CN107574192B

CN107574192B - 一种以732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法

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Publication number: CN107574192B
Application number: CN201710510282.3A
Authority: CN
Inventors: 杨胜远; 韦锦
Original assignee: Lingnan Normal University
Current assignee: Lingnan Normal University
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2037-06-28
Also published as: CN107574192A

Abstract

本发明涉及一种利用732阳离子交换树脂提高屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的方法，属于生物技术领域；本发明是以732阳离子交换树脂作为屎肠球菌谷氨酸脱羧酶的酶活促进剂，按照732阳离子交换树脂质量∶L‑谷氨酸溶液体积∶屎肠球菌菌悬液或谷氨酸脱羧酶游离酶液体积为1∶1∶1的比例混合构建732阳离子交换树脂‑谷氨酸脱羧酶复合催化体系，当于80r/min、37℃～43℃水浴振荡器反应或搅拌罐中低速搅拌反应24 h～36 h，γ‑氨基丁酸的产量可提高25.31%～143.23%。本发明提供的方法中，732阳离子交换树脂除了显著提高谷氨酸脱羧酶的活性外，其对γ‑氨基丁酸的交换吸附作用也是一种γ‑氨基丁酸纯化的过程，简化了下游提取纯化工艺，降低生产成本；方法简便，绿色环保。

Description

一种以732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法

技术领域

本发明涉及一种以732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸 (γ-Aminobutyric acid, GABA) 是一种具有4个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、镇静和改善睡眠等作用，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此γ-氨基丁酸还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料。

微生物生长繁殖快，以其生产γ-氨基丁酸不受时间和空间限制，因此通过微生物谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生产γ-氨基丁酸备受关注。谷氨酸脱羧酶是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸(L-glutamic acid, L-Glu) 发生α-羧基脱羧作用生成γ-氨基丁酸的唯一酶。由于谷氨酸脱羧酶作用的底物(L-谷氨酸)和产物(γ-氨基丁酸)均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产γ-氨基丁酸，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的报道。

陆兆新、杨胜远等在中国专利(专利号ZL 200510040758.9)中公开了一种γ-氨基丁酸的生产方法，它是以唾液链球菌嗜热亚种 (Streptococcus thermophilus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成γ-氨基丁酸。

吴天祥等在中国专利(公开号CN101240301)中公开了固态发酵制备γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：首先以腐乳为原料筛选出红曲霉菌种；接着将红曲霉MP1104菌种置于斜面培养基上培养7 d，使菌种活化；然后发酵菌种转接到培养基中，在温度30 ℃、转速150 r/min下将活化菌种摇床培养2 d，制备发酵种子，优选固态发酵条件和培养基；最后将菌种在上一步骤中优选的培养基和培养条件下进行培养生产γ-氨基丁酸。该方法以大米为发酵原料，以红曲霉为菌种，具有食用安全性，可以作为保健食品直接食用；该方法的γ-氨基丁酸产量和纯度均高，在最佳发酵条件与培养基下，γ-氨基丁酸产量由初始的0.21mg/g可达到0.35 mg/g，最终产品的纯度可以达到45%。

焦庆才等在中国专利(专利号ZL 200410064813.3)中公开一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，该制备方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸两种混合酸性氨基酸作为原料，将具有高活力L-谷氨酸脱羧酶的埃希氏菌Escherichia coli AS1.505的菌体细胞与含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的转化液混合，28-45℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。该方法解决了两种酸性混合氨基酸高效分离的难题，得到了附加值较高的γ-氨基丁酸，并具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。

梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187.5)中公开了一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于:保藏编号为 CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30h后，以0.5%～5%的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48 h～120 h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2 g湿菌体，悬浮于15～50 mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5 mmol/L～60 mmol/L，反应1～10 h，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187.5)中还公开了一种控制pH发酵生产γ-氨基丁酸的方法。其特征在于:保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基中，培养25～35 h后，以5～10%的接种量接种于发酵罐中，发酵罐装液量为1～3 L，搅拌转速为50～150 r/min，在30℃下静置培养，对其进行pH控制发酵，发酵培养约25～40 h，待菌体生长进入稳定期，pH值回升后，连续流加1～3 mol/L的盐酸，发酵培养基pH控制在5.0～5.6，继续培养约40～60 h，即得含γ-氨基丁酸的发酵液。

郭晓风等在中国专利(专利公开号CN101102683)中公开了一种涉及含有γ-氨基丁酸的食品的生产方法，其包括使酵母或其处理物作用于糖和/或糖代谢中间体，或者是作用于糖或糖代谢中间体和谷氨酸或其盐，其中，上述酵母具有在糖或糖代谢中间体存在下通过发酵反应生产γ-氨基丁酸的能力。

蒋冬花等在中国专利(专利公开号CN101302480)中公开了一种高产γ-氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其筛选方法和用途。该发明的高产GABA红色红曲霉(Monascus ruber Mr-5)菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M208043，保藏地为：中国典型培养物保藏中心。另外还公开了上述的红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法以及用途和用于γ-氨基丁酸的合成的方法，采用生物法合成γ-氨基丁酸的方法所得的发酵液中含6～9 g/L的γ-氨基丁酸。

崔晓俊等在中国专利(专利公开号CN101311273)中公开了一种生物合成的γ-氨基丁酸制剂的方法，该产品按重量百分比含有：5%至60%的γ-氨基丁酸。上述的生物合成的γ-氨基丁酸制剂的制备方法按以下步骤进行：首先将乳酸链球菌种接种到 250 mL由葡萄糖、玉米浆粉、脱脂豆粕粉、味精组成的发酵种子培养基，形成发酵液，将发酵液引入高速离心机中离心形成清液，将清液在40 ℃下，加入250 mg/L壳聚糖，搅拌絮凝，将经絮凝的待滤发酵液通过板框过滤机，得到滤清液，滤清液经阳离子树脂交换床进行离子交换，待离子交换树脂饱和后，去离子水洗脱，将谷氨酸全部洗脱，然后用氨水洗脱提取γ-氨基丁酸。

曹郁生等在中国专利(专利公开号CN101333508)中公开了一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其特征和工艺方法步骤为：经鉴定为Lactobacillus brevis(短乳杆菌)，国家菌种保藏号：Lactobacillus brevis CCTCCM 208054。将保藏于MRS琼脂斜面的短乳杆菌，转接于MRS液体培养基，经活化后，以2-5%的接种量接种于MRSG液体培养基，于25-30 ℃ 培养60-90 h，发酵液中的γ-氨基丁酸达到50-145 mmol/L。曹郁生等还在中国专利(专利公开号CN101333548)中公开了一种利用短乳杆菌制备γ-氨基丁酸的方法，其工艺方法步骤为：1.利用 MRS液体培养基将短乳杆菌活化后，以5%的接种量接种于MRSG发酵培养基，34℃培养40-60 h，4℃离心收集菌体；2.利用无菌生理盐水洗涤2次后悬于含10-100 mmol/L谷氨酸钠、pH 5.2的醋酸缓冲液中，34℃反应1～8 h，离心后即为含γ-氨基丁酸的溶液。

赵景联等在文摘(生物工程学报，1989,5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1%谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产γ-氨基丁酸。间歇反应5 h转化率达到了100%；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6 mL/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85%；连续柱式反应器中进行，控制流速12 mL/h，转化率达95%。

章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998, 13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产γ-氨基丁酸，获得了γ-氨基丁酸含量达到了98.94%，收率为49.65%。

Kono I等在文摘(Biosci. Biotechnol.Biochem.,2000,64(3):617-619)中介绍了对Koji制作中γ-氨基丁酸的变化，γ-氨基丁酸含量达到了120 μg/g 。

Wang JJ等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol, 2003,30：669-676)中报道了利用Monascus purpureus NTU 601进行固体发酵，γ-氨基丁酸含量达到了5004 mg/kg。

Su YC等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol, 2003,30(1)：41-46)中报道了采用Monascus purpureus CCRC31615进行固体发酵，γ-氨基丁酸含量达到了1200 mg/kg。

Nomura M等在文摘(J Dairy Sci.,1998,81:1486-1491)中介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus lactis 01-7，用于奶酪生产，奶酪的γ-氨基丁酸的含量达到了383 mg/kg。

许建军在其博士学位论文(江南大学，2004年2月)中报道了从乳酸菌中筛选到了高产γ-氨基丁酸的Lactococcus lactis菌株，25 L罐发酵72 h，发酵液的γ-氨基丁酸达到了250 mg/100 mL。

刘清等在文摘(氨基酸和生物资源，2004，26(1)：40-43)中也对高产γ-氨基丁酸乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的γ-氨基丁酸达到3.1 g/L。

Yokoyama S等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(1)：95-97)中报道了利用Lactobacillus brevis IFO-12005对酒糟进行发酵，γ-氨基丁酸的含量达到了10.18 mmol/L，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的γ-氨基丁酸溶液，可用于食品强化γ-氨基丁酸。

爱宕世高等在文摘(食品と科学, 2001,No.8, 81-85)中报道了采用Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产γ-氨基丁酸，在干粉含量达到了5%。

Komatsuzaki N等在文摘(Food Microbiology, 2005,22:497-504)中报道了从日本传统发酵食品中分离到了Lactobacillus paracasei用于γ-氨基丁酸生产，γ-氨基丁酸浓度达到了302 mmol/L。

Takahashi T等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004,97(6): 412-418)中报道筛选到了Saccharomyces cerevisiae UT-1的γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中γ-氨基丁酸浓度分别达到了0.4 mmol/L和0.42 mmol/L，较野生株分别提高了2.0和2.1倍。

Ijsseldijk等在美国专利(United States Patent, US5472718A)中公开了利用含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的酸奶加入到牛奶中，生产奶酪，所获得的奶酪具有较大的多孔性结构，质地大大改善，并在其中检测到了微量γ-氨基丁酸。

杨胜远等在中国专利(专利号ZL200910114018.3)中公开了一种分步控制发酵条件深层发酵生产γ-氨基丁酸的方法，它是以屎肠球菌(Enterococcus faecium)为菌种，通过分步控制深层发酵的pH值和温度条件，通过外源补加谷氨酸或谷氨酸钠，发酵生产γ-氨基丁酸，发酵醪中γ-氨基丁酸浓度达到10～20 g/L。

杨胜远等在中国专利(专利号ZL200910192105.0)中公开了一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，它是以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) 为菌种，通过发酵工程技术、细胞转化法和酶工程技术将外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠进行转化，生产高含量的γ-氨基丁酸(转化液γ-氨基丁酸含量达1～30%)。

杨胜远等在中国专利(专利号200910114016.4)中公开了一种细胞转化法生产γ-氨基丁酸的方法，它是以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，生产高含量的γ-氨基丁酸，或将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸。

虽然以微生物合成γ-氨基丁酸的公开技术较多，但是由于微生物谷氨酸脱羧酶的活性普遍不高， γ-氨基丁酸产量偏低，成本高，难以满足工业化生产需求。谷氨酸脱羧酶是生物合成γ-氨基丁酸的关键酶，其活性高低与γ-氨基丁酸的产量直接相关。除了谷氨酸脱羧酶的结构和微生物代谢产酶量外，催化反应的外部反应条件也是影响谷氨酸脱羧酶活性的重要因素。因此，如何提高微生物谷氨酸脱羧酶活力、提高高活力谷氨酸脱羧酶细胞的产量以及通过改善细胞转化反应体系或工艺条件，提高γ-氨基丁酸的产量，降低生产成本，将是今后亟需解决的关键问题。。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过732阳离子交换树脂提高屎肠球菌谷氨酸脱羧酶转化活性的方法，通过以732阳离子交换树脂作为辅助催化剂，将732阳离子交换树脂、含谷氨酸脱羧酶的屎肠球菌细胞、缓冲液和反应底物L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠盐组成共催化体系，最终实现促进屎肠球菌细胞谷氨酸脱羧酶转化活性，提高γ-氨基丁酸产量的目的，解决生物合成γ-氨基丁酸成本高居不下的问题。

732阳离子交换树脂选择性高，后处理简便，价廉易得、不污染环境、不腐蚀设备，容易分离及回收，可重复使用，已广泛用于物质的分离纯化。但是，作为辅助催化剂在生物酶催化反应体系中应用尚未报道。本发明在对多种不同树脂的筛选、反应条件及其作用机制等研究基础上，以732阳离子交换树脂作为辅助催化剂与屎肠球菌细胞或游离谷氨酸脱羧酶共催化L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠脱羧合成γ-氨基丁酸，732阳离子交换树脂能够显著提高屎肠球菌谷氨酸脱羧酶的转化活性，提高γ-氨基丁酸的产量，降低生产成本。

本发明的所使用的具有谷氨酸脱羧酶活性的屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株分离自泡菜，已于2017年6月19日进行专利菌种保藏，其保藏编号为：GDMCC 60203，保藏名称为：Enterococcus faecium，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。

为了实现本发明的目的，发明人首先对pH值对屎肠球菌GDMCC 60203细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的影响进行了研究，结果(附图1)表明细胞谷氨酸脱羧酶的最适反应pH值为4.4，当pH值在4.2～4.6之间时，细胞谷氨酸脱羧酶转化活性较强；当反应体系的pH值大于4.4时，细胞谷氨酸脱羧酶活性迅速下降。考虑谷氨酸脱羧基生成γ-氨基丁酸后，会造成反应体系pH升高，从会降低细胞谷氨酸脱羧酶活性，因此为了减小控制pH值的难度和减少调节反应pH值的酸用量，选择pH 4.2～pH 4.6作为细胞转化反应体系的pH值。

为了考察732阳离子交换树脂对转化反应缓冲体系pH值是否有影响，发明人按树脂质量∶缓冲液体积为1∶2的比例在pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液中加入732阳离子交换树脂，然后测定缓冲液的pH值，结果(附图2)加入树脂后，缓冲液的pH值很快由pH4.2下降到3.59±0.04，40 ℃保温1 h，缓冲液pH值可下降到3.32±0.03。为了防止732阳离子交换树脂影响酶催化反应体系初始pH，从而造成细胞谷氨酸脱羧酶转化活性下降，本发明将732阳离子交换树脂先采用pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液进行充分平衡，结果取得了很好的效果，平衡后的732阳离子交换树脂不再改变缓冲体系的pH值。

本发明进一步对经pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂对溶于pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的交换吸附能力进行了测试，当按树脂质量与0.2 mol/L L-谷氨酸-0.2 mol/L γ-氨基丁酸混合溶液(溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.2)体积为1∶2混合5min，结果(附图3)732阳离子交换树脂对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的均有交换吸附能力，当以树脂质量∶洗脱液体积为1∶20的0.15 mol/L Na₂CO₃溶液进行洗脱，洗脱液中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸分别为(21.31±0.09) mmol/L和(13.32±0.08) mmol/L。

为了避免树脂对L-谷氨酸的交换作用影响转化反应底物的浓度，本发明分别将采用含0.2 mol/L L-谷氨酸的pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂和不含L-谷氨酸的pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂分别按树脂质量∶0.3 mol/L L-谷氨酸一钠(味精)溶液(溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.2)体积∶屎肠球菌GDMCC 60203菌悬液体积为1∶1∶1的比例混合，然后于80 r/min、(40±3)℃水浴振荡器反应24 h，纱布过滤，分别收集滤液(记为转化液，下同)和树脂，再对树脂进行洗脱(记为洗脱液，下同)，合并转化液和洗脱液，结果(附图4)经含L-谷氨酸的pH4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732阳离子交换树脂可显著提高细胞谷氨酸脱羧酶的转化活性，转化反应24 h，γ-氨基丁酸产量较不加树脂的对照组提高了25.32%。然而，仅采用pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732阳离子交换树脂试验组的γ-氨基丁酸的产量略有降低，增产率为-3.32%。由此，本发明选择以含0.2 mol/LL-谷氨酸的pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂与屎肠球菌GDMCC 60203细胞构建复合转化反应体系。

732阳离子交换树脂的添加量是构建树脂-细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的重要参数，本发明在相同液体体积的转化体系中加入不同添加量的树脂，结果(附图5)，随着732阳离子交换树脂添加量增加，γ-氨基丁酸的产量也增加，当试验体系732离子交换树脂的添加量与液体总体积的比值达到1∶2时，γ-氨基丁酸产量较不添加732离子交换树脂的对照组增加了32.08%，继续增加732离子交换树脂添加量，γ-氨基丁酸的产量和增产率趋于平缓。因此，732离子交换树脂的添加量以与转化体系的总液体体积的比值为1∶2时较为适宜。

为了了解732阳离子交换树脂-细胞谷氨酸脱羧酶复合转化体系的适宜反应时间，本发明按已用含0.2 mol/L L-谷氨酸的pH4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂质量∶0.3 mol/L L-谷氨酸一钠(味精)溶液(溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.2)体积∶屎肠球菌GDMCC 60203菌悬液体积为1∶1∶1的比例混合，然后于80 r/min、(40±3)℃水浴振荡器反应不同时间，同时以不加树脂按同样操作作为对照，并跟踪测定不同时间转化反应液的pH值，结果(附图6)随着反应时间延长，试验组的γ-氨基丁酸产量逐渐高于对照组，转化反应24 h，1 L试验组的γ-氨基丁酸产量达到了(151.53±4.09) mmol，较对照组(118.28±9.18) mmol]提高了28.11%。虽然试验组和对照组的转化液pH值变化基本一致，但由于对照组产量高，对转化液的碱化作用更强，说明732阳离子交换树脂对调节转化体系pH值仍具有一定作用，但相对较弱。

转化体系的pH值是影响谷氨酸脱羧酶的重要条件，为了更好的控制转化体系的pH值，同时防止瞬间局部过酸而造成谷氨酸脱羧酶失活，本发明采用0.1 mol/L～0.5 mol/LHCl对转化体系的pH值进行调节，控制转化体系的pH值在4.2～4.6范围内，结果既加已用含L-谷氨酸的pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡的732阳离子交换树脂又控制pH值在4.2～4.6范围内的试验组每升γ-氨基丁酸产量达到了(278.57±5.51) mmol，较只加树脂但不控制pH值的试验组(162.52±6.12) mmol提高了71.41%，较不加树脂但控制pH值在4.2～4.6范围内的试验组(209.49±8.16) mmol提高了32.98%，相对于既不添加树脂也不控制pH值的对照组(114.23±4.08) mmol提高了143.87%。

从附图3可见，在pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液中，732阳离子交换树脂对作为反应底物的L-谷氨酸和生成的产物γ-氨基丁酸的交换能力不同，说明732阳离子交换树脂对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的交换能力与其在溶液中的解离状态相关。当缓冲液体系pH值发生改变，必将影响L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的解离状态，从而改变732阳离子交换树脂对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的交换能力，导致反应体系游离的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸浓度发生改变，造成产物抑制谷氨酸脱羧酶活性增加或下游酶(如γ-氨基丁酸转氨酶、γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶)对γ-氨基丁酸的代谢增加，最终造成γ-氨基丁酸产量减少。732阳离子交换树脂促进谷氨酸脱羧酶转化活性的机制可能是732阳离子交换树脂通过与γ-氨基丁酸的离子交换而控制转化液中游离的H⁺浓度和γ-氨基丁酸浓度，维持谷氨酸脱羧酶适宜反应pH值和减少γ-氨基丁酸的反馈抑制及下游酶的代谢，同时也因转化液游离γ-氨基丁酸浓度降低而加快γ-氨基丁酸离开谷氨酸脱羧酶活性中心的速度。

以上所述为本专利申请的研究过程示例，但不仅限于上述研究内容。经采用pH4.2～pH 4.6范围内的不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液替代上述涉及的pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液进行研究，结果732阳离子交换树脂均可显著提高谷氨酸脱羧酶的转化活性，γ-氨基丁酸的产量提高了25.32%～143.87%；反应底物L-谷氨酸一钠(味精)或L-谷氨酸溶液的浓度在0.2 mol/L～0.3 mol/L之间也具有同等效果；转化反应时间可依据细胞谷氨酸脱羧酶的活力情况根据生产需要进行调节，可选择24 h～36 h。

本发明将屎肠球菌GDMCC 60203细胞通过超声波破碎，采用pH 4.2～pH 4.6、0.2mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液提取谷氨酸脱羧酶，以其游离酶液与732阳离子交换树脂进行共催化反应，结果732阳离子交换树脂也可显著促进其谷氨酸脱羧酶的活性，γ-氨基丁酸的产量提高幅度也在25.32%～143.87%之间。

本发明的技术方案是：

将已再生或预处理的732阳离子交换树脂用pH 4.2～pH 4.6、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡，再用含0.2 mol/L L-谷氨酸的pH 4.2～pH 4.6、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡，然后按732阳离子交换树脂质量∶0.2 mol/L～0.3 mol/L L-谷氨酸一钠(味精)或L-谷氨酸溶液(溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.2～pH 4.6)体积∶屎肠球菌菌悬液（或游离谷氨酸脱羧酶酶液）体积为1∶1∶1的比例混合，于80 r/min、37℃～43℃水浴振荡器反应或搅拌罐中低速搅拌反应，转化反应过程中通过0.1 mol/L～0.5mol/L HCl调节转化体系的pH值在4.2～4.6，反应24 h～36 h后通过过滤、树脂洗脱和离心等工序即可获取γ-氨基丁酸母液。

本发明的方法是：

本发明所述的一种利用732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法包括以下步骤：

①已再生或预处理的732阳离子交换树脂用pH 4.2～pH 4.6、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡，然后用底物溶液平衡；

② 按步骤①平衡的732阳离子交换树脂质量∶底物溶液体积∶屎肠球菌菌悬液或谷氨酸脱羧酶酶液体积为1∶1∶1的比例将三者混合；

③ 将步骤②混合物于80 r/min、37℃～43℃水浴振荡器反应或于37℃～43℃低速搅拌或静置反应24 h～36 h，转化反应过程中通过0.1 mol/L～0.5 mol/L HCl调节转化体系的pH值在4.2～4.6；

④ 将步骤③转化反应后的混合物通过过滤、树脂洗脱和离心等工序即可获取γ-氨基丁酸母液。

上述步骤①和②所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液的浓度为0.2 mol/L～0.3 mol/L，制备方法是将底物溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，调节溶液的pH为4.2～4.6。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明选用的732阳离子交换树脂通过与γ-氨基丁酸的离子交换而控制转化液中游离的H⁺和γ-氨基丁酸浓度，在一定程度上可维持谷氨酸脱羧酶反应pH值，减少调节用酸量；同时，732阳离子交换树脂交换吸附γ-氨基丁酸后，可以减少产物的反馈抑制作用及下游酶的代谢，并可通过降低转化液游离γ-氨基丁酸浓度而加快γ-氨基丁酸离开谷氨酸脱羧酶活性中心的速度，促进谷氨酸脱羧酶的催化速率；另外，732阳离子交换树脂对γ-氨基丁酸的交换吸附作用也是一种γ-氨基丁酸纯化的过程，可以简化下游提取纯化工艺，降低生产成本。

本发明通过将732阳离子交换树脂加入屎肠球菌细胞或谷氨酸脱羧酶游离酶转化体系，显著提高了屎肠球菌的谷氨酸脱羧酶活性，γ-氨基丁酸的产量可提高25.32%～143.87%，可显著降低成本。另外，732阳离子交换树脂选择性高，后处理简便，价廉易得，容易分离及回收，可重复使用，不污染环境、不腐蚀设备。

附图说明

图1为pH值对屎肠球菌GDMCC 60203细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的影响；

图2为732阳离子交换树脂对转化反应缓冲体系pH值的影响；

图3为732阳离子交换树脂对L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的交换吸附能力；

图4为不同平衡方法制备的732阳离子交换树脂对屎肠球菌GDMCC 60203细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的影响；

图5为732阳离子交换树脂的添加量对屎肠球菌GDMCC 60203细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的影响；

图6为反应时间对732阳离子交换树脂对屎肠球菌GDMCC 60203细胞谷氨酸脱羧酶转化活性的影响；

图5和图6的图例中GABA为英文缩写，代表γ-氨基丁酸；

图6的图例中C.K. 为英文缩写，代表对照组；732树脂代表添加732阳离子交换树脂的试验组。

具体实施方式

本发明实施例以屎肠球菌GDMCC 60203细胞或其游离形式的谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸为例，说明利用732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法，但不仅限于屎肠球菌，732阳离子交换树脂对其他含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞或谷氨酸脱羧酶游离酶的转化活性同样具有促进作用。

实施例1

①. 将L-谷氨酸一钠(味精)溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液中，调节pH 至4.2～4.6，制备成0.2 mol/L～0.3 mol/L L-谷氨酸一钠溶液，作为底物溶液；

②. 将732阳离子交换树脂按照树脂说明用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl进行再生或预处理，然后用pH 4.2～pH 4.6、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡，再用底物溶液平衡；

③. 按步骤②平衡的732阳离子交换树脂质量∶底物溶液体积∶屎肠球菌GDMCC60203菌悬液体积为1∶1∶1的比例将三者混合，混合物即为谷氨酸脱羧酶复合转化反应体系；

④. 将步骤③混合物于80 r/min、37℃～43℃水浴振荡器反应或于37℃～43℃低速搅拌或静置反应24 h～36 h，转化反应过程中通过0.1 mol/L～0.5 mol/L HCl调节转化体系的pH值在4.2～4.6；

⑤. 将步骤④转化反应后的混合物通过过滤，分别收集滤液(转化反应液)和树脂，然后采用0.10 mol/L碳酸钠或氨水对树脂交换吸附的γ-氨基丁酸进行洗脱(洗脱液)，分别将转化反应液和洗脱液于4℃～35℃、4000 r/min～10000 r/min离心，去除沉淀物即可获得含γ-氨基丁酸的母液。

实施例2

①. 将L-谷氨酸溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液中，调节pH 至4.2～4.6，制备成0.2 mol/L～0.3 mol/L L-谷氨酸一钠溶液，作为底物溶液；

实施例3

③. 按步骤②平衡的732阳离子交换树脂质量∶底物溶液体积∶屎肠球菌GDMCC60203谷氨酸脱羧酶游离酶液体积为1∶1∶1的比例将三者混合，混合物即为谷氨酸脱羧酶复合转化反应体系；

Claims

1.一种以732阳离子交换树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法，其特征在于，将已再生或预处理的732阳离子交换树脂用pH 4.2～pH 4.6、0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡，再用底物溶液充分平衡，然后按732阳离子交换树脂质量∶底物溶液体积∶屎肠球菌GDMCC 60203菌悬液或谷氨酸脱羧酶游离酶液体积为1∶1∶1的比例混合，于80 r/min、37℃～43℃水浴振荡器反应或搅拌罐中低速搅拌反应24 h～36 h，转化反应过程中通过0.1mol/L～0.5 mol/LHCl控制转化体系的pH为4.2～4.6；所述底物为L-谷氨酸或L-谷氨酸一钠；所述底物溶液的浓度为0.2 mol/L～0.3 mol/L，制备方法是将底物溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，调节溶液的pH为4.2～4.6。