JPS6316119B2

JPS6316119B2 -

Info

Publication number: JPS6316119B2
Application number: JP2523280A
Authority: JP
Inventors: Taiji Minoda; Toshio Oomori; Hiroyuki Narishima
Original assignee: Nissan Chemical Corp
Current assignee: Nissan Chemical Corp
Priority date: 1980-03-03
Filing date: 1980-03-03
Publication date: 1988-04-07
Also published as: JPS56124387A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、微生物によるテルペン酸の製造法に
関し、さらに詳しくは、式（式中ｎは１または２を意味する）を有するテルペンに特定の微生物を作用させて式（式中ｎは前述したものと同一意義を有する）を有するテルペン酸および（または）式（式中ｎは前述したものと同一意義を有する）を有するテルペン酸を製造する方法に関する。

上記テルペン酸（）および（）は、いずれ
も香料であるβ―シネンザールの合成原料として
有用であることがビユチ（Bu¨chi）等により報告
されている〔ヘルベチカ・キミカ・アクタ
（Helvetica Chimica Acta）50巻2440頁（1967
年）〕。従来、上記テルペン酸（）および（）
は化学的合成法によつて製造されており、微生物
の作用により製造する方法は現在まで知られてい
ない。

本発明者等は前記テルペン酸（）および
（）を微生物の作用により製造する方法につい
て研究した結果、本発明を完成した。

本発明は前記式（）を有するテルペンを添加
した培地にシユウドモナス属、アクロモバクター
属、コリネバクテリウム属またはミクロコツカス
属に属する菌株を培養し、培地中に前記式（）
を有するテルペン酸および（または）前記式
（）を有するテルペン酸を生成せしめ、これら
を採取することを特徴とする前記式（）を有す
るテルペン酸および（または）前記式（）を有
するテルペン酸の製造法である。

本発明の方法において、原料として使用される
前記式（）を有する化合物は、式中ｎが１であ
る場合はβ―ミルセンであり、ｎが２である場合
はβ―フアルネセンである。本発明の方法におけ
る生成物のうち、前記式（）を有するテルペン
酸は、ｎが１である場合は２―メチル―６―メチ
レン―２，７―オクタジエン酸であり、ｎが２で
ある場合は、２，６―ジメチル―10―メチレン―
２，６，11―ドデカトリエン酸である。また、前
記式（）を有するテルペン酸はｎが１である場
合は、４―メチレン―５―ヘキセン酸であり、ｎ
が２である場合は、４―メチル―８―メチレン―
４，９―デカジエン酸である。

本発明の方法においては、菌株として、シユウ
ドモナス属、アクロモバクター属、コリネバクテ
リウム属、またはミクロコツカス属に属し、前記
式（）を有するテルペンを前記式（）を有す
るテルペン酸および（または）前記式（）を有
するテルペン酸に変換するものが使用される。

シユウドモナス属の例としてはシユウドモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida）S4―２（微
工研寄託番号5421号）およびシユウドモナス・ア
エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）
S7B1、アクロモバクター属の例としてはアクロ
モバクター・シクロクラステス
（Achromobacter cycloclastes）S20B1（微工研
寄託番号第5423号）、およびアクロモバクター・
デルマルバエ（Achromobacter delmarvae）Ｓ
―17―B1、コリネバクテリウム属の例としては、
コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス
（Corynebacterium hydrocarboclastus）S10B1
（微工研寄託番号第5422号）、ミクロコツカス属の
例としては、ミクロコツカス・エスピー
（Micrococcus sp）S64B1（微工研寄託番号第
5424号）等をそれぞれあげることができる。

上記菌株のうち、シユウドモナス・プチダ以外
の菌株は、いずれも山田等により同定されたもの
であり、アグリカルチユラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Agricultural and
Biological Chemistry）、27巻773頁（1963年）
にそれらの菌学的性質が記載されている。

また、シユウドモナス・プチダS4―２は、本
発明者等が長野県諏訪地方の土壌中から新たに分
離した菌株であつて、微工研に寄託受理番号第
5421号として寄託されており、以下の菌学的性質
を有する。

１細菌の形態形及び大きさ：桿菌、0.4〜0.6×1.2〜1.4μ 多性形：なし運動性：あり、複数の極鞭毛をもつ胞子：なしグラム染色性：陰性抗酸性：なし２生育状態肉汁寒天平板培養円形の集落を形成、滑らかな表面をもち、
色は白色乃至白色に近い黄褐色である肉汁寒天斜面培養おだやかに生育する。糸状肉汁液体培養薄膜を形成、濁る。

肉汁ゼラチン穿刺培養上部で生育、液化せず。

リトマス・ミルクアルカリ性、凝固及びペプトン化はしな
い。

３生理学的性質硝酸塩の還元：あり脱窒素反応：なし MRテスト：陰性 VPテスト：陰性インドールの生成：なし硫化水素の生成：なしデンプンの加水分解：陰性クエン酸の利用：コーザーの培地：ありクリステンセンの培地：あり硝酸塩の利用：ありアンモニウム塩の利用：あり色素の生成：キング氏Ｂ培地で水溶性の螢
光性色素を生成する。

ウレアーゼ：陰性オキシダーゼ：陽性カタラーゼ：陽性生育の範囲：PH５〜９で生育可、至適PH６
〜８。

生育温度：５〜35℃、至適温度20〜30℃ 酸素に対する態度：好気性Ｏ―Ｆテスト：酸化型糖類からの酸およびガスの生成Ｌ―アラビノース、Ｄ―キシロース、Ｄ―
グルコース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクト
ース、Ｄ―ガラクトース、シユークロース、
グリセリンからは酸を生成するがガスは生成
しない。

マルトース、ラクトース、トレハロース、
Ｄ―ソルビツト、Ｄ―マンニツト、イノシツ
ト、デンプンからは、酸もガスも生成しな
い。

３栄養要求性生育因子なし以上の菌学的性質を有する菌について、バージ
エイのマニユアル（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology）第８版に基いて
検索した結果、本菌株はシユウドモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）と同定された。

本発明で使用する培地組成は、使用する菌株が
良好に生育し、かつ、前記テルペン酸（）およ
び（または）（）の生産を順調に行わしめるた
めに適当な炭素源、窒素源、無機塩及び天然有機
栄養物などからなる。

炭素源としては、グルコース、グリセロール、
アラビノース等の種々の炭水化物、ｎ―ドデカ
ン、ｎ―ヘキサデカン、あるいはケロシン等の
種々の炭化水素、グルコン酸、酢酸、コハク酸等
の各種有機酸、グルタミン酸、アラニン、トリプ
トフアン等の各種アミノ酸も使用可能である。ま
た、ミルセンあるいはフアルネセンを唯一の炭素
源としてもよい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム等の各種の無機および有機アンモニ
ウム塩、尿素、ペプトン、NZアミン、肉エキス、
酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物等の各種含窒素有機物質、グルタミン
酸、アラニン等の各種アミノ酸等が使用可能であ
る。

無機物としては、各種燐酸塩、硫酸マグネシウ
ム等、さらに微量の重金属塩が使用されるが、天
然物を含む培地では必ずしも添加を必要としな
い。

また、栄養要求を示す変異株を用いる場合に
は、当然、その栄養要求を満足させる物質を培地
に加えなければならない。

培養は通常振盪または、通気撹拌培養などの好
気的条件下に行なうのがよい。水に難溶性の炭素
源等を使用する場合には、ポリオキシエチレンソ
ルビタン等の各種界面活性剤、あるいは、アセト
ン、エタノール等の有機溶媒を培地に添加するこ
とも可能である。培地のPHは5.0〜9.0、培養温度
は20〜35℃、培養期間は通常18〜120時間である。

本物質はこのようにして得られた培養液に、β
―ミルセンあるいはβ―フアルネセンを添加して
さらに培養を数時間ないしは数日間継続するかあ
るいは、培養菌体を水または適当な緩衝液に懸濁
し、β―ミルセンあるいはβ―フアルネセンを添
加して好気的に振盪あるいは通気撹拌することに
よつても得られる。また、β―ミルセンあるいは
β―フアルネセンを炭素源として培養した場合に
は、本物質は、培養液中にも蓄積する。

これらの培養液あるいは懸濁液からの目的物質
の採取および精製は、一般の有機化合物の採取お
よび精製の手段に準じて行なうことができる。た
とえば、これらから菌体その他を除去した液を
酸性とし、エチルエーテル等の有機溶媒を用いて
目的物質を抽出する。またこれからさらに酸性区
分の分画を行なつてもよい。このようにして得ら
れた抽出液を濃縮したのちシリカゲルクロマトグ
ラフイー、薄層クロマトグラフイー、ガスクロマ
トグラフイー等を用いて目的物質を単離すること
ができる。ベンゼンによる溶離液からは式（）
を有するテルペン酸が得られ、ベンゼン―酢酸エ
チルによる溶離液からは式（）を有するテルペ
ン酸が得られる。これらのテルペン酸は、分離・
確認を容易にするために、常法により、たとえば
ジアゾメタンによりメチルエステルとすることが
できる。

本発明の方法においては、通常式（）を有す
るテルペン酸と式（）を有するテルペン酸が同
時に培養物中に生成するが、培養法、培養時間等
培養条件を適宜選択することによつて両者の得量
をコントロールすることができる。例えば、β―
ミルセンまたはβ―フアルネセンを炭素源として
培養した場合、および培養時間が長い場合は式
（）を有するテルペン酸が優勢に得られ、その
他の場合は式（）を有するテルペン酸が優勢に
得られる。

さらに、本発明の方法における培養物の中に
は、上記テルペン酸（）および（）の他に式を有する４―メチル―３―ヘキセン酸が生成し、
このものは、前記ベンゼン―酢酸エチルによる溶
離液から得られる。

以上実施例により本発明の方法をさらに詳細に
説明するが、本発明は、これらによつて限定され
るものではない。

実施例１２―メチル―６―メチレン―２，７―オクタジ
エン酸の製造 (1) 硝酸アンモニウム５ｇ、リン酸１カリウム
1.8ｇ、リン酸２ナトリウム（12水塩）6.3ｇ、
硫酸マグネシウム（７水塩）0.2ｇ、塩化カル
シウム（２水塩）10mg、硫酸第１鉄（７水塩）
10mg、硫酸マンガン（４水塩）１mg、およびモ
リブデン酸アンモニウム（４水塩）１mgを精製
水１に加え、５規定水酸化ナトリウム溶液を
用いてPH7.2としたものを、５容三角フラス
コに入れ、121℃で10分間滅菌した後、β―ミ
ルセン５mlを添加して培地として用いた。これ
に、同様の組成の培地で30℃で２日間培養した
シユウドモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）S4―２（微工研寄託受理番号第5421
号）を３％接種し30℃で18時間振盪培養を行な
つた。この培養物を塩酸を用いて酸性とした
後、半容のエチルエーテルで２回抽出を行な
い、抽出物を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾
燥後、減圧濃縮を行ない、液量を100mlとした。
次いでこの濃縮物を、等容の炭酸水素ナトリウ
ム―水酸化ナトリウム緩衝液（PH12.5）で２回
抽出を行ない、さらにこれを塩酸を用いて酸性
とした後、等容のエチルエーテルで２回抽出を
行なつた。この抽出物を、水洗し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去すると油状
残渣が得られた。さらにこれをジアゾメタンを
用いてメチルエステルとした後、ガスクロマト
グラフにより分取を行なうことによつて、本物
質のメチルエステルが得られた。得られた本物
質の量をガスクロマトグラフによつて定量した
ところ、270mgであつた。

２―メチル―６―メチレン―２，７―オクタジ
エンメチルエステル IRスペクトルν^KBr _naxcm^-1：1590，990，900 MS（ｍ／ｅ）：93，105，120，121，41，91，
79，53，67，148，165，180（M⁺） NMRスペクトルCDCl₃δppm： 1.60（ｓ，3H；−CH₃），1.88（ｓ，2H；−
CH₂−），2.39（ｓ，2H；−CH₂−），3.78
（ｓ，3H；−OCH₃），5.07（ｓ，2H；＝
CH₂），5.27（ｄ，2H；＝CH₂），6.43（ｑ，
1H；−CH＝CH₂），6.79（ｓ，1H；−CH＝
Ｃ） (2) グリセロール10ｇ、硝酸アンモニウム５ｇ、
リン酸１カリウム1.8ｇ、リン酸２ナトリウム
（12水塩）6.3ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.2ｇ、塩化カルシウム（２水塩）10mg、硫酸
第１鉄（７水塩）10mg、硫酸マンガン（４水
塩）１mg、およびモリブデン酸アンモニウム
（４水塩）１mgを精製水１に加え、５規定水
酸化ナトリウム溶液を用いてPH7.2としたもの
を、５容三角フラスコに入れ、121℃で10分
間滅菌して培地として用いた。これに、同様の
組成の培地で30℃で２日間培養したシユウドモ
ナス・プチダ（Pseudomonas putida）S4―２
（微工研寄託受理番号第5421号）を10％接種し、
30℃で２日間振盪培養を行なつた。この培養液
を遠心分離して集菌し、１／15Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で２回洗滌後、同緩衝液500mlに懸濁
し、β―ミルセン５mlとともに５容三角フラ
スコに入れ、30℃で４日間振盪した。この反応
液を除菌後、塩酸を用いて酸性とし、半容のエ
チルエーテルで２回抽出を行なつた。この抽出
物を水洗、脱水し、減圧濃縮を行なつた後、等
容の炭酸水素ナトリウム―水酸化ナトリウム緩
衝液（PH12.5）で２回抽出を行なつた。さらに
これを塩酸を用いて酸性とし、等容のエチルエ
ーテルで２回抽出を行ない、抽出物を水洗、脱
水し、溶媒を留去すると、室温で半固体状を示
す物質1.1ｇを得た。これをシリカゲルカラム
を用いて精製を行なうと本物質0.8ｇが得られ
た。

(3) アクロモバクター・シクロクラテスＳ―20―
B1、コリネバクテリウム・ハイドロカーボク
ラスタスＳ―10―B1またはミクロコツカス・
エスピーS64―B1を使用して実施例２と同様の
操作を行ない目的物質をそれぞれ0.2mg、0.6mg
および0.1mgを得た。

実施例２４―メチレン―５―ヘキセン酸の製造硝酸アンモニウム５ｇ、リン酸１カリウム1.8
ｇ、リン酸２ナトリウム（12水塩）6.3ｇ、硫酸
マグネシウム（７水塩）0.2ｇ、塩化カルシウム
（２水塩）10mg、硫酸第１鉄10mg硫酸マンガン
（４水塩）１mg、モリブデン酸アンモニウム（４
水塩）１mgおよび精製水１の組成の培地10
を、水酸化ナトリウムでPH7.2とし、15容ジヤ
ーフアーメンターに仕込み、同様の培地でミルセ
ンを炭素源として、30℃で２日間培養した、シユ
ウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）S4
―２（微工研寄託受理番号第5421号）の培養液１
を植菌し、β―ミルセン50mlを添加して、温度
30℃、権拌毎分400回転、通気毎分２で66時間
培養後、β―ミルセン25mlをさらに加え、合計
115時間培養した。この培養液を遠心分離して除
菌し、減圧濃縮によつて全量を１とした。これ
を塩酸を用いて酸性とした後、等容のエチルエー
テルで２回抽出し、水洗および無水硫酸ナトリウ
ムによる脱水を行ない、減圧下、200mlまで濃縮
を行なつた。次いで、これを５％炭酸水素ナトリ
ウム水溶液100mlで２回抽出し、さらに塩酸を用
いてPH２としてから、200mlのエチルエーテルで
２回抽出を行なつた。この抽出物を水洗、脱水
し、溶媒を減圧留去すると油状残渣が得られた。
さらにこれをジアゾメタンを用いて、メチルエス
テルとした後、ガスクロマトグラフにより分取を
行なうことによつて、４―メチレン―５―ヘキセ
ン酸メチルエステル約1.1ｇが得られ、同時に副
生成物として４―メチル―３―ヘキセン酸メチル
エステル約1.0ｇが得られた。

４―メチレン―５―ヘキセン酸メチルエステル IRスペクトルν^Nujol _naxcm^-1：1590，990，900 MS（ｍ／ｅ）：81，79，98，53，41，140
（M⁺），68，109，125 NMRスペクトルCDCl₃δppm：2.58（ｓ，4H；
−CH₂−CH₂−），3.72（ｓ；OCH₃），5.06
（ｓ，2H；＝CH₂），5.23（ｄ，2H；CH₂＝
CH），6.42（ｑ，1H；CH₂＝CH−）実施例３４―メチル―８―メチレン―４，９―デカジエ
ン酸の製造 β―ミルセン５mlの代りに、β―フエルネセン
５mlを使用する以外は、実施例(2)と全く同一の操
作を行うことにより目的物質0.5ｇが得られた。

IRスペクトルν_naxcm^-1：2400−3600，1685，
1640，1590，990，905 NMRスペクトルCDCl₃δppm：11.6（ｓ，1H），
6.88（ｔ，1H），6.30（ｑ，ｊ＝17および
11cps，1H），4.8−5.4（ｍ，5H），2.2（ｍ，
8H），1.82（ｓ，3H），1.61（ｓ，3H）

Claims

【特許請求の範囲】１式（式中ｎは１または２を意味する）を有するテルペンを添加した培地にシユウドモナ
ス属、アクロモバクター属、コリネバクテリウム
属またはミクロコツカス属に属する菌株を培養
し、培地中に式（式中ｎは前述したものと同一意義をする）を有するテルペン酸および（または）式（式中ｎは前述したものと同一意義を有する）を有するテルペン酸を生成せしめ、これらを採取
することを特徴とする上記式（）を有するテル
ペン酸および（または）上記式（）を有するテ
ルペン酸の製造法。２式を有するβ―ミルセンを添加した培地にシユウド
モナス属、アクロモバクター属、コリネバクテリ
ウム属またはミクロコツカス属に属する菌株を培
養し、培地中に式を有する２―メチル―６―メチレン―２，７―オ
クタジエン酸および（または）式を有する４―メチレン―５―ヘキセン酸を生成せ
しめ、これらを採取して上記式（）を有する２
―メチル―６―メチレン―２，７―オクタジエン
酸および（または）上記式（）を有する４―メ
チレン―５―ヘキセン酸を得ることからなる特許
請求の範囲第１項記載のテルペン酸の製造法。３式を有するβ―フアルネセンを添加した培地にシユ
ウドモナス属、アクロモバクター属、コリネバク
テリウム属またはミクロコツカス属に属する菌株
を培養し、培地中に式を有する２，６―ジメチル―10―メチレン―２，
６，11―ドデカトリエン酸および（または）式を有する４―メチル―８―メチレン―４，９―デ
カジエン酸を生成せしめ、これらを採取して上記
式（）を有する２，６―ジメチル―10―メチレ
ン―２，６，11―ドデカトリエン酸および（また
は）上記式（）を有する４―メチル―８―メチ
レン―４，９―デカジエン酸を得ることからなる
特許請求の範囲第１項記載のテルペン酸の製造
法。