ナフタレンジカルボン酸は、培養
液又は反応液を濾過，遠心分離等により固液分離し、得
られた溶液に塩酸，硫酸等の酸溶液を加えて酸性とする
ことにより、２，６−ナフタレンジカルボン酸を回収す
ることができる。また、溶剤抽出等の方法によっても回
収することができ、この場合は、カラムクロマトグラフ
ィ等の公知の精製方法を適宜併用することができる。

【００２９】

【作用】本発明菌は、２，６−ジメチルナフタレン，２
−メチルナフタレン，２−エチルナフタレン，その他各
種のアルキルナフタレン類のアルキル基の全てあるいは
一部をカルボキシル基まで酸化する強い酸化酵素を持
ち、かつ芳香環の開裂反応等に必要な酵素を持たない微
生物である。このため、本発明菌は、従来の化学酸化法
や微生物酸化法に比して、高効率でアルキルナフタレン
類を酸化する作用を有し、微生物酸化法に広く応用され
る。

【００３０】また、本発明第１方法では、上記した本発
明菌が、脂肪族炭化水素，有機酸，有機酸の塩，アルコ
ール類，ケトン類，糖類のうちの少なくとも１つを生育
炭素源として増殖する際に、本発明菌が生成する酵素や
他の菌体成分の作用により、アルキルナフタレン化合物
のアルキル基の全て又はその一部のみを酸化して、ナフ
タレンカルボン酸化合物を製造する。このとき、本発明
菌は、アルキルナフタレン化合物を資化することがない
ため、アルキルナフタレン化合物を酸化して製造したナ
フタレンカルボン酸化合物を、これ以上酸化したり、分
解したりすることはない。よって、本発明第１方法によ
れば、高収率でナフタレンカルボン酸化合物を製造する
ことができる。また、本発明第２方法では、本発明菌の
休止菌体又は菌体成分を、アルキルナフタレン化合物に
接触させる。すると、酸化反応が生じて、ナフタレンカ
ルボン酸化合物が生成される。このとき、アルキルナフ
タレン化合物が資化されたり、生成されたナフタレンカ
ルボン酸化合物がこれ以上酸化されたり、分解される等
の不要な反応は生じない。よって、本発明第２方法によ
っても、高収率でナフタレンカルボン酸化合物を製造す
ることができる。

【００３１】

【実施例】

実施例１表２に示す培地成分を、蒸留水１リットルに溶かして培
地１を調製した。この培地１のｐＨは７．０であった。

【００３２】

【表２】

【００３３】上記のｐＨ７．０の培地１を、内径２１ｍ
ｍの試験管に１０ｍｌ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し
た後、室温に冷却した。これに、石油精製施設にて採集
した１０００種類の土壌を夫々０．５ｇと、生育炭素源
としてｎ−ヘキサデカンを０．１ｍｌ加え、試験管振盪
培養装置により、３０℃，２５０ｒｐｍにて７日間往復
振盪培養した。この培養液の夫々を、上記と同様に培地
１を分注、滅菌した別の試験管に、３白金耳植え継ぎ、
上記と同様に７日間振盪培養した。この培養液の夫々を
滅菌水により１０^６〜１０^８倍の範囲で希釈した後、培
地１に更に寒天を１リットル当たり１５ｇ加えて調製し
た寒天平面培地２に塗布し、ｎ−ヘキサデカンを０．１
ｍｌ加え、３０℃で７日間培養した。出現したコロニー
を白金耳で拾い、上記の培地１に移し、ｎ−ヘキサデカ
ン０．１ｍｌとアルキルナフタレン類として２，６−ジ
メチルナフタレン５ｍｇを加え、３０℃，２５０ｒｐｍ
にて７日間振盪培養した。この培養液の上清を、ＨＰＬ
Ｃにて分析し、２，６−ジメチルナフタレンを６−メチ
ル−２−ナフトエ酸や２，６−ナフタレンジカルボン酸
に酸化する強い酸化力を持つ菌株を選別した。更に、選
別した菌株は、上記の培地１に白金耳で植え継ぎ、炭素
源として２，６−ジメチルナフタレン５ｍｇを加え、上
記と同様に７日間培養した。その結果、炭素源として
２，６−ジメチルナフタレンのみを加えた場合には生育
しない菌の中で最も２，６−ナフタレンジカルボン酸の
生成量の高いものとして、微生物ＦＥＲＭＰ−１１７
５３を得た。

【００３４】実施例２実施例１の培地１を内径２１ｍｍの試験管に１０ｍｌ入
れ、微生物ＦＥＲＭＰ−１１７５３を接種し、同時にア
ルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフタ
レン５ｍｇと、生育炭素源としてｎ−ヘキサデカン０．
１ｍｌとを添加し、試験管振盪培養装置により、３０
℃，２５０ｒｐｍにて７日間培養した。この培養液の上
清を、ＨＰＬＣにて分析したところ、１５０ｍｇ／ｌの
２，６−ナフタレンジカルボン酸と、１００ｍｇ／ｌの
６−メチル−２−ナフトエ酸とが生成されていた。

【００３５】実施例３アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、１−メチルナフタレンを５ｍｇ添加
する以外は、実施例２と同様にして培養したところ、培
地中に０．３ｍｇ／ｌの１−ナフトエ酸が生成されてい
た。

【００３６】実施例４アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、２−メチルナフタレンを５ｍｇ添加
する以外は、実施例２と同様にして培養したところ、培
地中に１２０ｍｇ／ｌの２−ナフトエ酸が生成されてい
た。

【００３７】実施例５アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、１−エチルナフタレンを５ｍｇ添加
する以外は、実施例２と同様にして培養したところ、培
地中に１．８ｍｇ／ｌのα−ナフチル酢酸が生成されて
いた。

【００３８】実施例６アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、２−エチルナフタレンを５ｍｇ添加
する以外は、実施例２と同様にして培養したところ、培
地中に８９ｍｇ／ｌのβ−ナフチル酢酸が生成されてい
た。

【００３９】実施例７アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、２，３−ジメチルナフタレンを５ｍ
ｇ添加する以外は、実施例２と同様にして培養したとこ
ろ、培地中に０．５ｍｇ／ｌの２，３−ナフタレンジカ
ルボン酸が生成されていた。

【００４０】実施例８アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、１，２−ジメチルナフタレン、１，
３−ジメチルナフタレン、１，４−ジメチルナフタレ
ン、１，５−ジメチルナフタレン、１，６−ジメチルナ
フタレン、１，８−ジメチルナフタレン、２，３−ジメ
チルナフタレン、２，７−ジメチルナフタレンを各々５
ｍｇ添加する以外は、実施例２と同様にして培養を行っ
た後、培養液を遠心分離し、上清をＣ１８カラム（ウォ
ーターズ社製商品名“セップパック”使用）にて吸着処
理し、メタノールにて溶出した成分を常法に従いジアゾ
メタンにてメチル化し、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラ
フィ／マススペクトル）（ヒューレット・パッカード社
製商品名“ＨＰ５８９０シリーズII”と“ＨＰ５９７
１”四重極質量分析計）にて分析した。このときの分析
条件は、表３の通りとした。

【００４１】

【表３】

【００４２】上記の分析の結果、全ての基質に対して、
モノカルボン酸のメチル化物及びジカルボン酸のメチル
化物に対応するピークが得られた。得られた分析結果の
代表例として、２，３−ジメチルナフタレンを基質とし
た場合の結果を、参考のためにオーセンティク（標品）
のピークと併せて、図１及び図２に示す。なお、図１が
本発明の製造方法により生産されたモノカルボン酸のメ
チル化物に対応するマススペクトルで、図２が本発明の
製造方法により生産されたジカルボン酸のメチル化物に
対応するマススペクトルである。

【００４３】比較例１アルキルナフタレン類に対し強い酸化力を持つ微生物と
してロドコッカス属に属する微生物であるロドコッカス
・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＡＴＣ
Ｃ１９０７０株を用いる以外は、実施例２と同様にして
培養して２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産を試み
たが、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生成は認めら
れなかった。

【００４４】実施例９生育炭素源として表４に示す組成からなるパラフィン混
合物を０．１ｍｌ使用した以外は、実施例２と同様の操
作を行った。この結果、１３０ｍｇ／ｌの２，６−ナフ
タレンジカルボン酸を製造することができた。

【００４５】

【表４】

【００４６】実施例１０生育炭素源としてエタノールを０．１ｍｌ使用した以外
は、実施例２と同様の操作を行った。この結果、９０ｍ
ｇ／ｌの２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造するこ
とができた。

【００４７】実施例１１生育炭素源として酢酸ナトリウムを０．１ｇ使用した以
外は、実施例２と同様の操作を行った。この結果、７５
ｍｇ／ｌの２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する
ことができた。

【００４８】実施例１２生育炭素源としてグルコースを０．１ｇ使用した以外
は、実施例２と同様の操作を行った。この結果、１００
ｍｇ／ｌの２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する
ことができた。

【００４９】実施例１３実施例１と同様にして調製した培地８リットルを、内容
量１０リットルの醗酵槽に入れ、１２１℃で１５分間滅
菌した後、室温に冷却した。これに、微生物ＦＥＲＭ
Ｐ−１１７５３を接種し、同時に２，６−ジメチルナフ
タレン８ｇと、生育炭素源としてｎ−ヘキサデカン８０
ｍｌとを添加し、３０℃，５００ｒｐｍで７日間培養し
た。培養中、菌の生育と共に培養液のｐＨの低下が認め
られたので、２Ｎの水酸化ナトリウムをチュービングポ
ンプにて供給し、ｐＨを６．０に保持した。７日間経過
後、培地中の２，６−ナフタレンジカルボン酸をＨＰＬ
Ｃで分析したところ、９５０ｍｇ／ｌの２，６−ナフタ
レンジカルボン酸が製造されていた。

【００５０】実施例１４培養中のｐＨ６．０への保持を、１５％アンモニア水と
６ＮのＨＣｌの添加により行った以外は、実施例１３と
同様にして、培養時間による２，６−ナフタレンジカル
ボン酸の製造状況を調べた。この結果は、表５に示す通
りであった。なお、表５の結果をグラフ化して図３に示
した。

【００５１】

【表５】

【００５２】実施例１５アルキルナフタレン化合物として２，６−ジメチルナフ
タレンの代わりに、２−エチルナフタレンを１６ｇ添加
し、培地のｐＨを６．５とする以外は、実施例１３と同
様にして培養し、処理し、分析したところ、１８２０ｍ
ｇ／ｌのβ−ナフチル酢酸が生成されていた。

【００５３】実施例１６表６に示す培地２００ｍｌを、５００ｍｌ容の坂口フラ
スコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌した後、室温に冷
却した。これに、微生物ＦＥＲＭＰ−１１７５３を接
種し、３０℃，１１０ｒｐｍで３日間振盪培養した。こ
の後、遠心分離機にて菌体を集菌し、ｐＨ７．０の酢酸
緩衝液で２回洗浄した。洗浄した菌体を、上記の緩衝液
２００ｍｌに、６６０ｎｍにおける吸光度が４．０とな
るように懸濁させ、２，６−ジメチルナフタレンを１０
０ｍｇ添加した後、電子供与体として１Ｍエタノール水
溶液を０．１ｍｌ加え、３０℃，２５０ｒｐｍにて２４
時間反応させた。この結果、反応液中に、２５０ｍｇ／
ｌの２，６−ナフタレンジカルボン酸が製造されてい
た。

【００５４】

【表６】

【００５５】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明菌は、アル
キルナフタレン類のアルキル基に対して強い酸化力を有
するため、従来の化学的酸化法や微生物学的酸化法に代
えて、アルキルナフタレン類のアルキル基のみを微生物
学的に酸化する技術において広く適用することができ
る。また、本発明第１，第２方法は、本発明菌を使用す
るため、ナフタレン環の開環反応が生起したり、本発明
菌によってアルキルナフタレン化合物が資化されること
がなく、従って原料の損失のない高効率でのアルキルナ
フタレン化合物からのナフタレンカルボン酸化合物の製
造方法を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の２，３−ジメチルナフタレンを基質と
して得た生成物（モノカルボン酸のメチル化物）のマス
スペクトルの一例を示すグラフである。

【図２】本発明の２，３−ジメチルナフタレンを基質と
して得た生成物（ジカルボン酸のメチル化物）のマスス
ペクトルの一例を示すグラフである。

【図３】本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸の製
造状況の一例を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (72)発明者堀田康司埼玉県大宮市櫛引町２丁目598番１号 (56)参考文献特開昭63−219385（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】脂肪族炭化水素，有機酸類，その塩，ア
ルコール類，ケトン類，糖類のうちの少なくとも１つを
炭素源として生育可能で、アルキルナフタレン類に対し
強い酸化力を示し、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１１７５３号（ＦＥＲＭＰ−１１７５
３）として寄託されたことを特徴とする微生物。
【請求項２】請求項１記載の微生物をアルキルナフタ
レン化合物を含む培地で培養することを特徴とするナフ
タレンカルボン酸化合物の製造方法。
【請求項３】請求項１記載の微生物の休止菌体又は菌
体成分をアルキルナフタレン化合物と接触させることを
特徴とするナフタレンカルボン酸化合物の製造方法。