JPS6130554B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による補酵素Q₁₁の製造法に関
するものである。補酵素Ｑは下記の構造式 で示される化合物であり、生体内で電子伝達等を
なす因子として重要な役割を果している。この物
質が各種疾病に対して優れた薬理作用を示すこと
はすでに明らかにされている。上式においてｎ＝
６〜10に相当する同族体が微生物界に存在するこ
とが知られている。

本発明者らは微生物界における補酵素Ｑ同族体
の分布を研究した結果補酵素Q₁₁（上式において
ｎ＝11）がシユードモナス属に属する細菌によつ
て生産されることを発見し、本発明を完成するに
至つたものである。補酵素Q₁₁の自然界における
存在に関してはこれまである種の植物
〔「Biochemical Journal」第113巻38頁（1969）
参照〕に極めて微量に含有されることが報告され
た以外知られておらない。特に微生物の代謝生産
物としての補酵素Q₁₁は従来全く予測されておら
ず新規な技術的知見である。このような知見を端
緒として補酵素Q₁₁の工業生産が可能となつたこ
とは意義深いものである。

本発明によれば、補酵素Q₁₁の生産能を有する
シユードモナスに属する菌株を栄養培地中で培養
して補酵素Q₁₁を生成せしめそして菌体内に蓄積
された補酵素Q₁₁を採取する。補酵素Q₁₁を生産
する能力を有するシユードモナス属に属する細菌
としては例えばシユードモナスN842（微工研No.
3154）あるいはこれを変異処理して得られる変異
株である。また変異株であるシユードモナス
N842―M16は前記シユードモナスN842に比べて
カロチノイドの産生が少ない点が異なる。シユー
ドモナスN842の分類学上の諸性質に関しては特
開昭52−47990号公報中に詳細に述べられてい
る。上記シユードモナスN842の菌学的性質につ
いて示すと次のとおりである。

形態的所見 0.8〜1.0×1.5〜2.0μ グラム陰性桿菌 運動性あり、極鞭毛１本 培地上の所見 肉汁、肉汁寒天、ポテトデキストロース寒天培
地上の生育微弱 地上の生育微弱 グルコース２％、ペプトン１％、イーストエキ
ス１％からなる寒天培地での生育良好コロニー
はピンクで円形、周縁は全縁、隆起は滑らかな
中央凸状 生理的性質 生育PH5.3〜7.5（最適PH6.5） 生育温度25〜37℃（最適温度30℃） 酸素要求性 好気性 ゼラチン液化能 なし 澱粉液化能 なし カタラーゼ 陽性 チトクロームオキシダーゼ 陽性 硝酸還元性 陽性 リトマスミルク アルカリ化 メチルレツドテスト 陰性 VPテスト 陽性 インドール 生成せず 硫化水素 生成せず アンモニア 生成せず グルコースから好気、嫌気両条件下に酸および
ガスを生成せず 色素 非水溶性色素産生 窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸ナトリウムを利用 炭素源の利用性 利用されるもの：グルコース、ガラクトース、
キシロース、グリセリン、コハク酸、リン
ゴ酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、
メタノール、エタノール、蟻酸、アラニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン、グルタミン酸 利用されないもの：フラクトース、マルトー
ス、ラクトース、マンニトール、ソルビト
ール、マンノース、ラフイノース、トレハ
ロース、ラムノース、イヌリン、イノシト
ール、デキストリン、澱粉、酒石酸、グリ
コレート、酢酸、プロピオン酸、セリン、
グリシン、フオルムアルデヒド、ベンゼ
ン、ｐ―ヒドロキシ安息香酸 また、上記シユードモナスN842―M16（微工
研菌寄第3155号）は、シユードモナスN842の変
異株である。このシユードモナスN842―M16の
菌学的性質は、該シユードモナスN842の場合と
ほぼ同じであるが、上記したようにカロチノイド
合成能の点で該シユードモナスN842―M16の方
が劣ることおよび該シユードモナスN842―M16
の場合の培地上のコロニーが淡いピンク色である
こと等においてその菌学的性質を異にする。これ
ら細菌を培養する栄養培地としてはグルコースな
どの糖類、乳酸などの有機酸、メタノールなどの
アルコール、更にこれらの細菌が資化しうる他の
炭素源例えば炭化水素を炭素源とし、ペプトン、
アミノ酸、コーソステイープリカー、硫安などの
有機物および（または）無機物を窒素源とし、酵
母エキス、ビタミンなどを含有せしめる。培養は
PH４〜８および温度20゜〜37℃において２〜10日
間好気的に実施しそして培養液から菌体を遠心分
離および過により分離採取する。

菌体からの補酵素Q₁₁の抽出ならびに単離の方
法の一例を示すとメタノール、苛性ソーダおよび
ピロガロールの混液を菌体含有液に添加しそして
60〜90℃において１〜２時間還流加熱抽出する。
次いでその抽出液をｎ―ヘキサン等の溶媒で抽出
し、溶媒層を水洗および脱水後濃縮し、そしてこ
れをシリカゲルカラムに添加し次いでベンゼンで
展開する。

補酵素Ｑ画分を採取し次いで濃縮乾固後、流動
パラフインでコートしたシリカゲル薄層板で逆相
クロマトグラフイーを反覆して混在する他の補酵
素Ｑ同族体を除去する。かくして得られる補酵素
Q₁₁をアセトンより繰り返し結晶化することによ
り純粋な補酵素Q₁₁の結晶が得られる。

実施例 １ グルコース２％、イーストエキス１％およびポ
リペプトン１％からなる培地（PH6.5）15に、
シユードモナスN842株（微工研菌寄第3154号）
を同じ組成の培地300mlで48時間前培養した培養
液を種菌として接種し、30容ジヤーフアーメン
ターを用いて30℃で毎分15の空気を通気して
（70時間）撹拌培養し、そしてその後遠心分離に
より湿菌体ペーストを得た。ジヤーフアーメンタ
ー４基より得られた湿菌体1.7Kgを水1.2、メタ
ノール８、ピロガロール160ｇおよび水酸化ナ
トリウム1.2Kgと混合しそして80℃で２時間加熱
還流した。放冷後、12のｎ―ヘキサンで２回抽
出し、ｎ―ヘキサン層をとり、水洗後芒硝で乾燥
しそして濃縮乾固した。乾固物のアセトン可溶部
をとり、アセトンを留去しそして残渣をｎ―ヘキ
サンに溶解する。この溶液をシリカゲルカラム中
でベンゼンを展開溶媒として展開し、得られた補
酵素Ｑの画分をｎ―ヘキサンに溶解し、流動パラ
フインのｎ―ヘキサン溶液（５％）に浸漬後風乾
したシリカゲルＧ―60の薄層板（厚さ0.5mm）に
スポツトし、そしてアセトン―水（95：５）を展
開溶媒とする逆相薄層クロマトグラフイーを行つ
た。展開後補酵素Q₁₁に相当する画分をかき取
り、エチルエーテルを用いて抽出し、更に逆相薄
層クロマトグラフイーを３回繰り返しそして得ら
れた補酵素Q₁₁をアセトンより結晶化して純粋な
補酵素Q₁₁の結晶1.8mgを得た。

この結晶はｎ―プロパノール―水（４：１）お
よびジメチルフオルムアミドをそれぞれ展開溶媒
とする逆相ペーパークロマトグラフイー、および
アセトン―水（95：５）を展開溶媒とするシリカ
ゲル逆相薄層クロマトグラフイーで単一のスポツ
トを与え、また化学合成法によつて得た補酵素
Q₁₁ならびに実施例２において得られた結晶とよ
く一致した。

実施例 ２ シユードモナスN842株の変異株であるシユー
ドモナスN842―M16株（微工研菌寄第3155号）
を実施例１に示した組成の培地15に実施例１と
同様の条件で培養し、得られた湿菌体400ｇを水
300ml、メタノール２、ピロガロール40ｇおよ
び水酸化ナトリウム300ｇと混合しそして80℃で
２時間加熱還流した。放冷後３のｎ―ヘキサン
で２回抽出し、ｎ―ヘキサン層をとり、その後実
施例１に示した操作でシリカゲルカラムクロマト
グラフイーならびにシリカゲル逆相薄層クロマト
グラフイーを行つて補酵素Q₁₁を得た。更にこれ
をアセトンより結晶化せしめて純粋な補酵素
Q₁₁31mgを得た。この結晶の各種展開溶媒下の逆
相クロマトグラフイーにおける挙動、核磁気共鳴
スペクトルおよび紫外部吸収スペクトルは化学合
成法によつて得た補酵素Q₁₁のそれと完全に一致
した。更にマススペクトルによつて分子量930が
確認され、また融点は53℃であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 補酵素Q₁₁生産能を有するシユードモナス属
   に属する菌株もしくはその変異株を栄養培地中で
   培養して補酵素Q₁₁を生成せしめ次いでこれを採
   取することを特徴とする補酵素Q₁₁の製造法。