CN101538595B - 利用屎肠球菌分步发酵生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种分步控制发酵条件深层发酵生产γ-氨基丁酸的方法，它是以屎肠球菌(Enterococcus faecium)为菌种，通过分步控制深层发酵的pH值和温度条件，通过外源补加谷氨酸或谷氨酸钠，发酵生产γ-氨基丁酸，发酵醪中γ-氨基丁酸浓度达到10～20g/L。该方法具有简化发酵工艺、产率和设备的利用率高、操作方便等优点。

Description

利用屎肠球菌分步发酵生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及利用微生物生产γ-氨基丁酸的方法，特别是利用屎肠球菌(Enterococcusfaecium)深层发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，如降低血压、利尿、镇痛安神、改善脑机能、增进脑活力、促进长期记忆、营养神经细胞、改善更年期综合症等。当大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、帕金森等疾病。同时GABA还与脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪、目不明”。另外，GABA能促进精子的穿卵能力，提高受精率，用于掩饰或降低具有不愉快味道的物质的不愉快风味印象的用途以及可以提高饲料利用率和日增重。γ-氨基丁酸正被广泛运用于医药、食品保健、化工及农业等行业。GABA的生产主要可以通过化学合成和生物合成两条途径。化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业；生物合成法较化学合成法具有条件温和、环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，因此利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。

目前已经有一些利用不同种属的微生物生产GABA的报道。

陆兆新、杨胜远等在中国专利(专利号ZL 200510040758.9)中公开了一种γ-氨基丁酸的生产方法，它是以唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成γ-氨基丁酸。

吴天祥等在中国专利(公开号CN101240301)中公开了固态发酵制备γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：首先以腐乳为原料筛选出红曲霉菌种；接着将红曲霉MP1104菌种置于斜面培养基上培养7d，使菌种活化；然后发酵菌种转接到培养基中，在温度30℃、转速150r/min下将活化菌种摇床培养2d，制备发酵种子，优选固态发酵条件和培养基；最后将菌种在上一步骤中优选的培养基和培养条件下进行培养生产GABA。该方法以大米为发酵原料，以红曲霉为菌种，具有食用安全性，可以作为保健食品直接食用；该方法的GABA产量和纯度均高，在最佳发酵条件与培养基下，GABA产量由初始的0.21mg/g可达到0.35mg/g，最终产品的纯度可以达到45％。

焦庆才等在中国专利(专利号ZL 200410064813.3)中公开一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，该制备方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸两种混合酸性氨基酸作为原料，将具有高活力L-谷氨酸脱羧酶的埃希氏菌Escherichia coli AS1.505的菌体细胞与含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的转化液混合，28-45℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。该方法解决了两种酸性混合氨基酸高效分离的难题，得到了附加值较高的γ-氨基丁酸，并具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。

梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187.5)中公开了一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于15～50mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5mM～60mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187.5)中还公开了一种控制pH发酵生产γ-氨基丁酸的方法。其特征在于：保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基中，培养25～35小时后，以5～10％的接种量接种于发酵罐中，发酵罐装液量为1～3L，搅拌转速为50～150r/min，在30℃下静置培养，对其进行pH控制发酵，发酵培养约25～40小时，待菌体生长进入稳定期，pH值回升后，连续流加1～3mol/L的盐酸，发酵培养基pH控制在5.0～5.6，继续培养约40～60h，即得含γ-氨基丁酸的发酵液。

郭晓风等在中国专利(专利公开号CN101102683)中公开了一种涉及含有γ-氨基丁酸的食品的生产方法，其包括使酵母或其处理物作用于糖和/或糖代谢中间体，或者是作用于糖或糖代谢中间体和谷氨酸或其盐，其中，上述酵母具有在糖或糖代谢中间体存在下通过发酵反应生产γ-氨基丁酸的能力。

蒋冬花等在中国专利(专利公开号CN101302480)中公开了一种高产γ-氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其筛选方法和用途。该发明的高产GABA红色红曲霉(Monascus ruber Mr-5)菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M208043，保藏地为：中国典型培养物保藏中心。另外还公开了上述的红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法以及用途和用于γ-氨基丁酸的合成的方法，采用生物法合成γ-氨基丁酸的方法所得的发酵液中含6～9g/L的γ-氨基丁酸。

崔晓俊等在中国专利(专利公开号CN101311273)中公开了一种生物合成的γ-氨基丁酸制剂的方法，该产品按重量百分比含有：5％至60％的γ-氨基丁酸。上述的生物合成的γ-氨基丁酸制剂的制备方法按以下步骤进行：首先将乳酸链球菌种接种到250mL由葡萄糖、玉米浆粉、脱脂豆粕粉、味精组成的发酵种子培养基，形成发酵液，将发酵液引入高速离心机中离心形成清液，将清液在40℃下，加入250mg/L壳聚糖，搅拌絮凝，将经絮凝的待滤发酵液通过板框过滤机，得到滤清液，滤清液经阳离子树脂交换床进行离子交换，待离子交换树脂饱和后，去离子水洗脱，将谷氨酸全部洗脱，然后用氨水洗脱提取γ-氨基丁酸。

曹郁生等在中国专利(专利公开号CN101333508)中公开了一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其特征和工艺方法步骤为：经鉴定为Lactobacillus brevis(短乳杆菌)，国家菌种保藏号：Lactobacillus brevis CCTCCM 208054。将保藏于MRS琼脂斜面的短乳杆菌，转接于MRS液体培养基，经活化后，以2-5％的接种量接种于MRSG液体培养基，于25-30℃培养60-90h，发酵液中的γ-氨基丁酸达到50-145mM。曹郁生等还在中国专利(专利公开号CN101333548)中公开了一种利用短乳杆菌制备γ-氨基丁酸的方法，其工艺方法步骤为：1.利用MRS液体培养基将短乳杆菌活化后，以5％的接种量接种于MRSG发酵培养基，34℃培养40-60h，4℃离心收集菌体；2.利用无菌生理盐水洗涤2次后悬于含10-100mM谷氨酸钠、pH 5.2的醋酸缓冲液中，34℃反应1～8h，离心后即为含γ-氨基丁酸的溶液。

赵景联等在文摘(生物工程学报，1989，5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6ml/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12ml/h，转化率达95％。

章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998，13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。

Kono I等在文摘(Biosci.Biotechnol.Biochem.，2000，64(3)：617-619)中介绍了对Koji制作中GABA的变化，GABA含量达到了120μg/g。

Wang JJ等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30：669-676)中报道了利用Monascus purpureus NTU 60 1进行固体发酵，GABA含量达到了5004mg/kg。

Su YC等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30(1)：41-46)中报道了采用Monascus purpureus CCRC31615进行固体发酵，GABA含量达到了1200mg/kg。

Nomura M等在文摘(J Dairy Sci.，1998，81：1486-1491)中介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus lactis 01-7，用于奶酪生产，奶酪的GABA的含量达到了383mg/kg。

许建军在其博士学位论文(江南大学，2004年2月)中报道了从乳酸菌中筛选到了高产GABA的Lactococcus lactis菌株，25L罐发酵72h，发酵液的GABA达到了250mg/100ml。

刘清等在文摘(氨基酸和生物资源，2004，26(1)：40-43)中也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3.1g/l。

Yokoyama S等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，93(1)：95-97)中报道了利用Lactobacillus brevis IFO-12005对酒糟进行发酵，GABA的含量达到了10.18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化GABA。

爱宕世高等在文摘(食品と科学，2001，No.8，81-85)中报道了采用Lactobacillusplantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉含量达到了5％。

Komatsuzaki N等在文摘(Food Microbiology，2005，22：497-504)中报道了从日本传统发酵食品中分离到了Lactobacillus paracasei用于GABA生产，GABA浓度达到了302mM。

Takahashi T等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，97(6)：412-418)中报道筛选到了Saccharomyces cerevisiae UT-1的GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中GABA浓度分别达到了0.4mM和0.42mM，较野生株分别提高了2.0和2.1倍。

Ijsseldijk等在美国专利(United States Patent，US5472718A)中公开了利用含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的酸奶加入到牛奶中，生产奶酪，所获得的奶酪具有较大的多孔性结构，质地大大改善，并在其中检测到了微量GABA。

有关屎肠球菌(Enterococcus faecium)的报道方面，中国专利申请号：00114138公开了一种经分离筛选的屎肠球菌(CCTCCNO：M99016)及其应用。经培养基选择、粪便(猪)样品采集、接种及培养筛选，其特征是：分别经胆汁耐受性、耐酸性、安全性筛选、检测获得能应用于制造畜禽胃肠道微生态调节剂的特殊屎肠球菌纯培养物。并在此基础上，制成仔猪生态调节膏剂、畜禽饲料添加剂等。但目前尚未见有利用屎肠球菌分步发酵生产γ-氨基丁酸的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利用屎肠球菌为菌种，分步控制发酵条件以解决细胞繁殖与发酵产物累积的发酵条件不一致的矛盾，深层发酵生产γ-氨基丁酸的方法，可以生产高含量的γ-氨基丁酸，大大降低生产成本，简化发酵工艺，属于生物工程领域。

本发明人经过对大量微生物菌株进行筛选，自行从传统泡菜中分离筛选到了具有很高谷氨酸脱羧酶活性的菌株，经过鉴定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。再从微生物菌种保藏中心经过购买屎肠球菌(Enterococcus faecium)进行试验，也发现购买的屎肠球菌(Enterococcus faecium)都具有较高的谷氨酸脱羧酶活性。通过进一步研究确定了通过生物工程技术，以屎肠球菌为菌种，采取细胞培养与发酵累积产物进行分步控制的发酵技术，获得了高GABA含量(10-20g/L)的发酵醪。

本发明的获得的γ-氨基丁酸的分子量为103.1，结构式为：

本发明是这样实现的：通过以屎肠球菌(Enterococcus faecium)为菌种，通过逐级活化和放大，接入发酵罐进行分步控制发酵条件，使高谷氨酸脱羧酶活力细胞获得最大限度的增殖，然后在适宜发酵条件下作用于外源谷氨酸或谷氨酸钠，深层发酵生产高含量γ-氨基丁酸。

γ-氨基丁酸的生产方法有如下形式：

1、菌种：屎肠球菌(Enterococcus faecium)。

2、培养基：

MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸膏5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄·H₂O 0.19g/L，吐温80 1ml，调节pH7.0，121℃灭菌15min。

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸膏5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄·H₂O 0.19g/L，吐温80 1ml，调节pH7.0，琼脂10g/L。121℃灭菌15min。

TYG培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸钠5g/L，调节pH7.0，121℃灭菌15min。

改良PD培养基：马铃薯200g于1L水中煮沸30min，纱布过滤去渣。在清液中加入葡萄糖20g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，调节pH7.0，121℃灭菌15min。

3、发酵方法：以屎肠球菌为生产菌种，先进行活化，后接入种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，将种子液按4-10％接种量接入发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过控制pH6.0～7.0培养24～36h，再解除pH控制继续发酵12～18h，然后按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸发酵醪。

本发明的优点：

1、本发明的方法的优点是通过分步控制发酵条件，通过外加谷氨酸或谷氨酸钠底物，发酵生产GABA。该发明解决了屎肠球菌的细胞繁殖与发酵产物累积的发酵条件不一致的矛盾。发酵工艺简单，操作方便，GABA产量高。

2、本发明首次发现屎肠球菌具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，利用其作为菌种，分步控制发酵条件，可以通过深层发酵生产高含量的γ-氨基丁酸发酵醪(最高浓度可达20g/L)，可以简化生产工艺，降低生产成本，可提高设备的利用率。

具体实施方式

实施例1：

将屎肠球菌保藏菌种采用MRS斜面进行活化，接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过流加1mol/L NaOH控制pH6.0～7.0培养24h，然后解除pH控制，继续发酵12～18h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，于35～45℃，pH3.0～5.0继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。

实施例2：

以屎肠球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于30～37℃，100rpm摇床培养12h进行活化，然后按4-10％的接种量接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过流加1mol/L NaOH控制pH6.0～7.0培养24h，然后解除pH控制，继续发酵12～18h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。

实施例3：

以屎肠球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于30～37℃，100rpm摇床培养12h进行活化，然后按4-10％的接种量接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过流加1mol/L NaOH控制pH6.0～7.0培养24～36h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。

实施例4：

以屎肠球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于30～37℃，100rpm摇床培养12～24h进行活化，然后按4-10％的接种量接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过流加1mol/L NaOH控制pH6.0～7.0培养24h，然后解除pH控制，继续发酵12～18h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。

实施例5：

以屎肠球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于30～37℃，100rpm摇床培养12～24h进行活化，然后按4-10％的接种量接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，pH6.0～7.0，100～180rpm搅拌下培养24h，然后解除pH控制，继续发酵12～18h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，然后控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。

实施例6：

以屎肠球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，接入MRS或TYG或改良PD种子培养基，于30～37℃，pH6.0～7.0，100～180rpm搅拌培养12h，然后按4-10％接入MRS或TYG或改良PD发酵培养基，于30～37℃，pH6.0～7.0，100～180rpm搅拌下培养24h，然后解除pH控制，继续发酵12～18h，按15～40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，然后控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸含量为10～20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。

Claims (1)

1.一种分步控制发酵条件深层发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征为：以屎肠球菌(Enterococcus faecium)为菌种，经活化后接入种子培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌培养12～24h，将种子液按4～10％接种量接入发酵培养基，于30～37℃，100～180rpm搅拌下通过控制pH6.0～7.0培养24～36h，再解除pH控制继续发酵12～18h，然后按15～40g／L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过控制pH值在3.0～5.0于35～45℃继续发酵24～96h，从而获得γ-氨基丁酸发酵醪；所述种子培养基为MRS培养基或TYG培养基或改良PD培养基；所述发酵培养基为MRS培养基或TYG培养基或改良PD培养基。