CN110035991A - 一步发酵制备(r)-3-羟基丁酸或其盐 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过用非病原微生物一步发酵制备(R)‑3‑羟基丁酸或其盐的方法。(R)‑3‑羟基丁酸的发酵通过供应某些碳源和氮源来进行。这些微生物包括谷氨酸细菌HR057菌株或一种基因工程化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium Glutamicum)。

Description

一步发酵制备(R)-3-羟基丁酸或其盐
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月4日提交的美国申请号62/481,476的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
发明技术领域
本发明属于生物工程领域，具体来说，涉及通过微生物发酵制备(R)-3-羟基丁酸及其盐的方法。
发明背景
(R)-3-羟基丁酸(3-HB)是CAS号为625-72-9的光学手性化合物。(R)-3-羟基丁酸是通过长链脂肪酸在哺乳动物肝脏中代谢产生的。它作为血浆和外周组织中的主要酮存在，并且可以在身体的大多数组织中用作能量来源。
(R)-3-羟基丁酸对治疗许多疾病有积极作用，并且也具有营养功能。例如，它可用于治疗由酮水平升高引起的许多疾病(如神经病症，包括癫痫和肌阵挛，以及神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病和痴呆)；它可通过氧化辅酶Q来减少自由基损伤(如缺血)；它可通过提高训练效率和运动表现，提高新陈代谢的效率，实现对支持不足(inadequatesupport)、心绞痛、心肌梗死等的治疗；它还可以用于治疗癌症相关疾病，如脑癌(星形细胞瘤等)。此外，它对葡萄糖代谢紊乱(如1型糖尿病、2型糖尿病、低血糖酮病等)的治疗具有良好效果。它可用于控制骨质减少(骨质减少)、骨质疏松症、严重骨质疏松症和相关骨折。基于这些功能以及治疗和营养作用，(R)-3-羟基丁酸及其盐可用作食品添加剂和药物，具有很大的健康和药用价值。
(R)-3-羟基丁酸主要通过化学方法制备。它可以由直接化学合成制得，或通过用聚-3-羟基丁酸解聚酶酶促降解聚-3-羟基丁酸酯制备。(R)-3-羟基丁酸的化学合成需要高温、高压和昂贵的手性金属催化剂。聚-3-羟基丁酸的酶促降解过程需要大量的有机溶剂和非常纯的聚-3-羟基丁酸酯作为起始原料。除反应时间长外，反应后难以控制产物的外消旋化。此外，由于成本高并且效率低，为了满足工业规模商业化的更高要求，该方法需要在实验室中进行更多优化。
目前，大多数市售3-羟基丁酸是外消旋混合物，其中(R)-3-羟基丁酸与(S)-3-羟基丁酸的比例约为1比1。尽管研究表明(S)-3-羟基丁酸不具有生理活性，但外消旋3-羟基丁酸及其盐(尤其是钠盐)仍然是主要的商品形式，并被大多数消费者所接受。预期单一的光学(R)-3-羟基丁酸及其盐在未来将变得流行，替代外消旋3-羟基丁酸及其盐。
通常，认为天然或生物化合物比化学生产的化合物更安全(和无毒)。人们更喜欢“天然”或“生物”特征的药物、食品和化妆品成分来源。出于市场目的，药物、食品和化妆品制造商更愿意用生物学方法代替化学方法来制造相同的产品。因此，目标是以生物学方法代替作为主要方法的化学方法来生产(R)-3-羟基丁酸。
发明简述
为了以生物学方法生产“安全且无毒”的(R)-3-羟基丁酸，发明人研究了各种生物学方法，并且出乎意料地发现以非病原微生物作为宿主的发酵程序能够以异常高效的一步法生产(R)-3-羟基丁酸。通过基因工程技术筛选和选择最佳工程化生物，以增强与(R)-3-羟基丁酸主要代谢途径相关的基因的表达，并削弱分支代谢途径。之后，在发酵过程中可有效积累(R)-3-羟基丁酸，其在工业规模上具有广阔的应用前景。
因此，一方面，本发明提供了一种高效生产(R)-3-羟基丁酸的生物学方法(例如，以一步法)。另一方面，本发明提供食品级(R)-3-羟基丁酸及其盐。又一方面，本发明还提供食品级外消旋3-羟基丁酸及其盐以满足市场需要。又一方面，本发明还提供了一种细菌，其可使发酵培养基发酵以产生(R)-3-羟基丁酸。
具体地，本发明的一个方面提供了一种生产(R)-3-羟基丁酸的方法，该方法包括用非病原微生物使发酵液发酵。在该方法中，发酵液包含碳源和氮源以及由非病原微生物过表达的酶，所述碳源和氮源通过用非病原微生物一步发酵直接转化为(R)-3-羟基丁酸，所述(R)-3-羟基丁酸在发酵期间被分泌后，自发酵液中回收，所述非病原微生物选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、艰难短杆菌(Brevibacterium difficile)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和短杆菌(Brevibacterium breve)；并且所述非病原微生物具有以下生物转化能力：将丙酮酸和辅酶A转化为乙酰-CoA，将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，并将乙酰乙酸转化为(R)-3-羟基丁酸。
在一些实施方案中，由非病原微生物过表达的酶包括选自琥珀酰-CoA转移酶、乙酰乙酰-CoA合酶和3-HB脱氢酶的成员。在一些优选的实施方案中，微生物过表达琥珀酰-CoA转移酶和3-HB脱氢酶。
在一些实施方案中，非病原微生物包括谷氨酸棒杆菌、谷氨酸细菌HR057、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、黄色短杆菌或短杆菌。在一些优选的实施方案中，微生物包括谷氨酸棒杆菌或谷氨酸细菌HR057。在一些更优选的实施方案中，微生物是谷氨酸棒杆菌(如以保藏号CGMCC No.13111保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center)的谷氨酸棒杆菌)。
在一些实施方案中，碳源包括选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油的成员。在一些其他实施方案中，氮源包括选自有机氮源和无机氮源的成员。合适的有机氮源的实例包括但不限于玉米浆、麸皮水解物、豆饼水解物、酵母提取物、酵母粉、蛋白胨和尿素；其中合适的无机氮源的实例包括但不限于硫酸铵、硝酸铵和氨水。
在一些实施方案中，通过本发明的方法生产的(R)-3-羟基丁酸不含细菌内毒素，并且具有95％或更高的纯度。
在一些实施方案中，通过本发明的方法制备的(R)-3-羟基丁酸是以(R)-3-羟基丁酸钠盐、(R)-3-羟基丁酸钾盐、(R)-3-羟基丁酸镁盐或(R)-3-羟基丁酸钙盐的形式。
本发明的另一方面提供了通过外消旋化处理根据本发明方法生产的(R)-3-羟基丁酸或(R)-3-羟基丁酸盐制备的外消旋3-羟基丁酸。
本发明的另一方面提供了非病原微生物，其选自谷氨酸棒杆菌、谷氨酸细菌HR057、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、黄色短杆菌和短杆菌。
在一些实施方案中，非病原微生物是谷氨酸棒杆菌菌株或谷氨酸细菌HR057菌株。例如，谷氨酸棒杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13111。
在一些优选的实施方案中，非病原微生物能够以本发明的一步发酵法生产(R)-3-羟基丁酸。
本发明包括以下技术方案：
(R)-3-羟基丁酸的发酵通过使用非病原微生物进行，该非病原微生物将碳源和氮源直接转化为(R)-3-羟基丁酸，其被分泌到发酵液中并且可以直接回收。微生物可以是选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、黄色短杆菌和短杆菌的一种或多种成员。这些微生物具有以下生物转化功能：将丙酮酸和辅酶A转化为乙酰-CoA；将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；然后将乙酰乙酸转化为(R)-3-羟基丁酸。
优选地，微生物过表达选自琥珀酰-CoA转移酶、乙酰乙酰-CoA合酶和3-HB脱氢酶(3-HB脱氢酶，BDH)的一种或多种酶。
更优选地，微生物过表达琥珀酰-CoA转移酶或3-HB脱氢酶。
优选地，微生物抑制或下调β-酮硫解酶的表达。
在一个优选的实施方案中，微生物是谷氨酸棒杆菌。
在另一个优选的实施方案中，谷氨酸棒杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.13111。
在发酵过程中对于不同的微生物可以使用不同的培养基。碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。在发酵培养基中可以使用一种或多种有机或无机氮源。有机氮源可以来自玉米浆、麸皮水解物、豆饼水解物、酵母提取物、酵母粉、蛋白胨和尿素；无机氮源可以包括选自硫酸铵、硝酸铵和氨水的一种或多种化合物。
在本发明的一个优选实施方案中，当应用谷氨酸棒杆菌时，发酵培养基包括葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH4)2SO4 20g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、生物素100μg/L和消泡剂0.2g/L。
优选地，当进行分批进料发酵时，进料培养基包括硫酸铵500g/L和葡萄糖650g/L。
通过本发明的发酵方法制备的(R)-3-羟基丁酸的纯度可以大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或甚至大于99％。
因此制备的纯(R)-3-羟基丁酸不含细菌内毒素和化学气味如苦味。
(R)-3-羟基丁酸是一种酸，其与碱形成盐。或者，通过本发明制备的(R)-3-羟基丁酸可以以盐(如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐)的形式存在，优选以钠盐的形式存在。这些盐全都可以是光学活性化合物。
由于传统上外消旋3-羟基丁酸及其钠盐已被食品和药物制造商和消费者所接受，因此可以对(R)-3-羟基丁酸及其盐进行外消旋处理以制备外消旋3-羟基丁酸及其盐。例如，外消旋化可以通过在碱性溶液如氢氧化钠溶液中加热(R)-3-羟基丁酸一定时间来实现。
外消旋3-羟基丁酸盐可以是3-羟基丁酸钠、3-羟基丁酸钾、3-羟基丁酸镁或3-羟基丁酸钙。
通过本发明制备的(R)-3-羟基丁酸及其盐不含细菌内毒素和有毒化学物质，从而确保食品安全。此外，(R)-3-羟基丁酸可以直接用于制造药物和保健品，因为它不含化学残留物或化学反应杂质，并且它也没有诸如苦味等化学气味。
本发明中构建的基因工程化微生物可以在发酵过程期间在发酵液中有效地产生和积累(R)-3-羟基丁酸，并且可以通过下游工艺达到食品级(R)水平，其具有广泛的工业前景。
已经工程化谷氨酸棒杆菌以便以高产率生产(R)-3-羟基丁酸。该微生物的菌株于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13111，该保藏中心位于中国北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101(www.cgmee.net)。
如本文所用，术语“一步发酵”是指一种发酵方法，其包括将一种或多种发酵剂(例如，微生物)添加到发酵培养基中，所述发酵培养基经发酵产生所需产物，而不必添加第二轮发酵剂，并因此省略第二轮发酵过程。
如本文所用，术语“非病原微生物”是指通常不会对另一种微生物、生物或人类造成疾病、伤害或死亡的微生物。
发明详述
通过具体实施方案进一步详细描述本发明。以下实施例旨在说明本发明而不是限制本发明的范围。
除非另有描述或定义，否则本发明中采用质量百分比，如多种物质的添加量、含量和浓度。
在本发明提供的实施方案中，除非另有描述或说明，否则默认室温(15-30℃)。
在本发明中，能够通过发酵产生(R)-3-羟基丁酸的微生物菌株例如但不限于“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒杆菌菌株CGMCC No.13111”或“谷氨酸细菌HR057”。
在本发明中研究了通过微生物发酵(R)-3-羟基丁酸，以便向消费者和药物和食品制造商提供“天然化”或“生物源”来源的(R)-3-羟基丁酸及其盐、3-羟基丁酸及其盐。
发明人筛选并选择了用于构建基因工程菌株的物种。不考虑具有潜在病原特征的一般菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)。选择非病原微生物并将其基因工程化为发酵菌株，如谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、短杆菌和Brevibacterium brevica。通过筛选获得几种菌株，其能够通过发酵产生(R)-3-羟基丁酸。在发酵过程中完全没有产生可能对大多数人造成伤害的内毒素。因此，它被认为是“无毒且无害”的设计。
有必要调节和控制一些参数，如溶解氧、温度、pH等，以在发酵期间具有更高的(R)-3-羟基丁酸产率。
在发酵期间将常数dO2控制在15％至25％。发酵可在以下条件下进行：空气流速为约1vvm，其中vvm是每分钟的通风量与罐中液体的实际体积之比(例如，对于含有30升发酵液的发酵罐而言，1vvm等于30L/min；对于含有5升发酵液的发酵罐而言，l vvm等于5L/min)。
优选地，在发酵的初期阶段期间首先将温度控制在30～32℃，然后在发酵的后期阶段将温度升高至34～37℃，这促进微生物合成和排泄(R)-3-羟基丁酸。
在发酵的初期阶段期间，通常将pH控制在pH 6.0～8.0，优选pH6.5～7.0。然后可以在发酵的后期阶段将其调节至6.8～7.0，以促进从发酵液中合成和排出(R)-3-羟基丁酸。
上面的术语“发酵的后期阶段”是指从微生物生长的指数期到稳定期。例如，当采用OD600nm值监测细胞密度时，OD600nm值不再上升并趋于降低。
发酵过程期间残糖控制在1.0％～3.0％，更精确地说是1.5％～2.5％。
在发酵完成后，需要回收发酵液并从中提取(R)-3-羟基丁酸。例如，通过离心获得发酵液的上清液。必要时浓缩上清液；通过后处理如纯化和干燥分离(R)-3-羟基丁酸。
可通过过滤(包括超滤、纳滤等)除去发酵培养基中的细胞和大分子。必要时可以应用浓缩过滤和其他后处理手段如干燥、纯化和其他方法以分离(R)-3-羟基丁酸。或者，可通过离心得到发酵液的上清液，然后经过超滤、纳滤和其他方法除去大分子，或者必要时经过浓缩过滤，然后通过干燥、纯化和其他后处理手段来分离(R)-3-羟基丁酸。
为制备(R)-3-羟基丁酸盐如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐，等量的(R)-3-羟基丁酸与相应的碱或金属氧化物如氢氧化钠反应。将反应温度控制在30℃或更低，优选在25℃或更低，更优选在20℃或更低，其中可以尽可能地避免外消旋反应。
由于整个制备过程不需要或不涉及有机溶剂，因此从产物(R)-3-羟基丁酸中检测不到类似苦味的化学气味，该产物可以直接用于制造药物和保健产品。
实施例1：预培养和发酵
将储存在-80℃的甘油储备液CGMCC No.13111解冻并接种到含有500mL种子培养基(75g/L葡萄糖、25-30g/L玉米浆、20g/L(NH4)2SO4、1.5g/LKH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、1.0g/L尿素、30mg/L组氨酸、25g/L糖蜜、100μg/L生物素，pH 7.0)的5000mL烧瓶中，并在30℃下培养18小时。当OD＝0.4-0.5时，种子培养物培养完成。
将500mL种子培养物接种到装有5升培养基的7升发酵罐中。发酵培养基的组成与上述种子培养基相同，灭菌后pH值控制在6.4～6.7。进料培养基含有500g/L硫酸铵和650g/L葡萄糖。发酵温度设定为30℃，罐压力保持在0.05Mpa，初始通气比为1vvm。搅拌速度为600rpm。发酵的pH为约pH 6.5。
将pH控制在6.7，并在发酵的后期阶段将温度升至35℃。通过调节通风和搅拌速度将溶解氧常数(dO2)控制在15～25％。为了控制残糖水平，缓慢加入糖，同时原糖浓度降至约3.0％，残糖控制在1.5％～2.0％。72小时后，(R)-3-羟基丁酸累积至11.8g/L。
实施例2：分离发酵液和提取(R)-3-羟基丁酸
将实施例1中得到的5.2升发酵液以4500rpm离心，并弃去细胞。上清液用1％硅藻土过滤。在与1％活性炭混合搅拌30分钟后回收澄清的滤液。
将滤液通过纳滤膜浓缩，使得到的滤液通过732阳离子交换树脂，得到1000g/L浓缩滤液。浓缩的收集物为油状物并趁热收集，得到56.8g(R)-3-羟基丁酸，产率92.5％。(R)-3-羟基丁酸的纯度通过高效液相色谱法测定。色谱柱为Shim-pack Vp-ODSC18柱(150L×4.6)。流动相由乙腈：水(v/v)＝15:85组成，UV检测波长为210nm，进样体积为20μL，流速为1mL/min，柱温为10℃。(R)-3-羟基丁酸的纯度为98％，比光学值为[α]D20＝-25°(C＝6％，H2O)。
实施例3：(R)-3-羟基丁酸钠的制备
通过在25℃或更低温度下将实施例2中得到的5g(R)-3-羟基丁酸与等量的2.0N氢氧化钠溶液混合，进行中和反应。通过旋转浓缩，静置2小时，抽滤收集，并在60℃下干燥，最后获得4.9g(R)-3-羟基丁酸钠粉末，产率为81％。该盐的熔点为152℃，比光学值[α]D20为-14.1°(C＝10％，H2O)。
实施例4：(R)-3-羟基丁酸的外消旋化
将10g(R)-3-羟基丁酸缓慢加入到100mL的2.0N氢氧化钠溶液中，并将混合物加热至60℃持续4小时。产物的光学值在室温下为0°。通过加入盐酸进行中和反应，将混合物的pH调节至7.0。通过旋转蒸发直至观察到固体，静置2小时，然后过滤得到10.3g 3-羟基丁酸钠粉末，产率为85％。结果显示获得外消旋3-羟基丁酸盐。
总之，本发明公开了通过基因修饰工程化的谷氨酸棒杆菌可以一步法高产率发酵(R)-3-羟基丁酸，其被证明是安全且无毒的食品级。本发明公开的工程化菌株和制造方法具有广泛的工业应用前景。

Claims (20)

1.一种生产(R)-3-羟基丁酸的方法，所述方法包括用非病原微生物使发酵液发酵，其中所述发酵液包含碳源和氮源以及由非病原微生物过表达的酶，所述碳源和氮源通过采用非病原微生物一步发酵直接转化成(R)-3-羟基丁酸，所述(R)-3-羟基丁酸在发酵期间被分泌后从发酵液中回收，其中所述非病原微生物选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、艰难短杆菌(Brevibacterium difficile)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和短杆菌(Brevibacterium breve)；并且所述非病原微生物具有以下生物转化能力：将丙酮酸和辅酶A转化为乙酰-CoA，将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，并将乙酰乙酸转化为(R)-3-羟基丁酸。
2.权利要求1的方法，其中由所述非病原微生物过表达的酶包括选自琥珀酰-CoA转移酶、乙酰乙酰-CoA合酶和3-HB脱氢酶的酶。
3.权利要求1或2的方法，其中所述微生物过表达琥珀酰-CoA转移酶和3-HB脱氢酶。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述非病原微生物是谷氨酸棒杆菌、谷氨酸细菌HR057、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、黄色短杆菌或短杆菌。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌或谷氨酸细菌HR057。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。
7.权利要求6的方法，其中所述谷氨酸棒杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13111。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油的碳源。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述氮源包括选自有机氮源和无机氮源的氮源。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述有机氮源包括选自玉米浆、麸皮水解物、豆饼水解物、酵母提取物、酵母粉、蛋白胨和尿素的有机氮源。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述无机氮源包括选自硫酸铵、硝酸铵和氨水的无机氮源。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述(R)-3-羟基丁酸不含细菌内毒素，纯度为95％或更高。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述(R)-3-羟基丁酸以(R)-3-羟基丁酸钠盐、(R)-3-羟基丁酸钾盐、(R)-3-羟基丁酸镁盐或(R)-3-羟基丁酸钙盐的形式制备。
14.外消旋3-羟基丁酸，其通过外消旋化处理权利要求12的(R)-3-羟基丁酸而制得。
15.外消旋3-羟基丁酸，其通过外消旋化处理权利要求13的(R)-3-羟基丁酸盐而制得。
16.一种非病原微生物，选自谷氨酸棒杆菌、谷氨酸细菌HR057、枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌、艰难短杆菌、黄色短杆菌和短杆菌。
17.权利要求16的非病原微生物，其中所述非病原微生物是谷氨酸棒杆菌菌株或谷氨酸细菌HR057菌株。
18.权利要求17的非病原微生物，其中所述非病原微生物是谷氨酸棒杆菌菌株。
19.权利要求18的非病原微生物，其中所述谷氨酸棒杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13111。
20.权利要求16的非病原微生物，其中所述微生物能够以如权利要求1-13中任一项所述的一步发酵方法生产(R)-3-羟基丁酸。
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