JPS6142560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物によるＤ（−）−β−ヒドロキ
シ酪酸の製造法に関する。更に詳しくはキヤンデ
イダ属に属し、クロトン酸または酪酸をＤ（−）
−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微
生物をクロトン酸または酪酸あるいは該微生物が
酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換
しうる基質と接触反応させ、生成するＤ（−）−
β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする
Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の製造法に関する
ものである。 光学活性なＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸は、
２種の異なる官能基をもつ化合物であるところか
ら医薬・農薬・香料等の合成原料として好都合な
物質である。ところがＤ（−）−β−ヒドロキシ
酪酸の製造法に関して化学合成したDL（±）−β
−ヒドロキシ酪酸の光学分割法、およびアルカリ
ゲネス属、バチルス属等の細菌をグルコースやメ
タノール等の炭素源を含む培地で培養し得る方法
（特開昭53−18794）等があるが、いづれも収量お
よび価格の面でとうてい工業的に利用しうるもの
ではないと考えられる。 そこで本発明者等は、安価でかつ効率的なＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸の製造法を開発すべく
研究を重ねた結果、酪酸あるいはクロトン酸をＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有す
る微生物の存在を見い出した。例えばキヤンデイ
ダ・ルゴーザ（Candida rugosa）IFO 0750がそ
の能力を有することが見い出された。更に本発明
の意図するところを最大限に発揮するためには、
酪酸あるいはクロトン酸をＤ（−）−β−ヒドロ
キシ酪酸に変換する能力を有する微生物を変異
し、Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の資化性を低
下もしくは欠損せしめた変異株を用いて実施する
のが好ましいことも見い出した。またＤ（−）−
β−ヒドロキシ酪酸製造の原料としては酪酸、ク
ロトン酸の外にブチルアルコール、ブチルアルデ
ヒド、ブチロアミン、無水酪酸等の該微生物が容
易に酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に
変換しうる基質も使用しうることも見い出した。 本発明に使用しうる微生物としてキヤンデイ
ダ・ルゴーザ（Candida rugosa）IFO 0750、キ
ヤンデイダ・パラプシロシス（Candida
parapsilosis）IFO 0708および天然から分離した
キヤンデイダ属に属する微生物が含まれるが、酪
酸あるいはクロトン酸をＤ（−）−β−ヒドロキ
シ酪酸に変換する能力を有する微生物であれば同
様に実施できる。 微生物とクロトン酸、酪酸あるいは該微生物が
酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換
しうる基質とを接触反応させＤ（−）−β−ヒド
ロキシ酪酸へ変換させる方法として、微生物を栄
養培地で培養し、得た培養液に、あるいは培養液
から微生物を分離して菌体懸濁液を調製し、それ
にクロトン酸あるいは酪酸あるいは該微生物が酪
酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換し
うる基質を作用させる方法、あるいは酪酸、クロ
トン酸あるいは該微生物が酪酸またはＤ（−）−
β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質を添加した
培地で微生物を培養することにより、微生物を上
記化合物に作用させる方法等がある。また分離菌
体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー等で固
定化した状態でも用いうる。 微生物とクロトン酸または酪酸あるいは該微生
物が酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に
変換しうる基質との接触反応時に、該微生物が利
用しうるエネルギー源を補給すればＤ（−）−β
−ヒドロキシ酪酸の生産性は向上する。この際の
好ましいエネルギー源としてはグルコース、エタ
ノール、グリセロール、酢酸等がある。 通常の微生物はＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸
の代謝速度が早いためＤ（−）−β−ヒドロキシ
酪酸の蓄積量は少ないので、更に効率的に多量に
蓄積させるためには、先にも述べたとおり、Ｄ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸の資化性の低いか、も
しくは欠損した変異株を使用することが有利であ
る。この様な菌株を得るには人工変異あるいは自
然変異を利用するが、効率的に行なうには通常人
工変異が用いられる。人工変異の方法としては、
Ｘ線照射、紫外線照射、γ線処理、およびＮ−メ
チル−Ｎ−ニトロ−N′−ニトロソグアニジン
（NTG）などの変異誘起剤による処理が用いられ
る。例えば具体的な例として本発明者等がＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸資化能の欠損した変異
株を得るために行なつたNTGによる変異方法の
１例を示すと次のとおりである。ただし、目的と
する変異株が得られれば良いのであつてこの方法
に限定されるものではない。 保存用スラント（キヤンデイダ・ルゴーザIFO
0750）より１白金耳をグルコース40ｇ、
（NH₄）₂HPO₄13ｇ、KH₂PO₄7ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.8ｇ、ZnSO₄・7H₂O60mg、FeSO₄・
7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、MnSO₄・4H₂O10
mg、NaCl 0.1ｇ、ビオチン１mg、チアミン２
mg、水１、PH7.2の組成から成るＳ培地30mlを
500mm容フラスコに入れ接種し、30℃、20時間振
とう培養した。その培養液1.5mlを0.5Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で洗浄後、0.5mg/mlNTG溶液３ml
に懸濁し、４℃、60分放置した。その後、同じ緩
衝液で３回洗浄し、次の組成から成る固型平板培
地Ｃ培地（グルコース20ｇ、イーストエキス５
ｇ、肉エキス10ｇ、ペプトン10ｇ、寒天20ｇ、水
１、PH7.0）に塗布し、コロニーを出現させ
た。このコロニーをＳ培地のグルコースの代りに
酪酸10ｇ、寒天20ｇを加えたPH7.0のＢ培地にレ
プリカした。このＢ培地上で生育不良な菌株（酪
酸非資化性菌）を選んだ。この様な方法で得た酪
酸非資化性株を、実施例１に示すと同様な条件で
培養を行ない、Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸高
濃度蓄積株を選択した。このようにして選んだ変
異株は、いづれもＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸
資化性が著しく低下しており、本発明に利用でき
る。 本発明を実施するため、上記の方法で得た変異
株の例としてキヤンデイダ・ルゴーザKT8202株
がある。この変異株の菌学的性質として表１に示
すごとく親株と殆んど差は認められないが、酪
酸、β−ヒドロキシ酪酸の資化性において著しい
差が認められる。

【表】

【表】 なおキヤンデイダ・ルゴーザ（Candida
rugosa）KT8202株は工業技術院微生物工業研究
所へ微生物保管委託申請受理番号第111号として
寄託してある。 本発明に使用する培地はグルコース、グリセリ
ン等の炭素源、アンモニア、硫安、ペプトン、カ
ザミノ酸の無機、有機の含窒素化合物の窒素源、
リン酸カリウム、硫安マグネシウム等の生育に必
要な無機塩類に更にビオチン等のビタミン類、そ
の他必要に応じて通常の微生物の培養に用いられ
る種々の栄養源を適宜配合して用いることができ
る。培養には殺菌した培地に菌を接種し、20〜45
℃の温度でPH６〜９に保ちつつ１〜10日間通気撹
拌、振とう培養など好気的に行なう。培養の初期
は菌体の生育があり、その後Ｄ（−）−β−ヒド
ロキシ酪酸の生産が行なわれる。またＤ（−）−
β−ヒドロキシ酪酸生産時にエネルギー源として
グルコース等を補給すれば効率良く多量にＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸の生産が行なわれる。
酪酸等の原料は培養の初期から培地に加えておい
ても、菌体生育後中和して添加してもいづれでも
良い。 培養液あるいは菌体反応液から生成したＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸の回収するには、通常
のヒドロキシ酸の回収方法に用いられる手段を用
いることができる。例えば菌体除去後のＤ（−）
−β−ヒドロキシ酪酸含有液を濃縮し、硫酸等の
酸でPHを2.5以下に下げ、このものよりエーテ
ル、酢酸エチル等で抽出し、溶剤を除去後、減圧
蒸留すれば純粋なＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸
を容易にうることができる。 以下実施例により本発明を具体的に説明するが
本発明は実施例のみに限定されるものではない。 実施例 １ グルコース40ｇ、（NH₄）₂HPO₄13ｇ、KH₂PO₄7
ｇ、MgSO₄・7H₂O0.8ｇ、ZnSO₄・7H₂O60mg、
FeSO₄・7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、
MnSO₄・4H₂O10mg、NaCl 0.1ｇ、イーストエキ
ス５ｇ、酪酸20ｇ（１当り）の組成からなる培
地をNaOHでPH7.2とし、30mlを500ml容フラスコ
に入れ殺菌後、キヤンデイダ・ルゴーザKT8202
株を接種し、30℃、５日間振とう培養した。PHは
7.0に保ち、かつ毎日グルコースを２％添加し
た。培養終了後、生成したＤ（−）−β−ヒドロ
キシ酪酸をガスクロマトグラフイー〔長谷川等；
ジヤーナル・オブ・フアーメンテイシヨン・テク
ノロジー誌（Journal of Fermentation
Technology）59巻、203頁、1981〕で定量した結
果13mg/mlの蓄積が認められた。 上記条件での培養液を１集め遠心分離により
除菌後、上清を減圧下200mlまで濃縮した。これ
を硫酸でPH2.0となし、酢酸エチル500mlで３回抽
出した。溶剤を減圧下除去し、黄色油状物20ｇを
得た。これを減圧下蒸留し、（127℃／18mmHg）
無色油状物8.3ｇを得た。この物質はNMR、IR、
ガスクロマト分析によりβ−ヒドロキシ酪酸と同
定された。更に旋光度を測定した結果〔α〕^２５ _Ｄ−
23.0゜（Ｃ＝61、水）を示し、Ｄ（−）−β−ヒ
ドロキシ酪酸であると同定された。 実施例 ２ 実施例１に示した培地から酪酸を除いた培地30
mlを500ml容フラスコに入れ、殺菌後、変異株
KT8202株を植菌し、30℃で24時間振とう培養し
た。この培養液各々に無水酪酸、クロトン酸、ブ
チロアミンを別々に600mg、ブチルアルコール300
mg、ブチルアルデヒド150mg各々別々に添加し、
PHを7.0に調整した。更に各フラスコにグルコー
ルを600mgづつ毎日添加し、かつPHを7.0に保ちつ
つ４日間振とう培養を行なつた。培養終了後、生
成したＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸をガスクロ
マトグラフイーで分析した結果表２の如くであつ
た。

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様に培養し、培養開始後、24、
48、72時間目にエネルギー源としてグルコース
600mgまたはグリセロール600mg、または24、36、
48、60、72、84時間目にエタノール0.3ml、また
は酢酸0.3mlを添加し、PHを7.0に維持しつつ96時
間振とう培養した。培養終了後の培養液中のＤ
（−）−β−ヒドロキシ酪酸の生成量は表３の如く
であつた。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キヤンデイダ属に属し、クロトン酸または酪
   酸をＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能
   力を有する微生物を、クロトン酸または酪酸ある
   いは該微生物が酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロ
   キシ酪酸に変換しうる基質と接触反応させ、生成
   するＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸を採取するこ
   とを特徴とするＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の
   製造法。 ２ 微生物がキヤンデイダ・ルゴーザである特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 微生物がＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸資化
   能の低いか、もしくは欠損した変異株である特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ４ 変異株がキヤンデイダ・ルゴーザから誘導さ
   れた微生物である特許請求の範囲第３項記載の製
   造法。 ５ 微生物が酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキ
   シ酪酸に変換しうる基質が、ブチルアルコール、
   ブチルアルデヒド、ブチロアミンまたは無水酪酸
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ６ 微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に、
   酪酸またはクロトン酸あるいは該微生物が酪酸ま
   たはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる
   基質を接触反応させる特許請求の範囲第１項また
   は第３項記載の製造法。 ７ 酪酸、クロトン酸あるいは該微生物が酪酸ま
   たはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる
   基質を添加した培地で微生物を培養することによ
   り、微生物を酪酸、クロトン酸あるいは該微生物
   が酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変
   換しうる基質に接触反応させる特許請求の範囲第
   １項または第３項記載の製造法。 ８ 微生物を栄養培地で培養し、得られた培養液
   から微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、
   それを酪酸、クロトン酸あるいは該微生物が酪酸
   またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しう
   る基質に接触反応させる特許請求の範囲第１項ま
   たは第３項記載の製造法。 ９ 微生物とクロトン酸または酪酸あるいは該微
   生物が酪酸またはＤ（−）−β−ヒドロキシ酪酸
   に変換しうる基質との接触反応時に、該微生物が
   利用しうるエネルギー源を補給する特許請求の範
   囲第１項または第３項記載の製造法。 １０ 微生物が利用しうるエネルギー源が、グル
   コース、グリセロール、エタノール、または酢酸
   である特許請求の範囲第９項記載の製造法。