JPS6319153B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物によるＤ（−）―β―ヒドロ
キシ脂肪酸の製造法に関する、更に詳しくはキヤ
ンデイダ属に属し、炭素数６あるいは７の飽和脂
肪酸あるいはα，β―不飽和脂肪酸を炭素数６あ
るいは７のＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸に変
換する能力を有する微生物を炭素数６あるいは７
の飽和脂肪酸またはα，β―不飽和脂肪酸に変換
しうる基質と作用させ、生成する炭素数６あるい
は７のＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸を採取す
ることを特徴とするＤ（−）―β―ヒドロキシ脂
肪酸の製造法に関するものである。 光学活性なＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸は
２種の異なる官能基をもつ化合物であるところか
ら、医薬、農薬、香料等の合成原料として好都合
な物質である。炭素数６あるいは７のβ―ヒドロ
キシ脂肪酸の製法に関して、Ｌ（＋）型のそれら
に関しては田原等によつてムコール（Mucor）
属微生物を用いトランス―α，β―不飽和脂肪酸
から製造する方法が報告されている〔田原；アグ
リカルチユラル・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricultural Biological Chemistry）42巻，
879頁，1978）が、その対掌体のＤ（−）型につい
ては、その製法について今だ報告がなく、得られ
たことがない。 そこで本発明者等は、安価で、かつ効率的なＤ
（−）―β―ヒドロキシカプロン酸およびＤ（−）
―β―ヒドロキシヘプタン酸の製造法を開発すべ
く研究を重ねた結果、炭素数６あるいは７の脂肪
酸あるいはα，β―不飽和脂肪酸をＤ（−）―β
―ヒドロキシ脂肪酸に変換する能力を有する微生
物の存在を見い出した。例えばキヤンデイダ・ル
ゴーザ（Candida rugosa）IFO 0750がその能力
を有することを見い出した。更に本発明の意図す
るところを最大限に発揮するためには、炭素数６
あるいは７の飽和脂肪酸あるいはα，β―不飽和
脂肪酸をＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸に変換
する能力を有する微生物を変異し、Ｄ（−）―β
―ヒドロキシ脂肪酸の資化性を低下、もしくは欠
損せしめた変異株を用いて実施するのが好ましい
ことも見い出した。またＤ（−）―β―ヒドロキ
シ脂肪酸製造の原料としてはカプロン酸あるいは
ヘプタン酸の飽和脂肪酸、２―ヘキセン酸、ある
いは２―ヘプテン酸の不飽和脂肪酸の外にｎ―ヘ
キシルアルコール、ｎ―ヘプチルアルコール等の
当該微生物が容易に飽和脂肪酸に変換しうる基質
も使用しうることを見い出した。 本発明に使用しうる微生物としてキヤンデイ
ダ・ルゴーザ（Candida rugosa）IFO 0750ある
いはキヤンデイダ・パラプシロシス（Candida
parapsilosis）IFO 0708，があるが、炭素数６あ
るいは７の飽和脂肪酸あるいはα，β―不飽和脂
肪酸をそれぞれに対応するＤ（−）―β―ヒドロ
キシ脂肪酸に変換しうる能力をもつキヤンデイダ
属の微生物であれば同様に使用できる。 微生物と基質とを作用させてＤ（−）―β―ヒ
ドロキシ脂肪酸へ変換させる方法として、微生物
を栄養培地で培養し、得た培養液に、あるいは培
養液から微生物を分離して菌体懸濁液を調製し、
それに基質を作用させる方法、あるいは基質を添
加した培地で微生物を培養することにより、微生
物を基質と作用させる方法等がある。また分離菌
体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー等で固
定化した状態でも使用しうる。 微生物と基質との接触反応時に、当該微生物が
利用しうるエネルギー源を補給すればＤ（−）―
β―ヒドロキシ脂肪酸の生産性は向上する。この
際の好ましいエネルギー源としてはグルコース、
エタノール、グリセロール、酢酸等がある。 通常の微生物はＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪
酸の代謝速度が早いためＤ（−）―β―ヒドロキ
シ脂肪酸の蓄積量は少ないので、更に効率的に多
量に蓄積させるためには、先にも述べたとおり、
Ｄ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸の資化性の低い
か、もしくは欠損した変異株を使用することが有
利である。この様な菌株をうるには人工変異ある
いは自然変異を利用するが、効率的に行うには通
常人工変異が用いられる。人工変異の方法として
はＸ線照射、紫外線照射、およびＮ―メチル―Ｎ
―ニトロ―N′―ニトロソグアニジン（NTG）な
どの変異誘起剤による処理が用いられる。例えば
具体的な例として本発明者等がＤ（−）―β―ヒ
ドロキシ脂肪酸資化能の欠損した変異株を得るた
めに行なつたNTGによる変異方法の１例を示す
と次のとおりである。ただし、目的とする変異株
が得られれば良いのであつて、この方法に限定さ
れるものではない。 保存用スラント（キヤンデイダ・ルゴーザ
IFO 0750）より１白金耳をグルコース40ｇ，
（NH₄）₂HPO₄ 13ｇ，KH₂PO₄ ７ｇ，MgSO₄・
7H₂O 0.8ｇ，ZnSO₄・7H₂O 60mg，FeSO₄・
7H₂O 90mg，CuSO₄・5H₂O ５mg，MnSO₄・
4H₂O 10mg，NaCl 0.1ｇ，ビオチン１mg，チア
ミン２mg，水１，PH7.2の組成からなるＳ培地
30mlを500ml容フラスコに入れ接種し、30℃、20
時間振とう培養した。 その培養液1.5mlを0.5Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で洗浄後、0.5mg／ml NTG溶液３mlに懸濁し、
４℃、60分間放置した。その後、同じ緩衝液で３
回洗浄し、次の組成から成る固形平板培地Ｃ培地
（グルコース20ｇ、イーストエキス５ｇ、肉エキ
ス10ｇ、ペプトン10ｇ、寒天20ｇ、水１、PH
7.0）に塗布し、コロニーを出現させた。このコ
ロニーをＳ培地のグルコースの代りに酪酸10ｇ、
寒天20ｇを加えたPH7.0のＢ培地にレプリカした。
このＢ培地上で生育不良な菌株（酪酸非資化性
株）を選んだ。このようにして選んだ酪酸非資化
性株を実施例１と同様な条件で基質として酪酸を
用いＤ（−）―β―ヒドロキシ酪酸高濃度蓄積菌
を選んだ。この様にして選んだ変異株はＤ（−）
―β―ヒドロキシ酪酸と同様にＤ（−）―β―ヒ
ドロキシカプロン酸、およびＤ（−）―β―ヒド
ロキシヘプタン酸の資化性が共通して著しく低下
しており、本発明に利用できる。 本発明を実施するために上記の方法で得た変異
株の例としてキヤンデイダ・ルゴーザ KT8202
株がある。この変異株の菌学的性質として表１に
示すごとく、親株と殆んど差は認められないが、
β―ヒドロキシ脂肪酸の資化性において著しい差
が認められる。

【表】

【表】 なおキヤンデイダ・ルゴーザ（Candida
rugosa）KT8202株は工業技術院微生物工業研究
所に微工研条寄第111号（FERM BP―111）と
して寄託してある。 本発明に利用する培地はグルコース、グリセリ
ン等の炭素源、アンモニア、硫安、ペプトン、カ
ザミノ酸等の無機有機の含窒化合物の窒素源、リ
ン酸カリウム、硫酸マグネシウム、等生育に必要
な無機塩類、更にビオチン等のビタミン類、その
他必要に応じて通常の微生物の培養に用いられる
種々の栄養源を適宜配合して用いることができ
る。培養には殺菌した培地に菌を接種し、20〜45
℃の温度でPH６〜９に保ちつつ１〜10日間通気撹
拌、振とう培養等好気的に行なう。培養の初期は
菌体の生育があり、その後Ｄ（−）―β―ヒドロ
キシ脂肪酸の生産が行なわれる。またＤ（−）―
β―ヒドロキシ脂肪酸生産時に、エネルギー源と
してグルコース等を補給することにより効率良く
多量にＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸の生産が
行なわれる。基質は培養の初期から培地に加えて
も、菌体生育後添加してもいづれでも良い。 培養液、あるいは菌体反応液から生成したＤ
（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸を回収するには通
常のβ―ヒドロキシ脂肪酸の回収に用いられる手
段を用いることができる。例えば菌体を除去後、
Ｄ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸含有液を濃縮し、
硫酸等の酸でPHを2.5以下にし、これよりエーテ
ル、酢酸エチル等で抽出し、溶剤を除去後、減圧
蒸留すれば容易にＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪
酸をうることができる。 以下実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例 １ グルコース40ｇ、イーストエキス５ｇ、
（NH₄）₂HPO₄ 13ｇ、KH₂PO₄7ｇ、NgSO₄・
7H₂O 0.8ｇ、ZnSO₄・7H₂O 60mg、FeSO₄・
7H₂O 90mg、CuSO₄・5H₂O ５mg、MnSO₄・
4H₂O 10mg、NaC 0.1ｇ、カプロン酸あるい
はヘプタン酸５ml（１当り）の組成からなる培
地をNaOHでPH7.2となし、この30mlを500ml容フ
ラスコに入れ殺菌後、キヤンデイダ・ルゴーザ
KT8202株を接種し、30℃で３日間培養した。PH
は7.0に保ち、かつ毎日グルコースを２％づつ添
加した。培養終了後、生成したＤ（−）―β―ヒ
ドロキシ脂肪酸をガスクロマトグラフイー〔長谷
川等、ジヤーナル・オブ・フアーメンテイシヨ
ン・テクノロジー誌（Journal of Fermentation
Technology）59巻，257頁1981〕で定量した結
果、表２の如くＤ（−）―β―ヒドロキシカプロ
ン酸およびＤ（−）―β―ヒドロキシヘプタン酸
の蓄積が認められた。

【表】 上記条件で培養した培養液を２集め除菌後、
清澄液を減圧下500mlまで濃縮し、次に硫酸でPH
2.0とした。これを酢酸エチル700mlで３回抽出
し、溶剤を除去後、黄色油状物を、カプロン酸を
基質としたものからは23ｇ、ヘプタン酸を基質と
したものからは21ｇをそれぞれ得た。これを減圧
蒸留により精製し、無色油状のβ―ヒドロキシ酸
を表３の如く得た。NMR分析、IR、ガスクロ分
析および比旋光度測定等よりそれぞれＤ（−）―
β―ヒドロキシカプロン酸およびＤ（−）―β―
ヒドロキシヘプタン酸であると同定された。

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した培地から脂肪酸を除去した培
地30mlを500ml容フラスコに入れ、殺菌後、キヤ
ンデイダ・ルゴーザKT8202を植菌し、30℃で23
時間振とう培養した。この培養液各々に、２―ヘ
キセン酸、あるいは２―ヘプテン酸、あるいはｎ
―ヘキシルアルコール、あるいはｎ―ヘプチルア
ルコールを0.5％づつ添加し、PHを7.0に保ちつ
つ、培養中毎日２％グルコースを添加し、30℃で
更に２日間振とう培養した。培養終了後、生成し
たＤ（−）―β―ヒドロキシ脂肪酸をガスクロマ
トグラフイーで分析した結果、表４の如くの蓄積
が認められた。

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様に変異株KT8202株を培養し、
培養開始後、24，48時間目エネルギー源としてグ
ルコース600mg、またはグリセロール600mg、また
は24，36，48，60時間目にエタノール0.3mlまた
は酢酸0.3mlづつ添加し、かつPHを7.0に保ちつつ
72時間培養した。培養終了後の培養液中のＤ（−）
―β―ヒドロキシ脂肪酸の生成量は表５の如くで
あつた。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キヤンデイダ属に属し、炭素数６あるいは７
   の飽和脂肪酸あるいはα，β―不飽和脂肪酸を炭
   素数６あるいは７のＤ（−）―β―ヒドロキシ脂
   肪酸に変換する能力を有する微生物に炭素数６あ
   るいは７の飽和脂肪酸またはα，β―不飽和脂肪
   酸あるいは、当該微生物が炭素数６あるいは７の
   飽和脂肪酸に変換しうる基質を作用させ、生成す
   る炭素数６あるいは７のＤ（−）―β―ヒドロキ
   シ脂肪酸を採取することを特徴とするＤ（−）―
   β―ヒドロキシ脂肪酸の製造法。 ２ 微生物がキヤンデイダ・ルゴーザである特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 微生物が製造を目的とするＤ（−）―β―ヒ
   ドロキシ脂肪酸の資化能を低下、もしくは欠損せ
   しめた変異株である特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。 ４ 変異株がキヤンデイダ・ルゴーザから誘導さ
   れた微生物である特許請求の範囲第３項記載の製
   造法。 ５ 飽和脂肪酸がカプロン酸あるいはヘプタン
   酸、α，β―不飽和脂肪酸が、２―ヘキセン酸、
   あるいは２―ヘプテン酸、当該微生物が飽和脂肪
   酸に変換しうる基質がｎ―ヘキシルアルコールあ
   るいはｎ―ヘプチルアルコールであり、製造目的
   物がそれぞれに対応するＤ（−）―β―ヒドロキ
   シカプロン酸あるいはＤ（−）―β―ヒドロキシ
   ヘプタン酸である特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。 ６ 微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に基
   質を作用させる特許請求の範囲第１項あるいは第
   ３項記載の製造法。 ７ 基質を添加した培地で微生物を培養し、基質
   と微生物を作用させる特許請求の範囲第１項ある
   いは第３項記載の製造法。 ８ 微生物を栄養培地で培養し、得られた培養液
   から、微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製
   し、それに基質を作用させる特許請求の範囲第１
   項あるいは第３項記載の製造法。 ９ 微生物と基質を作用させる際に、当該微生物
   が利用しうるエネルギー源を補給することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第３項記載の
   製造法。 １０ 微生物が利用しうるエネルギー源がグルコ
   ース、グリセロール、エタノールまたは酢酸であ
   る特許請求の範囲第９項記載の製造法。