JPS58158190A - Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸の製
造法に関する。更に詳しくはキャンデイダ属に属し、ク
ロトン酸または酪酸をＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変
換する能力を有する微生物をクロトン酸または酪酸ある
いは該微生物が酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸
に変換しうる基質生接触反応させ、生成するＤ←）−β
−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするＤ←）−
β−ヒドロキシ酪酸の製造法に関するものである。

光学活性なり←）−β−ヒドロキシ酪酸は、２種の異な
る官能基をもつ化合物であるところから医薬・農薬・香
料等の合成原料として好都合な物質である。ところがＤ
←）−β−ヒドロキシ酪酸の製造法に関して化学合成し
たＤＬ（ト）−β−ヒドロキシ酪酸の光学分割法、およ
びプルカリゲネス属、バチルス属等の細菌をグＪレコー
スやメタノール等の炭素源を含む培地で培養し得る方法
（特開昭５５−１８７９４）等があるが、いづれも収量
および価格の面でとうてい工業的に利用しうるものでは
ないと考えられる。

そこで本発明者等は、安価でかつ効率的なり←）−β−
ヒドロキシ酪酸の製造法を開発すべく研究を重ねだ結果
、酪酸あるいはクロトン酸を“Ｄ←）−β−ヒドロキシ
酪酸に変換する能力を有する微生物の存在を見い出した
。例えばキャンデイダ・ルゴーザ（Ｃａｎｄｊ＋ｉａ　
ｒｕｇｏｓａ　）　　工ＦＯ０７５０がその能力を有す
ることが見い出された。更に本発明の意図するところを
最大限に発揮するためには、酪酸あるいはクロトン酸を
Ｄ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微
生物を変異し、Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の資化性
を低下もしくは欠損せしめた変異株を用いて実施するの
が好ましいことも見い出した。

またＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸製造の原料としては酪
酸、クロトン酸の外にブチ５ルアルコール、ブチルアル
デヒド、ブチロアミン、無水醋酸等の該微生物が容易に
酪酸またはＤト）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基
質も使用しうろことも見い出した。

本発明に使用しうる微生物としてキャンデイダ−７Ｌ７
ゴーザ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ　）　ＩＦＯ０
７５０゜キャンディダ脅パラプシロシｉ　（Ｃａｎｄｉ
ｄａｐａｒａｐｓｊ、］ｏｓｉｓ）工Ｆ０　０７０Ｂお
よび天然から分離したキャンデイダ属に属する微生物が
含まれるが、醋酸あるいはクロトン酸をＤ←）−β−ヒ
ドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生物Ｉ　であれ
ば同様に実施できる。

微生物とクロトン酸、酪酸あるいは該微生物が酪酸また
はＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質とを接
触反応させＤ←）−β−ヒドロキシ醋酸へ変換させる方
法として、微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に、
あるいは培養液から微生物を分離して菌体懸濁液を調製
し、それにクロトン酸あるいは酪酸あるいは該微生物が
酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基
質を作用させる方法、あるいは酪酸、クロトン酸あるい
は該微生物が酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に
変換しうる基質を添加した培地で微生物を培養すること
により、微生物を上記化合物に作用させる方法等がある
。また分離菌体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー
等で固定化した状態でも用いうる。

微生物とクロトン酸または酪酸あるいは該微生物が酪酸
またはＤ←）−β−ヒドロキン酪酸に変換しうる基質と
の接触反応時に、該微生物が利用しうるエネルギー源を
補給すればＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸の生産性は向上
する。この際の好ましいエネルギー源としてはグルコー
ス、エタノール、グリセロール、酢酸等がある。

通常の微生物はＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸の代謝速度
が早いためＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積量は少な
いので、更に効率的に多量に蓄積させるためには、先に
も述べたとおシ、Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の資化
性の低いか、もしくは欠損した変異株を使用することが
有利である。この様な菌株を得るには人工変異あるいは
自然変異を利用するが、効率的に行なうには通常人工変
異が用いられる。人工変異の方法としては、Ｘ線照射、
紫外線照射、γ線処理、およびＮ−メチル−Ｎ−二トロ
ーＮ′−二トロソクアニジン（ＮＴＧ　）などの変異誘
起剤による処理が用いられる。例えば具体的な例として
本発明者等がＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸資化能の欠損
した変異株を得るために行なったＮＴＧによる変異方法
の１例を示すと次のとおシである。ただし、目的とする
変異株が得られれば良いのであってこの方法に限定され
るものではない。

保存用スラント（キャンデイダ・ルゴーザＩＦＯ０７５
０）より１白金耳をグルコース４０ｉｆ。

（ＮＨ４）２ＨＰＯ４１３ｆ、　　ＫＨ＊ＰＯ＜　７ｇ
、　　ＪＳＯ４”７ＨｚＯｏ、ｓｆ、　ＺｎＳＯ４・７
ＨｚＯ６０’１９．　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ＝０９ＱＷＩ
ｇ、　ＣｕＢＯａ・５）１２０　５Ｑ、　　　Ｍ　ｒｌ
ｓＯ４＋　４Ｈ２’０　１０巧、　　　ＮａＣ１０，１
Ｆ。

ビオチン１ｙＮｉ、　　チアミン２ｒｎ９．水１　／、
　　ｐＨ７，２の組成から成るＳ培地３０１１／を５０
０　ｗｒｌ容フラスコに入れ接種し、６０″Ｃ５２０時
間振とう培養した。その培養液１．５　ｍｌを０．５　
Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７０）で洗浄後、０．５１１
９　／ｍｅ　ＮＴＧ溶液３ｍ１Ｋ懸濁し、４”Ｃ，６０
分放置した。その後、同じ緩衝液で６回洗浄し、次の組
成から成る固型平板培地Ｃ培地（グルコース２０ｆ、イ
ーストエキスｓｐ、肉エキス１０ｆ１ペプトン１０ｆ、
寒天２０ｇ、水１１．ｐＨ７，０）に塗布し、コロニー
を出現させた。このコロニーをＳ培地のグルコースの代
りに酪酸１０ｇ、寒天２０Ｆを加えたｐＨ７，０のＳ培
地にレプリカした。このＳ培地上で生育不良な菌株（酪
酸非資化性菌）を選んだ。この様な方法で得た酪酸非資
化性菌を、実施例１に示すと同様な条件で培養を行ない
、Ｄ←）−β−ヒドロキシ酪酸高濃度蓄積株を選択した
。とのようにして選んだ変異株は、いづれもＤ←）−β
−ヒドロキシ酪酸資化性が著しく低下しており、本発明
に利用できる。

本発明を実施するため、上記の方法で得た変異株の例と
してキャンテ°イダ・ルゴーザＫＴ８２０２株がある。

この変異株の菌学的性質として表１に示すごとく親株と
殆んど差は認められないが、酪酸、β−ヒドロキシ酪酸
の資化性において著しい差が認められる。

表　　１ 米Ｓ培地において、それぞれの化合物を唯一工業技術院
微生物工業研究所へ微生物保管委託申請受理番号第１１
１号として寄託しである。

本発明に使用する培地はグルコース、グリセリン等の炭
素源、アンモニア、硫安、ペプトン、カザミノ酸等の無
機、有機の含窒素化合物の窒素源、リン酸カリウム、硫
安マグネシウム等の生育に必要な無機塩類に更にビオチ
ン等のどりミソ類・その他必要に応じて過電の微生物Ｏ
竣１１１に用いられゐｓＡｏ栄養源な適宜配合して用い
ることができる。＃費には殺菌し九培地に曹を接種し、
２０〜４５１：０温度でｌ１１６〜９に保ちつつ１〜１
０日関遥気攪拌、振とり培養など好気約に行なう、培養
の初期は菌体の生育があ）、その後Ｄ←）−β−とドロ
奢Ｓ’１ｌｌｌＯ生慶が行なわれる。ｔたＤ（へ）−β
−ヒドロキＶ酪霞生産時にエネにギー源としてダにコー
ス啼を補給すれば効率良く齋量ＫＤ←）−β−ヒドロ年
ｓｙ＠鹸の生産が行なわれゐ、酪酸等の原料は墳ＩＩＯ
初期から皓地に加えておいても、画体生育後中和して添
加してもいづれでも廉い。

培養液あるいは画体反応液から生威し九塾←）−β−＊
　Ｆ　ａ　＊　Ｖ＠＠０［ｌＩＸす！にハ、　ｊｌｌｔ
ＯヒドロキＶ＊０［ｉｌ収方法に用いられる手段を用い
ることができる１例えば菌体除去＠ＯＤ←）−β−ヒド
ロ奢ＶｌｌＩ鐙含有波を濃細し、硫酸等０鐙”ｔ”　ｐ
　ＨをＬＳ以下に下げ、このものよ）工−テν、＃酸エ
チル等で抽出し、溶剤を除去螢、減圧蒸留すれば純粋な
り←）−β−ヒドロキシ酪酸を容易にうることかできる
。

以下実施例によシ本発明を具体的に説明するが本発明は
実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ グル：ｌ−ス４０１　、　　（ＮＨａ　）２ＨＰＯ４１
５ｇ、　ＫＨ，ｐｏ。

７ｇ、　　Ｍ７ＳＯ４”７Ｈ２００，８ｇ、　　ＺｎＳ
Ｏ４・７Ｈｚ０６０’Ｑ。

Ｆｅ５Ｏａ７Ｈ２０９０ＷＩ９．　　ｐｕｓＯ４−５Ｈ
２０５Ｗ９＊　　Ｍｎ５Ｏｎ”４Ｈ，Ｏｌ０ＩＷ、　　
ＮａＣ１０，１ｇ、イーストエキス５ｙ。

酪酸２０ｇ（１１当＃））の組成からなる培地をＮａＯ
Ｈテｐ　Ｈ７，２とし、３０　ｍｌを５００　”ａｔ容
フラスコに入れ殺菌後、キャンディダ・ルゴーザＫＴ８
２［］２株を接種し、３０　’Ｃ１５日間振とう培養し
た。ｐＨは７ｏに保ち、かつ毎日グルコースを２％添加
した。培養終了後、生成したＤ←）−β−ヒドロキシ酪
酸をガスクロマトグラフィ−（ｆｆｔ谷川等用ジャーナ
ル・オブ・ファーメンティジョン・テクノロジー誌（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｊ、Ｏｎ　Ｔｅ
ｃｈｎＯ］Ｏｇｙ）　ｓ　ｑ巻、２０３３４１９Ｂ１）
で定量した結果１３ηｉ　ｗｅの蓄積が認められた。

上記条件での培養液を１４集め遠心分離により除菌後、
上清を減圧下２０（］＋ｒまで濃縮した。

これを硫酸でｐＨ２，０となし、酢酸エチル５００耐で
６回抽出した。溶剤を減圧下除去し、黄色油状物２０ｆ
を得た。これを減圧上蒸留し、（１２７’Ｃ／　１８　
ｒｒｒｍＨｆ　）無色油状物８．３Ｎを得た。

この物質はＮＭＲ，工Ｒ，ガスクロマド分析ニよりβ−
ヒドロキシ酪酸と同定された。更に旋光度を測定した結
果［ａ、１２５−２３．ｏｏ（Ｃ＝６１．水）を示し、
Ｄ←）−β−ヒドロキシ酪酸であると同定された。

実施例２ 実施例１に示した培地から酪酸を除いた培地３ｏｖｔｌ
を５００　ｍｌ容フラスコに入れ、殺菌後。

変異株ＫＴ８２０２株を植菌し、３０　’Ｃで２４時時
間表り培養した。この培養液各々に無水酪酸、クロトン
酸、ブチロアミンを別々に６００〜、ブチ！レアルコー
ル３００１１１９％ブチルア々デヒド１５０ｒＲ９各々
別々に添加し、ｐＨｆ！−Ｚ（Ｈに調整した。更に各フ
ラスコにグル：ｘ　−ｙ、　ヲ６００１１９づつ毎日添
加し、かつｐＨをＺＯに保ちつつ４日間振とう培養を行
なった。培養終了後、生成したＤ←）−β−ヒドロキシ
醋酸をガスクロマトグラフィーで分析した結果表２の如
くであった。

表　　２ 実施例３ 実施例１と同様に培養し、培養開始後、２４゜４８．７
２時時間上二ネＶギー源としてグルコース６００〜また
はグリセロール６００η、または２４，３６．４Ｂ、６
０，７２．８４時間目にエタノ−ル０．３　ｙｔｌ、ま
たは酢酸０．３　ｍｌを添加し、ｐＨを７０に維持しつ
つ９６時時間表ぅ培養した。

培養終了後の培養液中のＤ←）−β−ヒトｐキシ酪酸の
生成量は表５の如くであった。

表　　６ 特許出願人　鐘淵化学工業株式会社 代理人弁理士浅野真−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　キャンデイダ属に属し、クロトン酸または醋
   酸をＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有す
   る微生物を、クロトン酸または醋酸あるいは該微生物が
   酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基
   質と接触反応させ、生成するＤ←）−β−ヒドロキシ酪
   酸を採取することを特徴とするＤ←）−β−ヒドロキシ
   酪酸の製造法。
2. （２）微生物がキャンデイダ・ルゴーザである特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）＠生物がＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸資化能の低
   いか、もしくは欠損した変異株である特許請求の範囲第
   １項記載の製造法。
4. （４）変異株がキャンデイダ・ルゴーザかう誘導された
   微生物である特許請求の範囲第３項記載の製造法。
5. （５）　　ＩＩ生物が酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキ
   シ酪酸に変換しうる基質が、ブチルアルコール、ブチル
   アルデヒド、ブチロアミンまたは無水酪酸である特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。
6. （６）＠生物を栄養培地で培養し、得た培養液に、酪酸
   まだはクロトン酸あるいは該微生物が酪酸またはＤ←）
   −β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質を接触反応させ
   る特許請求の範囲第１項または第３項記載の製造法。
7. （７）酪酸、クロトン酸あるいは該；微生物が酪酸また
   はＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質を添加
   した培地で微生物を培養することにより、微生物を酪酸
   、クロトン酸あるいは該微生物が酪酸またはＤ←）−β
   −ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質に接触反応させる特
   許請求の範囲第１項または第３項記載の製造法。
8. （８）微生物を栄養培地で培養し、得られた培養液から
   微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、それを酪酸
   、クロトン酸あるいは該微生物が酪酸またはＤ←）−β
   −ヒドロキシ酪酸に変換しうる基質に接触反応させる特
   許請求の範囲第１項または第６項記載の製造法。
9. （９）微生物とクロトン酸または酪酸あるいは該微生物
   が酪酸またはＤ←）−β−ヒドロキシ酪酸に変換し°う
   る基質との接触反応時に、該微生物が利用しうるエネル
   ギー源を補給する特許請求の範囲第１項または第６項記
   載の製造法。 ００　　微生物が利用しうるエネルギー源が、グルコー
   ヌ、グリセロール、エタノールＭ［ある特許請求の範囲
   第９項記載の製造法。