KR100850161B1

KR100850161B1 - 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및상기 방법에 의해 수득된 결정 상태의 2,6-나프탈렌디카르복실산

Info

Publication number: KR100850161B1
Application number: KR1020060098818A
Authority: KR
Inventors: 김성균; 최용복; 김동성
Original assignee: 주식회사 효성
Priority date: 2006-10-11
Filing date: 2006-10-11
Publication date: 2008-08-04
Also published as: KR20080032820A

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득되는 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 조 나프탈렌 디카르복실산을 150 내지 300℃의 물로 미리 세척한 다음, 알칼리 용액으로 용해시키고, 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하는 능력을 갖는 미생물과 반응시킨 후, 산성용액을 투입하여 결정화하고, 다시 30 내지 100℃의 물로 2차 세척하여 건조함으로써 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득할 수 있는 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 보다 경제적이고 효율적으로 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 대량생산할 수 있다.

미생물, 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid), 2-포밀-6-나프토산(2-formyl-6-naphthoic acid), 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-naphthalene dicarboxylic acid), 세척, 용해, 결정화

Description

미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산{Purification method of crude naphthalene dicarboxylic acid using microorganism and 2,6-naphthalene dicarboxylic acid in crystalline form obtained by using the same}

도 1은 본 발명에서 사용한 슈도모나스속 HN-72 균주의 16S rDNA의 일부 서열을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 실시예 2의 제 4단계에서 얻어진 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산(cNDA)의 현미경 사진이고,

도 3은 본 발명에 따른 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 실시하기 위한 정제 장치 시스템의 한 양상을 도시한 것이다.

*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*

A : 혼합기 B : 예비가열기

C : 용매가열공급장치 D : cNDA 여과 및 세정장치

E : 고압여과액 회수장치 F : 미생물 정제반응기

G : 미생물 제거장치 H : 결정화 반응기

I : 용매가열공급장치 J : 여과 및 세정장치

K : 여과액 회수장치 L : 슬러리 회수장치

M : 파우더 분리장치 N : 건조장치

본 발명은 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조 나프탈렌 디카르복실산을 150 내지 300℃의 물로 미리 세척한 다음, 알칼리 용액으로 용해시키고, 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하는 능력을 갖는 미생물과 반응시킨 후, 산성용액을 투입하여 결정화하고, 다시 30 내지 100℃의 물로 2차 세척하여 건조함으로써, 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 것을 특징으로 하는 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관한 것이다.

2,6-나프탈렌 디카르복실산과 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 디에스테르는 폴리에스테르 및 폴리아미드와 같은 여러 종류의 고분자 물질을 제조하는데 유용한 단량체이다. 예를 들면 2,6-나프탈렌 디카르복실산(NDA)과 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 디에스테르(NDC)를 에틸렌 글리콜과 축합반응하여 고성능 폴리에스테르 물질인 폴리(에틸렌2,6-나프탈레이트)(이하 PEN)을 생성할 수 있다. PEN으로부터 제조된 섬유 및 필름은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(이하 PET)에 비하여 강도가 높고 열적 성질이 우수하다. 이로 인해 PEN은 자기 녹음 테이프 및 전자 부품을 제조하는데 사용될 수 있는 박막과 같은 상용품을 제조하는데 사용되는 매우 우수 한 물질이다. 또한 기체 확산, 특히 이산화탄소, 산소 및 수증기에 대한 우수한 저항성으로 인해 PEN으로 제조된 필름은 식품 용기, 특히 고온 충전물용 식품 용기를 제조하는데 유용하다. 또한 타이어 코드 제조에 유용한 강화 섬유를 제조하는데 사용될 수 있다.

현재 NDC는 2,6-디메틸나프탈렌(이하, 2,6-DMN)을 산화시켜 조 나프탈렌 디카르복실산(이하cNDA)를 생산한 다음 이를 에스테르화하여 생산되고 있다. 현재 NDC가 PEN 합성시 주원료로 사용되고 있지만 2,6-나프탈렌 디카르복실산(이하 NDA)을 원료로 사용할 경우에 비해 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 첫째, NDA 축합반응 시에는 물이 생성되는데 비해 NDC의 경우 메탄올이 부산물로 생성되어 폭발성의 위험이 있으며, 둘째, NDC 제조 공정 중 순수한 NDC를 얻기 위하여 NDA를 에스테르화하여 정제공정을 거쳐 NDC를 생산하므로 NDA에 비하여 한 단계의 공정이 더 필요하고, 셋째로 기존의 PET 생산설비를 가지고 있을 경우 기존 설비의 이용 차원에서 NDC의 사용이 적절치 못하다. 이러한 NDC의 단점에도 불구하고 PEN 제조시 NDA 대신 NDC가 사용되는 이유는 아직까지 중합에 필요한 순도를 가진 정제된 NDA의 제조가 어렵기 때문이다.

2,6-DMN의 산화시에는 2-포밀-6-나프토산(이하, FNA), 2-나프토산(이하, NA), 트리멜리트산(이하, TMLA) 등 각종 불순물이 포함되어 있는cNDA가 생성된다. 이 중 특히 FNA가 존재하면 중합반응이 중간에서 멈추게 되어 중합도 저하의 원인이 되어 중합체의 물성에 나쁜 영향을 미치거나 폴리에스테르의 착색의 원인이 되므로 FNA를 제거해야 되나 이의 제거에는 어려운 문제가 존재한다.

따라서 cNDA에 존재하는 FNA를 제거하기 위하여 또는 NDA를 정제하기 위하여, 재결정법, 산화공정을 한번 더 거치는 방법, cNDA를 메탄올을 이용하여 NDC로 제조한 후 수화시켜 NDA를 제조하거나 수소화 공정에 의해 정제된 NDA를 제조하는 방법 등 여러 가지의 화학적 방법이 연구되어 왔으며, 그 외에도 용매 처리, 용융 결정, 고압 결정, 초임계 추출 등 다양한 정제방법이 사용되고 있다.

그 구체적인 예로 미국특허공보 제5,859,294호는 조 나프탈렌 디카르복실산을 알리패틱 아민(aliphatic amine) 또는 알리사이클릭 아민(alicyclic amine)을 포함하는 수용액에 용해시키고, 그에 포함된 불순물인 중금속 성분을 100 ppm 이하가 될 때까지 제거한 다음, 상기 나프탈렌 디카르복실산 아민 염을 함유하는 수용액을 가열하여 아민 성분을 증류시킴으로써 나프탈렌 디카르복실산을 생산하는 방법에 대해 개시하고 있고,

다른 미국특허공보 제6,255,525호는 불순물이 포함된 방향족 카르복실산(aromatic carboxylic acid)과 물의 혼합용액을 277-316℃, 77-121 kg/cm2, 수소 가스의 존재 하에서 수소화 금속 성분(hydrogenation metal component)이 없는 탄소 촉매와 접촉시킨 다음, 상기 혼합용액을 냉각하여 상기 방향족 카르복실산을 결정화하고, 상기 냉각된 혼합용액으로부터 결정화된 방향족 카르복실산을 회수함으로써 고순도의 방향족 카르복실산을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다.

또한 NDA의 결정화 반응과 관련하여 미국특허공보 제6,087,531호는 폴리(알킬렌 나프탈렌 디카르복실레이트)[poly(alkylene naphthalene dicarboxylate)]를 125-400℃에서 염기성 용액(알칼리 금속 염기성 용액, 하이드록사이드(hydroxide) 또는 알칼리의 금속의 카보네이트)에 용해시킨 다음 170-240℃에서 산으로 중화시켜 NDA결정을 회수하거나, 폴리에스테르 물질을 170-240℃에서 NaOH 용액 또는 KOH 용액으로 용해시킨 다음 아세트산으로 중화하여 NDA결정을 회수하는 방법을 공개하고 있으며,

미국특허공보 제6,426,431호는 K₂-NDA 수용액을 0-50℃, 0-200 psi 조건에서 CO₂로 처리하여 KH-NDA를 형성한 다음, 상기 KH-NDA를 물에 1:8 이상의 비율로 현탁하고, 100℃ 이상(140-160℃), 100 psi 이상(175-250 psi)의 조건에서 다시 CO₂ 로 처리하여 2,6-NDA의 정제 수율을 약 45%로 높이는 방법에 대해 공개하고 있다.

그러나 상기한 방법들은 고순도의 NDA 결정을 수득하기 위하여, 고온 및 고압 조건, 장시간 처리, 다량의 고가 재료 등을 필요로 함으로써 경제성이 떨어진다는 문제점이 있으며, 정제 수율 및 순도가 매우 낮고, 얻어진NDA 개별 결정 간에 응집 현상이 존재하여 실제 생산에 적용하기 곤란하다는 문제점이 있다.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 FNA를 NDA로 전환하는 미생물을 이용하여 상온 및 상압 조건하에서 cNDA를 정제 및 결정화함으로써 고수율 및 고순도의 NDA 를 보다 경제적이고 효율적으로 수득하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 고순도의 균일한 크기의 NDA결정을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관계한다.

보다 구체적으로, 본 발명은

(a) 조 나프탈렌 디카르복실산(crude naphthalene dimethylcarboxylic acid)을 150 내지 300℃의 물로 세척하여 불순물을 제거하는 단계;

(b) 상기 세척한 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액과 혼합한 뒤 알칼리 용액을 첨가하여 용해시킴으로써 정제 반응액을 준비하는 단계;

(c) 상기 정제 반응액과, 2-포밀-6-나프토산(2-formyl-6-naphthoic acid)을 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-naphthalene dicarboxylic acid)으로 전환하는 능력을 갖는 바실러스 속 미생물 또는 슈도모나스 속 미생물을 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내의 2-포밀-6-나프토산을 제거하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 1 내지 4로 조정한 다음 0 rpm 초과 1000 rpm이하의 속도로 교반하면서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하는 단계;

(e) 상기 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산을 30 내지 100℃의 물로 세척하여 그에 포함된 염을 제거하는 단계; 및

(f) 상기 세척물을 건조하여 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 정제방법에 관계한다.

이하, 본 발명의 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 단계별로 상세히 설명한다.

(ⅰ) 제 1단계: 세척 공정

먼저, 조 나프탈렌 디카르복실산(cNDA)을 150 내지 300℃의 물로 세척하여 2-나프토산(NA), 메틸나프토산(MNA), 트리멜리트산 (TLMA) 등의 불순물들을 미리 제거한다.

구체적으로, 조 나프탈렌 디카르복실산(cNDA)을 150 내지 300℃, 바람직하게는 200 내지 250℃의 고온의 물에 분산시킨 후 압력 1 내지 28 kg/cm²에서 1분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번, 바람직하게는 2회 반복함으로써 상기의 불순물들을 제거한다

이 때, 상기 물의 온도가 300℃를 초과하게 되면, NDA의 용해량이 크게 증가하여 수율이 크게 감소하는 문제점이 있을 수 있으며, 150℃ 미만일 경우에는 NA, MNA, TLMA 등의 부산물이 잘 용해되지 않는 문제가 생길 수 있다.

이와 같이, cNDA를 고온의 물에 분산시킨 후 일정 조건 하에서 여러 번 세척하면, 용해도 차이를 이용하여 상기의 기타 불순물들을 깨끗이 제거할 수 있으며, FNA 또한 어느 정도 제거할 수 있어서 후속하는 정제반응 및 결정화 단계에서 미생물의 사용량과 결정화하는데 필요한 산성용액의 사용량을 줄일 수 있다.

또한, cNDA 의 생산시에는 초산 등이 용매로 사용되어 상기 산 용액이 cNDA 내에 다량 포함되어 있는데, 본 세척 과정을 통해 상기의 산 용액 또한 제거됨으로써, 다음 단계인 cNDA 의 용해 공정에서 보다 적은 양의 알칼리 용액(예: KOH 용액, NaOH 용액 등)이 소모된다.

한편 상기 물의 양은 cNDA 중량 대비 5 내지 20배를 사용하는 것이 바람직하다.

(ⅱ) 제 2 단계: 용해 공정

상기 세척한 cNDA를 미생물과 반응시키기 전에 완충용액과 혼합한 뒤 알칼리 용액을 첨가하여 용해시킴으로써 정제 반응액을 제조한다. 즉, 본 단계에서는 cNDA 를 미생물과 반응시키기 위해, 미리 알칼리 용액을 이용하여 대량으로 용해시킨다.

이 때, 상기 완충용액으로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 물, 탄산나트륨 완충용액, 글리신 완충용액, 인산칼륨 완충용액, 인산나트륨 완충용액, 숙신산 완충용액, 아세트산나트륨 완충용액, 시트르산 완충용액, 피로인산나트륨 완충용액, 붕산 완충용액, 붕산나트륨 완충용액 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 pH 6.0 내지 9.0의 완충용액 범위를 가지는 칼륨 인산 완충용액 또는 붕산 완충용액을 사용하는 것이 좋다. 이 때, 상기 완충용액의 농도는 0.01 내지 100 mM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 알칼리 용액으로는 반드시 제한되는 것은 아니나 NaOH 용액 또는 KOH 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 그 첨가량은 pH 범위가 6 내지 10이 되도록 조절하는 것이 좋다.

본 발명에서는 상기 세척 공정을 통해 cNDA 내에 포함되어 있는 산 용액이 미리 제거되기 때문에, 알칼리 용액이 보다 적게 소모되며, 상기 cNDA 의 용해시간 또한 단축되어 공정 운용에 보다 유리하다.

한편, 본 단계의 정제 반응액에는 cNDA 를 보다 잘 용해시키기 위한 목적으로 유기용매가 추가로 첨가될 수 있는데, 그 바람직한 예로는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, "DMSO"), 디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, "DMF"), 디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide, "DMA"), 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, "THF") 등이 포함되며, 그 중에서도 디메틸설폭사이드를 사용하는 것이 효소 활성 측면에서 가장 바람직하다. 이 때, 유기용매의 첨가농도는 0.01 내지 10중량%인 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 첨가하지 않는 것이 좋다. 10중량%를 초과하여 유기용매를 첨가하면 미생물의 세포막을 용해시켜 반응을 저해하는 결과를 보인다.

(ⅲ) 제 3단계: 미생물과의 반응 공정

본 단계에서는, 상기 (ⅱ)단계에서 얻어진 정제 반응액과 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하는 능력을 갖는 미생물을 반응시켜 상기 cNDA 내의 2-포밀-6-나프토산(FNA)을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하여 제 거한다.

상기 미생물로는 특별히 한정되지 않고, 2-포밀-6-나프토산을 분해하는 능력이 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 속(Bacillus sp.) 또는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 속에 속하는 미생물을 사용할 수 있다.

가장 바람직하게는 바실러스 속 F-1(KCTC-10342BP), 바실러스 속 F-3(KCTC-10335BP) 또는 슈도모나스 속 HN-72(KCTC-10819BP)를 들 수 있는데, 상기 바실러스 속 F-1 및 F-3는 국내출원번호 제2002-0087819호로 출원되어 공개된 바 있고, 상기 슈도모나스 속 HN-72 균주는 2005년 6월 21일 국제기탁기관인 한국생명 공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC-10819BP로 기탁하였다.

본 단계에서, 상기 미생물은 액체배지(예: LB 배지, M9 배지 등)에 접종하여 25 내지 45℃의 온도 범위에서 진탕배양한 다음 원심분리를 통해 회수한 균체를 생리식염수 또는 증류수로 현탁하여 사용한다.

한편 본 단계의 반응온도 및 반응시간은 각각 25 내지 50℃, 1분 내지 2시간인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 35 내지 40℃, 10 내지 40분 동안 반응시키는 것이 좋은데, 특히 반응온도가 25℃ 미만이거나 50℃를 초과할 경우에는 반응성이 현저하게 감소하여 부적당하다.

(ⅳ) 제 4단계: 결정화 공정

본 단계에서는 상기 (ⅲ) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 1 내지 4로 조정한 다음 0 rpm 초과 1000 rpm 이하의 속도로 교반하면서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화한다.

좀 더 구체적으로, 2-포밀-6-나프토산(FNA)이 제거된 상태의 cNDA 정제반응 용액 내에 존재하는 비결정 상태의 cNDA 를 결정화하기 위하여, 교반기가 장착된 반응기 내에서 상기 (ⅲ) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 적당량 투입하여 pH를 1 내지 4로 조정한 다음 계속 0 rpm 초과 1000 rpm 이하, 바람직하게는 0 rpm 초과 400 rpm 이하의 속도로 교반하면서 적절한 온도로 조절하여 일정 시간 동안 유지 반응시킴으로써, 상온 및 상압 조건하에서 결정화가 이루어지도록 한다.

본 발명의 결정화 공정에 따르면, 상온 및 상압 조건 하에서 100 ㎛ 이상 크기의 균일한 cNDA결정을 얻을 수 있으므로 제조비용 및 공정 면에서 경제적이며, 수득된 cNDA 개별 결정 간에 응집 현상이 존재하지 않아 실용성 및 회수율이 높다. 또한, 상기 (ⅱ) 단계에서 알칼리 용액의 사용량이 감소하기 때문에 본 단계에서 사용되는 산성용액의 사용량 또한 감소되어 제조비용이 절감되는 효과가 있다.

이 때, 상기 산성용액으로는 황산, 염산, 빙초산, 질산 등을 사용할 수 있으며, cNDA결정의 크기 및 수율 면에서 황산 또는 염산을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 즉, 황산 또는 염산을 투입하는 경우, 100 ㎛ 이상의 균일한 크기의 cNDA 결정을 고수율로 수득할 수 있다.

결정화를 위한 반응 온도는 약 4 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 60℃인 것이 결정화 반응을 수행하는데 적절하며, 반응 시간은 약 1분 내지 10시간, 바람직하게는 2분 내지 30분 범위인 것이 연속 공정의 면에서 좋다. 결정화 시간이 너무 짧으면 결정화도가 낮아 중합반응시 개별 결정 간에 응집이 일어날 수 있으며, 결정화 시간이 지나치게 길어지면 불필요한 에너지 손실을 초래할 수 있다.

(ⅴ) 제 5단계: 2차 세척 공정

본 단계에서는 상기 (ⅳ) 단계를 통해 결정화된 cNDA 를 30 내지 100℃의 물로 세척하여 그에 포함된 염을 제거한다.

본 발명에서는 미생물을 이용한 정제 공정과 결정화 공정시 KOH 용액 등의 알칼리 용액 및 황산 등의 산성용액을 사용하기 때문에 결정화 후 K₂SO₄ 등의 염이 발생하게 된다. 따라서, 이를 제거하기 위해 30 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 80℃의 물로 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산(cNDA)을 2차 세척하는 공정을 거치게 된다. 이 때, 상기 물의 온도가 100℃를 초과하게 되면 불필요한 에너지 손실이 발생하게 되고, 30℃ 미만인 경우에는 염 제거가 전혀 되지 않는 문제가 생길 수 있다.

본 공정에서는 상기의 염화합물 뿐만 아니라 조 나프탈렌 디카르복실산을 정제하기 위해 사용된 미생물도 함께 제거될 수 있다.

구체적으로는, 결정화된 cNDA를 30 내지 100℃의 물에 분산시킨 후 상압에서 1분 내지 1시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 불필요한 염을 제거할 수 있으며, 이 때 상기 물의 양은 NDA 중량대비 5 내지 20배를 사용하는 것이 바람직하다.

(ⅵ) 제 6단계: 건조 공정

마지막으로, 상기 2차 세척 공정을 통해 불필요한 염화합물이 제거된 NDA 결정을 일정 온도에서 건조함으로써 최종적인 순수한 NDA 결정을 수득한다. 이 때, 상기 건조 처리는 30 내지 200℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 건조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 건조방법을 제한 없이 이용할 수 있다.

한편, 본 발명의 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법은 상기 (ⅲ)단계와 (ⅳ)단계 사이에 상기 (ⅲ)단계에서 사용한 미생물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이, 미생물을 이용한 cNDA 의 정제 후 미리 미생물을 제거하여 결정화 반응을 수행하면 NDA 결정의 순도 및 회수율을 보다 향상시킬 수 있다.

상기 미생물을 제거하기 위한 방법으로는 통상의 공지된 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 구체적으로는 마이크로필터 시스템, 연속원심분리기 또는 디칸터(decanter) 등을 사용하여 제거할 수 있다. 이 때, 상기 마이크로필터 시스템의 경우에는 0.1 내지 0.5㎛의 포어 크기(pore size)를 가지며, 세라믹, 스테인레스, 폴리프로필렌, PET등의 재질로 된 필터를 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 정제방법에 의해 수득되는 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산에 관계한다.

본 발명이 제공하는 2,6-나프탈렌 디카르복실산은 상기한 본 발명의 정제방법에 따라 수득됨으로써 99.8% 이상의 고수율 및 고순도로 얻어지며, 용도 및 경우에 따라 처리조건을 조절함으로써 정형 또는 무정형의 결정 상태로 얻을 수 있다. 특히 정형의 경우에는 격자구조를 가질 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 생성된2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정은, 평균 입경이 100 ㎛ 이상으로 크고 균일한 입자 형태를 가지므로, PEN 중합 공정시 에틸렌 글리콜과 저점도 슬러리를 형성하기에 매우 적합한 결정형태이다. 평균 입경이 작으면 제품의 취급이 까다롭고, PEN 중합 공정에서 에틸렌 글리콜과 혼합해 슬러리를 조제할 때 슬러리 형성능력이 떨어지기 때문에 동력소모가 많은 문제점이 있다. 바람직하게는 본 발명의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정은 100 내지 180 ㎛ 범위의 평균입경을 갖는다.

한편, 도 3은 본 발명에 따른 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 실시하기 위한 정제 장치 시스템의 한 양상을 도시한 것이다. 상기 도 3에 근거하여 본 발명에 의한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법의 일 실시형태에 대하여 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 혼합기(A)에 조 나프탈렌 디카르복실산 슬러리 용액을 넣은 후 예비가열기(B)를 통해 150 내지 300℃로 가열한 후, cNDA 여과 및 세정장치(D)에 투입하 여 압력 1 내지 28 kg/cm²에서 1분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 고압여과액회수장치(E)로 물을 제거한다. 필요한 경우 용매가열공급장치(C)로부터 150 내지 300℃의 물을 다시 공급받아 상기의 과정을 동일하게 1 내지 2회 더 반복할 수 있다.

그 다음, 미생물 정제 반응기(F)에 일정량의 완충용액을 주입하고, 여기에 상기 세척한 조 나프탈렌 디카르복실산을 첨가한 후 교반하면서 알칼리 용액을 첨가하여 반응액의 pH를 조절하면서 조 나프탈렌 디카르복실산을 용해시킨 다음, 다시 일정량의 물을 첨가하여 정제반응액을 제조한다. 상기 반응액을 일정한 온도로 유지하면서 미리 준비한 반응용 미생물 균체를 투입하여 반응시킨다. 이러한 과정을 통해 상기 미생물 정제 반응기(F)에서 cNDA 내의 FNA를 NDA로 전환시켜 FNA를 제거할 수 있다.

반응이 완료된 상기 정제반응액을 미생물 제거 장치(G)로 통과시켜 FNA를 제거하기 위해 사용한 미생물을 제거한다. 이 미생물 제거 장치(G)를 이용한 미생물 제거 공정은 필요에 따라 생략할 수 있다. 미생물 제거 공정을 생략하여도 후단의 여과 및 세정장치(J)에서 미생물을 제거할 수 있다.

미생물이 제거된 정제반응액을 결정화 반응기(H)로 이송하고, 여기에 산성용액을 첨가하는 동시에 교반하면서 결정화 반응을 진행시킨다.

그 다음, 상기 결정화가 완료된 cNDA를 포함하는 슬러리를 여과 및 세정장치(H)에 투입한다. 상기 여과 및 세정장치(J)에는 상기 슬러리 용액의 온도를 30 ℃ 내지 100℃로 유지시켜주기 위한 가열수단이 구비되어 있다. 또한 압력은 상압으로 유지되며, 여과를 위하여 10 내지 100㎛의 여과기가 구비되어 있다.

상기 여과 및 세정장치(J)는 여과액회수장치(K)와 연결되어 있어 상기 여과액회수장치(K)로 여과액을 방출하고 고상분을 여과기에 거른다.

여기에 다시 용매가열공급장치(I)로부터 30℃ 내지 100℃로 미리 예열된 물을 여과 및 세정장치(J)에 투입하고, 일정시간 교반한 후, 여과액회수장치(K)로 2차 여과액을 방출한다. 필요한 경우 위의 세정단계를 동일하게 1 내지 2회 더 반복할 수 있다. 세정 후 남은 순수한 NDA는 용매가열공급장치(I)로부터 30℃ 내지 100℃로 미리 예열된 물에 의해 슬러리를 형성하고, 슬러리 방출라인을 통해 슬러리회수장치(L)로 보내진다. 상기 슬러리회수장치(L)로 보내진 순수한 NDA 슬러리를, 파우더 분리장치(M)를 통해 용매를 제거한 후 건조장치(N)에서 건조하면, 순수한 NDA를 회수할 수 있다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 의하여 설명하나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

[ 실시예 1: 미생물의 선발]

(1) 균주 분리

미생물의 분리를 위하여 경기도 소재의 폐수처리장, 유류저장소 또는 주유소 부근 토양을 채취하여 사용하였다. 상기 토양 샘플 각 5 g을 0.85% 생리식염수 50 ml에 넣고 진탕한 후 여과한 여과액을 적당히 희석하여 cNDA 혼합물이 들어있는 LB 고체배지에 도말하고 30℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 결과 200 여종의 미생물이 분리되었다.

그 중 FNA와 동일한 위치에 포밀기(formyl group)를 가지는 2-나프타알데히드 (2-Naphthaldehyde)를 분해하는 미생물을 1차 선별하고자, 상기 200 여종의 미생물을 각각 LB 액체배지 5 ml에 접종하여 16시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 회수된 균체를 0.85% 생리식염수 1ml에 현탁하였다. 모든 유리 큐벳에 β-NAD 용액(0.25 mg/ml; 100 mM KH₂PO₄-KOH(pH 8.0)에 용해) 3ml를 넣고, 샘플 큐벳에는 2-나프타알데히드 용액(50㎍/ml; DMSO에 용해) 0.2 ml를, 그리고 블랭크 큐벳에는 DMSO 0.2 ml를 첨가하여 혼합한 다음, 상기 큐벳들을 분광기에 넣고 3분 동안 안정화한 후, 상기 미생물 현탁액 0.05 ml씩을 첨가하였다. 5분 후 340 nm에서 흡광도를 측정하여 블랭크와의 흡광도 차이를 비교함으로써 포밀기의 카르복실기로의 산화 여부를 확인하였다. 그 결과 흡광도 차이가 최소 0.1 이상인 4 종의 미생물을 분리하였다

이와 같이 1차 선별한 4종의 미생물을 다시 LB 액체배지에 접종하여 16시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 0.85% 생리식염수로 세척한 다음, 하기 표 1과 같은 조성의 반응액과 30℃의 반응조에서 3시간 동안 반응시킨 후, 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 FNA 제거능이 우수한 균주를 최종 선별하였다. 이 때, HPLC 분석조건은 하 기 표 2와 같았다. 분석 결과, HN-72로 명명한 균주가 높은 FNA 분해능을 가지고 있었다.

(2) 분리 미생물의 동정

상기 (1)에서 얻어진 균주를 동정하기 위하여, 16S rDNA 부분 시퀀싱(partial sequencing)을 실시하였다. 그 결과를 도 1(서열 1)에 도시하였다. 이 결과에 따르면, 상기 균주는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)에 속하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이를 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) HN-72로 명명하고, 2005년 6월 21일 국제기탁기관인 한국생명 공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC-10819BP로 기탁하였다. 상기 HN-72 균주의 형태학적, 생화학적 성질을 실험한 결과는 하기 표 3 및 표 4와 같았다.

[ 실시예 2: 미생물을 이용한 cNDA 의 정제]

제 1단계: cNDA 의 세척

혼합기(A) 내의 cNDA 슬러리 용액을 예비가열기(B)를 통해 220℃ 이상으로 가열한 후, 여과 및 세정장치(D)에 투입하여 압력 24.7 kg/cm², 온도 225℃에서 30분간 교반한 다음, 여과하여 고압여과액회수장치(E)로 물을 제거하였다. 여기에 다시 용매가열공급장치(C)로부터 225℃, 물 100L를 첨가한 후, 동일한 조건에서 30분간 교반한 다음 여과하여, 고압여과액회수장치(E)로 물을 제거하는 공정을 2회 반복하였다.

제 2단계: cNDA 의 용해

미생물 정제 반응기(F)에 50 mM 칼륨 인산 완충용액 50 L를 주입하고, 여기에 상기 제 1단계를 통해 세척한 cNDA 1 내지 10 kg를 첨가하여 교반하면서, KOH 용액을 첨가하여 반응액의 pH를 8.0이 되도록 조절하여 cNDA를 용해시킨 다음, 다시 물을 첨가하여 100 L의 정제 반응액(cNDA 농도: 1 내지 10 %, cNDA 내의 FNA 함량: 0.01 내지 4 %)을 제조하였다.

제 3단계: cNDA 의 정제

상기 실시예 1에서 선발한 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) HN-72 균주를 LB 액체배지 300 ml에 접종하여 16 시간 동안 30℃ 진탕배양기에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양한 다음, 원심분리하여 균체를 회수하고, 이를 0.85% 생리식염수로 세척한 후 다시 0.85% 생리식염수 5 ml에 현탁하여 반응용 균체를 준비하였다.

상기 제 2단계에서 수득한 정제 반응액을 40℃로 유지하면서 상기 반응용 균체를 0.1 내지 5 kg/L 투입한 다음 40℃에서 5분 내지 1시간 반응시켜 상기 cNDA 내의 FNA를 NDA로 전환시켜 제거하였다.

제 4단계: 정제된 cNDA 의 결정화

상기 제 3단계에서 얻어진 cNDA 정제용액 100 L를 교반장치가 부착된 결정화 반응기(H)로 이송하고 여기에 황산 용액을 첨가하여 pH가 3.0이 되도록 조정한 다음, 교반속도를 50 rpm, 온도를 40℃로 유지하면서 20분간 결정화 반응을 진행하였다.

결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 결정화가 제대로 진행되었으며, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 결정화된 cNDA 의 평균결정크기는 약 161.3 ㎛ 로 분석되었다. 상기 결정화된 cNDA 의 현미경 사진을 도 2에 도시하였다.

제 5단계: 결정화된 cNDA 의 2차 세척 및 건조

상기 제 4단계에서 결정화된 cNDA 슬러리 용액을 여과 및 세정장치(J)에 투입하여 상압, 온도 70℃에서 20분간 교반한 다음, 여과하여 여과액회수장치(K)로 물을 제거하였다. 여기에 다시 용매가열공급장치(I)로부터 70℃, 물 100L를 첨가한 후, 동일한 조건에서 20분간 교반한 다음 여과하여, 여과액회수장치(K)로 물을 제거하는 공정을 2회 반복하였다. 여기에 다시 상기 용매가열공급장치(I)로부터 70℃, 물 100L를 첨가한 후, 20분 이상 교반시켜 고르게 분산시킨 다음, 슬러지회수장치(L)로 이송하여, 디칸터(decanter)(M)를 이용하여 물을 제거한 후, 건조장치(N)에서 120℃ 건조하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.

[ 실시예 3]

상기 실시예 2의 제 3단계와 제 4 단계 사이에서, 상기 제 3단계에서 얻어진 cNDA 정제용액을 0.2 ㎛ 의 폴리프로필렌 필터를 사용하여 미생물을 제거한 후 결정화 반응에 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.

[ 실시예 4 내지 5]

본 발명의 미생물로 각각 바실러스 속 F-1(KCTC-10342BP) 및 바실러스 속 F-3(KCTC-10335BP)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.

[ 실시예 6 내지 7]

본 발명의 미생물로 각각 바실러스 속 F-1(KCTC-10342BP) 및 바실러스 속 F-3(KCTC-10335BP)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.

실험예 1

상기 실시예 2에서 사용된 최초의 cNDA, 제 1단계의 세척공정 후 얻어진 cNDA, 3단계의 정제반응 후 얻어진 cNDA, 그리고 제 5단계의 2차 세척 및 건조공정 후 얻어진 cNDA에 대하여 각각 성분을 분석한 후 그 결과를 하기 표 5 에 나타내었다.

상기 표 5의 결과로부터 본 발명의 cNDA 정제방법을 사용할 경우, 1차 세척 후 NA, MNA 등의 기타 불순물들을 상당량 제거할 수 있으며, 특히 미생물을 이용한 정제반응 및 2차 세척, 건조 후에는 FNA를 비롯한 cNDA 내의 불순물들을 거의 완전히 제거할 수 있음을 확인할 수 있다. 특히 FNA는 NDA로 100% 전환되어 99.9% 이상의 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정을 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2

한편 본 발명에 따른 cNDA 정제방법에서, 제 1단계인 cNDA 세척 공정의 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 2의 제 2단계에서 세척한 cNDA 를 용해시킬 때 사용된 KOH 용액의 사용량 및 용해시간을 측정하였다. 이 때, 비교예로서, 세척하지 않은 cNDA 를 상기 제 2단계와 동일한 방법으로 실시한 뒤 역시 사용된 KOH 용액의 사용량 및 용해시간을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6의 결과로부터, 본 발명과 같이 cNDA 를 고온의 물로 미리 세척하여 이용하는 경우, 이를 용해시키는데 필요한 알칼리 용액의 양이 세척하지 않고 이용하는 경우에 비해 약 22% 감소하며, 용해시간도 약 1/4로 감소함을 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 미생물을 이용한 cNDA의 정제단계 중 특히 cNDA 정제용액의 결정화 단계의 최적 반응조건을 찾기 위하여, 하기와 같이 반응조건을 여러 가지로 변화시켜 실험하고 그에 따른 결정화 반응 및 회수율을 비교 분석하였다.

실험예 3: 산 종류 및 교반속도에 따른 결정화 반응

상기 실시예 2의 제 3단계에서 얻어진 cNDA 정제용액 100 ml를 교반장치가 부착된 반응기에 넣고, 여기에 각각 황산, 염산, 빙초산, 질산 용액을 첨가하여 pH가 3.0이 되도록 조정한 다음, 교반속도를 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 rpm으로 유지하였다. 온도는 40℃로 하였으며, 상기의 조건에서 각각 20분간 결정화 반응을 진행하였다.

결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 모두 결정화된 것을 확인할 수 있었고, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 상기의 각 조건에서 얻어진 cNDA 결정의 평균크기를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 7의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 4가지의 산용액 중에서 황산과 염산이 결정화 반응에 가장 우수한 결과를 보였으며, 바람직한 교반속도는 0 rpm 초과 400 rpm 이하인 것으로 판단되었다.

실험예 4: 산 종류 및 온도조건에 따른 결정화 반응

교반속도를 50 rpm으로 하고, 반응 온도를 4, 15, 25, 40, 60, 80℃로 한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험하였다.

결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 모두 결정화된 것을 확인할 수 있었으며, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 상기의 각 조건에서 얻어진 cNDA 결정의 평균크기를 하기 표 8에 나타내었다. 하기 표 8의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 4가지의 산용액 중에서 황산과 염산이 결정화 반응에 가장 우수한 결과를 보였으며, 바람직한 온도는 40℃인 것으로 판단되었다.

실험예 5: pH 조건에 따른 회수율

교반속도를 50 rpm, 반응 온도를 40℃, pH 범위를 1, 2, 3, 4, 5, 6으로 조정한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험하였다. 즉, 20분간 결정화 반응을 진행한 후 일정량을 취하여 회수율을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표 9의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, pH 3 이하의 조건에서 회수율 99% 이상의 결과를 얻었으며, pH가 낮을수록 회수율이 높아지는 경향을 나타내었다.

실험예 6

한편, 본 발명에 따른 cNDA 정제방법에서, 제 5단계인 cNDA 2차 세척 공정의 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 2의 제 5단계를 통해 얻어진 NDA결정 내에 존재하는 이온의 양을 측정하여 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 이 때, 상기 이온의 양은 유도결합 플라즈마 방출 분광기(ICP-AES)를 이용하여 측정하였다.

이상 실시예를 통해 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 FNA를 NDA로 전환하는 미생물을 이용하여 그에 적합한 조건 하에서 조 나프탈렌 디카르복실산을 정제 및 결정화함으로써 고순도의 결정형 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 환경친화적이고 경제적으로 대량생산할 수 있는 이점이 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 조 나프탈렌 디카르복실산(crude naphthalene dimethylcarboxylic acid)을 150 내지 300℃의 물로 세척하여 불순물을 제거하는 단계;

(b) 상기 세척한 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액과 혼합한 뒤 알칼리 용액을 첨가하여 용해시킴으로써 정제 반응액을 준비하는 단계;

(c) 상기 정제 반응액과, 2-포밀-6-나프토산(2-formyl-6-naphthoic acid)을 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-naphthalene dicarboxylic acid)으로 전환하는 능력을 갖는 바실러스 속 미생물 또는 슈도모나스 속 미생물을 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내의 2-포밀-6-나프토산을 제거하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 1 내지 4로 조정한 다음 0 rpm 초과 1000 rpm 이하의 속도로 교반하면서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하는 단계;

(e) 상기 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산을 30 내지 100℃의 물로 세척하여 그에 포함된 염을 제거하는 단계; 및

(f) 상기 세척물을 건조하여 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid)의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 조 나프탈렌 디메틸카르복실산을 150 내 지 300℃의 물에 분산시킨 후 압력 1 내지 28 kg/cm²에서 1분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 완충용액은 물, 탄산나트륨 완충용액, 글리신 완충용액, 인산칼륨 완충용액, 인산나트륨 완충용액, 숙신산 완충용액, 아세트산나트륨 완충용액, 시트르산 완충용액, 피로인산나트륨 완충용액, 붕산 완충용액 및 붕산나트륨 완충용액으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 그 농도는 0.01 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 알칼리 용액은 KOH 용액 또는 NaOH 용액인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 유기용매를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 5항에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide), 디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide) 및 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이고, 그 첨가농도는 0.01 내지 10중량%인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
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제 1항에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 속 F-1(KCTC-10342BP) 또는 바실러스 속 F-3(KCTC-10335BP)이고, 상기 슈도모나스 속 미생물은 슈도모나스 속 HN-72(KCTC-10819BP)인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 반응온도는 25 내지 50℃이고, 반응시간은 1분 내지 2시간인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 산성용액은 황산, 염산, 빙초산 및 질산으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 반응 온도는 4 내지 80℃ 범위이고, 반응 시간은 1분 내지 10시간 범위인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 결정화된 조 나프탈렌 디메틸카르복실산을 30~100℃의 물에 분산시킨 후 상압에서 1분 내지 1시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 건조 온도는 30 내지 200℃ 범위인 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계와 (d) 단계 사이에 상기 (c) 단계에서 사용한 미생물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
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