CN113774004B - 一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ‑氨基丁酸的方法。所述短乳杆菌（Lactobacillus brevis）已于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23487，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明所述菌株可高产谷氨酸脱羧酶且稳定性好，所得酶活高达356.7 U/g；将发酵后的短乳杆菌全细胞催化L‑谷氨酸转化为γ‑氨基丁酸，所得γ‑氨基丁酸浓度高达418.3g/L，转化率可达99.0%以上，所得γ‑氨基丁酸可在食品中安全应用。本发明所述短乳杆菌具备产业化应用的潜力。

Description

一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经传导物质，主要存在于脑和骨髓中。γ-氨基丁酸是由谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸生成的（见图1）。我国卫生健康委员会批准短乳杆菌与希氏乳杆菌发酵制备的γ-氨基丁酸为新食品原料。γ-氨基丁酸具有多种生理功能，包括镇静、抗惊厥、治疗癫痫病；改善肝脏、肾脏功能；降低血压；调节激素分泌；延缓衰老；增强记忆；提高生殖活性；能促进胰岛细胞中胰岛素的分泌，有效地预防糖尿病。此外，γ-氨基丁酸还具有其它一些生理功能，如预防肥胖，促进酒精代谢，调节心律失常，防止动脉硬化以及防止皮肤老化等作用。γ-氨基丁酸还能够治疗尿毒症以及一氧化碳中毒。
目前制备γ-氨基丁酸的方法有植物富集法，化学合成法，微生物发酵法等。植物富集法虽然安全性好，但制得的γ-氨基丁酸浓度太低，无法作为医药、食品添加剂；利用化学合成法生产γ-氨基丁酸安全性较差、有化学残留，也不易达到医药及食品行业的标准；微生物发酵法具有成本低的优点，但得到的γ-氨基丁酸是一个多相的复杂体系，浓度低，下游分离成本高，是生产高纯高浓度γ-氨基丁酸的一个瓶颈问题。
目前发酵制备谷氨酸脱羧酶的微生物菌种主要是重组大肠杆菌与乳酸菌，重组大肠杆菌只能用于饲料级与医药级γ-氨基丁酸的制备，无法用于制备食品级γ-氨基丁酸。专利CN101928679虽然是采用乳酸菌发酵制备γ-氨基丁酸，但是该发明所用乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），而国家卫健委批准使用制备γ-氨基丁酸的乳酸菌仅短乳杆菌（Lactobacillus brevis）与希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）两种。并且该专利转化时加入了0.2mol/L醋酸缓冲液，这对后续的纯化结晶工艺增加了难度。专利CN110964760采用短乳杆菌发酵制备γ-氨基丁酸，但是其产量较低，仅为115.72g/L，而且其工艺没有将发酵与酶促全细胞转化分开，这对后续提取纯化工艺增加了难度，不利于实现产业化生产。专利CN107475151一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌，虽然其产量可以达到200g/L以上，但是其所用菌种为副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis），与短乳杆菌分属于乳杆菌属里不同的种，不在国家规定允许使用的菌种里面。
发明内容
本发明主要目的在于一株高产谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌及其制备γ-氨基丁酸的方法
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一株短乳杆菌，所述短乳杆菌（Lactobacillus brevis）已于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.23487，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还提供以上所述短乳杆菌的发酵培养基，所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-200.0g/L，玉米浆干粉3.0-35.0 g/L，蛋白胨5.0-30.0g/L，牛肉浸粉3.0-35.0g/L，酵母浸粉2.0-25.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0-15.0 g/L，乙酸钠3.0-20.0g/L，硫酸镁0.2-10.0 g/L，硫酸锰0.01-5.00 g/L，吐温80 0.2-3.0 g/L。
进一步地，所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-80.0g/L，玉米浆干粉10-35.0 g/L，蛋白胨5.0-10.0g/L，牛肉浸粉3.0-8.0g/L，酵母浸粉2.0-5.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0-5.0 g/L，乙酸钠3.0-5.0 g/L，硫酸镁0.2-1.0 g/L，硫酸锰0.01-0.05g/L，吐温80 0.2-1.0 g/L。
本发明还提供以上所述短乳杆菌的发酵方法，包括以下步骤：将以上所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；在25℃-37℃，pH值为5.0-7.5条件下发酵。
所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-200.0g/L，玉米浆干粉3.0-35.0 g/L，蛋白胨5.0-30.0g/L，牛肉浸粉3.0-35.0g/L，酵母浸粉2.0-25.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0-15.0 g/L，乙酸钠3.0-20.0 g/L，硫酸镁0.2-10.0 g/L，硫酸锰0.01-5.00g/L，吐温80 0.2-3.0 g/L。
本发明还提供以上所述短乳杆菌产谷氨酸脱羧酶的方法，将以上所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；向发酵培养基中加入5-60 g/L的L-谷氨酸钠，在0-50rpm，25℃-37℃，pH值为5.0-7.5条件下发酵24-48h；所述发酵培养基为：葡萄糖20-80.0g/L，玉米浆干粉10-35.0 g/L，蛋白胨5.0-10.0g/L，牛肉浸粉3.0-8.0g/L，酵母浸粉2.0-5.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0-5.0 g/L，乙酸钠3.0-5.0g/L，硫酸镁0.2-1.0 g/L，硫酸锰0.01-0.05 g/L，吐温80 0.2-1.0 g/L。
本发明还提供循环利用以上所述短乳杆菌全细胞制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：将所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；加入L-谷氨酸钠，进行发酵；发酵结束后收集发酵液，离心收集全细胞；所述发酵培养基为：葡萄糖20-80.0g/L，玉米浆干粉10-35.0 g/L，蛋白胨5.0-10.0g/L，牛肉浸粉3.0-8.0g/L，酵母浸粉2.0-5.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0-5.0 g/L，乙酸钠3.0-5.0 g/L，硫酸镁0.2-1.0 g/L，硫酸锰0.01-0.05 g/L，吐温80 0.2-1.0 g/L；
将收集所得全细胞加入到转化液中进行转化；转化结束后收集转化液，离心收集所述短乳杆菌全细胞，将其加入到新的转化液中，进行循环利用制备γ-氨基丁酸。
进一步地，将收集所得菌体按照湿重25-200g/L的添加量加入到转化液中，35-50℃，pH值为4.0-5.0条件下转化120-200h。
更进一步地，所述转化液包括以下组分：硫酸镁1-10g/L，磷酸吡哆醛0.1-1.5g/L，L-谷氨酸100-800g/L。
更进一步地，转化条件为：在温度为35-50℃，pH值为4.0-5.0条件下转化。循环转化时间可达120-200h。
进一步地，所述方法还包括γ-氨基丁酸提取纯化步骤：将转化液进行离心收集上清液，将上清夜进行超滤膜、纳滤膜过滤；收集滤液，向滤液中加入活性炭在55-80℃温度下进行吸附，吸附后进行抽滤得脱色液；将脱色液进行浓缩、降温析晶、重结晶，即得。
进一步地，所述方法还包括使用高效液相色谱分析法对转化液中的γ-氨基丁酸浓度进行测定：
高效液相色谱分析条件为：色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；
检测波长为190-235nm；
流动相：质量浓度为0.1-0.5%高氯酸用氢氧化钠调节pH至2.5-5.0的溶液，与乙腈以5-9:1的比例混合；
流速为0.5-1mL/min，柱温为25-35℃；进样量为10-30μL；分析时间10-20min。
L-谷氨酸与γ-氨基丁酸混标HPLC检测图谱见图2。
进一步地，所述含有谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌全细胞活性检测方法为：配制0.2mol/L醋酸钠溶液，用醋酸调节pH至4.4。用上述醋酸-醋酸钠缓冲液配制50.0g/L的L-谷氨酸钠、5.0g/L的七水硫酸镁、2.0g/L的磷酸吡哆醛混合反应液，并将反应液在55℃水浴锅中预热15min。取一定量的发酵液离心留菌体待用，取2mL预热后的反应液悬浮上述菌体，然后于55℃条件下水浴反应40min，离心取上清用HPLC检测γ-氨基丁酸含量从而计算出酶活。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明提供一株短乳杆菌，该菌株可高产谷氨酸脱羧酶且稳定性好，所得酶活高达356.7 U/g；将发酵后的短乳杆菌全细胞催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，所得γ-氨基丁酸浓度高达418.3g/L，转化率可达99.0%以上，所得短乳杆菌全细胞可循环用于转化制备γ-氨基丁酸，本发明所述短乳杆菌具备产业化应用的潜力。本发明所述方法制备所得γ-氨基丁酸可在食品中安全应用。
附图说明
图1：谷氨酸脱羧酶催化反应示意图；
图2：L-谷氨酸与γ-氨基丁酸混标HPLC检测图谱；
图3：实施例1中短乳杆菌扫描电子显微镜形貌图；
图4：实施例1中短乳杆菌16S rDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图：1号是GLB-66 PCR扩增产物，2号是GLB-127 PCR扩增产物，3号是GLB-128 PCR扩增产物，M是DNA Marker；
图5：实施例1中短乳杆菌GLB-127 16s rDNA序列系统发育树；
图6：实施例3、实施例4、实施例5、实施例6中L-谷氨酸钠对短乳杆菌产谷氨酸脱羧酶的影响；
图7：实施例4、实施例7、实施例8、实施例9中温度对短乳杆菌生长及产谷氨酸脱羧酶的影响；
图8：实施例21中转化液HPLC检测图谱；
图9：实施例21中γ-氨基丁酸纯品HPLC检测色谱图；
图10：实施例23中转化液HPLC检测图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
将出发菌株GLB-66在种子培养基（葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L）中培养24h，取种子液离心去上清，用10mL无菌生理盐水洗涤两遍，收集于有玻璃珠的三角瓶中振荡混合均匀，调整菌浓至108CFU/mL。在暗室取10mL于无菌培养皿中，加无菌转子置于磁力搅拌器上，在功率20W的紫外灯下20cm处开盖，边搅拌边照射，分别照射20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s，90s。将照射后的种子悬液稀释到合适的倍数，涂布于含有γ-氨基丁酸的固体平板（葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L，琼脂20.0g/L，γ-氨基丁酸5g/L）上培养2d，以固体平板上长出的单菌落（CFU）个数，计算不同诱变时间的致死率。选择致死率在80-90%的诱变照射时间80s进行实验。
致死率=（未经诱变的菌落数-诱变后的菌落数）/未经诱变的菌落数×100%
挑取平板上生长良好的单菌落在液体培养基（葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，谷氨酸钠10g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L）中培养48h，HPLC检测发酵液中γ-氨基丁酸浓度，得到两株编号为GLB-127与GLB-128的短乳杆菌，相对于出发菌株这两株菌在产量上分别提高16.4%与10.5%。液体培养基中连续传代5次，检测发酵液中γ-氨基丁酸浓度，菌株GLB-127产谷氨酸脱羧酶稳定性较好。
采用德国蔡司公司的热场发射扫描电子显微镜(Thermal Field EmissionScanning Electron Microscopy，TFESEM)观察菌体形态特征。将静止培养20h种子液离心收集菌体，用2.5%戊二醛在4℃固定4h，离心弃上清。然后用0.1mol/L无菌PBS洗涤菌体2遍。最后采用50%、75%、100%乙醇梯度脱水，喷金观测。通过扫描电子显微镜可以看到，短乳杆菌呈短杆状，表面光滑粗壮，无杂菌污染，菌体长度约1-2μm左右。短乳杆菌扫描电子显微镜形貌图见图3。
短乳杆菌的分子鉴定与系统分类
（1）16S rDNA序列分析法鉴定短乳杆菌
图4为诱变前与诱变后菌株16S rDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，可以看到菌株在1500bp处有一荧光条带，并且没有拖尾现象，满足测序的要求。将菌株16S rDNA测序后，得到测序结果，序列长度为1461bp，见SEQ ID NO.1。将所得序列在NCBI进行BLAST相似性比对，该菌株与Lactobacillus brevis 2651相似度最高，确定其为短乳杆菌。
（2）短乳杆菌系统分类
菌株GLB-127经16S rDNA基因序列分析鉴定为短乳杆菌，短乳杆菌属于厚壁菌门芽孢杆菌纲里的乳杆菌目乳杆菌科乳杆菌属。采用MEGA-X软件构建该菌的系统发育树，见图5。从系统发育树可以看出Lactobacillus brevis GLB-127与Lactobacillus brevis2560及Lactobacillus brevis 2651亲缘关系最近，为属内同种。
所述菌株GLB-127已于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）保藏编号为：CGMCCNo.23487，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入20 g/L的L-谷氨酸钠，分别在0rpm、50rpm、100rpm、150rpm，30℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
取0rpm、50rpm、100rpm、150rpm等四种不同摇床转速培养条件对短乳杆菌GLB-127生物量及谷氨酸脱羧酶活性的影响，实验结果见下表1。
表1
实验组 静置培养 50rpm 100rpm 150rpm
菌体OD<sub>600</sub> 3.5 4.3 5.8 7.1
酶活（U/g） 195.8 67.8 41.1 16.8
实施例3
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入10 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，30℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为3.5，酶活为135.3U/g菌体湿重。
实施例4
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入20g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，30℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为3.6，酶活为200.1U/g菌体湿重。
实施例5
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入30 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，30℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为3.6，酶活为200.1U/g菌体湿重。
实施例6
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入40 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，30℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为3.6，酶活为200.1U/g菌体湿重。
从实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所得结果及图6可以看出，培养基中添加L-谷氨酸钠浓度至20g/L时，谷氨酸脱羧酶活性达到200.1U/g以上，继续增加L-谷氨酸钠浓度无益于酶活的继续升高，所以选取L-谷氨酸钠的浓度为20g/L。
实施例7
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入20 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，25℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为2.6，酶活为179.7U/g菌体湿重。
实施例8
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入20 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，33℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为4.0，酶活为174.8U/g菌体湿重。
实施例9
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基A中，进行摇瓶发酵；向摇瓶中加入20 g/L的L-谷氨酸钠，在0rpm，37℃，pH值为6.6条件下发酵48h。
所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
经检测短乳杆菌GLB-127发酵液OD600为4.2，酶活为159.3U/g菌体湿重。
从实施例4、实施例7、实施例8、实施例9所得结果及图7可以看出，培养温度控制在30℃更有利于菌体生物量的增加与酶活的提高，这主要是因为重组蛋白的生成速率与酶蛋白空间结构的形成存在关系，低温放缓了蛋白质的生成速率，却维持了酶蛋白正确的空间结构，但是过低的温度却不利于生物量的积累，并且会增加生产成本，所以综合考虑诱导培养温度控制在30℃，酶活达到了200.1U/g菌体湿重。
实施例10
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，玉米浆干粉10g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例11
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，玉米浆干粉10g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例12
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例13
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，玉米浆干粉20g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例14
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖80.0g/L，玉米浆干粉35.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，磷酸氢二钾18.0 g/L，柠檬酸氢二铵5.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例15
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖20.0g/L，玉米浆干粉10 g/L，蛋白胨5.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，柠檬酸氢二铵1.0g/L，乙酸钠3.0 g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.01 g/L，吐温80 0.2 g/L。
实施例16
一种短乳杆菌GLB-127发酵培养基：葡萄糖200.0g/L，玉米浆干粉3.0 g/L，蛋白胨5.0g/L，牛肉浸粉35.0g/L，酵母浸粉2.0.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，柠檬酸氢二铵1.0 g/L，乙酸钠3.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰5.00 g/L，吐温80 3.0 g/L。
实施例10至实施例16所述发酵培养基为在发酵培养基A基础上进行的优化，所述发酵培养基A为：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，谷氨酸钠20g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
将短乳杆菌GLB-127分别接种于实施例10至实施例16所述发酵培养基及发酵培养基A中，加入20g/L的L-谷氨酸钠，每组设置2个重复，在30℃培养箱中静置培养48h。所得谷氨酸脱羧酶实验结果见下表2。
表2
实验组 初始组 实施例10 实施例11 实施例12 实施例13 实施例14 实施例15 实施例16
OD<sub>600</sub> 3.6 4.2 4.3 5.2 5.3 5.6 4.9 5.4
酶活（U/g） 193.5 234.6 246.9 278.4 278.3 243.8 264.7 256.7
由表2可以看出，短乳杆菌GLB-127接种于实施例10至实施例16所述发酵培养基中，与发酵培养基A相比，菌种生长量（OD600）及所得谷氨酸脱羧酶均有所提升，酶活最高可提升36.8%。
实施例17
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中，进行10L发酵罐放大实验，发酵罐底料按照6L发酵培养基称量，加入5L纯化水溶解，并加入2mL消泡剂进行灭菌处理。种子液OD600为3.5，镜检短杆粗壮，无杂菌。并加入20 g/L的L-谷氨酸钠。
发酵培养过程中，用氨水控制发酵液pH为5.6，50rpm搅拌转速，30℃条件下进行发酵培养。发酵液葡萄糖初始浓度为20g/L，6h后开始流加50%浓度的葡萄糖，共流加1500mL，发酵时间为36h，最终菌体OD600为22.3，酶活为317.1 U/g菌体湿重。
所述发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例18
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中，进行10L发酵罐放大实验，发酵罐底料按照6L发酵培养基称量，加入5L纯化水溶解，并加入1mL消泡剂进行灭菌处理。种子液OD600为2.6，镜检短杆粗壮，无杂菌。并加入20 g/L的L-谷氨酸钠。
发酵培养过程中，用氨水控制发酵液pH为6.2，0rpm搅拌转速，30℃条件下进行发酵培养。3h后继续流加50%浓度的葡萄糖，共流加1000mL，即碳源浓度为130g/L。发酵时间为72h，最终菌体OD600为8.6，酶活为348.6 U/g菌体湿重。
所述发酵培养基：葡萄糖50.0 g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例19
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中，进行10L发酵罐放大实验，发酵罐底料按照6L发酵培养基称量，加入5L纯化水溶解，并加入2mL消泡剂进行灭菌处理。种子液OD600为3.2，镜检短杆粗壮，无杂菌。并加入20 g/L的L-谷氨酸钠。
发酵培养过程中，用氨水控制发酵液pH为6.6，20rpm搅拌转速，30℃条件下进行发酵培养。5h后继续流加50%浓度的葡萄糖，共流加1200mL，即碳源浓度为160g/L。发酵时间为48h，最终菌体OD600为15.6，酶活为356.7 U/g菌体湿重。
所述发酵培养基：葡萄糖70.0 g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例20
短乳杆菌GLB-127产谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌GLB-127进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中，进行1000L发酵罐放大实验，发酵罐底料按照600L发酵培养基称量，加水定容至500L溶解，并加入30mL消泡剂进行灭菌处理。种子液OD600为2.9，镜检短杆粗壮，无杂菌。并加入20 g/L的L-谷氨酸钠。
发酵培养过程中，用氨水控制发酵液pH为6.0，0rpm搅拌转速，30℃条件下进行发酵培养。8h后继续流加50%浓度的葡萄糖，共流加100L，发酵时间为48h，最终菌体OD600为10.6，酶活为309.6 U/g菌体湿重。
所述发酵培养基：葡萄糖65.0 g/L，玉米浆干粉15g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硫酸锰0.04 g/L，吐温80 1.0 g/L。
实施例21
利用短乳杆菌GLB-127制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例19所述方法对短乳杆菌GLB-127进行发酵，发酵后离心收集菌体，将所得菌体按湿重50g/L的添加量加入转化液中，转化液中包括以下组分：终浓度400g/L的L-谷氨酸，5.0g/L的硫酸镁，1.0g/L的磷酸吡哆醛。温度控制在40℃，pH用磷酸控制在4.4。转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为278.1g/L，转化率为99.2%。将转化液离心收集全细胞菌体以备下次转化使用，收集上清液用于后续的提取纯化。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法：
色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长为190-235nm；
流动相为质量浓度为0.1%高氯酸用氢氧化钠调节pH至3.5，抽滤后与色谱级乙腈以9:1的比例混合即得；
流速为1mL/min，柱温为30℃；进样量为10 μL；分析时间15min。转化液HPLC检测色谱图如图8所示。
提取纯化方法：采用膜过滤与结晶相结合的工艺提取转化液中的γ-氨基丁酸，首先将转化液离心除去全细胞菌体，取转化上清过10KDa超滤膜，收集超滤穿出液，再将超滤穿出液过150Da纳滤膜收集纳滤穿出液。然后向纳滤穿出液中加入1.5%的活性炭，在70℃下吸附70min，抽滤除碳后，取1L脱色液在60℃下真空旋蒸浓缩。将脱色液浓缩至γ-氨基丁酸浓度为650g/L左右时，降温析晶。先自然降温，然后在2-8℃冰水浴中降温，滴加200mL乙醇，并以80rpm转速搅拌养晶3h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为295.3g，计算晶体收率为94.6%。
重结晶：将初次结晶样品在60℃条件下加水溶解并定容至450mL，首先自然降温，然后冰水浴降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品γ-氨基丁酸269.4g，计算晶体总收率为86.3%。检测晶体含量为99.6%。γ-氨基丁酸纯品HPLC检测色谱图如图9所示。
实施例22
利用短乳杆菌GLB-127制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例19所述方法对短乳杆菌GLB-127进行发酵，发酵后离心收集菌体，将所得菌体按湿重100g/L的添加量加入转化液中，转化液中包括以下组分：终浓度500g/L的L-谷氨酸，2.0g/L的硫酸镁，0.4g/L的磷酸吡哆醛。温度控制在45℃，pH用磷酸控制在4.5。转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为347.5g/L，转化率为99.2%。将转化液离心收集全细胞菌体以备下次转化使用，收集上清液用于后续的提取纯化。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法如实施例21所示。
提取纯化方法如实施例21所示。
实施例23
利用短乳杆菌GLB-127制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例19所述方法对短乳杆菌GLB-127进行发酵，发酵后离心收集菌体，将所得菌体按湿重75g/L的添加量加入转化液中，转化液中包括以下组分：终浓度600g/L的L-谷氨酸，3.0g/L的硫酸镁，0.5g/L的磷酸吡哆醛。温度控制在48℃，pH用磷酸控制在4.6。转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为418.3g/L，转化率为99.5%。将转化液离心收集全细胞菌体以备下次转化使用，收集上清液用于后续的提取纯化。转化液HPLC检测图谱如图10所示。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法如实施例21所示。
提取纯化方法如实施例21所示。
实施例24
循环利用短乳杆菌GLB-127全细胞制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例21所述方法利用短乳杆菌GLB-127全细胞对L-谷氨酸进行转化，转化结束后离心收集短乳杆菌GLB-127全细胞，将所得短乳杆菌GLB-127全细胞按实施例21所述方法进行再次转化，转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为279.1g/L，转化率为99.6%。将转化液离心再收集短乳杆菌GLB-127全细胞，继续按实施例21所述方法进行转化，所得短乳杆菌GLB-127全细胞可重复利用转化10次，全细胞催化酶循环利用总时长达150h。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法如实施例21所示。
提取纯化方法如实施例21所示。
实施例25
循环利用短乳杆菌GLB-127全细胞制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例22所述方法利用短乳杆菌GLB-127全细胞对L-谷氨酸进行转化，转化结束后离心收集短乳杆菌GLB-127全细胞，将所得短乳杆菌GLB-127全细胞按实施例22所述方法进行再次转化，转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为341.2g/L，转化率为97.5%。将转化液离心再收集短乳杆菌GLB-127全细胞，继续按实施例22所述方法进行转化，所得短乳杆菌GLB-127全细胞可重复利用转化8次，全细胞催化酶循环利用总时长达120h。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法如实施例21所示。
提取纯化方法如实施例21所示。
实施例26
循环利用短乳杆菌GLB-127全细胞制备γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
按实施例23所述方法利用短乳杆菌GLB-127全细胞对L-谷氨酸进行转化，转化结束后离心收集短乳杆菌GLB-127全细胞，将所得短乳杆菌GLB-127全细胞按实施例23所述方法进行再次转化，转化结束后，经HPLC检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为417.0g/L，转化率为99.2%。将转化液离心再收集短乳杆菌GLB-127全细胞，继续按实施例23所述方法进行转化，所得短乳杆菌GLB-127全细胞可重复利用转化6次，全细胞催化酶循环利用总时长达90h。
使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度的方法如实施例21所示。
提取纯化方法如实施例21所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东国力生物科技有限公司，山东国力生物技术研究院
<120> 一株短乳杆菌及循环利用其全细胞制备γ-氨基丁酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tcagagacat gcagtcgaac gagcttccgt tgatgacgtg cttgcactga tttcaacaat 60
gaagcgagtg gcgaactggt gagtaacacg tggggaatct gcccagaagc aggggataac 120
acttggaaac aggtgctaat accgtataac aacaaaatcc gcatggattt tgtttgaaag 180
gtggcttcgg ctatcacttc tggatgatcc cgcggcgtat tagttagttg gtgaggtaaa 240
ggcccaccaa gacgatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac attgggactg 300
agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag 360
tctgatggag caatgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaaac tctgttgtta 420
aagaagaaca cctttgagag taactgttca agggttgacg gtatttaacc agaaagccac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat 540
tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt cggcttaacc 600
ggagaagtgc atcggaaact gggagacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt 660
gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctagtc 720
tgtaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780
ccatgccgta aacgatgagt gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta 960
ccaggtcttg acatcttctg ccaatcttag agataagacg ttcccttcgg ggacagaatg 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttattatca gttgccagca ttcagttggg cactctggtg agactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gtcgcgaagt cgtgaggcta agctaatctc 1260
ttaaagccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ttggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgaga taacctacgg gagtcaagca 1440
gctagtgtga tgaaccaccc a 1461

Claims (8)

1.一株短乳杆菌，其特征在于，所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)已于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.23487，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述短乳杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；在25℃-37℃，pH值为5.0-7.5条件下发酵；
所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-200.0g/L，玉米浆干粉3.0-35.0g/L，蛋白胨5.0-30.0g/L，牛肉浸粉3.0-35.0g/L，酵母浸粉2.0-25.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0g/L，柠檬酸氢二铵1.0-15.0g/L，乙酸钠3.0-20.0g/L，硫酸镁0.2-10.0g/L，硫酸锰0.01-5.00g/L，吐温80 0.2-3.0g/L。
3.权利要求1所述短乳杆菌产谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法包括摇瓶发酵培养产谷氨酸脱羧酶和发酵罐发酵培养产谷氨酸脱羧酶；摇瓶发酵培养和发酵罐发酵培养产谷氨酸脱羧酶的方法包括：
将权利要求1所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；加入5-60g/L的L-谷氨酸钠，在0-50rpm，25℃-37℃，pH值为5.0-7.5条件下发酵24-72h；
发酵罐发酵培养产谷氨酸脱羧酶的方法还包括发酵过程中流加葡萄糖；
所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-80.0g/L，玉米浆干粉10-35.0g/L，蛋白胨5.0-10.0g/L，牛肉浸粉3.0-8.0g/L，酵母浸粉2.0-5.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0g/L，柠檬酸氢二铵1.0-5.0g/L，乙酸钠3.0-5.0g/L，硫酸镁0.2-1.0g/L，硫酸锰0.01-0.05g/L，吐温80 0.2-1.0g/L。
4.循环利用权利要求1所述短乳杆菌全细胞制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述短乳杆菌进行活化、制备种子液；将种子液接入到发酵培养基中；加入L-谷氨酸钠，进行发酵；发酵结束后收集发酵液，离心收集全细胞；
将收集所得全细胞加入到转化液中进行转化；转化结束后收集转化液，离心收集所述短乳杆菌全细胞，将其加入到新的转化液中，进行循环利用制备γ-氨基丁酸；
所述发酵培养基为：葡萄糖20.0-80.0g/L，玉米浆干粉10-35.0g/L，蛋白胨5.0-10.0g/L，牛肉浸粉3.0-8.0g/L，酵母浸粉2.0-5.0g/L，磷酸氢二钾1.0-18.0g/L，柠檬酸氢二铵1.0-5.0g/L，乙酸钠3.0-5.0g/L，硫酸镁0.2-1.0g/L，硫酸锰0.01-0.05g/L，吐温80 0.2-1.0g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化液包括以下组分：硫酸镁1-10g/L，磷酸吡哆醛0.1-1.5g/L，L-谷氨酸100-800g/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，转化条件为：在温度为35-50℃，pH值为4.0-5.0条件下转化。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括γ-氨基丁酸提取纯化步骤：将转化液进行离心收集上清液，将上清液进行超滤膜、纳滤膜过滤；收集滤液，向滤液中加入活性炭在55-80℃温度下进行吸附，吸附后进行抽滤得脱色液；将脱色液进行浓缩、降温析晶、重结晶，即得。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用高效液相色谱分析法对转化液中的γ-氨基丁酸浓度进行测定：
高效液相色谱分析条件为：色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；
检测波长为190-235nm；
流动相：质量浓度为0.1-0.5％高氯酸用氢氧化钠调节pH至2.5-5.0的溶液，与乙腈以5-9:1的比例混合；
流速为0.5-1mL/min，柱温为25-35℃；进样量为10-30μL；分析时间10-20min。
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