JPH0380091A - 新規微生物及び該微生物を用いた２，６―ナフタレンジカルボン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シュードモナス属に属する新規微生物、及び
該微生物、その休止菌体または菌体由来の酵素を用いて
２，６−ジメチルナフタレンを酸化１，２．６−ナフタ
レンジカルボン酸を製造する方法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

２．６−ナフタレンジカルボン酸は高機能性樹脂原料、
合成中間体として有用な化合物であり、現在化学合成法
により生産されている。ところで、この２，６−ナフタ
レンジカルボン酸を高機能性樹脂原料として用いる場合
、同−芳香環主にカルボキシル基が複数個導入されたも
のが混入していると重合度を低下させるため、純度の高
い２，６−ナフタレンジカルボン酸が必要とされる。

しかしながら、化学合成法は高温反応であるため、官能
基の転移が起こりやすく、純度の高い２゜６−ナフタレ
ンジカルボン酸が得られにくい。・また、化学合成法は
高温高圧反応であるため爆発の危険性があり、大量のエ
ネルギーを消費する等の問題点もあった。

これらの問題点を解決する方法として、微生物を用いた
微生物酸化法の研究が進められている。

微生物酸化法は常温常圧で反応させることができるうえ
、官能基の転移が起こらないため副生物の生産がほとん
どないという優れた特徴を有している。

しかしながら、これまでの方法では微生物を用いて２．
６−シメチルナフタ、レンを酸化しても、一方のメチル
基しか酸化されず、２，６−ナフタレンジカルボン酸を
生産することはできなかった（Ｂ、　　八、　　ＢへＲ
ＮＳＬＢＹ　　八ＰＰＬＩＩＥＤ　　ＡＮＤ　　ＢＮＶ
ＩＲＯＮＭＢＮＴ八ＬＭＩＣＲＯＢＩＯへＯＧＹ　ＶＯ
Ｌ、　　５４．　　Ｎｏ、２　　Ｆｅｂ、　　１９８８
年。

４２８〜４３３頁）。また、糖質との共酸化により２．
６−ナフタレンジカルボン酸の生産を確認した報告もあ
るが、収量が低く定性的な研究にとどまっている（Ｇ、
　Ｋ、　５ＫＲＹＡＢＩＮ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＯＫ
Ｌ。

ＡＫＡＤ、　　ＮへｌＩＫ［ｌ５ｓＲ２０２，９７３〜
　９７４　頁。

１９７２年）。

このため、新規な２，６−ナフタレンジカルボン酸生産
菌を見出し、微生物酸化法により２，６ジメチルナフタ
レンから２．６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方
法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者らは、前記課題を解決せ
んと鋭意検討を重ね、幾多の微生物をスクリーニングし
た結果、２．６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基
を酸化できる酸化力の強い新規微生物を見出し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、シュードモナス属に属し、２．６
−ジメチルナフタレンを単一炭素源として生育可能であ
る２、６−ナフタレンジカルボン酸生産菌ならびに該２
，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌を、２，６−ジメ
チルナフタレンを含む培地で培養することを特徴とする
２、６−ナフタレンジカルボン酸の製造法及び該２．６
−ナフタレンジカルボン酸生産菌の体止菌体もしくは菌
体由来の酵素を２．６−ジメチルナフタレンと接触させ
ることを特徴とする２、６−ナフタレンジカルボン酸の
製造法を提供するものである。

本発明の新規微生物は、通常の手段、例えば炭素源とし
て２，６−ジメチルナフタレンのみを添加した培地を用
いて、該培地で生育し、２，６ナフタレンジカルボン酸
生産能力があるか否かをもってスクリーニングすること
により分離することができる。

当該分離方法の詳細を以下に例示する。すなわち、微生
物の増殖に必要な成分のうち炭素源を含まない培地（以
下、培地という）を試験管等に分注、滅菌した後、予め
採取した土壌を添加する。

これに２．６−ジメチルナフタレンを加え、試験管振と
う機等により培養を行なう。この培養液を予め培地を分
注しておいた別の試験管等に白金耳等を用いて植えつぎ
した後、２．６−ジメチルナフタレンを添加し試験管振
とう機等によりさらに培養する。この培養液もしくは滅
菌水等で希釈した培養液を寒天培地等に塗布した後、２
．６−ジメチルナフタレンを添加し、さらに培養する。

培養によって得られたコロニーを単離し、それぞれの菌
株について２．６−ナフタレンジカルボン酸生産能力を
確ｇ忍することにより、２，６−ナツタレンジカルボン
酸生産菌を選択することができる。

前記分離操作に用いる培地には炭素源以外は一般的な培
地成分を使用することができる。すなわち、窒素源とし
ては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿
素等が、無機塩類としては、例えばカリウ・ム、ナトリ
ウム、鉄、マクネシウム、マンガン、銅、カルシウム、
コバルト等の各塩類等が使用できる。また、前記分離操
作における培養条件は、一般に微生物が死滅しない培養
条件であればよく、例えばｐＨ約４〜９、温度約１０〜
４０℃で約１〜３０日間好気的に培養すればよい。得ら
れた菌株の２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産能力
の確認は、それぞれの菌株を前記分離操作に用いたと同
様の培地に２゜６−ジメチルナフタレンを添加した培地
中で、同様の条件で培養した培養液を遠心分離等で分離
した後、上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）　、ガスクロマトグラフイー
（ＧＣ）　、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線
吸収スペクトル（ＩＲ）　、紫外線吸収スペクトル（Ｉ
ＩＶ）等を用いて分析すればよい。

前記分離操作によって得られた微生物の一例であるＩ）
−１８６株を、細菌の分類同定法〔パージエイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１版、　１９８
４年〕に従って同定試験を行なった。その結果、本発明
の新規微生物Ｄ−１８６は、以下のような菌学的性質を
有する。

（ａ）　　形態 ■細胞の形及び大きさ 長桿菌、０．３〜０．５× ２μｍ なし あり、極鞭毛（車名） なし 陰性 なし ■細胞の多形性の有無 ■運動性の有無 ■胞子の有無 ■ダラム染色性 ■抗酸性 （ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　良好な生育、黄色、（形）円形
、（隆起） 半レンズ状、（周辺） 金縁、（表面）粗面、 （光沢）にぷい光沢、 （性質）粘稠 ■肉汁寒天斜面培養　　良好な生育、黄色、（隆起）台
状、（表 面）粒状、（光沢）に ぷい光沢 ■肉汁液体培養　　　　良好な生育、 （混濁）なし、（沈 澱）少、（菌膜）厚膜 状 ■肉汁ゼラチン穿刺培養　中程度の生育、ゼラチンを液
化する ■リドマスミルク　　　脱色する、凝固しない（Ｃ）生
理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　（＋） ■脱窒反応　　　　　　（−） 只 ■ＭＲテスト ■ＶＰテスト ■インドールの生成 ■硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解 ■クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地 Ｃｈｒ　１ｓｔｅｎｓｅｎの培地 ■無機窒素源の利用 硝酸塩 アンモニウム塩 ［相］色素の生成 ■ウレアーゼ ■オキシダーゼ ［相］カタラーゼ ■生育の範囲 温度 （−） （−） なし なし く−） 利用する 利用する 利用する 利用する なし く−） （＋） （十） ｌ０℃で生育しない、 １５〜３７℃で生育す る、４１℃で生育しな い ｐＨ３，５１で生育しない、 ４．１９〜８．９３で生育する、 ９．０８で生育しない ［相］酸素に対する態度　　好気性 ［相］○−Ｆテスト　　　　酸化的 ■糖類から酸及びガスの生成の有無 （１）Ｌ−アラビノース　酸（−）、ガス（−）（２）
Ｄ−キシロース　　酸く＋）、ガス（−）（３）Ｄ−グ
ルコース　　酸（＋）、ガス（−）（４）Ｄ−マンノー
ス　　酸（−）、ガス（−）（５）Ｄ−フラクトース　
酸（＋）、ガス（−）（６）Ｄ−ガラクトース　酸（＋
）、ガス（−）（７）麦芽糖　　　　　　酸く＋〉、ガ
ス（−）（８）ショ糖　　　　　　酸（＋）、ガス（−
）（９）乳　糖　　　　　　酸（＋）、ガス（−８）Ｑ
、Ｇ　）レバロース　　　酸く＋）、ガス（−）Ｑｌ）
Ｄ−ソルビット　　酸（−）、ガス（−）０のＤ−マン
ニット　　酸（−）、ガス（−）０つイノジット　　　
　酸（−）、ガス　（−）０４）グリセリン　　　　酸
（−）、ガス〈−）Ｑ！ｉｔデンプン　　　　　酸（＋
）、ガス（−）［相］アルコール酸化能　　あり 以上の同定結果から、本菌はシュードモナス属に属する
ものと認められる。さらに、本菌は２゜６−ジメチルナ
フタレンを単一炭素源として生育可能であり、かつ培地
中に２，６−ナフタレンジカルボン酸を蓄積する。芳香
族炭化水素を酸化する酸化力の強い菌株としてシュード
モナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｐｕｔｉｄ
ａ）八ＴＣＣ１７４８４株、１２６３３株、ロドコッカ
ス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、）八Ｔ
ＣＣ１９０７０株、シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）八ＴＣＣ１７４８３株等が
あり、２゜６−ジメチルナフタレンの一方のメチル基の
みを酸化して６−メチルナフタレン−２−カルボン酸を
蓄積する例としてロドコッカス　エスピーＡＴＣＣ１９
０７０株が知られている。しかしながら、シュードモナ
ス属に属し、２，６−ジメチルナフタレンを単一炭素源
として生育可能である２、６ナフタレンジカルボン酸生
産菌は、まだ報告されていない。本菌は前記の菌よりも
はるかに強い酸化力を有しており、様々な酸化反応に利
用可能である。以上の菌学的性質より本発明者らは、木
菌はシュードモナス属に属する新菌種であると判定し、
本菌をシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ
、　　Ｄ１８６株と命名し、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した〔微工研菌寄第１０９５３号（ＦＢＲ
ＭＰ−１０９５３）　：ｌ。

本発明微生物を用いて２．６−ジメチルナフタレンを酸
化し、２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産するには
、本発明微生物を培養してもよいし、該微生物の体止菌
体または菌体由来の酵素と２．６−ジメチルナフタレン
を接触させてもよい。

次に本発明微生物としてＤ−１８６株（以下、本菌とい
う）を用いた場合の２．６−ナフタレンジカルボン酸の
製造法について説明する。本菌を培養する場合の使用培
地としては、炭素源として２．６−ジメチルナフタレン
を含有すること以外は、本閑の生育が良好であれば他の
培地成分は特に制限されない。すなわち、窒素源として
は、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモ
１ ニウム、硫酸アンモニウム、ｌ１ｌｌ１２アンモニウム
、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素等が、無機塩類としては、例えばカリウム、ナ
トリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウ
ム、コバルト等の各塩類等が使用できる。炭素源として
は、２．６−ジメチルナフタレン以外に安息香酸、サリ
チル酸、２−メチルナフタレン、ナフタレン、アントラ
セン、グルコース、フラクトース、デンプン等の補助基
質を添加することも可能である。

培養条件は、本菌が死滅せず増殖可能であればよく、例
えば培養温度は約１５〜３７℃、より好ましくは約２５
〜３５℃、培地のｐＨは約４．２〜８．９、より好まし
くは約６．０〜８．０で、好気的雰囲気で約１〜３０日
間培養するのが好ましい。

２．６−ジメチルナフタレンを単一炭素源として本菌を
培養する場合、目的とする２、６−ナフタレンジカルボ
ン酸を効率よく生産するためには、基質である２、６−
ジメチルナフタレンを本菌の増殖のための最低必要量以
上に添加することが必要である。前記の補助基質を添加
する場合は、補助基質の添加量に応じて２．６−ジメチ
ルナフタレンの添加量を調整することができる。本菌は
、２６−ジメチルナフタレンによって阻害を受けないた
め、これを多量に添加することが可能であるが、生成す
る２、６−ナフタレンジカルボン酸の量が増加すると培
地中のｐ＋＋が下がるので、水酸化ナトリウム、アンモ
ニア、水酸化カリウム等のアルカリ溶液でｐＨを調整す
ることが望ましい。

本菌を用いて、２，６−ジメチルナフタレンから２，６
−ナフタレンジカルボン酸を生産する工程はバッチ式で
もよく、バイオリアクター等を用いる連続式でも可能で
ある。基質である２、６−ジメチルナフタレンは、例え
ば坂ロフラスコを用いたバッチ生産の場合は培地約１１
に対し約０．５〜６０ｇ１−船釣なファーメンタ−を使
用し、アルカリで中和しながらバッチ生産を行なう場合
は培地約１ｊ２に対し約０．５〜１５０ｇ添加できる。

また、２，６−ジメチルナフタレン上に直接本菌を増殖
させ、培地を連続的または間欠的に噴霧することもでき
る。

次に本閑の体止菌体あるいは菌体由来の酵素により２，
６−ナフタレンジカルボン酸を生産する場合、用いる菌
体の生産は、前記培養条件下での場合と同じ条件で行な
うことができる。得られた菌体培養物は、そのまま酵素
源として使用することができるが、遠心分離等の操作に
より固液分離して得た微生物菌体を用いることが好まし
い。さらに微生物菌体を燐酸緩衝液等の溶液で洗浄し、
該溶液にｌｌ！！！濁して使用することもできる。また
、菌体由来の酵素は、常法により精製することができる
。すなわち、例えば微生物菌体の懸濁液を超音波、フレ
ンチプレス、高圧ホモジナイザー等により破砕処理して
得られた菌体破砕物を、遠心分離等の操作により固液分
離した後、カラム精製、電気泳動等の一船釣＠製手法を
用いて精製酵素とすることができる。また、微生物菌体
や酵素を固定化したものを使用することもでき、固定化
したものを使用することによって効率よく反応を行なう
ことができる。この固定化は、アルギン酸カル喝 シウム法、ボ・リアクリルアミドゲル法、ポリウレタン
樹脂法、光架橋樹脂法等常法により、行なうことができ
る。

これらの菌体もしくは菌体由来の酵素を用いて、２６−
ナフタレンジカルボン酸を生産するためには、菌体もし
くは菌体由来の酵素を、２，６ジメチルナフタレンと燐
酸緩衝液等の中で接触させて反応させればよい。反応温
度及びｐＨは、前述した本閑の培養条件下の場合と同様
であるのが好ましく、また好気的雰囲気で反応させるの
が好ましい。この反応においては、エネルギー源として
メタノール、エタノール、水素、ニコチン酸アミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮへＤ）、ホルムアルテ′ヒト、
蟻酸等の電子供与体を適宜添加するのが好ましい。

以上の如くして得られた培養液または反応液中の２．６
−ナフタレンジカルボン酸は常法により精製することが
できる。すなわち、培養液または反応液を濾過、遠心分
離等により処理した後、得られた溶液に塩酸、硫酸等の
酸溶液を加えて酸性とすることにより、２，６−ナフタ
レンジカルボン酸を回収することができる。また、溶剤
抽出等の方法により回収することも可能であり、カラム
クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用するこ
ともできる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来知られていなかった２゜６−ジメ
チルナフタレンを単一炭素源として生育可能で、２，６
−ナフタレンジカルボン酸を生産することができる新規
微生物もしくはその休止菌体または菌体由来の酵素を用
い、２．６−ジメチルナフタレンから微生物酸化法によ
り、２．６ナフタレンジカルボン酸を効率良く生産する
ことができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ 第１表に示す培地成分を蒸留水１１に溶解したところ、
ｐ＋＋は７．０であった。

第１表 この培地を内径２１ｍｍの試験管に１０ｍｅ入れ、１２
１℃で１５分間滅菌した。冷却後、三重県四日市地方の
石油精製施設にて採集した１、　０００種類の土壌をそ
れぞれ０．５ｇ加え、別途濾過滅菌した２、６−ジメチ
ルナフタレンをそれぞれ５　ｍｇ添加し、試験管振とう
機により３０℃、２５　Ｏｒｐｍで７日間往復振とう培
養した。別の試験管にさきに作成した培地１０ｍ１を分
注し、白金耳を用いて培養液を３白金耳植えつぎした後
、試験管振とう機により３０℃、２５　Ｏｒｐｍでさら
に７日間往復振とう培養した。増殖が認められたものに
ついて滅菌水を用いて１０４〜１０８倍の範囲で希釈し
た後、さきに調製しておいたものと同様の培地１１にさ
らに１５ｇの寒天を加えることにより予め調製しておい
たシャーレを用いた平板培地に塗布し、２．６−ジメチ
ルナフタレン５　ｍｇを加えた後、３０℃で７日間培養
した。得られたコロニーを単離した後、すべての微生物
のうちから次の方法により２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸生産菌株を選択した。すなわち、さきに作成したの
と同様の培地１０ｍ１を試験管に分注し、１２１℃で滅
菌し、冷却した後、それぞれの微生物を白金耳を用いて
１白金耳植えつぎした。これに２．６−ジメチルナフタ
レン５　ｍｇを添加した後、試験管振とう機により３０
℃、２５　Ｏｒｐｍで７日間往復振とう培養した。この
培養液を遠心分離した後、上清を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）で分析することにより２，６−ナフ
タレンジカルボン酸生産菌を選択し、シュードモナスｓ
ｐ、Ｄ−１８６株を得た。

実施例２ 実施例１と同様の培地を内径２１ｍｍの試験管に１０−
入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。冷却後、実施例１
の方法で得た菌株を白金耳を用いて１白金耳植えつぎ、
別途濾過滅菌した２、６−ジメチルナフタレンを５　ｍ
ｇ添加し、試験管振とう機により３０℃、２５　Ｏｒｐ
ｍで７日間往復振とう培養した。培養液を遠心分離後、
上清をＨＰＬＣによって定量分析したところ、生成した
２、６−ナフタレンジカルボン酸の収量は、２０ｍｇ／
ｊ？であった。

また、生成した２、６−ナフタレンジカルボン酸は、Ｈ
ＰＬＣ，ＧＣ，ＮＭＲ，ＩＲ，ＵＶＩ、ｍより定性分析
を行なったところ、市販品と完全に一致した。

実施例３ 補助基質として濾過滅菌した安息香酸ナトリウムを５　
ｍｇ添加する以外は実施例２と同様に行なったところ、
２，６−ナフタレンジカルボン酸３００ｍｇ／ｊ！が得
られた。

実施例４ ９− それぞれ濾過滅菌した肉汁培地１００ｍ１２に２゜６−
ジメチルナフタレンｌｏｍｇを添加した後、実施例１で
得られたシュードモナスｓｐ、Ｄ−１８６株を白金耳を
用いて３白金耳植えつぎ、坂ロフラスコにて３０℃で３
日間培養し、遠心分離法によって集菌した。この菌体を
トリスマレイン酸緩衝液にて洗浄し、同級衝液に再懸濁
させ、６００ｎｍにおける吸光度が３．０となるように
菌濃度を調節した。この菌体懸濁液１００−に濾過滅菌
した２゜６−ジメチルナフタレン１００ｍｇを添加した
後、電子供与源として１Ｍエタノール水溶液１０μｌを
加え、３０℃、２５　Ｏｒｐｍで２４時間往往復上うし
て反応させた。反応生成液を遠心分離した後、ＨＰ　Ｌ
　Ｃにより定量分析したところ、生成した２、６ナフタ
レンジカルボン酸の収量は７００ｍｇ／ｊ！であった。

比較例１ 芳香族炭化水素に対し強い酸化力をもつ菌株として、シ
ュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔ
ｉｄａ）八ＴＣＣ１７４８４株１こよる２、６−ナフタ
レン０ ジカルボン酸の生産を試みた。

すなわち、実施例１と同様の培地を内径２１ｍｍの試験
管に１０−入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。冷却後
、シュードモナス　プチダ　へＴＣＣ１７４８４株を白
金耳を用いて１白金耳植えつぎ、濾過滅菌したバラキシ
レン５０μｌと２．６−ジメチルナフタレン５　ｍｇを
添加した後、３０℃、２５　Ｏｒｐｍで７日間往復振と
う培養した。培養液を遠心分離した後、上清をＩＩＰＬ
Ｃにより定量分析したところ、２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸の生成は全くδ忍められなかった。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　シュードモナス属に属し、２，６−ジメチルナフタ
   レンを単一炭素源として生育可能である２，６−ナフタ
   レンジカルボン酸生産菌。 ２　請求項１記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸生
   産菌を、２，６−ジメチルナフタレンを含む培地で培養
   することを特徴とする２，６−ナフタレンジカルボン酸
   の製造法。３　請求項１記載の２，６−ナフタレンジカ
   ルボン酸生産菌の休止菌体もしくは菌体由来の酵素を２
   ，６−ジメチルナフタレンと接触させることを特徴とす
   る２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法。